Cellulase Frm N.crassa

8/6/2019 Cellulase Frm N.crassa

http://slidepdf.com/reader/full/cellulase-frm-ncrassa 1/6

J O U R N A L OF B A C T E R I O L O G Y , A p r . 1 9 7 7 , p . 1 8 1 - 1 8 6

C o p y r i g h t 0 1 9 7 7 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

V o l . 1 3 0 , N o . 1P r i n t e d i n U . S . A .

C e l l u l a s e o f N e u r o s p o r a c r a s s a

BRUCE M . EBERHART,* RETA S . BECK, A N D KATHY M . GOOLSBY

B i o l o g y D e p a r t m e n t , U n i v e r s i t y o f N o r t h C a r o l i n a a t G r ee n s b o r o , G r e e n s b o r o , N o r t h C a r o l i n a 2 7 4 1 2

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 7 S e p t e m b e r 1 9 7 6

M y c e l i a a n d u n g e r m i n a t e d c o n i d i a o f N e u r o s p o r a c r a s s a w e r e f o u n d t o s e c r e t ee x t r a c e l l u l a r e n d o c e l l u l a s e ( E C 3 . 2 . 1 . 4 ) . A s i m p l e i n d u c t i o n s y s t e m o f p o t a s s i u mp h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 0 ) p l u s i n d u c e r r e l i e d o n t h e i n t e r n a l m e t a b o l i c r e s e r v e s

o f c o n i d i a o r m y c e l i a t o p r o v i d e e n e r g y a n d s u b s t r a t e s f o r p r o t e i n s y n t h e s i s .B u f f e r c o n c e n t r a t i o n f o r o p t i m u m e n z y m e p r o d u c t i o n w a s 1 0 0 mM, b u t a t h i g h e r

b u f f e r c o n c e n t r a t i o n s e n z y m e p r o d u c t i o n w a s i n h i b i t e d . C e l l o b i o s e w a s c l e a r l yt h e b e s t i n d u c e r , w i t h a n o p t i m u m e f f e c t f r o m 0 . 0 5 t o 1 mM. I n d e i o n i ze d w a t e r ,

c e l l u l a s e r e m a i n e d m o s t l y a s s o c i a t e d w i t h t h e c e l l , b u t a v a r i e t y o f s a l t s s t i m u -

l a t e dt h e r e l e a s e

o f c e l l u l a s e i n t ot h e

m e d i u m .

T h e s t u d y o f c e l l u l o s e d e c o m p o s i t i o n i s w e l l

d o c u m e n t e d i n a number o f o r g a n i s m s ( 9 , 1 7 ,1 9 ) . T h i s m e t a b o l i c p a t h w a y i s a p p r o p r i a t e l y

s t u d i e d i n N e u r o s p o r a c r a s s a b e c a u s e o f t h e

a d v a n t a g e o f d o i n g b o t h b i o c h e m i c a l a n d g e -n e t i c c e l l u l a s e s t u d i e s i n t h e s a m e s y s t e m ( 1 5 ) .E a r l i e r r e p o r t s h a v e d e s c r i b e d ( i ) t h e p r e s e n c eo f c e l l u l a s e a n d t w o 8 - g l u c o s i d a s e s ( 4 ) a n d ( i i )

t h e l o c a t i o n o f 8 - g l u c o s i d a s e a c t i v i t y , b o t hw i t h i n t h e c e l l s a n d o n t h e s u r f a c e o f N e u r o -s p o r a ( 3 ) . T h i s r e p o r t d e s c r i b es t h e p r o d u c t i o n

o f a n e x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e a n d c o n d i t i o n s t h a tf o s t e r t h e r e l e a s e o f t h i s e n z y m e i n t o t h e e x t e r -n a l m e d i a .

MATERIALS AND METHODS

C h e m i c a l s . C e l l o b i o s e , p - n i t r o p h e n y l - , 8 - n - g l y c o -p y r a n o s i d e , a n d a l l o t h er i nd u ce r s a n d v i t a m i n sw e r e f r o m C a l b i o c h e m , L o s A n g e l e s , C a l i f . ; c o p p e r

s u l f a t e , m e r c u r i c c h l o r i d e , l e a d a c e t a t e , a n d s i l v e rn i t r a t e w e r e f r o m M a l l i n c k r o d t C h e m i c a l W o r k s ,S t . L o u i s , M o . ; c a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e 4MSP wasf r o m H e r c u l e s P o w e r C o . , W i l m i n g t o n , D e l .

S t r a i n sa n d m e d i a . S t r a i n s w e r e m a i n t a i n e d o n

g l y c e r o l - s u c r o s e c o m p l e t e ( G S C ) medium i n t u b e s

( 5 ) . C o n i d i a w e r e p r o d u c e d i n 2 - l i t e r w i d e - m o u t hf l a s k s c o n t a i n i n g 3 0 0 m l o f GSC m e d i u m . V o g e lm i n i m a l medium was u s e d t h r o u g h o u t ( 3 2 ) . W i l d -

t y p e N e u r o s p o r a s t r a i n s w e r e 7 4 - O R 8 - l a a n d E m e r -s o n 6 9 2 a , b o t h f r o m t h e F u n g a l G e n e t i c s S t o c k C e n -t e r , A r c a t a , C a l i f . S t r a i n s 3 3 ( 2 - 6 ) , g l u c - 2 ( 3 ) , a n d6 2 ( 2 - 9 ) w e r e s e l e c t e d i n o u r l a b o r a t o r y f o r l o w a r y l -, 8 - g l u c o s i d a s e a c t i v i t y a n d e x c e l l e n t g r o w t h q u a l i -t i e s . E x o t i c s t r a i n s l i s t e d i n T a b l e 1 w e r e a g i f t f r o mD a v i d P e r k i n s , S t a n f o r d U n i v e r s i t y , a n d t h e F u n g a lG e n et i cs S t o c k C e n t e r .

