박 종 철박 종 철

연세대학교 의과대학 의학공학교실연세대학교 의과대학 의학공학교실

• CellCell 의 의 ViabilityViability 란 무엇인가란 무엇인가 ??

- - 성장성장

- - 증식증식

- - 대사활성 등대사활성 등

• Cell ViabilityCell Viability 의 측정의 측정

- - 측정방법에 따라서 차이가 발생측정방법에 따라서 차이가 발생

: : 각 측정법에서 별도의 정의를 사용각 측정법에서 별도의 정의를 사용

[[ 예예 ] Trypan blue ] Trypan blue 염색염색 : : 세포막의 세포막의 integrityintegrity 에 기초한 염색에 기초한 염색

형광염색형광염색 : : 세포내 효소의 활성에 기초한 염색세포내 효소의 활성에 기초한 염색

Isotope: Isotope: 세포의 대사활성에 기초세포의 대사활성에 기초

- - 종래의 방법종래의 방법

: (Macro) : (Macro) 성장성장 , , 증식증식

- - 최근 시도되고 있는 방법최근 시도되고 있는 방법

: (Micro) : (Micro) 성장성장 , , 증식증식 , , 대사활성대사활성 , , 세포막 손상 등세포막 손상 등

• Cell viability Cell viability 측정의 응용측정의 응용

- - 조직공학 조직공학

- - 발효공학발효공학

- - 독성학 독성학

- - 위생학 위생학 (( 식품식품 ,, 환경 등환경 등 ))

- - 생명공학생명공학

• Cell viability Cell viability 측정 방법의 선택시 고려사항측정 방법의 선택시 고려사항

- - 신속성신속성

- - 정확성 정확성 (( 정량적정량적 ))

- - 경제성경제성

- - 용이성용이성

• 발효과정의 세포수 측정 시스템에 요구되는 특징발효과정의 세포수 측정 시스템에 요구되는 특징 (by Dr. Matsunaga)(by Dr. Matsunaga)

- - 응답이 빠르고응답이 빠르고 , , 연속적으로 측정이 가능연속적으로 측정이 가능

- - 높은 감도높은 감도

- - 측정부분이 생물학적으로 불활성측정부분이 생물학적으로 불활성

- - 시약을 첨가할 필요가 없음시약을 첨가할 필요가 없음

- - 비파괴적 측정법비파괴적 측정법

- - 광범위한 적용범위광범위한 적용범위

- - 수명이 길고수명이 길고 , , 저렴저렴

- - 혼탁한 시료라도 사용가능혼탁한 시료라도 사용가능

- - 멸균가능멸균가능

• Viability Viability 측정 방법측정 방법

검경법 검경법 (( 염색법염색법 ))

생균수 측정법생균수 측정법 : : 군집 군집 (colony) (colony) 형성형성

흡광도흡광도 , , 탁도 측정법탁도 측정법

일반적 효소활성 확인법일반적 효소활성 확인법 : API ZYM: API ZYM

Isotope Isotope 사용법사용법

형광염색법형광염색법 : FDA-PI: FDA-PI

발광 확인법발광 확인법 : Luciferin-Luciferase: Luciferin-Luciferase

극미약광 측정법극미약광 측정법

영상처리법영상처리법

생물진동 확인법생물진동 확인법

막전위 측정법 막전위 측정법

검경법 검경법 (( 염색법염색법 ))

- - 세포수 측정법의 기본세포수 측정법의 기본 , , 가장 일반적가장 일반적

- Haematocytometer- Haematocytometer 를 사용하여를 사용하여 , , 세포농도를 구함세포농도를 구함

- - 적당한 염색제를 사용하여 적당한 염색제를 사용하여 viability viability 측정이 가능측정이 가능

- - 단점단점 : : 조작이 복잡하고 기술과 경험이 필요조작이 복잡하고 기술과 경험이 필요

101066 cells/ml cells/ml 이하의 세포농도에서 측정불가능이하의 세포농도에서 측정불가능

pH pH 변화변화 : Neutral Red, Phenolphthalein: Neutral Red, Phenolphthalein

핵산의 염색핵산의 염색 : Acridine Orange, Ethidium Bromide: Acridine Orange, Ethidium Bromide

세포막 변형세포막 변형 : Tryphan Blue: Tryphan Blue

세포 세포 mitochodriamitochodria 내의 효소 활성내의 효소 활성 : MTT: MTT

Viable cellViable cell Dead cellDead cell

Blue stainedBlue stained

Viable cellViable cell Dead cellDead cell

Red StainedRed Stained

Trypan BlueTrypan Blue: : an indicator of cell integrityan indicator of cell integrity

• Viable cells Viable cells exclude acidic dyeexclude acidic dye

Neutral RedNeutral Red: : an indicator of lysosome integrityan indicator of lysosome integrity

