MINISTERUL EDUCAŢIEI, CERCETĂRII ŞI TINERETULUI UNIVERSITATEA DIN ORADEA

FACULTATEA DE ŞTIINŢE CATEDRA DE BIOLOGIE

Cristian – Mircea Petruş

Rezumatul tezei de doctorat

CERCETĂRI PRIVIND REACŢIA PLANTELOR HIPERHIDRICE DIN VITROCULTURĂ LA

APA Pi ŞI LA APA SĂRĂCITĂ ÎN DEUTERIU

Conducător ştiinţific: Prof.univ.dr. Dorina Cachiţă

Oradea, 2008

2  

CUPRINS 1. CONSIDERAŢII GENERALE ……………………………..…………

1.1. VITROCULTURILE VEGETALE – SCURT ISTORIC, IMPORTANŢA TEORETICĂ ŞI PRACTICĂ …………………………………….………

1.1.1. Definiţie. Scurt istoric …………………………………….……… 1.1.2. Caracteristici generale …………………………………………… 1.1.3. Importanţa teoretică şi practică ………………….……………... 1.1.4. Malformaţii hiperhidrice …………………………………………

1.2. HIPERHIDRIA SAU VITRIFICAREA ………….……………………. 1.3. CAUZELE APARIŢIEI HIPERHIDRIEI LA NIVELUL FITOINOCULILOR …………………………………………………….

1.3.1. Rolul apei în viaţa plantelor ………..…………………….. 1.3.1.1. Rolul apei în celula vegetală ……………………….………….…1.3.1.2. Rolul apei în germinaţia seminţelor ……………………..………1.3.1.3. Rolul apei în procesul de fotosinteză …………………………..…1.3.1.4. Rolul apei în procesul de respiraţie ………………………………1.3.1.5. Bilanţul de apă al plantelor ……………………………..…………1.3.1.6. Conţinutul de apă în diferitele organe ale plantelor ……………1.3.1.7. Rolul apei în plantulele cultivate „in vitro” ……....………………

1.3.2. Implicarea apei în procesele de hiperhidrie ……………..……….. 1.3.2.1. Rolul apei în vitroculturile vegetale ………………………..…..

1.3.2.1.1. Apa naturală – compus anorganic cu proprietăţi complexe Principalele proprietăţile fizice ale apei naturale ..………………... Principalele proprietăţile chimice ale apei …………….…………

1.3.2.1.2. Date bibliografice cu referire la apa Pi şi la apa sărăcită în deuteriu, în special privitoare la acţiunea lor asupra plantelor …...……….……………………………………...

Apa Pi – producere, proprietăţi fiziologice ………………………. Apa sărăcită în deuteriu – producere, proprietăţi fiziologice ….…..

1.4. POSIBILITĂŢILE EXISTENTE ÎN PREVENIREA SAU AMELIORAREA HIPERHIDRIEI …………………………………….

1.4.1. Experimente efectuate cu apă Pi sau cu apă sărăcită în deuteriu în scopul prevenirii sau anihilării hiperhidriei la nivelul vitroculturilor vegetale ………………………………………………

2. CERCETĂRI PROPRII PRIVIND EFECTELE APEI Pi ŞI

ALE APEI SĂRĂCITE ÎN DEUTERIU ASUPRA VITROPLANTULELOR HIPERHIDRICE ……………………...

1 1 1 3 6 8 8 16 18 19 23 24 24 25 25 26 28 28 30 30 31 33 34 42 55 64 70

2.1. SCOPUL CERCETĂRILOR ………………..………………………...…. 2.2. MATERIAL ŞI METODĂ …………………………………………….……

70 73

3  

2.2.1. Tipul materialului vegetal. Caracteristici morfoanatomice, fiziologice, biochimice şi cerinţe ecologice la sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) ………………………………

2.2.2. Detalii tehnice privind realizarea vitroculturilor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) ……………………..….

2.2.2.1. Medii de cultură testate. Modificări aduse mediului de cultură Murashige-Skoog (MS) (1962) ………………………………. 2.2.2.2. Tipul de inocul şi de recipiente de cultură, presterilizarea, îmbuşonarea şi sterilizarea acestora cu mediile de cultură …... 2.2.2.3. Asepsia şi asepsizarea încăperilor şi a materialului vegetal ….. 2.2.2.4. Inocularea, condiţiile de incubare şi creştere în vitrocultură ..

2.2.2.5. Iniţierea de vitroculturi din seminţe de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) …………….…………….………

2.2.2.6. Iniţierea şi subcultura de calus de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) ………………………………….

2.2.2.7. Metode utilizate de noi în prevenirea hiperhidriei la nivelul vitroculturilor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) ………………………………….………….……

2.2.3. Examinarea materialului vegetal …………..……………………… 2.2.3.1.Tehnici de microscopie optică folosite în examinarea citologică 2.2.3.2.Tehnici de microscopie electronică. Realizarea preparatului

vegetal în vederea evidenţierii aspectelor ultrastructurale surprinse în celulele fitoinoculului …………………………..

2.2.3.3. Biometrizări …………….………………..……………………. 2.2.3.4. Metode de dozare fotocolorimetrică a pigmenţilor clorofilieni 2.2.3.5. Metode de prelucrare statistică …………………….……….….

73 75 75 77 79 79 81 82 83 84 84 85 87 88 90

2. 3. REZULTATE ŞI DISCUŢII ………………….………………………… 2.3.1. Rezultate înregistrate în prevenirea apariţiei hiperhidriei şi a

calusogenezei la fitoinoculii de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) …………………………………………………

2.3.1.1. Germinarea în regim aseptic a seminţelor drajate de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) pe mediu de bază (MB) MS ½, agarizat, preparat cu apă distilată ………………

2.3.1.2. Rezultate înregistrate la 30 de zile de la realizarea culturii de apex caulinar, respectiv de minibutaşi uninodali, apicali, de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), pe mediu de bază MB – MS (1962), solidificat, preparat cu diferite tipuri de ape …………………………………………………………

2.3.2. Aspecte structurale şi ultrastructurale observate în frunzuliţele normale şi în cele hiperhidrice, precum şi în calusul hiperhidric de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), comparativ cu probele provenite din frunzuliţelor normale, regenerate pe medii de cultură în care apa distilată a fost înlocuită cu apă Pi sau cu apă sărăcită în deuteriu (25 ppm D) ………………….…...

91 91 91 93 101

4  

2.3.2.1. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), cultivate timp de 30 de zile în seră (martor)……………………………………………..…………..

2.3.2.2. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), normale, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură lipsite de regulatori de creştere (martor „in vitro”) ………………………………..……..………………..…

2.3.2.3. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), hiperhidrice, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA …………..