I n d u c t i o n i n p r e g e r m i n a t i v e c o n i d i a a n d m y c e -

l i a . C o ni d i a w e r e h a r v e s t e d i n s t e r i l e w a t e r , w a s h e dt w i c e b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d r e s u s p e n d e d i n 2 v o l -umes o f s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r . M y c e l i a l f r a g m e n t sw e r e r e m o v e d b y f i l t r a t i o n t h r o u g h c h e e s e c l o t h . T h ec o n i d i a w e r e s u s p e n d e d i n 0 . 1 N H C l f o r 5 mi n t o

i n a c t i v a t e e x t e r n a l p - g l u c o s i d a s e s t h a t i n t e r f e r ew i t h i n d u c t i o n a n d w e r e t h e n w a s h e d a g a i n w i t h 1v o l u m e o f d i s t i l l e d w a t e r . T h e s e c e l l s w e r e i m m e d i -a t e l y i n o c u l a t e d i n t o 0 . 1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f f e r , pH 7 . 0 , w i t h a f i n a l o p t i c a l d e n s i t y o f 0 . 1 5 0 t o0 . 2 5 0 a t 6 0 0 n m , l i g h t p a t h o f 1 . 0 c m . I n d u c t i o n

medium r o u t i n e l y c o n t a i n e d 1 . 0 mM c e l l o b i o s e . C u l -

t u r e s w e r e s h a k e n i n 1 2 5 - m l E r l e n m e y e r f l a s k s a t

2 5 ° C . T o d e t e r m i n e t h e r e l e a s e o f e x t r a c e l l u l a r c e l -l u l a s e , s a m p l e s w e r e t a k e n a n d c e n t r i f u g e d , a n d t h e

s u p e r n a t a n t w a s a s s a y e d . R e m a i n i n g c e l l s w e r e f r o -z e n f o r a s s a y a t a l a t e r t i m e .

M y c e l i a w e r e i n d u c e d i n a manner s i m i l a r t o t h a tu s e d f o r c o n i d i a . T o p r o d u c e m y c e l i a , c o n i d i a w e r e

i n o c u l a t e d i n t o 5 0 m l o f V o g e l medium i n 2 5 0 - m l

E r l e n m e y e r f l a s k s w i t h 2% s u c r o s e , 1% v i t a m i n

s t o c k s o l u t i o n , 1 0 0 mg o f t h i a m i n e , 3 0 mg o f r i b o -f l a v i n , 7 5 mg o f p y r i d o x a l , 2 0 0 mg o f c a l c i u m p a n t o -

t h e n a t e , 5 mg o f p - a m i n o b e n z o i c a c i d , 7 5 mg o f n i c o -t i n a m i d e , 2 0 0 mg o f c h o l i n e h y d r o c h l o r i d e , 1 mg o ff o l i c a c i d , a n d 6 0 mg o f i n o s i t o l , a n d t h e n s h a k e n i na Ne w B r u n s w i c k r e c i p r o c a l s h a k e r a t 8 0 rpm a t

2 5 ° C f o r 4 0 h . T h e g r o w t h medium was d e c a n t e d ,

a n d t h e m y c e l i u m was w a s h e d i n t o t w o b a t c h e s o fs t e r i l e , d i s t i l l e d w a t e r . I n d u c t i o n w as s t a r t e d i m m e -

d i a t e l y b y t h e a d d i t i o n o f t h e p a d s t o4 0 ml

o f 0 . 1 Mp h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 0 , a n d a f i n a l c o n c e n t r a t i o n

o f 1 . 0 mM c e l l o b i o s e . D e i o n i z e d w a t e r w i t h i n d u c e r

w a s s u b s t i t u t e d f o r b u f f e r e d m e d i a i n e x p e r i m e n t sd e s i g n a t e d t o s h o w r e t e n t i o n a n d s u b s e q u e n tr e l e a s e o f c e l l u l a s e r e s u l t i n g f r o m t h e a d d i t i o n o fs p e c i f i c s a l t s t o t h e m e d i u m . T h e i n d u c t i o n m i x t u r e

was i n c u b a t e d a t 2 5 ° C o n a r e c i p r o c a l s h a k e r f o r 6 h .A t h a r v e s t , t h e e n t i r e medium was p o u r e d t h r o u g hc h e e s e c l o t h t o s e p a r a t e m y c e l i u m . Th e c l e a r f i l t r a t ewas f r o z e n f o r f u t u r e a s s a y . T h e m y c e l i u m w a s

p r e s s e d o n f i l t e r p a p e r a n d f r o z e n f o r f u t u r e d r y -w e i g h t d e t e r m i n a t i o n .

C e l l u l a s e a s s a y . T h r o u g h o u t t h i s w o r k w e h a v e

c o n f i n e d o u r a t t e n t i o n t o t h e c e l l u l a s e a c t i v i t y t h a tc l e a v e s t h e c e l l u l o s e m o l e c u l e i n t e r n a l l y ( 5 ) . T h em o s t d e f i n i t i v e wa y t o d e t e c t t h i s a c t i v i t y i s t o meas-

u r e t h e d e c l i n e i n v i s c o s i t y o f a s o l u b l e c a r b o x y -m e t h y l - c e l l u l o s e p r e p a r a t i o n c a u s e d b y i n t e r n a l e n -

1 8 1



1 8 2 EBERHART, BECK, AND GOOLSBY

T A B L E 1 . R e l a t i v e e n z y m e a c t i v i t i e s i n s t a n d a r d a n de x o t i c N e u r o s p o r a s t r a i n s a

Enzyme a c t i v i t y c

S t r a i n o r i g i n a n ds t o c k n o . b C e l l o A r y l - u o - C e l l u -

b i a s e d a s e e l a s e '

P u e r t o , R i c o , 4 2 9 1 9 0 8 1 0 1 , 3 6 5N o r t h A f r i c a , 4 3 0 3 3 8 1 , 2 7 2 2 6 6

J a v a , 4 3 1 1 , 1 9 0 1 , 4 0 0 2 0 7

F i j i , 4 3 2 1 1 6 1 , 1 6 9 3 2 0

P h i l i p p i n e s , 4 3 3 1 , 1 9 0 1 , 4 0 0 7 8 6

L i b e r i a , 4 3 4 2 7 7 1 , 0 4 3 4 6

F i j i , 4 3 5 3 4 8 1 , 1 0 2 2 2 2

S i n g a p o r e , 4 3 6 1 , 1 3 3 1 , 2 2 7 2Ne w Z e a l a n d , 6 4 3 1 , 7 5 1 1 , 0 2 9 6 9 3

C o s t a R i c a , 8 5 1 2 5 5 1 , 5 7 0 1 , 9 4 5C o s t a R i c a , 8 5 2 3 6 1 1 , 2 7 9 5 7 5

L i b e r i a , 9 6 1 1 7 7 9 2 8 5 9 2

L i b e r i a , 9 6 7 2 1 7 8 6 8 2 7 3U . S . A . 9 8 8 7 8 5 7 2 5 1 , 6 9 5U . S . A . 2 6 2 1 , 8 2 0 1 , 6 8 0 2 , 6 7 2

a P r e g e r m i n a t i v e c o n i d i a w e r e i n d u c e d f o r 6 h

u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s w i t h 0 . 1 M p h o s p h a t e

b u f f e r a n d 1 mM c e l l o b i o s e ( s e e t e x t ) . f 3 - G l u c o s i d a s ea s s a y s w e r e d o n e o n w h o l e c e l l s w i t h p h e n e t h y l

a l c o h o l t o a l t e r p e r m e a b i l i t y .b F u n g a l G e n e t i c s S t o c k C e n t e r n u m b e r .

e E x p r e s s e d a s c h a n g e i n o p t i c a l d e n s i t y p e r m i n -

u t e a t a 4 1 0 mM c o n c e n t r a t i o n p e r 1 o p t i c a l d e n s i t yu n i t o f c e l l s .

d D e f i n e d a s t h e r m o l a b i l e f 8 - g l u c o s i d a s e a t 6 0 ° C

f o r 1 m i n .e 3 - G l u c o s i d a s e s t a b l e a t 6 0 ° C f o r 1 m i n .