• Neutral Red is endocytosed byNeutral Red is endocytosed by vital cells and internalized vital cells and internalized inside lysosomeinside lysosome

Mitochondrial Mitochondrial dehydrogenasedehydrogenase

MitochondriaMitochondria

Substrate (MTT)Substrate (MTT)

Substrate (MTT)Substrate (MTT)

Substrate (MTT)Substrate (MTT)

Insoluble coloredInsoluble coloredformazen (product)formazen (product) • MTT is converted to anMTT is converted to an

insoluble colored formazaninsoluble colored formazan

derivative which is thenderivative which is then

solubilized in acidicsolubilized in acidic

isopropanolisopropanol

MTT assayMTT assay: Cell viability by mitochondrial dehydrogenase: Cell viability by mitochondrial dehydrogenase

군집형성측정법 군집형성측정법 (Colony (Colony 계수법계수법 ))

- - 생균수 측정법의 기본생균수 측정법의 기본

- - 피검액 일정량을 한천피검액 일정량을 한천 (agar) (agar) 배지와 섞어 배양하여배지와 섞어 배양하여 ,,

생성된 생성된 colonycolony 를 계수를 계수 . (Bateria) . (Bateria)

- - 한천배지위에 일정량의 세포현탁액을 도말하여 배양한 후한천배지위에 일정량의 세포현탁액을 도말하여 배양한 후 ,,

생성된 생성된 colonycolony 를 계수를 계수 . (Fungi, Animal cell, Plant cell). (Fungi, Animal cell, Plant cell)

- - 선택 배지를 사용하면선택 배지를 사용하면 , , 세포의 식별도 가능세포의 식별도 가능

- - 세포수 측정한계세포수 측정한계 : 1 cell/ml: 1 cell/ml

- - 임상의학에서는 가장 일반적임상의학에서는 가장 일반적

- - 단점단점 : : 죽은 세포의 계수가 불가능죽은 세포의 계수가 불가능

측정에 장시간 측정에 장시간 (24(24 시간 이상시간 이상 ) ) 필요로함필요로함

시스템화가 곤란시스템화가 곤란

Colony Colony 계수법계수법

SampleSample

Spreading of sampleSpreading of sample

Plate with fresh agarPlate with fresh agar

Determination of the number of colonyDetermination of the number of colony

CultureCulture

흡광도흡광도 , , 탁도 측정법탁도 측정법

- - 총물질로 탁도를 측정하는 방법총물질로 탁도를 측정하는 방법

세포내 함유된 특정물질을 추출하여 측정세포내 함유된 특정물질을 추출하여 측정

- - 세포농도의 탁도 측정에는 투과광과 산란광 고려세포농도의 탁도 측정에는 투과광과 산란광 고려

- - 세포현탁액에 의한 산란광의 세기에 영향을 미치는 요인세포현탁액에 의한 산란광의 세기에 영향을 미치는 요인

: : 세포농도세포농도 , , 크기크기 , , 형태형태 , , 세포성분 등세포성분 등

- - 피검액이 일정하다면피검액이 일정하다면 , , 산란광의 세기는 총세포수에 대응산란광의 세기는 총세포수에 대응

- - 간편간편 , , 일정수주의 정밀도를 가짐일정수주의 정밀도를 가짐

- - 측정한계측정한계 : 10: 1066 cells/ml cells/ml

- - 단점단점 : Cell viability : Cell viability 측정 불가측정 불가

세포간 식별 불가세포간 식별 불가

고형분을 함유한 검체의 정확한 측정 곤란고형분을 함유한 검체의 정확한 측정 곤란

진한색의 배지 사용할 때 정확한 측정 곤란진한색의 배지 사용할 때 정확한 측정 곤란

일반적 효소 활성 확인법일반적 효소 활성 확인법

-API ZYM-API ZYM

- 19 - 19 종류의 일반적인 지질종류의 일반적인 지질 , , 단백질단백질 , , 당 분해 효소의 활성당 분해 효소의 활성

1. Phosphatase alkaline1. Phosphatase alkaline

2. Esterase (C4)2. Esterase (C4)

3. Esterase Lipase (C8)3. Esterase Lipase (C8)

4. Lipase (C14)4. Lipase (C14)

5. Leucine arylamidase5. Leucine arylamidase

6. Valine arylamidase6. Valine arylamidase

7. Cystein arylamidase7. Cystein arylamidase

8. Trypsin8. Trypsin

9. Chymotrypsin9. Chymotrypsin

10. Phosphatase acid10. Phosphatase acid

11. Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase11. Naphthol-AS-B1-phosphohydrolase