2.3.2.3.1.Rezultatele observate la vitrofrunzuliţe mai puţin hiperhidrice …………………………………..….………..

2.3.2.3.2.Rezultatele observate la vitrofrunzuliţe cu un stadiu ridicat de hiperhidrie ………………………………..….………… 2.3.2.4. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu

transmisie, observate în secţiunile longitudinale practicate prin calus de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), cultivat timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA …………………………………….…....

2.3.2.5. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), nehiperhidrice, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA, dar tratate cu APi …………………………………………………...……..

2.3.2.6. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), nehiperhidrice, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA, dar tratate cu ASD ……….………………………..……………….………

2.3.3. Conţinutul în pigmenţi asimilatori al vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) normale sau hiperhidrice ………………………………………………..…..…….

2.4. CONCLUZII …………...….………………………….……….…..….…… 3. BIBLIOGRAFIE ………………….………………………………………… 4. ARTICOLE PROPRII PUBLICATE, CU REFERIRE LA TEMA TEZEI DE DOCTORAT ……………………………………………………

104 119 144 144 164 181 218 231 257 260 262 290

5  

Capitolul 1 CONSIDERAŢII GENERALE Vitroculturile (termeni sinonimi: culturile „in vitro” de celule şi ţesuturi

vegetale, cormofitotehnologii, micropropagare) reprezintă un ansamblu de tehnici care presupune cultivarea în condiţii aseptice a oricărei părţi dintr-o plantă, pe un mediu nutritiv artificial (Vântu, 2005). Adeseori, prin culturile „in vitro” la plante se subînţeleg tehnicile de clonare, respectiv de micropropagare, obţinere de haploizi, dar şi culturi de celule, de protoplaşti etc. Scopurile acestora sunt multiple şi diferite (Cachiţă şi colab., 2004).

Hiperhidria, după Gautheret (1977), supranumită şi vitrificare (Phillips şi Matthews, 1964), este o transparentizare a unor ţesuturi vegetale din cauza „inundării” cu apă a spaţiilor intercelulare în zonele respective, organele afectate de acest fenomen prezentând un conţinut hidric mai ridicat decât acela existent în ţesuturile normale.

În condiţii aseptice, plante vitroase pot să apară relativ brusc. Aceste vitroplantule suferă transformări morfofiziologice, frunzele lor recurbându-se, devenind translucide, sticloase, rugoase (brânzoase), uneori ondulate şi casante, prezentând o creştere malformată, hipertrofiată. Aspectul general este acela de ţesut sau vitroplantule degenerate (Cachiţă şi colab., 1986; Gaspar şi colab., 1987; Cachiţă şi Crăciun, 1990; Cachiţă şi colab., 1991 a şi b; Ueno şi Shetty, 1996; Ueno şi colab., 1998; Cachiţă, 2001; Cachiţă şi Ardelean, 2004; Cachiţă şi Crăciun, 2004). Frunzuliţele vitroplantulelor hiperhidrice prezintă un tablou general alterat, fapt observabil atât prin microscopia optică, cât şi prin cea electronică. Alături de modificări morfoanatomice, fiziologice şi de ultrastructură, procesul de hiperhidrie se caracterizează şi prin modificări de ordin biochimic (Shanzhi şi colab., 2004).

În esenţă, în literatura de specialitate, există mai multe ipoteze referitoare la cauzele care produc hiperhidria la nivelul fitoinoculilor, şi anume:

creşterea umidităţii relative în incita recipientelor de cultură (Ziv şi colab., 1983; Capellades şi colab., 1990);

prezenţa etilenei în recipientele de cultură (De Proft şi colab., 1985; Kevers şi Gaspar, 1985);

solidificarea mediului de cultură cu concentraţii prea scăzute de agar - agar (Cachiţă, 1987; Leonhardt şi Kandeler, 1987; Zimmerman şi Swartz, 1994; Nairn şi colab., 1995; Franck şi colab., 1997; Constantinovici şi Cachiţă, 1999 a şi b; Arrabal şi colab., 2002; Prehn şi colab., 2003);

mediul de cultură lichid este acela care influenţează eliberarea de etilenă, care se acumulează în atmosfera din vasele de cultură (Kevers şi Gaspar, 1985; Dube şi Vidaver,1992; Ziv şi Shemesh, 1996; Lorenzo şi colab., 1998; Albany şi colab., 2005). După unii autori, numai etilena endogenă induce hiperhidria (Hauzinska, 1974; Davis şi colab., 1977; Sutter şi Langhans, 1979; Hakkaart şi Versluijs, 1983; Druart şi colab., 1984; John, 1986), dar s-a constatat faptul că, controlul potenţialului de apă nu este singura cale prin

6  

care concentraţia agarului în mediul de cultură afectează hiperhidria (Debergh, 1983; Bornman şi Vogelmann, 1984; Vieitez şi colab., 1985);

prezenţa în mediul de cultură Murashige – Skoog (1962) a tidiazuronului (TDZ) 1–fenil–3–(1–2–3–tiadiazol–5YL, adică ureea) (Giusti şi colab., 2002; Tzitzikas şi colab., 2004);

adăugarea în mediul de cultură a retardantului de creştere ancymidol (Chen şi Ziv, 2001);

cantitate crescută de citochinine, în special de BA (Abrie şi Van Staden, 2001; Echeverrigaray şi colab. 2000) sau de amoniu, în mediul de cultură (Kevers şi colab., 1984; Daguin şi Letouze, 1985; Orlikowska, 1987; Ziv, 1992; Gaspar şi colab., 1995; Heloir şi colab., 1997; Gavidia şi colab., 1997; Kevers şi colab., 2004; Ivanova şi colab., 2006).

reacţii biochimice (implicând fenolii solubili, peroxidazele bazice şi acide, metabolismul auxinei şi cel al etilenei) (Kevers şi colab., 1984; Kevers şi Gaspar, 1985);

reducerea concentraţiei de săruri minerale din mediul de cultură (Wang şi colab., 2007);

temperatura ambientală ridicată din camerele de creştere (Cachiţă şi Crăciun, 1986; Gaspar şi colab. 1987; Petruş – Vancea şi colab., 2008);

încercări de inducere a rezistenţei platelor la factori biotici şi abiotici (Patto şi colab., 2006);

factorul genetic (Cassells şi Curry, 2001).

Apa Pi – producere, proprietăţi fiziologice Apa Pi (APi) este utilizată în experimentele care fac obiectul prezentei teze

de doctorat a fost produsă de către o firmă particulară autorizată, pe baza tehnologiilor Bio Control System, tehnologii care au fost elaborate şi dezvoltate, încă în urmă cu 40 de ani, în Japonia şi în alte ţări ale lumii, obţinându-se prin purificarea şi bioenergizarea apei potabile cu ajutorul instalaţiei Life Energy, înlăturându-se astfel substanţele nocive din apă, aceasta căpătând proprietăţi fizice şi chimice deosebite.