' C e l l u l o s e a s s a y was o f e x t r a c e l l u l a r e n z y m e u s -

i n g s t a n d a r d p r o c e d u r e i n t e x t .

z y m a t i c c l ea v a g e o f t h e f 3 - g l u c o s i d i c b o n d s . C e l l u -

l a s e a s s a y m i x t u r e c o n t a i n ed 2 . 5 m l o f 1% s o d i u m

c a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e i n p o t a s s i u m p h o s p h a t eb u f f e r , 0 . 1 M , a t pH 5 . 0 , w h i c h was p r e p a r e d r o u -

t i n e l y b y m i x i n g f o r 1 mi n i n a W a r i n g b l e n d e r . A l s o

a d d e d w e r e 1 . 0 m l o f e n z y m e s o l u t i o n a t pH 7 . 0 a n d1 . 5 m l o f 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r a t pH 6 . 0 . T h e f i n a lr e a c t i o n m i x t u r e h a d a t o t a l v o l u m e o f 5 . 0 m l a n d a

f i n a l pH o f 6 . 0 . T h e a b o v e c o m p o n e n t s w e r e m i x e dg e n t l y a n d i n c u b a t e d a t 4 0 ° C f o r 2 0 m i n , a n d t h e n

t h e f l o w r a t e was m e a s u r e d i n a n O s t w a l d V i s c o s i m -e t e r t u b e . C a l c u l a t i o n o f u n i t s h a s b e e n r e p o r t e d

e a r l i e r ( 5 ) .

RESULTS

A t y p i c a l e x p e r i m e n t t h a t d e m o n s t r a t e s t h e

r e l e a s e o f c e l l u l a s e f r o m N e u r o s p o r a m y c e l i a i ss h o w n i n F i g . 1 . T h e c e l l s w e r e g r o w n f o r 4 0 hi n V o g e l medium ( 2 7 ) . E q u a l p o r t i o n s o f c e l l sw e r e w a s h e d w i t h d e i o n i z e d w a t e r a n d s u s -p e n d e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 0 , w i t h

1 . 0 mM c e l l o b i o s e a s i n d u c e r . C e l l s w e r e s e p a -r a t e d b y f i l t r a t i o n t h r o u g h Whatman n o . 1 f i l -

t e r p a p e r , a n d t h e f i l t r a t e w a s a s s a y e d f o r c e l l u -l a s e a c t i v i t y ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . C e l l s

J . B A C T E R I O L .

i n c u b a t e d w i t h p h o s p h a t e b u f f e r r e l e a s e dh i g h e r l e v e l s o f e x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e i n t h e

m e d i u m . T h i s p o s i t i v e r e s p o n s e i n p h o s p h a t em e d i a w a s t y p i c a l b o t h o f 4 0 - h m y c e l i a a n d o fp o s t g e r m i n a t i v e c o n i d i a i n o t h e r e x p e r i m e n t s .

T h e e x p e r i m e n t r a i s e d t h e q u e s t i o n o f t h e p o s s i -b l e r o l e o f p h o s p h a t e b u f f e r i n s t i m u l a t i n g i n -t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e p r o d u c t i o n , a s o p p o s e d t of a c i l i t a t i o n o f r e l e a s e o f c e l l u l a s e i n t o t h e m e -

d i u m .T h e e f f e c t o f p h o s p h a t e b u f f e r o n p r o d u c t i o n

o f i n t e r n a l c e l l u l a s e , a s w e l l a s e x t r a c e l l u l a rc e l l u l a s e , i s s h o w n i n F i g . 2 . C o n i d i a w e r e i n -d u c e d w i t h 1 . 0 mM c e l l o b i o s e a t c o n c e n t r a t i o n s

o f p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 0 , f r o m 0 t o 5 0 0 mM.A f t e r 6 h o f i n c u b a t i o n i n t h e s a m e m e d i u m ,

c e l l s w e r e e x t r a c t e d ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h -

o d s ) a n d t h e t o t a l e x t r a c t a b l e c e l l u l a s e was

c o m p a r e d w i t h e x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e i n t h e

m e d i u m . T o t a l c e l l u l a s e i n t h e c u l t u r e c o u l d b e

c a l c u l a t e d b y a d d i n g t h e s e t w o v a l u e s , s i n c eo n l y a t r a c e o f t h e c e l l u l a s e a c t i v i t y r e m a i n e di n t h e c e l l d e b r i s . I n t e r n a l c e l l u l a s e w a s h i g h -

e s t a t 1 0 0 mM b u f f e r , w i t h a d e c l i n e i n e x t e r n a la n d t o t a l a c t i v i t y a t 5 0 0 mM b u f f e r . T h i s e x p e r -

i m e n t s h o w s t h a t t h e r e i s a b u f f e r c o n c e n t r a -

3

§ 2

O-I

2

o

.

U /

!

0

U

1 2 3 4 5 6

T I M E ( H O U R S )

F I G . 1 . P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e . M y -c e l i a were grown f o r 4 0 h , w a s h e d i n w a t e r , ands u s p e n d e d i n 0 . 1 Mphosphate b u f f e r , pH 7 . 0 ( u n b r o -

k e n l i n e s ) , o r i n water ( b r o k e n l i n e s ) , e a c h c o n t a i n -

i n g 1 mM c e l l o b i o s e . S y m b o l s : ( U ) S t r a i n 6 2 ( 2 - 2 ) ;

( 0 ) s t r a i n 6 9 2 a . R e l e a s e d enzyme was a s s a y e d a s

d e s c r i b e d i n t h e t e x t .

S

, l 0

E.,

I. ,- 0

E,c -M . - ,

/

I 1



CELLULASE OF N . CRASSA 1 8 3

O 0 . 4 -

I

N

0 . 2 A

A

C.II

1 1 0 1 0 0 S o o

S U F F E R (mM)

F I G . 2 . C e l l u l a s e p r o d u c t i o n f r o m p o s t g e r m i n a -t i v e c o n i d i a r e l a t e d t o b u f f e r c o n c e n t r a t i o n . P o t a s -s i u m p h o s p h a t e b u f f e r w a s a t p H 6 . 0 w i t h s t r a i n 7 4 -O R 8 - l a . S y m b o l s : ( A ) C e l l u l a s e e x t r a c t e d f r o m c e l l s ;( 0 ) c e l l u l a s e i n m e d i u m .

t i o n o p t i m u m f o r t o t a l c e l l u l a s e p r o d u c t i o n t h a td i f f e r s f r o m t h e o p t i m u m o f c e l l u l a s e r e t e n t i o ni n t h e c e l l .

