Embed Size (px)
Citation preview
ศดรจระพนธ กรงไกร 1
ศดร จระพนธ กรงไกร (jerapankchulaacth)
Ancient Egypt Fermentation
Cell Biology for Medical Students (3000108)-Academic Year 2011
httpbiochemmdchulaacth Cell Biol book 1 chapter 11- Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 2
History of Enzymology
In 1860 L Pasteur identified fermentation of glucose to alcohol is done by yeast
Discovery of Zymase (Diastase) in yeast by E Buchner (NP 1907) and A Harden (NP
1929) sucrose ethanol
In 1926 J Sumner showed the enzyme is a protein (Urease) (NP 1946)
In 1930 J Northrop crystallized preteases in gastro-intestinal tract (= proteins) (NP 1946)
In 1934 D Hodgkin did x-ray diffraction of pepsin (for 3-D structure) (NP 1964)
Ancient Egypt Fermentation
In 1878 Willy Kunhe coined the word ldquoenzymerdquo
Enzumersquo = in yeast or ferment (Greek)
ศดรจระพนธ กรงไกร 3Telomere-Telomerase
H Florey (NP 1945) purified lysozyme hydrolysing cell wall mucopolysaccharides
A Kornberg (NP1959) discovered DNA polymerase in 1957
S Ochoa (NP 1959) discovered RNA polymerase
C Anfinsen S Moore W Stein (NP 1972) discovered catalysis of ribonuclease
D Baltimore R Dulbecco HM Temin (NP 1975) discovered reverse transcriptase (RNA-gtDNA)
W Arber D Nathans H Smith (NP 1978) discovered restriction endonuclease
P Boyer J Walker (NP 1997) discovered ATP synthase JC Skou (NP 1997) discovered NaK-ATPase
ศดรจระพนธ กรงไกร 4
เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to
1 Define enzyme
2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors
metal ions prosthetic groups and coenzymes
3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme
4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction
5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate
concentration using Michaelis-Menten equation
6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations
pH temperature
7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition
of enzyme
8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme
isozyme and covalent modification
9 Discuss the roles of enzymes in clinical application
ศดรจระพนธ กรงไกร 5
Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme
2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction
efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)
classification nomenclature
3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms
4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot
5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH
temperature
6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation
of enzyme activity
7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent
modification
8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and
enzyme defect
ศดรจระพนธ กรงไกร 6
เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)
เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม
ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา
และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ
ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน
1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)
2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)
3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency ampturnover)
Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)
NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)
rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 2
History of Enzymology
In 1860 L Pasteur identified fermentation of glucose to alcohol is done by yeast
Discovery of Zymase (Diastase) in yeast by E Buchner (NP 1907) and A Harden (NP
1929) sucrose ethanol
In 1926 J Sumner showed the enzyme is a protein (Urease) (NP 1946)
In 1930 J Northrop crystallized preteases in gastro-intestinal tract (= proteins) (NP 1946)
In 1934 D Hodgkin did x-ray diffraction of pepsin (for 3-D structure) (NP 1964)
Ancient Egypt Fermentation
In 1878 Willy Kunhe coined the word ldquoenzymerdquo
Enzumersquo = in yeast or ferment (Greek)
ศดรจระพนธ กรงไกร 3Telomere-Telomerase
H Florey (NP 1945) purified lysozyme hydrolysing cell wall mucopolysaccharides
A Kornberg (NP1959) discovered DNA polymerase in 1957
S Ochoa (NP 1959) discovered RNA polymerase
C Anfinsen S Moore W Stein (NP 1972) discovered catalysis of ribonuclease
D Baltimore R Dulbecco HM Temin (NP 1975) discovered reverse transcriptase (RNA-gtDNA)
W Arber D Nathans H Smith (NP 1978) discovered restriction endonuclease
P Boyer J Walker (NP 1997) discovered ATP synthase JC Skou (NP 1997) discovered NaK-ATPase
ศดรจระพนธ กรงไกร 4
เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to
1 Define enzyme
2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors
metal ions prosthetic groups and coenzymes
3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme
4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction
5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate
concentration using Michaelis-Menten equation
6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations
pH temperature