12. 12. -galactosidase-galactosidase

13. 13. -galactosidase-galactosidase

14. 14. -glucuronidase-glucuronidase

15. 15. -glucosidase-glucosidase

16. 16. -glucosidase-glucosidase

17. N-acetyl-17. N-acetyl--glucosaminidase-glucosaminidase

18. 18. -mannosidase-mannosidase

19. 19. -fucosidase-fucosidase

Isotope Isotope 사용법사용법

• PrinciplePrinciple: Cell must continually synthesize protein: Cell must continually synthesize protein in order to remain viablein order to remain viable

33H-ProlineH-Proline

Viable cellViable cell

SynthesisSynthesisof proteinof protein

AccumulationAccumulationIncorporationIncorporation

Measurement ofMeasurement ofprotein concentration andprotein concentration andradio-labelled amino acidsradio-labelled amino acids

- - 33H-Proline: generally used because it is not compete withH-Proline: generally used because it is not compete with other amino acids during transport within cellother amino acids during transport within cell- - 33H-thymidine: related with the number of cells replicatingH-thymidine: related with the number of cells replicating DNA as well as that of accumulated radiolabelled DNA as well as that of accumulated radiolabelled amino acidsamino acids

형광 염색법형광 염색법 : Assessment of Viability by Double-Staining: Assessment of Viability by Double-Staining

Viable CellViable Cell

PIPI

Esterase

FDAFDA

FF FFFFFF

FF 515 nm515 nm(Fluorescence)(Fluorescence)

Non-viable Non-viable CellCell

PIPIFDAFDA

620 nm620 nm(Fluorescence)(Fluorescence)

488 nm488 nm(Excitation)(Excitation)

PIPI

PIPI PIPI

PI: Propidium IodidePI: Propidium IodideFDA: Fluoresein DiacetateFDA: Fluoresein Diacetate

Flow-Cytometry (FCM)Flow-Cytometry (FCM)

Cell SuspensionCell Suspension

Laser-BeamLaser-Beam

前方散亂光前方散亂光[ Scatter ][ Scatter ]

螢光螢光[ Fluorescence ][ Fluorescence ]

[- control][- control]: non-staining: non-staining

Living cellsLiving cells

Dead cellsDead cells

ATP ATP 측정법 측정법 (Bioluminescence)(Bioluminescence)

- - 세포내 특정물질의 광학적 측정법세포내 특정물질의 광학적 측정법

- - 세포중의 세포중의 ATPATP 는 성장과정는 성장과정 , , 배양조건에 관계없이 거의 일정배양조건에 관계없이 거의 일정

- - 세포로부터 추출된 세포로부터 추출된 ATPATP 와 반딧불의 와 반딧불의 Luciferin-Luciferase Luciferin-Luciferase 반응반응

생성된 형광 강도를 측정생성된 형광 강도를 측정

- - 세포를 직접 탁도로 측정하는 것보다 감도가 높음세포를 직접 탁도로 측정하는 것보다 감도가 높음

- - 단점단점 : : 추출 조작등 복잡 추출 조작등 복잡 (ATP (ATP 소실 가능성소실 가능성 ))

파괴적 측정파괴적 측정

결과를 얻기까지 시간을 요함 결과를 얻기까지 시간을 요함 (( 현재는 해결됨현재는 해결됨 ))

배지중의 배지중의 ATP, ATP, 금속이온 등이 영향금속이온 등이 영향

죽은 세포의 측정이 불가능죽은 세포의 측정이 불가능

- Firefly bioluminescence- Firefly bioluminescence

Luciferin + Luciferase + MgLuciferin + Luciferase + Mg2+2+ + ATP + ATP Luciferyladenylate L-AMP Luciferyladenylate L-AMP

L-AMP-luciferase + OL-AMP-luciferase + O22 Oxyluciferin*-luciferase Oxyluciferin*-luciferase

Oxyluciferin*-luciferase Oxyluciferin*-luciferase Oxyluciferin-Luciferase + Light (562 nm) Oxyluciferin-Luciferase + Light (562 nm)

- Bacterial luminescence- Bacterial luminescence Photobacterium phosphoreum, Vibrio harveyiPhotobacterium phosphoreum, Vibrio harveyi

NAD(P)H + FMN FMNHNAD(P)H + FMN FMNH22 + NAD(P) + NAD(P)

FMNHFMNH22 + Luciferase +O + Luciferase +O22 FMNH(OOH)•luciferase FMNH(OOH)•luciferase

FMNH(OOH)•luciferase + RCHO FMNH(OOH)•luciferase + RCHO FMN + R•COOH + Luciferase FMN + R•COOH + Luciferase

HH22O + Light O + Light

Oxido reductaseOxido reductase

Cell LysisCell Lysis + Luciferin + O+ Luciferin + O22

In the presence ofIn the presence ofLuciferase & MgLuciferase & Mg2+2+

AMP + CO + Pyrophosphoric Acid + Oxyluciferin + AMP + CO + Pyrophosphoric Acid + Oxyluciferin + LuminescenceLuminescence(480 nm)(480 nm)