R e l e a s e o f c e l l u l a s e b y b u f f e r a f t e r i n d u c t i o ni n w a t e r medium i s s h o w n i n F i g . 3 . M y c e l i aw e r e g r o w n f o r 4 0 h i n minimum medium w i t hs u c r o s e . E a c h 1 2 5 - m l f l a s k c o n t a i n e d 5 0 m l o fm e d i u m , a n d t h e m y c e l i a c o n t e n t s w e r e c l o s e l ye q u i v a l e n t i n w e t w e i g h t . M y c e l i a l p a d s w e r ew a s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d p l a c e d i n

f l a s k s c o n t a i n i n g w a t e r a n d 1 . 0 mM c e l l o b i o s e .

A s t h e i n d u c t i o n p r o c e e d e d , p o t a s s i u m p h o s -p h a t e b u f f e r w a s a d d e d t o s e l e c t e d f l a s k s a t 2 -o r 4 - h i n t e r v a l s t o b r i n g t h e m o l a r i t y t o 0 . 1 M .S a m p l e s o f m e d i u m w e r e a n a l y z e d f o r c e l l u l a s ea c t i v i t y . C e l l u l a s e was r e l e a s e d more r e a d i l ya f t e r a d d i t i o n o f b u f f e r , e s t a b l i s h i n g l e v e l s i n 3 0

mi n t h a t w e r e c o m p a r a b l e t o c e l l u l a s e l e v e l s i nc u l t u r e s t h a t h a d b e e n i n d u c e d w i t h p h o s p h a t eb u f f e r f r o m t h e b e g i n n i n g . T h i s s h o r t s p a n i n

t h e a p p e a r a n c e o f c e l l u l a s e i n t h e medium s u g -g e s t s t h a t t h e p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r a c t s

d i r e c t l y t o r e l e a s e p r e f o r m e d e n z y m e a l r e a d y a t

o r n e a r t h e c e l l s u r f a c e . T h e m y c e l i a e x p o s e d t o

c e l l o b i o s e a n d p h o s p h a t e b u f f e r f r o m t h e s t a r t

o f t h e e x p e r i m e n t r e l e a s e d c e l l u l a s e c o n t i n u -

o u s l y , t h u s s u g g e s t i n g t h a t t h e p r o c e s s i s u n -

l i k e t h e s h o c k r e l e a s e o f p e r i p l a s m i c e n z y m e s

( 7 , 2 6 ) . B y c o n t r a s t , r e l a t i v e l y l o w c o n c e n t r a -t i o n o f i o n s a r e r e q u i r e d f o r t h e c o n t i n u i n gg r a d u a l r e l e a s e o f c e l l u l a s e f r o m N e u r o s p o r ac e l l s .A v a r i e t y o f s a l t s s t i m u l a t e d t h e r e l e a s e o f

c e l l u l a s e . I n e x p e r i m e n t s w i t h m y c e l i a g r o w nf o r 4 0 h a n d t h e n e x p o s e d t o s a l t a n d i n d u c e r f o r6 h , 9 0 % o f t h e c e l l u l a s e w a s r e l e a s e d i n t h ep r e s e n c e o f 0 . 1 M s o d i u m o r p o t a s s i u m p h o s -p h a t e . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g p o -t a s s i u m c h l o r i d e , m a g n e s i u m c h l o r i d e , a n d s o -d i u m c i t r a t e ( d a t a n o t s h o w n ) .

I n d y i c t i o n a n d r e l e a s e o f c e l l u l a s e a s a f u n c -t i o n o f pH o f t h e medium i s s h o w n i n F i g . 4 .C e l l s w e r e i n d u c e d f o r 6 h w i t h 1 mM c e l l o b i o s ei n a r a n g e o f pH f r o m 5 . 5 t o 8 . 5 , u s i n g 0 . 1 Mp o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r . C e l l u l a s e w a s r e -

l e a s e d m a x i m _ a l l y i n t o t h e medium a t pH 7 . 0 .C e l l u l a s e a c c u m u l a t e d w i t h i n t h e c e l l s a t pH7 . 5 e v e n t h o u g h t o t a l p r o d u c t i o n o f c e l l u l a s ew a s l e s s t h a n a t pH 7 . 0 . T h i s o b s e r v a t i o n h a sl e d u s t o u s e pH 7 . 0 a s a s t a n d a r d c o n d i t i o n i nt h e r o u t i n e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r c e l l u -l a s e .

T o s t u d y t h e e f f e c t i v e n e s s o f d i f f e r e n t p o t e n -

t i a l i n d u c e r s , p r e g e r m i n a t i v e c o n i d i a o f s t r a i n s7 4 - O R 8 - l a a n d 3 3 ( 2 - 6 ) A w e r e i n d u c e d f o r 6 hu n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s i n 1 . 0 M s o l u t i o n s o ft h e f o l l o w i n g c o m p o u n d s : c e l l o b i o s e , N - a c e t y l -

3 . 0

2 . 0

/AN

AAA-z

->Z A -

T I M E ( H O U R S )

F I G . 3 . R e l e a s e o f c e l l u l a s e f r o m 4 0 - h m y c e l i a .S y m b o l s : ( 0 ) C e l l s i n i t i a l l y i n d u c e d i n b u f f e r ; ( A )c e l l s i n d u c e d i n w a t e r w i t h b u f f e r a d d e d a t 2 o r 4 h .S t r a i n u s e d wa s 6 2 ( 2 - 2 ) a .

V O L . 1 3 0 , 1 9 7 7



g l u c o s a m i n e , a m y g d a l i n , a r b u t i n , g a l a c t o s e , 1 . 2

g e n t i o b i o s e , g l u c o n o - A - l a c t o s e , g l u c o s e , x y l o s e ,l a m i n a r i b i o s e , t r e h a l o s e , m a l t o s e , a n d m a n -n o s e . O n l y c e l l o b i o s e s h o w e d a s i g n i f i c a n t i n -d u c t i o n ; m a l t o s e s h o w e d 1 0 % o f c e l l o b i o s e ,

w h e r e a s t h e o t h e r c o m p o u n d s d i d n o t i n d u c es i g n i f i c a n t l e v e l s o f c e l l u l o s e ( d a t a n o t s h o w n ) .T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l o b i o s e c o n c e n - 0 *

t r a t i o n a n d e x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e p r o d u c t i o n

w a s d e t e r m i n e d f o r f o u r N e u r o s p o r a s t r a i n s $ * e( F i g . 5 ) . P r e g e r m i n a t i v e c o n i d i a w e r e e x p o s e dt o c e l l o b i o s e c o n c e n t r a t i o n s f r o m 0 t o 5 . 0 mM u _

f o r 6 h u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s . T h e o p t i m u m - /c e l l o b i o s e c o n c e n t r a t i o n f o r w i l d - t y p e s t r a i n 7 4 - z