7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition
of enzyme
8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme
isozyme and covalent modification
9 Discuss the roles of enzymes in clinical application
ศดรจระพนธ กรงไกร 5
Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme
2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction
efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)
classification nomenclature
3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms
4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot
5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH
temperature
6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation
of enzyme activity
7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent
modification
8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and
enzyme defect
ศดรจระพนธ กรงไกร 6
เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)
เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม
ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา
และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ
ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน
1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)
2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)
3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency ampturnover)
Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)
NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)
rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 3Telomere-Telomerase
H Florey (NP 1945) purified lysozyme hydrolysing cell wall mucopolysaccharides
A Kornberg (NP1959) discovered DNA polymerase in 1957
S Ochoa (NP 1959) discovered RNA polymerase
C Anfinsen S Moore W Stein (NP 1972) discovered catalysis of ribonuclease
D Baltimore R Dulbecco HM Temin (NP 1975) discovered reverse transcriptase (RNA-gtDNA)
W Arber D Nathans H Smith (NP 1978) discovered restriction endonuclease
P Boyer J Walker (NP 1997) discovered ATP synthase JC Skou (NP 1997) discovered NaK-ATPase
ศดรจระพนธ กรงไกร 4
เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to
1 Define enzyme
2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors
metal ions prosthetic groups and coenzymes
3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme
4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction
5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate
concentration using Michaelis-Menten equation
6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations
pH temperature
7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition
of enzyme
8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme
isozyme and covalent modification
9 Discuss the roles of enzymes in clinical application
ศดรจระพนธ กรงไกร 5
Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme
2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction
efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)
classification nomenclature
3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms
4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot
5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH
temperature
6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation
of enzyme activity
7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent
modification
8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and
enzyme defect
ศดรจระพนธ กรงไกร 6
เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)
เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม
ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา
และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ
ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน
1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)
2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)
3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency ampturnover)
Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)
NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)
rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 4
เอนไซม (Enzyme)Learning objectives The students should be able to
1 Define enzyme
2 Describe structure and function enzyme regarding protein components cofactors
metal ions prosthetic groups and coenzymes
3 Describe enzyme specificity regarding structure of substrate and active site of enzyme
4 Describe effects of an enzyme catalyzed reaction
5 Describe the velocity of an enzyme catalyzed reaction as function of substrate
concentration using Michaelis-Menten equation
6 Discuss factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations
pH temperature
7 Discuss irreversible competitive noncompetive and uncompetitive inhibition
of enzyme
8 Discuss the regulation of enzyme activity regarding allosteric enzyme proenzyme
isozyme and covalent modification
9 Discuss the roles of enzymes in clinical application
ศดรจระพนธ กรงไกร 5
Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme
2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction
efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)