Interesul cercetătorilor români pentru apa Pi a crescut tot mai mult în ultimii ani, studii lor fiind concretizate în numeroase articole, desfăşurându-se anual şi un Simpozionul internaţional „Apa un miracol”, de la Constanţa, din anul 2002, organizat sub înaltul patronaj al preşedintelui României, la care s-au comunicat numeroase articole legate de efectul apei Pi asupra plantelor (de castraveţi), în pomicultură, în înrădăcinarea în diferite substraturi neconvenţionale udate cu acest tip de apă (Godeanu şi colab., 2002; Hoza şi colab., 2002; Stănică şi colab., 2002 - http://www.apa-pi.ro/htmlsursa/simpozion.htm, 2002).

Apa sărăcită în deuteriu – producere, proprietăţi fiziologice

Apa sărăcită în deuteriu (ASD) (apa superuşoară, ori apa parţial dedeuterizată) este produsă de Institutul Naţional de Cercetare - Dezvoltare pentru Tehnologii Criogenice din România, cu sediul la Râmnicu Vâlcea. Apa respectivă

7  

are o compoziţie asemănătoare apei distilate, dar posedă un conţinut mult mai scăzut în deuteriu - un izotop al hidrogenului - decât în apa naturală sau cea distilată (http://www.incdtc.com, 2003). Procedeul de obţinere de ASD la concentraţia izotopică dorită, în domeniul 10 - 120 ppm D/(D+H) este protejat în ţara noastră prin brevetare (Tamaian şi Titescu, 2005 a şi b şi 2007); în principiu, metoda constă în distilarea continuă sub vid a apei naturale pe coloane de separare de înalta performanţă.

Apa cu un conţinut de 25 ppm D, potrivit lui Nuţiu şi Ardelean (2002), inhibă creşterile tumorale (mai ales în xenotransplanturi), la om şi la animale stimulează reactivitatea vasculară şi imunitatea naturală a organismelor, sporeşte rezistenţa acestora la dozele mici de radiaţii gamma etc.

Capitolul unu conţine o sinteza unor rezultate proprii, dar nu numai, ale studierii rolului pe care îl are apa Pi şi apa sărăcită în deuteriu asupra plantelor sănătoase, atât aflate în condiţii naturale de viaţă, cât şi multiplicate prin micropropagare. Astfel au fost sintetizate rezultatele personale obţinute în studierea efectelor celor două tipuri de ape asupra germinaţiei cariopselor de grâu (Triticum aestivum), de porumb (Zea mays) sau a seminţelor de ridichi (Raphanus sativus) (Cachiţă şi colab., 2002; Petruş şi colab., 2004), ori asupra înrădăcinării butaşilor de Tradescantia L. (Petruş şi colab., 2003; Petruş şi Cachiţă, 2008), precum şi asupra fitoinoculilor de Cymbidium ori Petunia (Petruş şi colab., 2004). Din cunoştinţele noastre, după o amplă studiere a bibliografiei de specialitate de ultimă oră, colectivul de cercetători condus de d-na profesor Dorina Cachiţă, la Universitatea din Oradea, a fost primul care a gândit protocoale de înlăturare a hiperhidriei (Radoveţ şi Cachiţă, 2005; Petruş şi Cachiţă, 2008), utilizând apa Pi, respectiv apa sărăcită în deuteriu (25 ppm D), atât prin culturi în dublu strat, cât şi de prevenire a apariţiei acestui fenomen, prin substituirea apei distilate din mediile de cultură, fie cu apă Pi, fie cu apă sărăcită în deuteriu (cu 25 ppm D).

Capitolul 2 CERCETĂRI PROPRII PRIVIND EFECTELE APEI

Pi SAU ALE APEI SĂRĂCITE ÎN DEUTERIU ASUPRA VITROPLANTULELOR HIPERHIDRICE

2.1. SCOPUL CERCETĂRILOR Cercetările care fac obiectul prezentei teze de doctorat au constat în

studierea fenomenului de hiperhidrie, pe vitroculturi de sfeclă, în principal pe sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera ), atât sub raport fiziologic, biochimic şi microscopic sub acţiunea apei Pi sau a apei sărăcite în deuteriu. Aceste studii sunt de mare interes, întrucât, dacă descrierea aspectelor morfoanatomice, fiziologice şi biochimice, în literatura de specialitate - cu referire la hiperhidrie - sunt numeroase, cele care privesc aspectele ultrastructurale, în special ca urmare a unui tratament antihiperhidrie cu apă Pi sau apă sărăcită în deuteriu, reprezintă noutăţi pe plan mondial.

8  

2.2. MATERIAL ŞI METODĂ Tabelul 8 Protocolul experimental al cercetărilor care fac obiectul prezentei teze de

doctorat Specia Tipul de

cultură

Material vegetal

secţionat Mediul de cultură Condiţii de

cultură

Durata de

cultură

Variante în studiile de

microscopie

Beta vulgaris

var. Saccharifera

„in vivo” - frunzuliţe 1. turbă

- 25 ºC; - iluminare

naturală

30 zile 1.Martor „in vivo”

„in vitro”

- frunzuliţe

2. MB – MS lipsit de regulatori de creştere, preparat cu AD (V0) 3. MB – MS + 2,5 mgl BA preparat cu AD (V00) 4. MB – MS + 2,5 mgl BA preparat cu APi (V1) 5. MB – MS + 2,5 mgl BA preparat cu ASD (V2)

- 23οC± 2oC în perioada de lumină;

- 20οC ± 2oC, în perioada de întuneric; 1700 lucşi; 16/24 h fotoperioada

30 zile

2. Martor „in vitro” 3. Frunză hiperhidrică 4. Tratament cu APi 5. Tratament cu ASD 6. Calus hiperhidric

- calus 6. MB – MS + 2, 4 D, 2 mg/l, preparat cu AD

Iniţierea de vitroculturi pe medii aseptice din seminţe de sfeclă de zahăr (Beta

vulgaris var. Saccarifera), subcultivarea minibutaşilor uninodali apicale ai vitroplantulelor provenite în urma germinaţieie, precum şi subcultivarea calusului regenerat la baza tulpiniţelor acestora, s-au realizat respectând cu stricteţe regulile de asepsie şi asepsizare, precum şi cele de inoculare

Indicii de creştere biometrizaţi au exprimat atât rizogeneza (lungimea şi numărul de rădăciniţe), cât şi caulogeneza (număr de frunzuliţe, lungime peţioluri, lungimea limbului foliar, număr de rozete, lungimea tulpiniţei), precum şi gradul de hiperhidrie sau calusogeneză.