O R 8 - 1 a w a s 0 . 1 mM, w h e r e a s c o n c e n t r a t i o n s 0 . 4 -

a b o v e t h i s w e r e l e s s e f f e c t i v e . S t r a i n s 3 3 ( 2 - 6 ) , _g l u c - 2 , a n d E M 6 9 2 a , w i l d t y p e , w e r e i n d u c e d

m a x i m a l l y a t 1 . 0mM

c e l l o b i o s e .S t r a i n

C M 6 2 ( 2 - 2 ) , w i l d t y p e , r e s p o n d e d b e s t t o h i g h e r _ *c o n c e n t r a t i o n s . I n s t r a i n 7 4 - O R 8 - l a , t h e d e c l i n ei n e n z y m e p r o d u c t i o n w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n - et r a t i o n s o f c e l l o b i o s e c o n c e n t r a t i o n may h a v e /b ee n d u e t o p r o d u c t i o n o f g l u c o s e f r o m c e l l o - 0

0 . 0 1 0 . 0 5 0 . 1 o . s 1 0 s . 0 Ib i o s e b y t h i s s t r a i n . D e s p i t e t h e p r i o r t r e a t m e n t C E L L O S I O S E ( E M )o f c e l l s w i t h a c i d t o r e m o v e s u r f a c e a r y l - / 3 - g l u - F I G . 5 . E x t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e p r o d u c t i o n a s ac o s i d a s e a c t i v i t y , i t i s p o s s i b l e t h a t i n t r a c e l l u - f u n c t i o n o f c e l l o b i o s e c o n c e n t r a t i o n . B u f f e r w a s 0 . 1 Ml a r e n z y m e s may r e l e a s e g l u c o s e w i t h i n t h e c e l l p h o s p h a t e . P r e g e r m i n a t i v e c o n i d i a f r o m s t r a i n s : ( 0 )b e f o r e c e l l o b i o s e h a s h a d a n i n d u c e r e f f e c t . G l u - 7 4 - O R 8 - l a ; ( a ) 3 3 ( 2 - 6 ) ; ( $ ) C M 6 2 ( 2 - 2 ) ; ( e ) 6 9 2 a .c o s e i n h i b i t s t h e i n d u c t i o n n o t o nl y o f c e l l u l a s e ,

b u t a l s o o f a r y l - , 8 - g l u c o s i d a s e a n d c e l l o b i a s e a s

2 . 5 w e l l ( 4 ) . T h e m o d e o f g l u c o s e a c t i o n i s p r o b a b l yv i a c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n ( 1 1 , 1 8 ) .

P r e v a l e n t m o d e l s f o r c e l l u l o s e d e c o m p o s i t i o n( 1 ) i n v o l v e t h e a c t i o n o f b o t h e n d o c e l l u l a s e a n de x o c e l l u l a s e ( , S - g l u c o s i d a s e ) t o p r o d u c e f r e e g l u -c o s e . S i n c e t h er e a r e t w o , 3 - g l u c o s i d a s e s i n N e u -r o s p o r a , we w i s h e d t o know w h e t h e r e i t h e r o ft h e s e e n z y m e s w a s r e d u c e d a t l e v e l s o f a c t i v -i t y c o o r d i n a t e w i t h t h e c e l l u l a s e p r o d u c t i o n i ng 1 . 5 / \ t h e s e s t r a i n s . S u c h a c o o r d i n a t i o n w o u l d d i s t i n -

x / \ g u i s h o n e o r b o t h o f t h e f 8 - g l u c o s i d a s e s a s a

\ / \ c o n s t a n t e l e m e n t o f t h e c e l l u l o s e d e c o m p o s i t i o n

0 \ p a t h w a y . T o t e s t t h i s p o i n t , a v a r i e t y o f s t a n -z_d a r d a n d e x o t i c s t r a i n s w e r e i n d u c e d a n d a s -

s a y e d f o r c e l l o b i a s e a r y l - , 3 - g l u c o s i d a s e a n d e x -t r a c e l l u l a r c e l l u l a s e a c t i v i t i e s . T h e r e w a s l i t t l e

* * e v i d e n c e f o r c o r r e l a t i o n o f a c t i v i t y o f e i t h e r o f0 . 5 / t h e t w o f 8 - g l u c o s i d a s e s w i t h t h e c e l l u l a s e a c t i v -

i t y w i t h i n i n d i v i d u a l s t r a i n s ( T a b l e 1 ) . C e l l u -A// l a s e a c t i v i t y v a r i e d w i d e l y a m o n g e x o t i c

s t r a i n s . C e l l o b i a s e a c t i v i t y was n e x t m o s t v a r i -

0, , . a b l e i n a c t i v i t y , w h e r e a s a r y l - 4 8 - g l u c o s i d a s e0 6 i 0 6 . 5 7 . 0 7 . 5 U was t h e m o s t c o n s t a n t f r o m s t r a i n t o s t r a i n . A l l

p H o f t h e s t a n d a r d l a b o r a t o r y w i l d - t y p e s t r a i n s

F I G . 4 . E f f e c t o fpH o n c e l l u l a s e p r o d u c t i o n a n d t h a t w e t e s t e d f e l l r o u g h l y w i t h i n t h e s a m er e l e a s e . S y m b o l s : ( 0 ) C e l l u l a s e i n m e d i a ; ( A ) c e l l u - r a n g e o f c el l u l a s e a c t i v i t y a n d o n l y v a r i e d b yl a s e b o u n d i n c e l l s . P r e g e r m i n a t i v e c o n i d i a o f s t r a i n t w o - o r t h r e e f o l d , w h e r e a s t h e e x t r e m e r a n g e i n7 4 - O R 8 - l a w e r e i n 0 . 1 M b u f f e r a n d a s s a y e d u n d e r e x o t i c s was many h u n d r e d - f o l d u n d e r s i m p l es t a n d a r d i n d u c t i o n c o n d i t i o n s . c o n d i t i o n s o f i n d u c t i o n .

1 8 4 E B E R H A R T , B E C K , AND GOOLSBY J . B A C T E R I O L .