classification nomenclature
3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms
4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot
5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH
temperature
6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation
of enzyme activity
7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent
modification
8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and
enzyme defect
ศดรจระพนธ กรงไกร 6
เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)
เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม
ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา
และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ
ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน
1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)
2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)
3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency ampturnover)
Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)
NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)
rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 5
Learning contents 1 Definition of enzyme ribozyme and deoxyribozyme
2Characteristics of enzyme activation energy of an enzyme catalyzed reaction
efficiency specificity cofactors (metal ions prosthetic groups coenzymes)
classification nomenclature
3 Enzyme active site substrate-enzyme binding catalytic mechanisms
4 Kinetics of enzyme Michaelis-Menten equation Lineweaver-Burk plot
5 Factors affecting enzyme activity enzyme and substrate concentrations pH
temperature
6 Inhibition (irreversible competitive noncompetitive uncompetitive) and activation
of enzyme activity
7 Regulation of enzyme activity allosteric enzyme proenzyme isozyme covalent
modification
8 Clinical application of enzyme laboratory diagnosis therapy drug target and
enzyme defect
ศดรจระพนธ กรงไกร 6
เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)
เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม
ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา
และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ
ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน
1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)
2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)
3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency ampturnover)
Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)
NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)
rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 6
เอนไซมคออะไร (Enzyme definition)
เอนไซม (enzyme E) เปนโปรตนชนดหนงททาหนาทเรงปฏกรยาเคม
ในสงทมชวต (biological catalysts agents of life) โดยเซลลจะสรางขนมา
และเกยวของกบระบบเมตาบอลสมของเซลลนนเปนสวนใหญ
ความหมายของ E จะตองครอบคลมโมเลกลของโปรตนทมลกษณะดงน
1 เรงอตราเรวของปฏกรยาเคม (catalysis)
2 มความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยานน ๆ สง (specificity)
3 ถกนามาใชเรงอตราเรวในปฏกรยาตอไปไดอก (efficiency ampturnover)
Catalysis = Greek Kata (down) + Lyein (loosen)
NB The concentration of most enzymes in a living cell is lt 10-5 M (lt 10 microM)
rapid turnover (high efficiency) of E is very necessary
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 7
E
substrates (A+B) ------gt products (C+D)S P
เรงปฏกรยาใหเรวขนมากกวา 100 ลานเทาขนไป เมอเทยบกบปฏกรยาทไมม E
มความจาเพาะตอปฏกรยา A+ B ---gt C+ D เทานน
เมอเรงปฏกรยาแลว E จะถกนามาใชในการเรงปฏกรยาการเปลยนแปลง
A+ B โมเลกลอนๆ ใหเปน C+ D ตอไปได
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 8
Bond cleavage half life (t frac12) reaction in aqueous at
25 degC 100 degCprotein hydrolysis 400 years 55 weeks
polysaccharide hydrolysis 4700000 years 160 years
RNA hydrolysis 4 years 9 days
DNA hydrolysis 140000 years 22 years
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
Uroporphyrinogen decarboxylase is the most efficient enzyme
(first enzyme of Hemechlorophyll synthesis)
OMP decarboxylase is the second one
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 9
ปฏกรยาทไมม E ใชเวลานานและตางกน
Ref Wolfenden R and Snider MJ (2001) Acc Chem Res 34 938-45 Lewis CA and Wolfenden R (2008) Proc Natl Acad Sci 105 17328-33
(Red = no cofactor)
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 10
ในป 1982 TCech และ SAltman (NP 1989) ไดคนพบโมเลกล RNA สามารถเรงปฏกรยา
การตดตอ RNA ไดเอง จากเชอโปรโตซวชนดหนง เรยกโมเลกลชนดนวา ldquoribozymerdquo
ในป 1997 Breaker ไดคนพบโมเลกล DNA สามารถเรงปฏกรยาบางชนดได จงเรยก
โมเลกลชนดนวา ldquodeoxyribozymerdquo
เปนเอนไซมทไมใชโปรตน เมอเรงปฏกรยาไมสามารถนามาในการเรงปฏกรยาตอไป
Ribozyme (RNAzyme) and Deoxyribozyme(DNAzyme) = Catalytic nucleic acids
(nucleic acids enzyme efficiency lt protein enzyme ~ 105 fold specificity กตามาก )
ปจจบนไดมการพฒนา ribozyme ใหเปน antiviral agents รวมทงใน gene therapy
cancer inflammatory disease และ hematological disorders และไดมการศกษาบทบาท
ribozyme ทมตอ control of gene regulation และ protein synthesis (peptidyl transferase)
Ribozyme and Deoxyribozyme
Carbohydrate (1998) lipid micelles (1980) Catalytic potential
rRNA
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 11