Secţiunile în vederea evidenţierii structurii anatomice a frunzuliţelor şi calusului de sfeclă de zahăr au fost făcute cu ajutorul unui ultramicrotom marca Leica UC6.

Probele prelevate din zona mediană a jumătăţii laterale a limbului foliar şi cele din calus, cu dimensiuni de 0,5 mm au fost prefixate în soluţie de glutaraldehidă 2,7%, şi apoi spălate în tampon fosfat 0,15M pH 7,4. Postfixarea pieselor s-a făcut în soluţie de acid osmic 2% şi apoi au fost spălate în tampon fosfat 0,15M pH 7,4. Piesele deshidratate în acetonă, au fost incluse în Epon 812, polimerizarea făcându-se în etuvă la temperatura de 60°C, timp de 3 zile. Blocurile formate au fost modelate şi apoi secţionate la un ultramicrotom tip Leica UC6, la grosimea de 70 nm. Secţiunile au fost amplasate pe grile electrolitice şi dublu contrastate cu soluţii de acetat de uranil şi citrat de plumb. Secţiunile ultrafine au fost examinate la un microscop electronic de tip Jeol JEM 1010. Imaginile au fost selecţionate şi fotografiate

9  

cu ajutorul unei camere video digitale marca CCD Mega View III, procesate apoi pe calculator şi prelucrate în programul Corel Foto Paint 12

Determinarea cantitativă a pigmenţilor asimilatori (clorofilele „a”, „b” şi pigmenţi carotenoizi) s-a realizat în N,N-dimetilformamidă (DMF), conform metodei descrise de Moran şi Porath (1980);

Prelucrarea statistică a fost realizată fie prin analiza varianţei (Steinbach, 1961) şi prelucrate cu ajutorul programului pentru calculator Microsoft Excel, 2007, fie cu testul t din programul pentru calculator de prelucrare statistică SPSS for Windows, v.16.0.

2.3. REZULTATE ŞI DISCUŢII

2.3.1. Rezultate înregistrate în prevenirea apariţiei hiperhidriei şi a calusogenezei la fitoinoculii de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) Din apexurile vitroplantulelor obţinute în urma germinaţiei pe medii

aseptice a seminţelor drajate de sfeclă de zahăr au fost realizate subculturi, acestea fiind amplasate pe medii de bază Murashige – Skoog (MB-MS), cu sau fără adaos de BA, preparate cu diferite tipuri de ape, respectiv AD, APi sau ASD (cu 25 ppm D), după un protocol descris în tabelul 8. Indicii de creştere ai vitroplantulelor, la 30 de zile de subcultură, sunt prezentaţi în figura 22.

050

100150200250300350400450500

1. Numărrădăciniţe

2. Lungimerădăcinițe

3. Număr totalfrunzuliţe

4. Numărfrunzuliţe verzi

5. Numărfrunzulițe

hiperhidrice

6. Numărfrunzulițenecrozate

7. Număr rozete 8. Lungime limb 9. Lungimepețioluri

10. Lungimetulpinițe

11. Talievitroplantule

Voo

%

V1 V2

 

Fig. 22 Valori procentuale ale indicilor de creştere ai vitroplantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) la 30 de zile de la subcultivarea minibutaşilor uninodali, apicali, pe medii aseptice MB – MS (1962), conform următoarelor variante experimentale: V1 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă Pi; V2 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (25 ppm D), raportate la datele înregistrate la lotul amplasat pe mediu V00 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă distilată, considerate ca fiind 100%.

Înlocuirea AD din compoziţia mediului de cultură cu APi (V1) a condus la

diminuarea procesului calusogenezei, comparativ cu varianta martor (calusul format la baza fitoinoculilor cultivaţi pe medii MB-MS, cu adaos de 2,5 mg/l BA şi

10  

preparate cu apă distilată), la baza tulpiniţelor cultivate pe astfel de medii (chiar în prezenţa a 2,5 m/l BA) fiind prezent un calus de dimensiuni mult mai reduse, de doar 0,2 - 0,3 cm. Pe mediu de cultură preparat cu APi (V1) frunzuliţele vitroplantulelor care veneau în contact cu mediul de cultură au intrat într-un proces de dediferenţiere, neoformându-se calus pe toată suprafaţa lor (Tabelul 11).

Prepararea mediului de cultură cu ASD (V2) a avut un efect inhibitor asupra calusogenezei, fapt care a permis (la 90 de zile de vitrocultură) formarea unui sistem radicular bine dezvoltat, la nivelul primului nod al vitrotulpiniţei (Fig. 23). Tabelul 11 Caracteristicile calusului de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), regenerat

la baza fitoinoculilor, la 30 de zile de la subcultivarea apexurilor caulinare uninodale, pe medii aseptice MB –MS, agarizate, conform următoarelor variante experimentale: V00 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă distilată; V0 – MB - MS lipsit de regulatori de creştere, preparat cu apă distilată; V1 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă Pi; V2 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (25 ppm D).

Variante experimentale V00 V0 V1 V2 Dimensiunile calusului (lungime/lăţime/grosime) (cm) 2,5/2/1 - 0,3/0,2/0,2 -

Culoarea calusului brun - brun - Consistenţa calusului compact - compact -

Fig. 23 Aspecte ale vitroplantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) regenerate

din minibutaşi uninodali, apicali, amplasaţi pe următoarele medii de cultură: V00 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă distilată; V0 – MB - MS lipsit de regulatori de creştere, preparat cu apă distilată; V1 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă Pi; V2 – MB - MS + 2,5 mg/l BA, preparat cu apă sărăcită în deuteriu (25 ppm D), aflate la 30 de zile de la iniţierea subculturii; A – în vitrocultură şi B – scoase din recipientele de vitrocultură (barele semnifică 1 cm).

după 90 zile 

11  

2.3.2. Aspecte structurale şi ultrastructurale observate în frunzuliţele normale şi în cele hiperhidrice, precum şi în calusul hiperhidric de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), comparativ cu probele provenite din frunzuliţelor normale, regenerate pe medii de cultură în care apa distilată a fost înlocuită cu apă Pi sau cu apă sărăcită în deuteriu (25 ppm D)

Studiul efectuat de noi comportă analizarea, din mai multe unghiuri de vedere, a aspectelor de microscopie optică şi de ultrastructură surprinse la nivelul probelor tisulare, prelevate fie din limburile foliare ale vitroplantulelor de sfeclă de zahăr normale sau hiperhidrice, fie din calusurile vitrificate.