V O L . 1 3 0 , 1 9 7 7

E x o t i c s t r a i n S i n g a p o r e 4 3 6 w a s e x a m i n e d i n

g r e a t e r d e t a i l b e c a u s e o f i t s v e r y l o w c e l l u l a s ea c t i v i t y i n y o u n g c u l t u r e s . A l t h o u g h t h i s s t r a i np r o d u c e d v e r y l o w l e v e l s o f c e l l u l a s e a c t i v i t yu n d e r s t a n d a r d m i n i m a l i n d u c t i o n c o n d i t i o n s ,

t h e a d d i t i o n o f v i t a m i n s u p p l e m e n t s i n c r e a s e dt h e l e v e l s o f t h i s e n z y m e a c t i v i t y . T h i s s u g g e s t s

t h a t f u t u r e c o m p a r i s o n s o f e n z y m e a c t i v i t i e s o fe x o t i c s t r a i n s w i t h w i l d t y p e s h o u l d a l s o b emade w i t h c o m p l e x n u t r i t i o n a l m e d i a a s w e l l

a s m i n i m a l m e d i a b e c a u s e o f t h e v a r i e d n u t r i -t i o n a l c a p a b i l i t i e s o f t h e e x o t i c a n d s t a n d a r dw i l d - t y p e s t r a i n s .

DISCUSSION

T h e m o d e l t h a t i s g e n e r a l l y p r o p o s e d f o r t h e

d e c o m p o s i t i o n o f c e l l u l o s e b y m i c r o b e s ( 9 , 1 7 )

a g r e e s w i t h o u r o b s e r v at i o n o f a n e x t r a c e l l u l a rc e l l u l o s e a n d t w o 3 - g l u c o s i d a s e s i n N e u r o s p o r a( 5 , 8 , 1 0 ) . I n f u n g i , t h r ee t y p e s o f e n z y m e s a r e

b e l i e v e d t o b e d i r e c t l y i n v o l v e d i n c e l l u l o s e d e -c o m p o s i t i o n . T h e f i r s t , a C 1 e n z y m e , s w e l l s c e l -l u l o s e . T h e s e c o n d t y p e o f c e l l u l a s e , r e p o r t e d

h e r e , b r e a k s c e l l u l o s e i n t o i n t e r m e d i a t e - s i z e

c h a i n s . F i n a l l y , 8 - g l u c o s i d a s e r e l e a s e s g l u c o s e

s e q u e n t i a l l y f r o m t h e e n d s o f t h e s e s h o r t e n e dc h a i n s . N a t u r a l l y o c c u r r i n g c e l l u l o s e c h a i n s

a r e p r o b a b l y t o o l a r g e t o p e n e t r a t e t h e c e l l w a l l

s p a c e s i n N e u r o s p o r a ( 1 3 , 2 3 , 2 4 ) . T h e r e f o r e ,

e x t e r n a l c e l l u l a s e a c t i v i t y i s r e q u i r e d f o r t h ep r e p a r a t i o n o f c e l l u l o s e a s a c a r b o n s o u r c e .A r y l - 3 - g l u c o s i d a s e o f N e u r o s p o r a i s i n a p o -

s i t i o n t o f u r t h e r d e g r a d e t h e i n i t i a l p r o d u c t s o fc e l l u l a s e a c t i v i t y f r o m i t s l o c a t i o n w i t h i n t h e

c e l l w a l l o f N e u r o s p o r a ( 3 ) . C e l l o b i a s e , w h i c h i sf o u n d o n l y w i t h i n t h e c e l l , c a n t h e n b r e a k downt h e s m a l l e r 8 3 - g l u c o s i d i c p o l y m e r s t h a t s u r v i v e

e x p o s u r e t o a r y l - , ( - g l u c o s i d a s e o f t h e c e l l w a l l .C e l l o b i o s e i s a n e f f e c t i v e i n d u c e r o f c e l l u l a s e

i n f u n g i ( 6 , 1 2 , 1 5 ) a n d a l s o a c t s a s a n i n d u c e r

f o r c e l l o b i a s e a n d a r y l - , 3 - g l u c o s i d a s e i n N e u r o -

s p o r a ( 5 ) . N e i t h e r g l u c o s e n o r o t h e r m o n o s a c -c h a r i d e s t e s t e d p e r f o r m a n i n d u c t i o n f u n c t i o n ,w h e r e a s m a l t o s e i s a n i n d u c e r 1 0 % a s e f f e c t i v ea s c e l l o b i o s e .

C e l l u l a s e i s n o t e f f e c t i v e l y r e l e a s e d f r o m m y -c e l i a i f s a l t s a r e a b s e n t f r o m t h e i n d u c t i o n m e -d i u m . We p r o p o s e t w o l i k e l y m e c h a n i s m s t oe x p l a i n t h e r e t e n t i o n o f c e l l u l a s e b y m y c e l i ai n d u c e d i n w a t e r a l o n e . T h e f i r s t p o s s i b i l i t yi n v o l v e s a r e q u i r e m e n t f o r c e r t a i n i o n s b y ar e a c t i o n s t e p i n t h e s e c r e t i o n o f c e l l u l a s e . S i n c e

v e s i c l e s i n t h e h y p h a l t i p o f N e u r o s p o r a , a n do t h e r f u n g i , a r e i n v o l v e d i n s e c r e t i o n o f e x t r a -

c e l l u l a r e n z y m e s ( 1 ) , t h i s s t e p c o u l d r e q u i r e t h ep r e s e n c e o f i o n s f o r a c t i v a t i o n .A s e c o n d p o s s i b i l i t y f o r c e l l u l o s e r e t e n t i o n i s

t h a t t h e e n z y m e i s r e l e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f

CELLULASE OF N . CRASSA 1 8 5

w a t e r a l o n e , b u t i s t h e n b o u n d t o t h e c e l l w a l l

b y r e a c t i o n a n a l o g o u s t o i o n e x c h a n g e ( 2 2 , 2 9 ) .I n t h i s s y s t e m , a d d e d s a l t s w o u l d f a c i l i t a t er e l e a s e o f a b s o r b e d p r o t e i n i n t o t h e m e d i a ( 2 5 ) .A t p r e s e n t , we d o n o t h a v e e v i d e n c e t o d e c i d e

b e t w e e n t h e s e t w o p o s s i b i l i t i e s . I t d o e s n o t ,h o w e v e r , s e e m t h a t a n a l t e r n a t e p o s s i b i l i t y o fs h o c k r e l e a s e ( 7 , 2 6 ) c a n e x p l a i n t h e g r a d u a lr e l e a s e o f c e l l u l a s e s e e n i n c o n t i n u o u s e x p o s u r eo f c e l l s t o 1 mM p h o s p h a t e b u f f e r .