peptidyl transferase on 23S rRNA
of 50S ribosome as ribozyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 12
Deoxyribozyme will have effieciency
and specificity (of sequence to be cut)
Ribozyme and Deoxyribozyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 13
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 14
การเรงปฏกรยาของเอนไซมมลกษณะอยางไร
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 15
รปท 1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยการไปลดคา activation energy เสนทบแสดงการเปลยน S ไปเปน P
โดยไมมการเรงปฏกรยา เสนประแสดงการเปลยน S ไปเปน P โดยม enzyme เปนตวเรง
1 เอนไซมเรงปฏกรยาโดยไปลด activation energy ของปฏกรยา
Eg Sucrose hydrolysis without sucrase 26000 calmol Sucrose hydrolysis with sucrase 9000 calmol
(ground state)
Linus Pauling
(1946)
+ Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 16
E ทางานโดยจะไปลด activation energy (ยอวา ∆G ne หรอ Ea) ของปฏกรยา (E ทกชนด)
คา Ea หรอ ∆ G ne น เปนปรมาณของพลงงานทใชในการใหสาร S เปลยนเปน P
โดยผานภาวะทถกกระตนเรยกวา transition state
ในภาวะดงกลาว S จะอยในภาวะทไมเสถยรทสด (most unstable) และถกเปลยน
เปน P
E ทางานโดยมกจะไปลด entropy (∆s disorder) และ ลด enthalpy (∆H heat) ของ ปฏกรยา (E สวนใหญ)
E จะไมไปทาใหคา ∆G (Gibbs free energy change) ของปฏกรยาเปลยน
รวมทงคา Keq (equilibrium constant = [P][S]) กจะไมเปลยนแปลงดวย
ES ------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 17
E ทางานโดยลด entropy (∆s disorder) ของปฏกรยา Rate enhancement by entropy reduction
Less disorder
More order
disorder
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 18
2 เอนไซมมประสทธภาพการทางานสง (high efficiency)
E จะทาใหปฏกรยาเคมนนเพมขน 108-1019 เทา จากปฏกรยาทไมตองอาศย E
(สวนใหญ ~1015 เทา) Arginine decarboxylase = 1019 เทา
ปฏกรยาเคมใดถาเรงปฏกรยาโดยใชสารเคม (chemical catalysts) จะทาใหเพมขน
เพยง 102-106 เทา
3 เอนไซมมความจาเพาะเจาะจงตอปฏกรยาสง (high specificity)
E มความจาเพาะตอ S ทมนเรงปฏกรยานน รวมทงมความจาเพาะตอ P ทเกดขนดวย
(chemical specificity)
E ยงมความจาเพาะชนด stereospecificity ดวย เชน
จาเพาะตอ D- และ L- isomers α - หรอ β ndashforms
( eg glucose oxidase β-D-glucose gtgtgtgt α-D-glucose)
รวมทง cis- และ trans- forms ดวย
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 19
4 เอนไซมบางชนดตองการปจจยรวมในการเรงปฏกรยา (cofactor)
41 metal ion (14 metals)-Ref
Mg (16) Zn (9) Fe (8) Mn (6) Ca (2) (5 metals=41)
Cu Co Na K Ni V Mo W Cd (eg Cd-carbonic anhydrase) (1-05) (9 metals = 6)
Se (15)-Gluathione peroxidase (ltlt)
E พวกนเรยกวา ldquometalloenzymerdquo (~47 ของ enzyme survey 2009)
โดย metal ion จะมสวนรวมกบ enzymeในการจบกบ S ท active site
ทาให S เปลยนไปเปน P ไดดขน
Reference Waldron et al Nature 460
823-830 (13 Aug 2009)
Mg hexokinase phosphofructokinase enolase
Zn carboxyl peptidease alcohol dehydrogenase
Fe cytochrome oxidase catalase xanthine oxidase
Mn glycosyltransferase hexokinase enolase
Ca lipase lecithinase
Cu tyrosinase superoxide dismutase (SOD)
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 20
42 coenzyme (1932 discovered by E Auhagen)
เปนโมเลกลอนๆ ทไมใช metal ions
มทงชนดทไมจบแนน กบ E และชนดท จบแนน
โมเลกลพวกนมกเปนวตามน เชน riboflavin thiamin niacin
pyridoxine (B-6) pantothenate folic acid B-12
Eg FMN (flavin mononucleotide) FAD (flavin adenine dinucleotide)
TTP (thiamin pyrophosphate)-enzyme pyruvate dehydrogenase
NAD NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)
Pyridoxal phosphate CoenzymeA (CoA panthothenate component)
Tetrahydrofolate 5-methyltetrahydrofolate Cobalamin
(A Todd showed that these coenzymes are derivatives of vitamin B group NP 1957)
1 ชนดทไมจบแนนเชน NADNADP FAD เปน coenzymes ของ E หลายชนด
เชน dehydrogenases ตางๆ ทาหนาท electron carriers
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 21
OH Warburg NP 1931-
structure of NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 22
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 23
2 ชนดทจบแนน (tightly bound) จะเรยก coenzyme นวาเปน prosthetic group
เชน a) Iron porphyrin (heme) complex เปน prosthetic group of cytochrome
oxidase
Apoenzyme + Cofactor ---------gt Holoenzyme
(inactive E) (active E)
b) Biotin prosthetic group of many carboxylases
Iron porphyrin (heme) complex
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 24
การแบงประเภทและการเรยกชอเอนไซม (Classification and nomenclature)
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 25
Class Catalysis Examples
1 Oxidoreductases redox reaction dehydrogenase oxidase reductase
2 Transferases transfer functional transaminasekinase methyltransferase
groups(1-C glycosyl)
3 Hydrolases hydrolysis peptidase glycosidase phospholipase
4 Lyases cleavage of C=C decarboxylase aldolase
C=O C-N bonds
5 Isomerases isomerization isomerase epimerase mutase
6 Ligases synthesis of new synthetase carboxylase
molecules
ตารางท 1 แสดงประเภท การเรงปฏกรยาและตวอยางของเอนไซม
การแบงประเภทเอนไซม
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 26
ตวอยาง EC 1111 (EC = Enzyme CommitteeCommission IUBMB 1964)
class 1 oxidoreductase
subclass 11 acting on CH-OH group of donor
subsubclass 111 with NAD+ or NADP+ as acceptor
