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中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６（１１）：９０９７

ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ．２０１６１１１３

工程大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究进展

房立霞　曹英秀　宋　浩（天津大学化工学院　系统生物工程教育部重点实验室　天津化学化工协同创新中心合成生物学平台　天津　３０００７２）

摘要　游离脂肪酸作为一种重要的平台化合物，其衍生产品被广泛应用到能源、化学工业中。作为更加可持续、绿色的生产策略，利用工程微生物合成游离脂肪酸是以石油基和动植物为原料生

产脂肪酸类产品的重要补充。大肠杆菌作为经典的模式微生物，通过对其进行代谢工程改造，脂

肪酸的积累已经从痕量提高到了约９ｇ／Ｌ，展示了其作为脂肪酸合成菌株的巨大应用潜力。随着合成生物学技术的涌现，“感应调控器”、体外重构、β氧化逆循环、异源合成途径的整合等思路的引入极大地加快了工程大肠杆菌脂肪酸合成的进化速率，并赋予大肠杆菌合成多种脂肪酸产品

的能力。对近年来通过代谢工程和合成生物学手段改造大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究进展进

行综述，对其发展前景进行展望。

关键词　脂肪酸　代谢工程　合成生物学　大肠杆菌　工程微生物中图分类号　Ｑ８１９

收稿日期：２０１６０３３１　　修回日期：２０１６０４２５ 国家自然科学基金资助项目（２１５０６１５３）通讯作者，电子信箱：ｃａｏｙｉｎｇｘｉｕ＠１６３．ｃｏｍ

　　作为一种平台化合物，脂肪酸被广泛应用于多个

领域。其衍生的烷／烯烃和脂肪酸酯比短链醇具有更

高的能量密度，并且与汽油不存在１０％ ～２０％的混合

壁垒，被认为是更有潜力的替代燃料［１］。而衍生的脂

肪醇和三酰甘油等产品因具有优良的亲疏水性，也是

洗涤剂、润滑剂、化妆品和药物等多种化学工业产品的

主要原料［２］。但现阶段脂肪酸主要从石油或动植物中

提取，存在可持续性差、与粮食争地等问题，因此利用

工程微生物高效地合成可再生脂肪酸成为了近年来的

研究热点［３４］。

　　因为遗传背景清晰，大肠杆菌的脂肪酸代谢和调

控被最早研究［５６］。值得注意的是，除了合成细胞必需

的脂质和细胞膜，大肠杆菌自身几乎不积累游离脂肪

酸。但是通过表达合成路径中的关键基因［７］、敲除旁

路代谢途径［８］、上下游代谢模块的适配［９］等代谢工程

改造，大肠杆菌中脂肪酸的产量已经达到约９ｇ／Ｌ［９１０］，

展示了大肠杆菌巨大的工业脂肪酸合成潜力。另外，

随着合成生物学技术的成熟与运用，大肠杆菌脂肪酸

合成速率和产品种类也得到了更快的发展。实时反馈

调控［１１１２］、体外重构代谢路径指导体内改造［１３］等新思

路，减少了无义工程菌株的构建数量。β氧化循环的逆

转［１４１５］和多物种合成路径的整合［１６１７］，也赋予大肠杆

菌更高效地合成多种脂肪酸产品的能力。这些合成生

物学技术极大地拓宽了大肠杆菌脂肪酸的合成方式和

应用范围。本综述从代谢工程和合成生物学的角度对

重组大肠杆菌合成脂肪酸的研究进展进行详细介绍并

展望其发展前景。

１　代谢工程手段

　　提高大肠杆菌脂肪酸产量的代谢工程手段主要是

通过调控脂肪酸代谢路径中基因的表达水平实现的，

包括敲除脂肪酸降解路径和前体旁路代谢路径的基

因、过表达脂肪酸合成路径的基因及组合优化，如图１

所示。

１．１　优化代谢路径

　　提高脂肪酸的积累首先需要阻断脂肪酸的降解路

径或其合成前体的旁路代谢途径。β氧化是脂肪酸降

解的主要路径，脂酰辅酶 Ａ（ｃｏｅｎｚｙｍｅＡ，ＣｏＡ）合酶

（ｆａｄＤ）和脂酰 ＣｏＡ脱氢酶（ｆａｄＥ）分别催化 β氧化的

第一、二步反应，敲除 ｆａｄＤ或 ｆａｄＥ可以阻断脂肪酸的

分解代谢［７８］。另外，敲除三羧酸（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄ，

２０１６，３６（１１） 房立霞 等：工程大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究进展

ＴＣＡ）循环中的若干基因可以减少乙酰 ＣｏＡ的旁路代

谢分流，其中敲除琥珀酰 ＣｏＡ脱氢酶基因 ｓｕｃＣ可显著

提高脂肪酸产量［１８１９］。

图１　大肠杆菌脂肪酸代谢途径及其工程改造

Ｆｉｇ．１　ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＮｏｔｅｓ： ｇｅｎｅｄｅｌｅｔｉｏｎ； ｇｅｎｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