P o t a s s i u m o r s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r s t i m u -

l a t e s c e l l u l a s e p r o d u c t i o n u p t o 1 0 0 mM b u ti n h i b i t s e n z y m e p r o d u c t i o n a t h i g h e r c o n c e n -

t r a t i o n s . I t i s p o s s i b l e t h at t h e s e i o n s c a n i n t e r -a c t w i t h a c o m p o n e n t a t t h e c e l l membranes u c h a s c e l l o b i o s e p e r m e a s e a n d i n t h i s wayb l o c k t h e e n t r y o f t h e i n d u c e r , t h u s b l o c k i n ge n z y m e p r o d u c t i o n . T h i s w o u l d l e a d u s t o p r e -d i c t t h at o t h er s a c ch a r i d e p e r m e a s e s o f N e u r o -s p o r a ma y b e i n h i b i t e d b y h i g h p h o s p h a t eb u f f e r c o n c e n t r a t i o n s ( 1 6 , 2 0 , 2 1 ) . T h e r e l a t e do b s e r v a t i o n o f a pH o p t i m u m f o r c e l l u l a s e i n -d u c t i o n ma y r e f l e c t t h e pH optimum o f a c e l l o -b i o s e p e r m e a s e . T h e p r i m a r y e f f e c t o f o p t i m u mpH c o u l d b e r e g u l a t i o n o f e n t r y o f t h e i n d u c e r .A s e c o n d a r y e f f e c t m i g h t i n v o l v e t h e r e l e a s e o ft h e e n z y m e i n t o t h e e x t e r n a l m e d i a , s i n c e e x -

p e r i m e n t s s h o w t h a t r e l e a s e o f c e l l u l a s e f r o m

t h e c e l l i s s l i g h t l y r e t a r d e d a t pH v a l u e s a b o v e

7 . 0 .

E a r l i e r w o r k ( 1 5 ) s h o w e d t h a t c e l l u l a s e a n dc e l l o b i a s e a c t i v i t y w e r e p r o d u c e d c o o r d i n a t e l yi n t h e c e l l - 1 m u t a n t o f N e u r o s p o r a . By c o n -

t r a s t , t h e p r e s e n t d a t a s h o w l i t t l e c o r r e l a t i o nb e t w e e n l e v e l s o f c e l l u l a s e o r c e l l o b i a s e a c t i v i -t i e s i n t h e e x o t i c s t r a i n s t h a t w e h a v e i n d u c e d

i n s i m p l e m e d i a . W e h a v e a l s o o b s e r v e d a l a c k

o f c o o r d i n a t i o n b e t w e e n t h e l e v e l s o f a c t i v i t y o fe i t h e r c e l l o b i a s e o r c e l l u l a s e w i t h a r y l - , 8 -g l u c o s i d a s e a c t i v i t y i n e x o t i c s t r a i n s .W e h a v e n o t f o u n d a n e f f e c t i v e e n r i c h m e n t

t e c h n i q u e t o o b t a i n m u t a n t s o f N e u r o s p o r a

w i t h a l t e r e d c e l l u l a s e a c t i v i t y , b u t w e a r e p u r -s u i n g t h e g e n e t i c b a s i s o f v a r i a t i o n i n c e l l u l a s ea c t i v i t y i n e x o t i c s t r a i n s . T h e h e t e r o g e n e i t y o fc e l l u l a s e a c t i v i t y i n t h e s e s t r a i n s s u g g e s t s i n -v o l v e m e n t s o f more t h a n o n e g e n e l o c u s . W eh o p e t o u l t i m a t e l y d e t e r m i n e t h e g e n e t i c c o n -

t r i b u t i o n b y a p p r o p r i a t e c r o s s e s b e t w e e n e x o t i cs t r a i n s a n d s t a n d a r d l a b o r a t o r y s t r a i n s .

ACKNOWLEDGMENTS

T h i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d b y g r a n t 8 4 5 3 f r o m t h e

N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n .

LITERATURE CITED

1 . C h a n g , P . L . Y . , a n d J . R . T r e v i t h i c k . 1 9 7 4 . Ho w i m p o r -t a n t i s s e c r e t i o n o f e x o e n z y m e s t h r o u g h a p i c a l c e l lw a l l s o f f u n g i . A r c h . M i c r o b i o l . 1 0 1 : 2 8 1 - 2 9 3 .



186 EBERHART, BECK, AND GOOLSBY

2 . E b e r h a r t , B . M . , a n d R . S . B e c k . 1 9 7 0 . L o c a l i z a t i o n o ft h e f - g l u c o s i d a s e s i n N e u r o s p o r a c r a s s a . J . B a c t e r i o l .1 0 1 : 4 0 8 - 4 1 7 .

3 . E b e r h a r t , B . M . , a n d R . S . B e c k . 1 9 7 3 . I n d u c t i o n o f 3 -

g l u c o s i d a s e i n N e u r o s p o r a c r a s s a . J . B a c t e r i o l .1 1 6 : 2 9 5 - 3 0 3 .

4 . E b er h ar t , B . M . , D . F . C r o s s , a n d L . R . C h a s e . 1 9 6 4 . ( B -

G l u c o s i d a s e s y s t e m o f N e u r o s p o r a c r a s s a . I . / 3 - G l u -c o s i d a s e a n d c e l l u l a s e a c t i v i t i e s o f m u t a n t a n d w i l d -t y p e s t r a i n s . J . B a c t e r i o l . 8 7 : 7 6 1 - 7 7 0 .

5 . G o u l d , R . F . ( e d . ) . 1 9 6 9 . C e l l u l a s e s a n d t h e i r a p p l i c a -t i o n . A d v a n c e s i n C h e m i s t r y s e r . n o . 9 5 . A m e r i c a nC h e m i c a l S o c i e t y P u b l i c a t i o n s , W a s h i n g t o n , D . C .

6 . G u p t a , D . P . , a n d J . B . H e a l e . 1 9 7 0 . I n d u c t i o n o f c e l l u -l a s e ( C . ) i n V e r t i c i l l i u m a l b o - a t r u m . J . G e n . M i c r o -

b i o l . 6 3 : 1 6 3 - 1 7 3 .7 . H e p p e l , L . A . 1 9 6 7 . S e l e c t i v e r e l e a s e o f e n z y m e s f r o m

b a c t e r i a . S c i e n c e 1 5 6 : 1 4 5 1 - 1 4 5 5 .8 . H i r s c h , H . M . 1 9 5 4 . T e m p e r a t u r e d e p e n d e n t c e l l u l a s e

p r o d u c t i o n b y N e u r o s p o r a c r a s s a a n d i t s e c o l o g i c a li m p l i c a t i o n . E x p e r i e n t i a 4 : 1 8 0 - 1 8 2 .

9 . K i ng , K . W . , a n d M . I . V e s s a l . 1 9 6 9 . E n z y m e s o f t h e

c e l l u l a s e c o m p l e x , p . 7 - 2 5 . I n R . F . G o u l d ( e d . ) , C e l l u -l a s e s a n d t h e i r a p p l i c a t i o n . A d v a n c e s i n C h e m i s t r y

s e r n o . 9 5 . A m e r i c a n C h e m i c a l S o c i e t y P u b l i c a t i o n s ,W a s h i n g t o n , D . C .