serial numbers 1111 AlcoholNAD+ oxidoreductase
systemic name เรยกวา Alcohol NAD+ oxidoreductase
trivial name เรยกวา Alcohol dehydrogenase
เพอความสะดวกเรามกใช trivial name ของ E ในการเรยกชออยเสมอ
เชน pepsin carboxypeptidase cytochrome oxidase
Substrate + ase = enzyme name eg protein + ase = protease
การเรยกชอเอนไซม
C2H5OH + NAD+ CH3CHO + NADH
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 27
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 28
กลไกการเรงปฏกรยาของเอนไซม (enzyme catalytic mechanisms)
primary structure polypeptide chain (sequence of amino acids)
secondary structure coil of chain ( α-helix β-pleated motif etc)tertiary structure globular proteins (showing conformation catalytic properties)
quaternary structure subunit association (dimer tetramer oligomer)
monomeric enzyme
(very few)
dimer
tetramer
pepsin
subunit
oligomeric enzyme
(majority)
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 29
รปท 2 แสดงการจบระหวาง substrate และ เอนไซมท active site
มาพจารณา globular protein ทเปนเอนไซม
E มบรเวณทจบกบ S เพอเปลยนเปน P เรยกวา active site
ม catalytic residues กรดอะมโนในบรเวณนนทเปลยน S เปน P ได
active site ของ E จะมลกษณะเปนรอง (cleft) มเนอทอยเพยงนดเดยวเมอเทยบ
กบโมเลกลของ E
E จบกบ S โดยอาศยพนธะ hydrogen ionic hydrophobic และ van der Waals
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 30
ทฤษฎทใชอธบายการจบของ E กบ S ม 2 ทฤษฎ ดงน
1 Fischerrsquos Lock and Key theory (Jigsaw model= Template theory) โดย Emil Fischer (1894)
E เปรยบเหมอน lock และ S เปรยบเหมอน key คอ E จะม active site ทสอดคลอง
(complementary) กบรปรางหรอโครงสราง (structure) ของ S อยางพอดอยแลว ทาให S จบ
กบ E ได เหมอนลก -แมกญแจ (The key will fit only to its own lock)
2 Koshlandrsquos Induced-fit theory โดย Daniel Koshland (1959)
S จะจบกบ E แลวเหนยวนาให E เปลยนรปรางใหสอดคลองกบ S ทจบไดพอด นนกคอ
active site ของ E จะมรปรางสอดคลองกบ S ไดพอด หลงจากจบกบ S แลว (The S induces conformational changes in the E such that precise orientation of catalytic groups is affected
like glove (E) and hand (S) enters to it)
รปท 3 Model แสดงการจบ
ระหวาง substrate และ
enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 31
ขนตอนการเรงปฏกรยาเคมโดยเอนไซม
1 E จบกบ S ท active site (ES complex)
2 มการเปลยนแปลงโครงสราง (conformational change)
3 เกดปฏกรยา acid-base catalysis (proton donorsacceptors)
ระหวาง catalytic residues กบ S (ขนกบชนด E)
4 มการสราง covalent intermediates (covalent catalysis ขนกบชนด E)
5 ปลอย P ออกจาก E (เกด EP complex กอน)
6 E ถกนาไปเรงปฏกรยาไดใหม (turnover)
(Eg carbonic anhydrase = 600000 cycle per second
lactate dehydrogenase = 1000 cycle per second
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase = 100 cycle per second)
E lt----------------------- ES ----------gt ES ----------gt P
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 32
รปท 4 การสลายพนธะเปปไทดโดยเอนไซม carboxypeptidase A (CPA)-monomeric enzyme
CPA เปน E ทสลายพนธะเปปไทดดานปลายคารบอกซลของ polypeptide chain
CPA มจานวนกรดอะมโน 307 ตว
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 33
รปท 5 แสดงโครงสราง 3 มตของ CPA โดยม Zn2+ เปนองคประกอบโดยยดดวย
พนธะ coordination กบกรดอะมโนของ Glu 72 His 196 และ His 69
N
C
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 34
รปท 6 ให S เปน glycyltyrosine จบกบ CPA ท active site โดยมกรดอะมโนของ
Arg 145 Tyr 248 และ Glu 270 ทาหนาท catalytic residues ของ CPA
มกรดอะมโนทเกยวของดงน Glu 270 Tyr 248 และ Arg 145 รวมทง Zn2+
ทถกยดไวดวยกรดอะมโน Glu 72 His 196 และ His 69
มพนธะอยางออน (เสนประ) ยดระหวาง E กบ S เกดการเปลยนแปลง
โครงสรางของ E เนองจากม S มาจบอย
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 35
รปท 7 ขนตอนการเรงปฏกรยาในบรเวณ
active site ของ carboxypeptidase
กรดอะมโนทเกยวของในการเรงปฏกรยา จะยดตดกบ S ทาใหมนอยในตาแหนงทใกลชดกบ S
มากขน (proximity effect) เกดการสลายพนธะเปปไทดได โดยอาศย acid-base catalysis
สราง covalent intermediate ชนด tetrahedron จากนนจะสลายได product
Base catalysis
Acid catalysis
Covalent intermediate
Proximity effect decrease entropy
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 36
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 37
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 38
Crystal of P falciparum OMPDC needle-shaped crystals amp X-ray diffraction pattern
orotidine 5rsquo-monophosphate decarboxylase
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 39
3-D structure of OMPDC (27 Aring resolution)
TIM barrel
top view (dimer)side view (monomer)
45 Aring62 Aring
40 Aring
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 40
Native 27Å resolutionComplex 26Å resolution
Structural Change of OMPDC upon binding of UMP
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 41
Enzyme (Protein) Catalysis ndash Specificity - Efficiency
Turnover EfficiencyConclusion Part I
Catalysis
Specificity
Most enzymes are known to have evolved to work nearly as efficiently as is physical possible
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 42
จลนศาสตรของเอนไซม (Enzyme kinetics)
Kinetics = Study of reaction rate
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 43