În primul rând au fost expune aspectele structurale şi ultrastructurale observate de noi, comparativ, atât la frunzuliţe aparţinând unor plantule de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) normale, ţesuturi prelevate din limbul foliar al frunzuliţelor recoltate din mediul septic de viaţă (Planşele I şi II), cât şi de la vitrofrunzuliţe ale tulpiniţelor de sfeclă de zahăr regenerate din apexurile unor vitroplantule generate în urma germinării pe medii aseptice a seminţelor (Planşele III - V) (vezi sumarul planşelor de microscopie, de mai jos).

Apoi, au fost descrise aspectele identificate în eşantioanele tisulare prelevate din limburile vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr vitrificate, suferinde de o fază de vitrificare mai moderată (Planşele VI şi VII) sau cu un grad mult mai avansat de hiperhidrie (Planşele VIII şi IX), precum şi din calusul regenerat la nivelul bazei tulpiniţelor vitrificat şi el (Planşele X –XIII), de menţionat fiind faptul că, numai plantele vitrificate au generat calus, ceea ce dovedeşte, o dată în plus, că există un dezechilibru hormonal la acest nivel.

O altă variantă de mediu de cultură testată a fost aceea în care apa distilată (AD) a fost înlocuită cu apă Pi (APi), luată ca atare, livrată de firma producătoare şi care, ca şi apa naturală, conţine 150 ppm D (aspectele microscopice ale frunzuliţelor tulpiniţelor provenite de pe astfel de mediu de cultură se regăsesc în Planşele XIV şi XV), la care se adaugă rezultatele obţinute de noi la frunzuliţele tulpiniţelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) regenerate pe medii cu apă sărăcită în deuteriu (ASD), având doar 25 ppm D (XVI – XVIII).

Imaginile de microscopie au fost colaţionate în planşe (I – XVIII) cu scopul vizualizării de ansamblu a aspectelor structurale şi ultrastructurale şi impun o analiză comparativă a acestora, pentru ca, după planşa de ansamblu, să fie etalate fotografiile respective, cu un grad mai mare de mărire a detaliilor, care să permită efectuarea unor examinări de mai mare relevanţă.

12  

SUMARUL PLANŞELOR CARE CUPRINDE IMAGINI DE MICROSCOPIE REALIZATE LA SFECLĂ DE ZAHĂR (BETA VULGARIS VAR. SACCHARIFERA)

- Studii efectuate la 30 de zile de la iniţierea culturilor - Planşa I – Fig. 1 - 4 – Imagini de microscopie optică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul

foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescute în mediul natural de viaţă (martor – „in vivo”);

Planşa II – Fig. 1 - 4 – Imagini de microscopie electronică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescute în mediul natural de viaţă (martor – in vivo);

Planşa III – Fig. 1 - 4 – Imagini de microscopie optică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescute în mediul septic (martor – „in vitro”);

Planşa IV – Fig. 1 - 6 – Imagini de microscopie electronică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescute în mediul septic (martor – „in vitro”);

Planşa V – Fig. 1 - 6 – Imagini de microscopie electronică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescută în mediul septic (martor – „in vitro”);

Planşa VI – Fig. 1 - 5 – Imagini de microscopie optică observate în secţiunile transversale efectuate prin limbul foliar al vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr cu un grad scăzut de hiperhidrie;

Planşa VII – Fig. 1 - 8 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile transversale efectuate prin limbul foliar al vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr cu un grad scăzut de hiperhidrie;

……………………………………………………………………………………………………………...……… Planşa VIII – Fig. 1 - 9 – Imagini de microscopie optică observate în secţiunile transversale efectuate prin

limbul foliar al vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr cu un grad ridicat de hiperhidrie;

Planşa IX – Fig. 1 - 2 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile transversale efectuate prin limbul foliar al vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr cu un grad ridicat de hiperhidrie;

Planşa X – Fig. 1 - 6 – Imagini de microscopie optică observate în secţiunile longitudinale efectuate prin calus hiperhidric;

Planşa XI – Fig. 1 - 6 – Imagini de microscopie optică observate în secţiunile longitudinale efectuate prin calus hiperhidric;

Planşa XII – Fig. 1 - 7 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile longitudinale efectuate prin calus hiperhidric;

Planşa XIII – Fig. 1 - 8 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile longitudinale efectuate prin calus hiperhidric;

Planşa XIV – Fig. 1 - 2 – Imagini de microscopie optică observate în secţiunile transversale efectuate prin vitrofrunzuliţe provenite de la plantule regenerate şi crescute pe mediu preparat cu APi;

Planşa XV – Fig. 1 - 6 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile transversale efectuate prin vitrofrunzuliţe provenite de la plantule regenerate şi crescute pe mediu preparat cu APi;

Planşa XVI – Fig. 1 - 6 – Imagini de microscopie optică observate în secţiunile transversale efectuate prin vitrofrunzuliţe provenite de la plantule regenerate şi crescute pe mediu preparat cu ASD;

Planşa XVII – Fig. 1 - 5 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile transversale efectuate prin vitrofrunzuliţe provenite de la plantule regenerate şi crescute pe mediu preparat cu ASD;

Planşa XVIII – Fig. 1 - 5 – Imagini de microscopie electronică observate în secţiunile transversale efectuate prin vitrofrunzuliţe provenite de la plantule regenerate şi crescute pe mediu preparat cu ASD.

13  

2.3.2.1.Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), normale, cultivate timp de 30 de zile în seră (martor)

Aspectele structurale şi ultrastructurale ale frunzuliţelor plantulelor de

sfeclă de zahăr cultivate în condiţii naturale de viaţă sunt normale (Planşa I şi II).

Planşa I – Fig. 1 – 4, poziţiile a şi b Imagini de microscopie optică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescute în mediul natural de viaţă (martor – „in vivo”) (epi.sup. – epiderma superioară; epi.inf. – epiderma inferioară; m.f. - mezofil foliar; t.p. – ţesut palisadic; t.l. – ţesut lacunos; nv – nervură; st. – stomată; cel.st. – celule stomatice; c.sst. – camera substomatică; mc – maclă de oxalat de calciu; cl – cloroplaste; V – vacuolă) (20X – 100x).

Planşa II – Fig. 1 – 4, poziţiile a şi b Imagini de microscopie electronică surprinse în secţiunile transversale practicate prin limbul foliar al frunzuliţelor de sfeclă de zahăr crescute în mediul natural de viaţă (martor – in vivo)(p.c. – perete celular; L – lacună; sp.i. – spaţiu intercelular; cl – cloroplaste; V – vacuolă; M – mitocondrie; N – nucleu; n – nucleol.

epi.sup

epi.inf.

m.f.

epi.sup

nv m.f.m.f.

epi.supepi.sup

cel.st.

mc

epi.inf. epi.inf.

cl cl

c.sst.

t.p.

t.l.

V V

c.sst.c.sst.

st. st.

cl cl

cl

N

cl

V

V

V

V

V

V V cl n

N

nM

M

Nn

V

p.c.