ａｃｃ：ａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ｆａｂＤ：ｔｒａｎｓａｃｙｌａｓｅ；ｆａｂＨ：ｋｅｔｏａｃｙｌＡＣＰｓｙｎｔｈａｓｅ；ｆａｂＧ：ｋｅｔｏａｃｙｌＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｆａｂＺ／ｆａｂＡ：ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌＡＣＰ

ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ；ｆａｂＩ：ｅｎｏｙｌＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ；ｆａｂＦ／ｆａｂＢ：３ｏｘｏａｃｙｌＡＣＰｓｙｎｔｈａｓｅ；ｔｅｓＡ′：ｔｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅ；ｆａｄＤ：ａｃｙｌＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｆａｄＥ：ａｃｙｌＣｏＡ

ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｇｌｔＡ：ｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ；ｓｕｃＣ：ｓｕｃｃｉｎｙｌＣｏＡｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ｆｕｍＡＣ：ｆｕｍａｒａｔｅｈｙｄｒａｔａｓｅ

　　过表达脂肪酸合成路径中的各基因是提高大肠杆

菌脂肪酸合成能力的另一个有效手段。ａｃｃ编码的乙

酰ＣｏＡ羧化酶（ａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＡＣＣ）催化乙酰

ＣｏＡ生成丙二酰 ＣｏＡ是脂肪酸合成过程的限速步

骤［７，２０２２］，丙二酰ＣｏＡ生成丙二酰酰基载体蛋白（ａｃｙｌ

ｃａｒｒｉｅｒｐｒｏｔｅｉｎ，ＡＣＰ）由 ｆａｂＤ编码的酰基转移酶

（ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＦａｂＤ）催化完成［２３２４］；ｆａｂＩ、ｆａｂＺ和 ｆａｂＧ

编码的烯脂酰ＡＣＰ还原酶 （ｅｎｏｙｌＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ，

ＦａｂＩ）、羟 脂 酰ＡＣＰ 脱 水 酶 （ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌＡＣＰ

ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ，ＦａｂＺ）和酮脂酰ＡＣＰ还原酶（ｋｅｔｏａｃｙｌＡＣＰ

ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＦａｂＧ）催化脂肪酸合成路径的链延长反

应［１３，１８１９］，过表达这些基因可以不同程度地提高脂肪

酸的产量。脂酰ＡＣＰ的积累对脂肪酸合成途径中的很

多酶都会产生反馈抑制作用［２５２７］，硫酯酶可以将脂肪

酸从酰基运载蛋白上水解下来解除这种反馈抑制。过

表达大肠杆菌本身的硫酯酶基因 ｔｅｓＡ′和 ｔｅｓＢ可大量合

成Ｃ１４脂肪酸［８，１０，２８］；过表达不同植物和其他菌种来源

的硫酯酶会专一性地大量合成某一种或几种特定长度

的游离脂肪酸，如香樟樟脑（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍｃａｍｐｈｏｒｕｍ，

ＣｃＴＥ，Ｃ１４，１６）［１３，２２］、加州月桂（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ，

ＵｃＴＥ，Ｃ１２）［７，２８］、蓖 麻 （Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ，ＲｃＴＥ，

Ｃ１４，１６）［２９］、麻疯树（Ｊａｔｒｏｐｈａｃｕｒｃａｓ，ＪｃＴＥ，Ｃ１４，１６）

［２９］、不

动杆菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒｂａｙｌｙｉ，ＡｂＴＥ，Ｃ８１６）［３０］、化脓链球

菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ，ＳｐＴＥ，Ｃ１２，１４）［３１］等，大大地丰

富了产物的多样性。

　　在上述提及的单独敲除或过表达基因的手段中，

过表达硫酯酶对大肠杆菌脂肪酸合成的促进效果最为

明显，脂肪酸产量提高幅度可以达到几倍至几十

倍［７，３０］。另外，综合应用上述策略可更大程度地提高

脂肪酸产量（表１）。例如，在敲除 ｆａｄＤ的菌株中过表

达ｔｅｓＡ′和ＣｃＴＥ可将脂肪酸的产量提高近２０倍［２２，３０］；

在敲除 ｆａｄＤ的菌株中，过表达 ｆａｂＺ和 ＲｃＴＥ并敲除ｓｕｃＣ可产得５．７ｇ／Ｌ的Ｃ１４，１６脂肪酸

［１９］。

１．２　上下游代谢模块适配

　　在多基因代谢路径中，利用代谢工程手段可以提

高限速步骤等的反应速率，但由此积累或消耗的前体

物和中间体并不能完全协调下游路径，甚至会降低细

胞活力和路径产率。Ｘｕ等［９］基于乙酰 ＣｏＡ和丙二酰

ＣｏＡ这两个关键中间体将大肠杆菌脂肪酸合成路径划

分为各自独立却又相互联系的三个模块：上游乙酰ＣｏＡ

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中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３６Ｎｏ．１１２０１６

表１　代谢工程优化大肠杆菌中脂肪酸的合成

Ｔａｂｌｅ１　ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ

Ｅ．ｃｏｌｉ ＤｅｌｅｔｉｏｎＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｏｔｈｅｒｓ ＴｈｉｏｅｓｔｅｒａｓｅＣｕｌｔｕｒｅｔｙｐｅ Ｔｉｔｅｒ（ｇ／Ｌ） Ｙｉｅｌｄ（％ ｍ／ｍ） Ｒｅｆ

ＤＨ１ ｆａｄＤ － ＴｅｓＡ′ Ｂａｔｃｈ ０．７ ３．５ ［８］

ＤＨ１ ｆａｄＥ － ＴｅｓＡ′ Ｂａｔｃｈ １．１ ６．０ ［８］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ／ｓｕｃＣ － ＲｃＴＥ Ｂａｔｃｈ １．３ １１ ［１８］

ＢＬ２１ － ＴｅｓＡ′ Ｆｅｄｂａｔｃｈ ５．１ ４．１ ［１０］

ＢＬ２１ － － ＡｂＴＥ Ｆｅｄｂａｔｃｈ ３．６ ＜６．１ ［３０］

ＭＧ１６５５ － － ＳｐＴＥ Ｂａｔｃｈ ０．３４ ＜３．４ ［３１］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ － ＲｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ２．２ ＜１５ ［２９］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ － ＪｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ２．１ ＜１５ ［２９］

Ｗ３１１０ ｆａｄＤ － ＴｅｓＡ′ Ｂａｔｃｈ ０．３１ ＜３．１ ［２８］

Ｗ３１１０ ｆａｄＤ － ＴｅｓＢ Ｂａｔｃｈ ０．１８ ＜１．８ ［２８］

Ｗ３１１０ ｆａｄＤ － ＵｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ０．１２ ＜１．２ ［２８］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ － ＵｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ０．７７ ＜１５ ［７］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ ＡＣＣ ＵｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ０．８１ ＜１６ ［７］

ＢＬ２１ ｆａｄＤ ＡＣＣ ＴｅｓＡ′／ＣｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ０．３８ － ［２２］

ＢＬ２１ ｆａｄＤ ＡＣＣ ＴｅｓＡ′／ＣｃＴＥ Ｆｅｄｂａｔｃｈ ２．５ ４．８ ［２２］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ ＦａｂＤ ＲｃＴＥ Ｂａｔｃｈ １．３ ＜１６ ［２３］

ＭＧ１６５５ － ＡＣＣ／ＦａｂＤ － Ｂａｔｃｈ ０．２５ － ［２４］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ ＦａｂＺ ＲｃＴＥ Ｂａｔｃｈ １．７ １４ ［１８］

ＭＧ１６５５ ｆａｄＤ／ｓｕｃＣ ＦａｂＺ ＲｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ５．７ ＜３８ ［１９］