รปท 8 ความสมพนธระหวางความเขมขนของเอนไซมตางชนดและอตราเรวของปฏกรยา
จลนศาสตรของเอนไซม
1 ความเขมขนของ E (เมอให [S] สงมาก)
โดย v จะแปรตาม [E] และ E ตางชนดกนจะใหคา v แตกตางกนดวย
Velocity (v) = Activity = Unit (micromol per min) or katal (mol per sec)
ปจจยทมผลตอจลนศาสตรของเอนไซม
อตราเรวของปฏกรยา ES ------gt P
v
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 44
รปท 9 ความสมพนธระหวางความเขมขนของ substrate และอตราเรวของปฏกรยา
2 ความเขมขนของ S
คา v สมพนธกบ [S] เปน hyperbolic graph และท [S] สงๆ คา v จะไมเพมขนอกตอไป
(saturation)
คา v ทตาแหนงนจะเรยกวา maximum velocity เรยกยอวา Vmax ของปฏกรยานนๆ
คา v จะเรยกวา initial velocity
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 45 รปท 10 ความสมพนธระหวางคา pH และอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซมบางชนด
3 pH
E ทางานดทสดท pH หนงๆทเหมาะสม จะเรยกวา pH optimum
การเปลยนแปลง pH ใหสงมากหรอตาไปอาจจะทาให E เสยสภาพธรรมชาต
(denaturation) หรอทาใหการจบกนระหวาง S กบ E เกดขนไมด
ผลกคอ E จะทางานไดนอยลง หรอไมทางานเลย
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 46
รปท 11 ความสมพนธระหวางอณหภมและอตราเรวของปฏกรยาของเอนไซม
4 อณหภม
ปกตปฏกรยาเคมจะเพมขนเมอเพมอณหภมสงขน
ในการเรงปฏกรยาโดย E เมออณหภมมากขน จะทาใหทางานดขน
ถาเกน 60oC E จะทางานลดลง เพราะอาจถก denature โดยความรอน
ทอณหภมตา การจบกนของ E กบ S เกดขนไมด ทาให E ทางานไดนอยลง
E ทวไปมกจะม optimum temperature ทประมาณ 37 oC ซงใกลกบอณหภมปกตของเซลล
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 47
5 ความดนบรรยากาศ (pressure)
คา v ของ E จะแปรตามความดน ถาความดนสง ๆ จะทาลาย E (denaturation) ได
6 ความเขมขนของประจ (ionic strength)
คาความเขมขนของสารละลายทมประจ ทใชในการศกษา E นน จะมคา
ionic strength ทเหมาะสมประมาณ 01-02 M ถาคานมากหรอนอยเกนไป
ทาใหมผลตอ activity ของ E ได
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 48
สมการของ Michaelis-Menten
พจารณาจากปฏกรยาขางลาง โดยใหมการสราง ES complex เปนตวกล k1 k3
E + S ES E + P
k2
สมมตใหปฏกรยาอยในภาวะ steady state คอ [ES] คงทตลอดเวลา
จะทาให อตราการสราง ES เทากบอตราการสลาย ESco
ncen
trat
ion
time
E
ES
PS
steady state
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 49
รปท 12 ความสมพนธแบบจลนศาสตรของ Michaelis-Menten ระหวางความเขมขนของsubstrate
([S]) และอตราเรวของปฏกรยา (v) โดยคา Vmax เปน อตราเรวของปฏกรยาสงสด และ Km
เปนคาคงทของ Michaelis [ Km = (k2+k3)k1 ]
Km
Vmax
= (k2+k3)k1
V
Michaelis constant
คา v ของปฏกรยาจะขนกบ [S] และเมอเพม [S] มากๆ
จะทาใหเกดปฏกรยาสงสด (Vmax) นนคอ active site บน E จะจบกบ S จนหมด
Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 50
จากสมการ Michaelis-Menten จะไดความสมพนธของ v
กบ [S] ดงน
v = V max [S] _____________________(1)
Km + [S]
คา Km เรยกวา Michaelis constant สามารถหาได โดยจะมคาเทากบ [S] ทใหปฏกรยา
เกดขนเปนครงหนงของ Vmax ซงกคอในขณะนนครงหนงของ active site บน E จบอย กบ S
ท [S] นนๆ
Km = [S] at 12 Vmax ----------------------------------(2)
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 51
bull คา Km มหนวยเปน molesliter (M)
bull คา Km ใชเปนคาบอกการจบระหวาง S กบ E ท active site (affinity)
bull ถาคา Km ตา แสดงวา E นนจบกบ S ไดด และ [S] ทใชในปฏกรยาจะตาไปดวย
bull คา Km ของ E มกจะอยระหวาง 10-1-10-6 M (และ ใกลเคยงกบคา physiological
concentration ของ S ในเซลลนน)
เชน Km ของ pepsin = 3x10-4 M
Km ของ glucokinase = 5x10-5 M
bull คา Km จะไมขนกบ concentration ของ E
Km is the signature of the enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 52
คา kcat คอ จานวนโมเลกลของ S ถกเปลยนเปน P ใน 1 หนวยเวลา
ในขณะท active site ของ E จบกบ S หมด คา kcat มคาระหวาง 1-108 ตอวนาท
(สวนใหญ ~ 50-1000 s-1)
kcat = Vmax [E] ______________________(3)
ตวอยาง carbonic anhydrase CPA pepsin lysozyme
มคา kcat เทากบ 6x105 6x102 05 และ 05 ตอวนาท ตามลาดบ
kcat = k3 = turnover number of enzyme
kcat Km = catalytic efficiency of enzyme unit = M-1 s-1
Many enzymes have catalytic efficiency (kcat Km) of 106-5x108 M-1 s-1
Eg carbonic anhydrase has kcat Km of 5x108 M-1 s-1
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 53
จากสมการ v = Vmax[S] จะเปลยนเปนรปของสมการ Lineweaver-Burk ไดดงน
Km+[S]
1 = Km 1 + 1 _____________________(4)
v Vmax [S] Vmax
นาคา 1v (Y axis) และ 1[S] (X axis) มาสรางเปนกราฟเรยกวา Lineweaver-
Burk plotldquo (1934) โดยจะไดกราฟเสนตรงทม
คาทเสนตดแกน X เปน -1Km
คาทเสนตดแกน Y เปน 1Vmax
คาความชน (slope) เปนคา Km Vmax
Y = a X + b
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 54
รปท 13 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมชนด Michaelis
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 55
การยบยงและการกระตนการทางานของเอนไซม
(Enzyme inhibition and activation)
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 56
การยบยงการทางานของเอนไซม
สารยบยงการทางานของ E เรยกวา inhibitor (I)
ลกษณะการยบยง ม 2 แบบดงน
1 การยบยงแบบไมทวนกลบ (Irreversible inhibition) สารยบยงแบบนจะเรยกวา ldquoirreversible inhibitorsrdquo
irreversible inhibitor มกจะไปจบกบหม -OH-SH ของ serinecysteine ท active site
และจะไปทาลาย activity ของ E โดยการสรางพนธะ covalent กบ functional groups
ตวอยาง Irreversible inhibitor
สาร organophosphates
Diisopropylphosphofluoridate (DIPF)
Sarin (nerve gas methylisopropylphosphofluoridate)
เชน acetylcholinesterase chymotrypsin trypsin หรอพวก coagulating factors