L

L

N n sp.i.

V

VV

a a a a

b b b b

14  

2.3.2.2.Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), normale, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii lipsite de regulatori de creştere (martor „in vitro”)

A. B. A – microscopie optică (20 X) (epi.sup. – epidemă superioară; st - stomată; c.sst. – cameră substomatică; V – vacuolă; L – lacună; m.f. – mezofil foliar) B – microscopie electronică (epi – epidermă; epi.sup. – epidermă superioară; p.c. – perete celular; N – nucleu; n – nucleol; cl - cloroplaste; Cgl – conglomerate electron dense; L - lacună). 2.3.2.3. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu

transmisie, observate în secțiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), hiperhidrice, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA

A B A – microscopie optică (20 X) (epi.inf. – epidemă inferioară; st - stomată; m.f. – mezofil foliar; L –

lacuna; c.sst. – camera substomatică; cel.st. – celule stomatice; ost - osteolă); B – microscopie electronică (p.c. – perete celular; cl – cloroplaste; cld – cloroplaste dezorganizate).

Limburile foliare suferinde de hiperhidrie prezintă celule cu structură dezorganizată, cu pereţi sinuoşi, spaţii intercelulare largi, număr redus de cloroplaste, unele dintre acestea, ultrastructural, pot fi vizualizate ca fiind într-o stare avansată de dezordonare a granelor şi tilacoidelor.

V

V V

V

V V

V

L

L

L

c.sst. epi.sup.

st

m.f. V

V

V

Cgl Nn

N

cl cl

epi

L

L

c.sst.

VV

cel.st. epi.inf.

ost

m.f.

p.c.cl

cld

p.c.

L

15  

2.3.2.4. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secțiunile longitudinale practicate prin calus de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), cultivat timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA

Calusul de sfeclă de zahăr era alcătuit din celule normale, dar cele mai numeroase erau

celulele dezorganizate, în care tonoplastul lipsea, iar sucul vacuolar s-a amestecat cu citoplasma formând o aşa numită mixoplasmă:

A B Aspecte detaliate de microscopie optică (A – 100X) şi electronică (B) ale celulelor dezorganizate observate în secţiuni longitudinale practicate prin calus hiperhidric de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), regenerat la baza fitoinoculilor, pe mediu de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA, preparat cu apă distilată (sp.i. – spațiu intercelular; mx – mixoplasmă (suc vacuolar + citoplasmă); V - vacuolă; cl – cloroplast; N – nucleu; p.c. – perete celular; L - lacună).

2.3.2.5. şi 2.3.5.6. Aspecte de microscopie optică şi de microscopie electronică cu transmisie, observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), nehiperhidrice, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA, dar tratate cu APi, respectiv cu ASD

La nivel structural şi ultrastructural, atât apa Pi, dar mai ales apa sărăcită în deuteriu, având 25 ppm D, prezentă în mediul de vitrocultură, ca înlocuitoare a apei distilate, au condus la prevenirea instalării aspectelor specifice sindromului hiperhidric, în frunzuliţele de sfeclă de zahăr, deoarece aspectul celulelor limburilor foliare ale vitroplantulelor cultivate pe astfel de medii era normal şi nicidecum ca şi a acelora hiperhidrice.

N

V

sp.i.

mx

cl

cl

cl

p.c

mx L

L

L

mxcl

V

16  

A B Aspecte ultrastructurale observate în secţiunile transversale practicate prin frunzuliţele plantulelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), nehiperhidrice, cultivate timp de 30 de zile „in vitro” pe medii de cultură cu adaos de 2,5 mg/l BA, dar tratate cu APi (A) sau cu ASD (B) (p.c. – perete celular; sp.i. – spaţiu intercelular; cl – cloroplaste; M – mitocondrie; N – nucleu; V – vacuolă; Cgl – conglomerate electron dense; x – xilem; d.l. – depuneri de lignină).  

2.3.3. Conţinutul în pigmenţi asimilatori al vitrofrunzuliţelor de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) normale sau hiperhidrice

Hiperhidria frunzuliţelor vitroplantulelor de sfeclă de zahăr a condus la

diminuarea drastică a cantităţii de pigmenţi asimilatori în aceste organe (Fig. 25), iar prezenţa apei Pi sau a aceleia sărăcite în deuteriu, chiar în prezenţa BA - prin prevenirea apariţiei acestui neoplasm - a condus la o acumulare mai ridicată de pigmenţi asimilatori în frunzuliţele plantulelor cultivate în acest regim, diferenţele negative, între cantităţile de clorofilă a sau b şi carotenoizi, înregistrate în aceste frunzuliţe, faţă de cele semnalate la lotul martor, au fost nesemnificative din punct de vedere statistic.

Vo

0

20

40

60

80

100

AD APi ASD

%

clorofilă „a”

clorofila „b”

carotenoizi

total pigmenți

 Fig. 25 Valorile procentuale ale pigmenţilor asimilatori prezenţi în frunzuliţele vitroplantulelor de

sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera, la 30 de zile de la cultivarea pe medii MB – MS (1962), cu adaos de 2,5 mg/ BA şi preparate cu următoarele tipuri de ape: apă distilată (AD) ori cu apă Pi (APi), sau cu apă sărăcită în deuteriu (ASD), raportate la cele înregistrate în frunzuliţele vitroplantulelor martor, nehiperhidrice, cultivate pe mediu MB – MS, lipsit de regulatori de creştere, a căror date au fost considerate de referinţă, respectiv 100% .

N

N

N

N N

V

V

VL

V

V

x

d.l.

cl

M

cl Cgl

N

N

sp.i.

17  

2.4. CONCLUZII 1. Sfecla de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera) este una din plantele de

mare interes economic, pentru producţia de zahăr, necesară atât pentru industria alimentară, cât şi pentru obţinerea de etanol şi care în ameliorare este clonată prin proceduri de micropropagare. În astfel de practici, apariţia hiperhidriei la nivelul vitroculturilor este destul de frecventă, ceea ce scade randamentul în producerea de plante pentru câmpul de ameliorare, indispensabile în selectarea de genotipuri rezistente la rizomanie şi în clonarea acestora. În cazul nostru, la sfecla de zahăr hiperhidria a fost provocată de citochinina benziladenină, introdusă în mediul de cultură – în concentraţie de 2,5 mg/l - tocmai pentru a spori rata de multiplicare la varietăţile omologate ca fiind rezistente la rizomanie.