Principle of Bioluminescence Assay MethodPrinciple of Bioluminescence Assay Method

극미약광 측정법극미약광 측정법

- - 광전자계수법에 기초하여광전자계수법에 기초하여 , , 고감도 발광검출장치로 측정고감도 발광검출장치로 측정

NoiseNoise 를 줄이기 위하여 를 줄이기 위하여 (( 진공진공 ) ) 냉각 방식을 채용냉각 방식을 채용

Liquid nitrogen CCD camera Liquid nitrogen CCD camera 사용사용

감도감도 : : 수개의 광자 수개의 광자 (photon) / 10 sec(photon) / 10 sec

• 극미약광 발광 극미약광 발광 MechanismMechanism

1. Chemiexitation1. Chemiexitation

2. Superhelical DNA2. Superhelical DNA

1. Chemiexitation1. Chemiexitation

MitochondriaMitochondria 의 전자전달계에서 전자유출과 동시에의 전자전달계에서 전자유출과 동시에

활성물질 활성물질 (O(O22--, OH, O, OH, O22*, H*, H22OO22, Fe, Fe2+2+/Fe/Fe3+3+)) 이 생성되어이 생성되어

Unsaturated fatty acidUnsaturated fatty acid 와 반응하여 와 반응하여 singlet oxygen(Osinglet oxygen(O22*) *) 생성생성

OO22** 가 가 unsaturated compound (lipid, phospholipid, ubiquinone)unsaturated compound (lipid, phospholipid, ubiquinone)

과 반응하여 과 반응하여 chemiluminescent reactionchemiluminescent reaction

DNA DNA gyrasegyrase

DNA DNA gyrasegyrase

PositivelyPositivelysupertwisted DNAsupertwisted DNA

NegativelyNegativelysupertwisted DNAsupertwisted DNA

no ATPno ATP ATPATP

relaxedrelaxed

G < 0G < 0

2. Superhelical DNA2. Superhelical DNA

Supertwisted DNASupertwisted DNA 가 복제를 위하여 가 복제를 위하여 relaxationrelaxation 될 때될 때 ,,

supertwist 9supertwist 9 개당 개당 -225kj/mol-225kj/mol 의 의 GG 가 발생하여가 발생하여 ,,

이 이 energyenergy 로 극미양발광이 가능한 로 극미양발광이 가능한 exited nucleotide exited nucleotide 생성생성

• 극미약발광의 예극미약발광의 예

동물세포동물세포 : : 간장간장 , , 근육근육 , , 심장심장 , , 신경신경 , , 혈구세포 등혈구세포 등

발광정도는 발광정도는 3-203-20 분간 세포 분간 세포 11 개당 개당 1 photon 1 photon 정도정도

파장은 파장은 400-700 nm400-700 nm

식물세포식물세포 : : 여러 식물이 발아할 때여러 식물이 발아할 때 , Meiosis, Meiosis 하는 세포로부터 하는 세포로부터

극미약광의 변화 확인극미약광의 변화 확인

(superhelical DNA(superhelical DNA 가 원인으로 추측가 원인으로 추측 ))

Yeast (Saccharomyces cerevisiae)Yeast (Saccharomyces cerevisiae)

Logarithmic phaseLogarithmic phase 의 경우 의 경우 UVUV 파장이 많음파장이 많음

Stationary phaseStationary phase 의 경우 가시파장이 많음의 경우 가시파장이 많음

BuddingBudding 할 때 발광이 강함할 때 발광이 강함

막전위 막전위 (membrane potential) (membrane potential) 측정법측정법

- Transmembrane proton gradient- Transmembrane proton gradient

pmf (proton motive force)pmf (proton motive force) 를 가짐를 가짐 pmfpmf 의 의 electrical componentelectrical component 의 단위의 단위 : mV: mV

- Bacteria- Bacteria 에서 에서 outward proton pumping outward proton pumping 결과결과 Plasmic (inner) side: alkaline, electrically (-)Plasmic (inner) side: alkaline, electrically (-)

relative to the periplasmic (outer) siderelative to the periplasmic (outer) side

- Mitochodria - Mitochodria

Matrix side of the inner memb: relatively alkaline, (-)Matrix side of the inner memb: relatively alkaline, (-)

-Chloroplast (thylakoid memb)-Chloroplast (thylakoid memb)

광합성중에 광합성중에 inward proton pumpinginward proton pumping

outer side: alkaline, electrically (-)outer side: alkaline, electrically (-)

-- 막전위 측정 방법막전위 측정 방법

micro-electrode injection: injection micro-electrode injection: injection 위치 파악 곤란위치 파악 곤란

dis-Cdis-C33-5: -5: 형광형광

merocyanin 540: merocyanin 540: 형광형광