ยา antibiotic penicillin จะไปยบยงการทางานของ glycopeptide transpeptidase
ในการสราง cell wall ของแบคทเรยโดยจะจบกบ OH ของ serine ท active site ของ E
เชนเดยวกบ DIPF
Aspirin inhibits cyclooxygenase (prostaglandin synthesis) by serine acetylation
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 57
รปท 14 สารยบยงแบบไมทวนกลบทสรางพนธะโควาเลนตกบเอนไซม
H H
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 58
2 การยบยงแบบทวนกลบ (Reversible inhibition)
เมอม I จะยบยงการทางานและเมอเอา I ออก จะทาให E นนกลบทางานใหมได
เรยก I นวา reversible inhibitors
แบงเปน 3 กลมดงน
21 Competitive inhibition (competitive inhibitor)
I จะมรปรางคลายกบ S (อาจเรยก S analog) ทาใหไปแยง S ในการจบ
ท active site ผลกคอ E จบกบ S ไดนอยลง E กจะม activity
ตวอยาง
1 succinate dehydrogenase (malonate จะเปน I ของ E เพราะ
ม โครงสรางคลาย succinate)
2 pteroate synthase ( sulfanilamide = p-aminobenzoic acid (PABA)
analog--- G Domagk NP 1939-sulfa drug)
ผลของการยบยงน จะให คา Km เพมขนแต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 59
รปท 15 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม competitive inhibitor
คา Km เพมขน แต Vmax คงท
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 60
Pepsin-pepstatin complex (Enzyme-competitive inhibitor complex)
Antibiotic pepstatin is pentapeptide ( has 4 unhydrolyzed peptide bonds)
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 61
HIV-1 Reverse Transcriptase (RT)RT is a viral polymerase responsible for synthesis of viral DNA strandThe RT inhibitors are majority for drugs in clinical use
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 62
Avian flu H5N1 virus Neuraminidase (NA) Enzyme NA is responsible for release of virion from the host epithelial cells by cleaving the receptor sialic acid NA inhibitor is the drug in clinical use eg zanamivir (Relenza) and oseltamivir (Tamiflu)
Crystal of NA-Tamiflu complex
Tamiflu
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 63
Competitive inhibitors ยงมอกชนดหนงทเรยกวา transition-state analogrdquo
เปนสาร I ทมโครงสรางเหมอนกบ S ในขณะทอยใน transition state (transition state
intermediate) โดย I พวกนจะจบกบ E ไดดกวา S
ตวอยางเชน N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ใชยบยงเซลลมะเรง
โดยจะมโครงสรางคลายกบตวกลางของ S ใน transition state ในเอนไซม
aspartate transcarbamylase (ATCase)-W Lipscomp (NP 1976)
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 64
รปท 16 การเรงปฏกรยาโดยเอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) และ โครงสรางของ N-phosphonacetyl-L-aspartate (PALA) ทคลายกบโครงสราง
ของ transition-state ในปฎกรยา
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 65
22 Noncompetitive inhibition (noncompetitive inhibitor)
ตวอยาง Ag+ Hg2+ Pb2+ จะจบกบ -SH ของ cysteine หรอ CN- จบกบ
iron porphyrin (heme) ของ cytochrome oxidase ไปยบยงการทางาน สามารถ
แกไขได โดยเตมสารไปจบ I เหลานใหหลดจาก E ไดเชน CN- ไปดง metal ionsได
I แบบนจะจบคนละตาแหนงกบ active site ผลคอ
- Km คงท
- Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 66
รปท 17 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม noncompetitive inhibitor จบทไมใชตาแหนง active site
Km คงท Vmax ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 67
23 Uncompetitive inhibition (uncompetitive inhibitor)
พบนอยมาก (เชน hydrazine ยบยง arylsulphatase) I แบบนจะจบกบ E
ไดเฉพาะในรป ES complex เทานน ทาใหมการลดลงทงคา Vmax และ Km
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 68
รปท 18 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทม uncompetitive inhibitor อย
คา Vmax และ Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 69
การกระตนการทางานของเอนไซม
สารกระตน (activator A) จะเรงปฏกรยาใหเพมขน
ตวอยางทสาคญคอ metal ions โดยจะทาหนาทเปน acids (electrophiles)
ในการ acid-base catalysis รวมทงยงทาให E หรอ S เกด strain เพมขน
ผลคอ E จบกบ S ดขน (Km จะลดลง) ทาให [S] ทใชในปฏกรยาลดตาลงดวย
อาจเรยกวา metal ion catalysis กได
Zn (magenta sphere)-carbonic anhydrase +
compounds 1-6 (activator)
histamine
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 70
รปท 19 Lineweaver-Burk plot ของเอนไซมทมสารกระตนการทางานอย
Km ลดลง
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 71
การควบคมการทางานของเอนไซม (Enzyme regulation)
Allosteric enzymeM-M enzyme
[S]
v
Allosteric enzyme
Proenzyme = zymogen Enzyme complex
Isoenzyme = isozyme
Enzyme covalent modificatiom
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 72
การควบคมการทางานของเอนไซม
1 Allosteric enzyme (regulatory enzyme=key enzyme=rate limiting enzyme= Vmax) E เหลานจะตองประกอบดวย subunits หลาย หนวย (quaternary structure)
เมอมจบกบ S ทหนวยท 1 จะให S ตวตอไปจบกบหนวยท 2 ไดดยงขนตอไปเรอยๆ
(เรยกวา Cooperativity = co-op)
กราฟความสมพนธ v กบ [s] เปนรป sigmoidal curve (S-shape)
การควบคมแบบนมกพบในวถการสงเคราะหชวโมเลกลตางๆ
โดยท end product จะมายบยงการทางานท E ตวแรกๆ ของวถนนๆ
E1 E2 E3 E4 E5 A I I B C D E Z
End product+
Feedback inhibition
Feedforward activation
21
34
S1 S2
S3S4
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 73
ตวอยาง การสงเคราะหไพรมดนนวคลโอไทด UMP (end product) จะยบยงเอนไซม