2. În urma cercetărilor efectuate în cadrul prezentei teze de doctorat, comparativ cu parametrul respectiv înregistrat la lotul martor (fitoinoculi cultivaţi pe medii preparate cu apă distilată), indicii de creştere ai vitroplantulelor provenite din apexuri caulinare, uninodale, de sfeclă de zahăr, cultivate pe medii de cultură Murashige – Skoog (1962), cu adaos de BA 2,5 mg/l, în care apa distilată, utilizată ca solvent al tuturor componentelor hidrosolubile încorporate în mediul de vitrocultură, a fost înlocuită cu apă Pi sau cu apă sărăcită în deuteriu (având 25 ppm D), au fost semnalate stimulări ale alungirii taliei tulpiniţelor neoformate la nivelul fitoinoculilor amplasaţi atât pe medii cu apă Pi (ca atare), cât şi pe cele preparate cu apă sărăcită în deuteriu, cu 25 ppm D, în timp ce procesul de rizogeneză a fost absent în primul caz menţionat şi a fost prezent doar la baza tulpiniţelor lotului crescut pe mediu cu apă sărăcită în deuteriu, cu D în concentraţie de 25 ppm. În schimb, prezenţa acestor ape a prevenit apariţia hiperhidriei, dar şi a formării de calus, la nivelul vitroculturilor.

3. Macroscopic, la nivelul fitoinoculilor de sfeclă de zahăr trataţi cu apă Pi sau cu apă sărăcită în deuteriu, nu s-au evidenţiat aspecte morfologice caracteristice fenomenului de hiperhidrie, fapt demonstrat şi la nivel structural şi ultrastructural. Aşadar, putem afirma, cu certitudine, că înlocuirea apei distilate din mediile de cultură utilizate în vitroculturile de sfeclă de zahăr este o modalitate relativ ieftină, şi la îndemâna biotehnologilor, de prevenire a acestui sindrom metabolic, ceea ce poate a beneficii economice în industriile de micropropagare, axate pe micropropagare la sfeclă de zahăr şi poate şi a altor specii multiplicate „in vitro”.

4. Aspectele de microscopie optică şi electronică cu transmisie surprinse în secţiunile transversale efectuate prin limburile foliare ale frunzuliţelor hiperhidrice de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), provenite de pe medii de cultură MB – MS, cu adaos de 2,5 mg/l benziladenină şi preparate cu apă distilată, au semnalat o stare de dezorganizare celulară mai mult sau mai puţin intensă, manifestată printr-o distribuire haotică a celulelor mezofilului foliar, fără diferenţierea acestuia în parenchim palisadic şi în parenchim lacunos, cu o structură laxă, cu lacune mari, care comunică cu osteolele larg deschise, cu pereţi celulari sinuoşi, cu cantităţi reduse de cloroplaste, cu nuclei aplatizaţi, vacuole foarte mari şi chiar cu colapsarea conţinutului celular, comparativ cu martorul, a căror

18  

frunzuliţe care au aparţinut vitroplantulelor cultivate pe un mediu de cultură similar, dar lipsit de regulatori de creştere au prezentat o structură normală.

5. Rezultatele de microscopie, atât optică, dar mai ales electronică, confirmă efectele pozitive observate macroscopic şi fiziologic exercitate de apa Pi şi apa sărăcită în deuteriu (cu 25 ppm D) în prevenirea hiperhidrie la fitoinoculii de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), deoarece la aceste probe, prelevate de la frunzuliţe provenite de pe medii MB – MS, cu adaos de 2,5 mg/l benziladenina şi preparate cu unul dintre cele două tipuri de ape menţionate, nu au fost evidenţiate aspecte de dezorganizare şi disfuncţionalitate celulară, distingându-se celule cu conţinut viu, cu tipologii structurale cu un mare grad de normalitate, în special în imaginile secţiunilor provenite de la limburile foliare ale fitoinoculilor trataţi cu apă sărăcită în deuteriu (cu 25 ppm D).

6. În cadrul experimentelor care au făcut obiectul prezentei teze de doctorat am obţinut doar calus hiperhidric de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), el regenerându-se, la baza fitoinoculilor, pe mediul de cultură cu adaos de 2,5 mg/l benziladenină şi preparat cu apă distilată. De remarcat a fost faptul că, mediile de cultură, cu adaos de 2,5 mg/l benziladenină, dar preparate cu apă Pi sau cu apă sărăcită în deuteriu, a inhibat formarea de calus.

7. Cantitatea de pigmenţi asimilatori a fost semnificativ diminuată în frunzuliţele hiperhidrice, crescute pe medii cu benziladenina, comparativ cu frunzuliţele lotului martor, provenite de pe medii lipsite de regulatori de creştere, iar în cazul frunzuliţelor vitrocultivate pe medii în care apa distilată a fost înlocuită cu apă Pi sau apă sărăcită în deuteriu, cu 25 ppm D, clorofila a, b şi carotenoizii au semnalat valori cantitative asemănătoare martorului, acest fapt fiind o dovadă în plus – alături de aspectele morfo-fiziologice, structurale şi ultrastructurale - al eficienţei celor două tipuri de ape în anihilarea fenomenului de hiperhidrie la vitroplantulele de sfecla de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera).

8. Putem afirma astfel cu certitudine că, înlocuirea apei distilate din mediile de cultură a sfeclei de zahăr (Beta vulgaris var. Saccharifera), fie cu apă Pi, dar mai ales cu apă sărăcită în deuteriu (cu 25 ppm D) este o metodă deosebit de eficientă în prevenirea apariţiei fenomenului de hiperhidrie în aceste vitroculturi.

Contribuţii Teza aduce noutăţi în domeniul culturilor de celule şi ţesuturi vegetala, de o

deosebită importanţa, atât din punctul de vedere a cercetării fundamentale, prin cercetările de ultrastructură a vitrofrunzuliţelor normale sau hiperhidrice şi a vitrocalusului suferind de hiperhidrie, precum şi în ceea ce priveşte cantitatea de pigmenţi asimilatori în vitrofrunzuliţele hiperhidrice, comparativ cu cele normale, cât şi a aceleia aplicative, prin identificarea unor metode de prevenire a neoplaziei menţionate anterior, la nivelul vitroculturilor de sfeclă de zahăr, prin introducerea apei Pi sau a apei sărăcite în deuteriu (cu 25 ppm D), în compoziţia mediului de vitrocultură, ca înlocuitoare a apei distilate.

Rezultatele acestor cercetări originale care fac obiectul prezentei teze de doctorat sunt reprezentative în domeniul culturilor vegetale „in vitro”, deoarece ne demonstrează cu certitudine că acest fenomen nedorit, care apare la multe dintre

19  

specii (cum este şi sfecla de zahăr, specie de importanţă deosebită pentru agricultură), în condiţii de asepsie, producând pagube însemnate producătorilor, şi anume hiperhidria, poate fi înlăturată, prin metode relativ simple şi puţin costisitoare.