1 0 . K u r o d a , H . , a n d T . M o c h i z u k i . 1 9 6 7 . S t u d i e s o n c e l l u -l o l y t i c e n z y m e p r o d u c e d b y N e u r o s p o r a s p e c i e s . I .

C u l t u r e c o n d i t i o n s a n d s o m e p r o p e r t i e s o f c r u d e e n -z y m e . J . F e r m e n t . T e c h n o l . 4 5 : 3 4 1 - 3 4 6 .

1 1 . M a g a s a n i k , B . 1 9 6 1 . C a t a b o l i t e r e p r e s s i o n . C o l d S p r i n gH a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . 2 6 : 2 4 9 - 2 5 6 .

1 2 . M a n d e l s , M . , a n d E . T . R e e s e . 1 9 6 0 . I n d u c t i o n o f c e l l u -l a s e i n f u n g i b y c e l l o b i o s e . J . B a c t e r i o l . 7 9 : 8 1 6 - 8 2 6 .

1 3 . M a r z l u f , G . A . , a n d R . L . M e t z e n b e r g . 1 9 6 7 . S t u d i e s o n

t h e f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e o f t h e t r a n s m e m b r a n e l o -c a t i o n o f i n v e r t a s e i n N e u r o s p o r a c r a s s a . A r c h . B i o -c h e m . B i o p h y s . 1 2 0 : 4 8 7 - 4 9 6 .

1 4 . M e y e r s , S . P . , B . P r i n d l e , a n d E . S . R e y n o l d s . 1 9 6 0 .C e l l u l o l y t i c a c t i v i t y o f m a r i n e f u n g i . T a p p i 4 3 : 5 3 4 -

5 3 8 .1 5 . M y e r s , M . G . , a n d B . M . E b e r h a r t . 1 9 6 6 . R e g u l a t i o n o f

c e l l u l a s e a n d c e l l o b i a s e i n N e u r o s p o r a c r a s s a . B i o -c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 2 4 : 7 8 2 - 7 8 5 .

J . B A C T E R I O L .

1 6 . N e v i l l e , M . M . , S . R . S u s k i n d , a n d S . R o s e m a n . 1 9 7 1 . Ad e r e p r e s s i b l e a c t i v e t r a n s p o r t s y s t e m f o r g l u c o s e i n

N e u r o s p o r a c r a s s a . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 : 1 2 9 4 - 1 3 0 1 .1 7 . N i s i z a w a , K . 1 9 7 3 . M o d e o f a c t i o n o f c e l l u l a s e s . H a k k o

K o g a k u Z a s s h i 5 1 : 2 6 7 - 3 0 4 .1 8 . N i s i z a w a , T . , H . S u z u k i , a n d K . N i s i za wa . 1 9 7 2 . C a t a b -

o l i t e r e p r e s s i o n o f c e l l u l a s e f o r m a t i o n i n T r i c h o d e r m a

v i r i d e . J . B i o c h e m . ( T o k y o ) 7 1 : 9 9 9 - 1 0 0 7 .1 9 . R e e s e , E . T . ( e d . ) . 1 9 6 3 . A d v a n c e s i n e n z y m a t i c h y d r o l -

y s i s o f c e l l u l o s e a n d r e l a t e d m a t e r i a l s . T h e M a c -M i l l a n C o . , Ne w Y o r k .

2 0 . S c a r b o r o u g h , G . A . 1 9 7 0 . S u g a r t r a n s p o r t i n N e u r o -

s p o r a c r a s s a . J . B i o l . C h e m . 2 4 5 : 1 6 9 4 - 1 6 9 8 .2 1 . S c h n e i d e r , R . P . , a n d W. R . W i l e y . 1 9 7 1 . R e g u l a t i o n o f

s u g a r t r a n s p o r t i n N e u r o s p o r a c r a s s a . J . B a c t e r i o l .1 0 6 : 4 8 7 - 4 9 2 .

2 2 . T o n o m u r a , K . , a n d 0 . T a n a b e . 1 9 6 4 . L o c a l i z a t i o n o fc e l l - b o u n d a - a m y l a s e i n A s p e r g i l l u s o r y z a e d e m o n -s t r a t e d b y f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e . J . B a c t e -r i o l . 8 7 : 2 2 6 - 2 2 7 .

2 3 . T r e v i t h i c k , J . R . , a n d R . L . M e t z e n b e r g . 1 9 6 6 . G e n e t i c

a l t e r n a t i o n o f p o r e s i z e a n d o t h e r p r o p e r t i e s o f t h e

N e u r o s p o r a c e l l w a l l . J . B a c t e r i o l . 9 2 : 1 0 1 6 - 1 0 2 0 .2 4 . T r e v i t h i c k , J . R . , a n d R . L . M e t z e n b e r g . 1 9 6 6 . M o l e c u -

l a r s i e v i n g b y N eu r o s p o r a c e l l w a l l s d u r i n g s e c r e t i o no f i n t e r t a s e i s o z y m e s . J . B a c t e r i o l . 9 2 : 1 0 1 0 - 1 0 1 5 .

2 5 . W e i m b e r g , R . , a n d W. L. O r t o n . 1 9 6 6 . E l u t i o n o f e x o -

c e l l u l a r e n z y m e s f r o m S a c c h a r o m y c e s f r a g i l i s a n d

S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e . J . B a c t e r i o l . 9 1 : 1 - 1 3 .2 6 . W i l e y , W. R . 1 9 7 0 . T r y p t o p h a n t r a n s p o r t i n N e u r o s p o r a

c r a s s a : a t r y p t o p h a n - b i n d i n g p r o t e i n r e l e a s e d b y c o l do s m o t i c s h o c k . J . B a c t e r i o l . 1 0 3 : 6 5 6 - 6 6 2 .

2 7 . V o g e l , H . J . 1 9 6 4 . D i s t r i b u t i o n o f l y s i n e p a t h w a y samong f u n g i : e v o l u t i o n a r y i m p l i c a t i o n s . Am. N a t .9 8 : 4 3 5 - 4 4 6 .

2 8 . W o r t h i n g t o n B i o c h e mi c a l s C o r p . 1 9 7 2 . E n z y m e s , e n -

z y m e r e a g e n t s , r e l a t e d b i o c h e m i c a l s . W o r t h i n g t o ne n z y m e m an u a l . W o r t h i n g t o n B i o c h e m i c a l s C o r p . ,F r ee h o l d , N . J.

2 9 . Y o b u k i , M . , a n d S . F u k u i . 1 9 7 0 . P r e s e n c e o f b i n d i n gs i t e f o r a - a m y l a s e a n d o f m a s k i n g p r o t e i n f o r t h i s s i t eo n m y c e l i a l c e l l w a l l s o f A s p e r g i l l u s o r y z a e . J . B a c t e -

r i o l . 1 0 4 : 1 3 8 - 1 4 4 .

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