carbamyl phosphate synthase II (CPS II E1) ซงเปน E ตวทหนงของวถการสงเคราะห
พบไดทงในเซลลแบคทเรย และสตวเลยงลกดวยนม โดย UMP จบ E ทไมใช active site
ซงเรยกวา ldquoallosteric siterdquo ( allo = other not active site )
HCO3- + ATP + Gln carbamyl phosphate
รปท 20 ก แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
allosteric site
allosteric site
R = relax form
T = tense (taut)
form
R = active T = inactive
active site
allosteric site
pink
active site purple
CPS II
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 74
รปท 20 ข แสดงการควบคมแบบ allosteric ของ regulatory enzyme
Allosteric enzyme อาจจะประกอบดวย regulatory subunit (R subunit) ให effector
มาจบ (allosteric site) ควบคม activity ของ catalytic subunit (C subunit) ใน E นน ๆ
เชน เอนไซม aspartate transcarbamylase (ATCase) ตวทสองของวถดงกลาวในแบคทเรย
ATCase จะถกกระตนดวย ATP และถกยบยงดวย CTP โดย ATP CTP ไปจบท
allosteric sites บน R subunit มผลตอ activity ของ C subunit (W Lipscomb NP 1976)
Effector = ATP or CTP
Sigmoidal curve (S-shape)
ATP Km
CTP Km
C subunit
R subunit
C 6+ R 6
(allosteric site)
(active site) Carbamyl phosphate + Asp dihydroorotate ATCase
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 75
2 Isozymes (Isoenzymes)
เปน multiple forms ของ E ตวหนงทสามารถเรงปฏกรยาเดยวกน โดย forms ตางๆ
เหลานมาจาก gene ตางชนดกน จะม amino acid composition ตางกน
คาทางจลนศาสตร เชน Vmax Km ตางกนดวย
Tetramer
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 76
ตวอยางทสาคญคอ lactate dehydrogenase (LDH LD) ประกอบดวย 4 subunits
ทมโครงสรางตางกน 2 ชนด คอ M (muscle) และ H (heart) subunit ทาใหได E
ถง 5 forms คอ
M4 M3H M2H2 MH3 H4
(muscle) LDH5 LDH4 LDH3 LDH2 LDH1 (heart)
- ve ---- electrophoresis------gt + ve
M4 จะพบมากในตบ กลามเนอ H4 พบมากในหวใจ
isozymes ทเหลอจะพบในไต สมอง และเมดเลอดแดง
ในกลามเนอ E ทใชเปน M4 ซงจะเปลยน pyruvate ----gtlactate
เพอเขา anaerobic metabolism
ในขณะทหวใจ E ทใชเปน H4 จะเปลยน lactate ----gtpyruvate
เพอเขา aerobic metabolism เพอสรางพลงงานไดตอไป
M4
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 77
creatine phosphokinase or creatine kinase (CPK CK)
ประกอบดวย 2 subunits M (muscle) และ B (brain)
E มได 3 isozymes
- CK-BB พบมากทสดในสมอง
- CK-MM พบเฉพาะในกลามเนอ
- CK-MB พบไดในกลามเนอและหวใจ
โดยท myocardial cell จะม 12-15 ของ CK ทงหมด
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 78
3 Proenzyme (zymogen inactive enzyme)
ตวอยาง E ในระบบยอยอาหาร และระบบแขงตวของเลอด โดยเซลลจะ
สรางเปน inactive form กอน
เมอตองการใชกจะถกเปลยนเปน active E อยางรวดเรว และ E อนๆ
ทเกยวของจะถกกระตนใหทางานในลกษณะเพมจานวนมากขน (amplification)
ลกษณะเชนนจะเรยกวา enzyme cascade
proenzyme active
protease (trypsin)
chymotrypsinogen -------------gt chymotrypsin
pepsinogen ------------gt pepsin
(self activation H+)
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 79
protease (trypsin then chymotrypsin)
chymotrypsinogen (Pro-CT) -------------gt chymotrypsin (CT)
trypsin
chymotrypsin
Example of proenzyme and how does it activate I
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 80
Example of proenzyme and how does it activate II
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 81
4 Multienzyme complex (Metabolons)
PDH-size 14-15 MDa hexamer ~ 9 MDa (Ribosome=27 MDa)
Ref RN Perham et al (2005) Structure 13 1119-32
E หลายตวมารวมกนเปน complex เพอทาหนาทตอเนองกนทาใหการเรง
ปฏกรยาในเมตาบอลสมเกดขนไดรวดเรว (increase efficiency) อนเปนผลจาก evolution
ตวอยาง pyruvate dehydrogenase (3 E complex= 60 subunits) -size 14 MDa (Ribosome=27 MDa)
fatty acid synthetase (6-7 E complex in mammal yeast bird)
glycolysis (5 Es out of 11 Es are complex binding to red cell membrane)
purine de novo synthesis (6 Es in eukaryotes catalyze 10 reactions = complex
as purinosome (2008-2010))
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 82
5 Covalent modification
E บางครงถกเตมหมบางหมเขาไปในกรดอะมโน ทาให E นนถกควบคมการทางาน
ได เชน E ทใชสงเคราะหและสลายไกลโคเจน จะถกเตมหมฟอสเฟต (phosphoryl group)
เขาไปท OH ของ serine (E-P) ทาใหยบยงหรอกระตนการทางานได
กรดอะมโนอนๆ ทถกเตมหมฟอสเฟตได เชน threonine tyrosine histidine (no OH)
Example Activity state
Low High
Glycogen synthase E-P E
Glycogen phosphorylase E E-P
6 Gene regulation
E จะถกควบคมการสราง โดย gene เฉพาะหนงๆ หาก gene นนถกกดอย
(repression) E กจะไมสามารถสรางได ความรเรองนจะไดศกษาตอไป
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 83
Covalent modification (Fischer amp E Krebs NP1992 = protein phosphorylation)
Protein phosphorylation alters enzyme activity
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 84
Example of covalent modification of human enzymes
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 85
Covalent modification by other modifiers
adenylylation
uridylylation
ADP-ribosylation
methylation
NB Some enzymes have several regulatory mechanisms
eg glycogen phospholylase
- allosteric enzyme (activator = AMP)
- covalent modification (active-E-P)
- isozymes (a b) etc
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
ศดรจระพนธ กรงไกร 86
End
Exam MCQs10 questions with 5 choices
References are in Med Cell Biol book 1
chapter 11-Enzyme