Capitolul 3 Bibliografia Au fost studiate - în vederea elaborării prezentei teze de doctorat - 301 de

titluri bibliografice, de ultimă oră în domeniul studiat, dintre care amintim: 1. Berdea, P., Cuna, S., Cuna, C., Balas, G., 2007, Preliminary study of

deuterium depleted water effect on the live cells by isotopic ratio mass spectrometry. Studia Universitatis Babeş-Bolyai, Geologia, 52 (1), 6.

2. Cachiţă C.D., Ardelean A., 2004, Hiperhidria la vitroculturile de cormofite - o boală fiziologică, neoplasică. În: Fiziopatologia celulei vegetale în regim de vitrocultură. Ed. Daya Satu Mare, p. 30 - 42.

3. Cachiţă C.D., Crăciun C., 1982, Ultrastructure of Forsythia suspensa callus cells obtained fron young shoot culture, Proc. 5th International Congres Plant Tissue and Cell Culture, Tokyo, p. 47 - 48.

4. Cachiţă C.D., Crăciun, C., 1990, Ultrastructural Studies on Some Ornamentals. În: Handbook of Plant Cell Culture. Vol. V, Evans, D. A. (ed.), McGraw-Hill Publ.Co., S.U.A, p. 57 - 94.

5. Cachiţă C.D., Crăciun C., 1997, Ultrastructural studie son some ornamentals, Eds. Ammirato P.V., Evans D.R., Sharp W.R., Bajaj Y.P.S., McGraw-Hill Publishing Company, Handbook of Plant Cell Culture Ornamental Species, Vol. 5, p. 57-94.

6. Cachiţă, C.D., Crăciun, C., Pamfil, D., 1986, Vitrification and Stress in Carnation Plantlets Transferred from „vitro” on Septic Medium the Presence of 2 – Chloroethiylphosforic Acid; Ultrastructural Aspects. În: 6 Internat. Congr. Of Plant Tissue and Cell Culture, Minneapolis, Minnesota, aug (rezumat).

7. Cachiţă, C.D., Petruş C.M., Vancea, A., Ardelean,A., Morariu, V., Ştefănescu, I., 2002, Efectul apei cu un conţinut scăzut în deuteriu asupra germinaţiei la grâu, porumb şi ridichi. În: „Water, Environment and Health”, EASA Conference, Arad, p 83 – 86.

8. Corneanu, M., Corneanu, G.C., Cristea, C., Bercu, R., Roşca, A., Ştefănescu, I., 2005, The effects of the deuterium-depleted water on in vitro organogenesis processes in Robinia pseudoacacia var. Oltenica. Revue de Cytologie et Biologie Végétales-Le Botaniste, 28, p. 236 – 245.

9. Gaspar, Th., Kevers, C., Penel, C., Crevecoeur, M., Greppin, H., 1988, Biochemical characterization of normal and habituaded sugarbeet calli. Relationship with anatomy, habituation and organogenesis. Postdamer Forschungen, nr. B 57, p. 20 - 30.

10. Gaspar, Th., Kevers, C., Debergh, P.C., Maene, L., Paqpes, M., Boxus, P., 1987, Vitrification: Morphological, physiological, and ecological aspects. In: Cell and tissue culture in forestry, Vol. 1, General principles and

20  

biotechnology. Bonga, J.M., Durzan, D.L (eds.), Dordrecht Martinus Nijhoff Publ., p. 152 - 166.

11. George, E., 1993, Plant propagation by tissue culture. Ed. Exegetics. Part 1. 574 p.

12. Häsler, J., Gaspar, Th., Crèvecoeur, M., 2003, Long term in vitro-cultured plant cells show typical neoplastic features at the cytological level. Biol Cell., 95 (6), p. 357 – 364.

13. Ivanova, M., Novak, O., Strnad, M., Van Staden, J., 2006, Endogenous cytokinins in shoots of Aloe polyphylla cultured in vitro in relation to hyperhydricity, exogenous cytokinins and gelling agents. Plant Growth Regul, 50, p. 219 – 230.

14. Petruş - Vancea, A., Radoveţ – Salinschi, D., Cachiţă, C.D., 2008, Hyperhydricity annihilation from vitrocultures with deuterium depleted water and Pi water, by double layer system, Internaţional Symposium „New Research in Biotechnology”, Bucureşti (sub tipar).

15. Radoveţ-Salinschi, D., Cachiţă, C.D., 2005 a, Influenţa apei sărăcite în deuteriu (87,5 ppm deuteriu) asupra vitroculturilor hiperhidrice de Coleus hybridus Ethna var. Ethna. În: Lucrările celui de al XIV-lea Simpozion Naţional de Culturi de Ţesuturi şi Celule Vegetale, intitulat „Conservarea Vitroculturilor Vegetale”. Cachiţă, C.D., Sand, C. (eds.), Editura Alma Mater, Sibiu, p. 158 - 173.

16. Sand C., Cachiţă C.D., 2000, Influenţa mediului de cultură asupra regenerării de plante din calus de sfeclă de zahăr (Beta vulgaris L var. Sacharifera). În: Lucrările celui de al IX-lea Simpoyion Naţional de Biotehnologie Vegetală. Editura Universităţii “Ovidius” din Constanţa, Cachiţă, C.D., Ardelean, A. (eds.), p. 151-158.

17. Somlyai, G., 2001, Să învingem cancerul! Efectele biologice ale reducerii de deuteriu. Editura Conphys, Râmnicu Vâlcea.

18. Ştefănescu, I., Tamaian, R., Titescu, G., 2004, Deuterium depleted water. Short history and news. Progress in Cryogenics and Isotopes Separation, nr. 13+14, Ed. Conphys, Rm. Vâlcea, pag. 7 - 10.

19. Ziv, M., 1991, Vitrification: Morphological and physiological disorders of in vitro plants. In: Micropropagation technology and application. Deberg, P.C., Zimmerman, R.H. (eds.), Academic Publishers, Netherlands, p. 45 - 70.

20. Wang, Y-L., Wang, X-D., Zhao, B.,Wang, Y-D., 2007, Reduction of hyperhydricity in the culture of Lepidium meyenii shoots by the addition of rare earth elements. Plant Growth Regulation, 52, No. 2, p. 151 - 159.

Capitolul 4 conţine o listă cu 8 articole publicate de subsemnatul, care conţin cercetări cu referire la tema tezei de doctorat. O parte dintre aceste cercetări au fost publicate fie în reviste cotate BDI, fie în Volumele Lucrărilor Simpozionului de Culturi de Ţesuturi şi Celule Vegetale, ori în Analele Simpozionului de Biologie Celulară, iar o altă categorie de cercetări sunt prezentate în premieră în prezenta teză de doctorat, urmând a face obiectul unor comunicări ştiinţifice viitoare şi publicate.