ＢＬ２１ ｆａｄＥ ＦａｂＺ／ＦａｂＧ／ＦａｂＩ ＴｅｓＡ′／ＣｃＴＥ Ｂａｔｃｈ ０．６５ － ［１３］

形成模块、中游乙酰 ＣｏＡ活化模块和下游脂肪酸合酶

模块。通过改变质粒的拷贝数来组合优化这三个模块

的转录水平，使脂肪酸中间体（乙酰 ＣｏＡ和丙二酰

ＣｏＡ／ＡＣＰ）的供需得以平衡。而且，通过定制上游和下

游模块的核糖体结合位点来改善翻译效率，进而提高

脂肪酸产量。将工程改造的菌株进行分批补料培养最

终得到８．６ｇ／Ｌ的脂肪酸（约２２％理论产量）。

２　合成生物学策略

　　与代谢工程的研究方法不同，合成生物学更侧重于

从最基本的基因元件开始一步步构建零部件和回路，从

而实现人工生物系统的目标功能［４］。利用合成生物学策

略可以对脂肪酸代谢路径中的关键组分进行建模、表征

和微调，从而优化代谢回路、指导理性工程改造，不仅提

高了脂肪酸产量，而且丰富了终产物的多样性。

２．１　动态调控回路

　　代谢工程手段对基因表达的调控主要是静态水平

的，如拷贝数［３２］、基因间隔［３３］、启动子强度［３４３５］、核糖

体结合位点［３６］，但天然存在的代谢路径都是通过反馈

机制动态地调控代谢物浓度，以维持细胞生长、增加能

源利用率。在大肠杆菌脂肪酸合成路径中过表达 ａｃｃ

可以促进关键中间体丙二酰 ＣｏＡ的合成，但会对细胞

产生一定的毒性［２０２１］，所以有些学者在大肠杆菌中构

建了感应并动态调控丙二酰ＣｏＡ的回路［１１１２，３７］。

　　ＦａｐＲ是枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中天然存

在的脂肪酸合成路径的转录调控因子，可专一性地识

别并结合启动子上游特定的 ＤＮＡ片段，抑制启动子下

游基因的转录，若丙二酰 ＣｏＡ与 ＦａｐＲ结合则会改变

ＦａｐＲ的构象，使其从结合着的 ＤＮＡ上解离，从而基因

转录得以开启［３８３９］。特别地，ＦａｐＲ结合到大肠杆菌内

源启动子ＰＧＡＰ的上游活化序列会开启 ＰＧＡＰ下游基因的

转录。基于ＦａｐＲ丙二酰 ＣｏＡ对 ＤＮＡ转录的抑制／开

启特性，Ｌｉｕ等［１１］和Ｘｕ等［１２］在大肠杆菌中分别构建了

丙二酰 ＣｏＡ的动态调控回路 ＦａｐＲＰＦａｐＲＬａｃＩＰＴ７ＡＣＣ

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２０１６，３６（１１） 房立霞 等：工程大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究进展

和ＦａｐＲ（ＰＴ７ＡＣＣ／ＰＧＡＰＦＡＳ），如图２所示。由此实现

了对丙二酰ＣｏＡ的动态调控，平衡了细胞的生长和产

物的形成，脂肪酸的效价分别提高了３４％和１５．７倍。

图２　大肠杆菌丙二酰ＣｏＡ的动态调控回路

Ｆｉｇ．２　ＤｙｎａｍｉｃｃｏｎｔｒｏｌｐａｔｈｗａｙｏｆｍａｌｏｎｙｌＣｏＡｉｎＥ．ｃｏｌｉ（ａ）ＴｈｅｂｉｎｄｉｎｇｏｆＦａｐＲｔｏＰＦａｐＲｒｅｐｒｅｓｓｅｓｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬａｃＩ，ａｃｔｉｖａｔｉｎｇＰＴ７ｔｏｔｕｒｎｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＣ，ｗｈｉｃｈｃａｔａｌｙｓｅｓａｃｅｔｙｌＣｏＡｔｏ

ｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ；ＴｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄｍａｌｏｎｙｌＣｏＡｂｉｎｄｓｔｏＦａｐＲ，ｍａｋｉｎｇＰＦａｐＲｆｒｅｅ，ｔｈｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄＬａｃＩｍａｋｅｓＰＴ７ｔｕｒｎｏｆｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＣ，

ｗｈｉｃｈｉｎｔｕｒｎｄｅｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ　（ｂ）ＷｈｅｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｍａｌｏｎｙｌＣｏＡｉｓｖｅｒｙｌｏｗ，ＦａｐＲｔｕｒｎｓｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＣ

ａｎｄｔｕｒｎｓｏｆｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＡＳ，ｌｅａｄｉｎｇｔｏｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｍａｌｏｎｙｌＣｏＡ；ｔｈｅｅｎｈａｎｃｅｄｍａｌｏｎｙｌＣｏＡｂｉｎｄｓｔｏＦａｐＲ，ｍａｋｉｎｇＰＦａｐＲａｎｄＰＴ７

ｆｒｅｅ，ｗｈｉｃｈｔｕｒｎｓｏｆｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＣａｎｄｔｕｒｎｓｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＡＳａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｍａｌｏｎｙｌＣｏＡｔｏｆａｔｔｙａｃｉｄｓ　 Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ

ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈａｔＦａｐＲｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓａｎｄｃｏｍｂｉｎｅｓ

２．２　体外生物合成系统

　　基于实验经验设计出的调控基因表达的手段理论

上可以提高脂肪酸产量，但其实际结果不可预知，有时

甚至与预期相反，而且实验周期较长。利用体外生物

合成系统可以定量分析脂肪酸合成路径的调控，快速

找出代谢路径的关键点，指导代谢工程手段的理性设

计，从而减少了无义菌株的构建，加快了工程改造的

速率。

　　体外研究最初是将培养的大肠杆菌细胞破碎弃去

膜和核糖体制得无细胞提取液。通过在此无细胞培养

液中添加脂肪酸合成路径中的关键成分（ＡＣＣ、ＡＣＰ、

ＴｅｓＡ），Ｌｉｕ等［４０］证实脂肪酸的合成速率很大程度上取

决于中间体丙二酰 ＣｏＡ的浓度。另外，与 Ｋｅａｔｉｎｇ

等［４１］的研究结果一致，当ＴｅｓＡ和 ＡＣＰ的浓度很高时，

脂肪酸的合成速率迅速下降。后期 Ｙｕ等［１３］将脂肪酸

合酶（ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＡＳ）和 ＴｅｓＡ共１０个组分全

部纯化后构建成体外重组体系。利用此体外体系进行

动力学分析和滴定实验，发现脂肪酸的合成速率与

ＦａｂＩ和ＦａｂＺ的浓度呈双曲线的关系。将此研究结果

应用于指导体内相应基因表达水平的调控，大肠杆菌

脂肪酸的产量从０．４５ｇ／Ｌ提高到０．６５ｇ／Ｌ。在最佳反

应条件下，体外脂肪酸合成系统产出的主要是 Ｃ１６和

Ｃ１８的饱和及单不饱和脂肪酸，单不饱和脂肪酸的相对丰度会随着羟脂酰硫酯脱水酶 ＦａｂＡ浓度的增大或酮脂酰ＡＣＰ合酶 ＦａｂＢ浓度的减小而降低［４２］，由此可指

导体内饱和脂肪酸的合成。

２．３　功能逆转的β氧化循环　　Ｄｅｌｌｏｍｏｎａｃｏ等［１５］和 Ｃｌｏｍｂｕｒｇ等［１４］成功地逆转大

肠杆菌自身的β氧化途径，并以此逆转途径进行羧酸合成。在功能逆转的 β氧化循环中，脂酰基链的延长不需要乙酰ＣｏＡ到丙二酰 ＣｏＡ的耗能的转化，而是直接利用乙酰 ＣｏＡ，由此将碳源和能量最大化地用于目标产物的合成。

　　在没有脂肪酸的情况下，β氧化路径中的基因不能正常表达。在脂肪酸代谢的转录调控因子 ＦａｄＲ和 ａｔｏ操纵子的反应调节子ＡｔｏＣ中引入突变［４３］、用 ｃＡＭＰ不依赖型的突变体（ｃｒｐ）替代内源全局转录调控因子ｃｒｐ［４４］、敲除反应调节子ＡｒｃＡ［４５］，综合应用上述策略实现只有葡萄糖作为碳源时β氧化路径中基因的组成型表达。在此基础上，敲除代谢旁路、过表达硫解酶基因

ｆａｂＡ、羟脂酰ＣｏＡ脱氢酶／烯脂酰ＣｏＡ合酶基因ｆａｄＢ和脂酰ＣｏＡ硫酯酶基因 ｆａｄＭ，在大肠杆菌中成功构建出功能逆转的β氧化循环［１５］。用矿物盐培养基进行分批

发酵，胞外 Ｃ１０～１８脂肪酸产量约为 ７．０ｇ／Ｌ，产率为０．２８ｇ／ｇ（约８０％理论产率）。为了明确路径基因的组

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中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３６Ｎｏ．１１２０１６

成及作用，Ｃｌｏｍｂｕｒｇ等［１４］将多种硫解酶、３羟酰基 ＣｏＡ

脱氢酶、烯酯酰ＣｏＡ水合酶、烯酯酰ＣｏＡ还原酶进行重

组纯化和体外动力学表征，最终选定硫解酶 ＡｔｏＢ及

ＦａｄＡ、羟脂酰ＣｏＡ脱氢酶／烯脂酰 ＣｏＡ合酶 ＦａｄＢ和眼

虫（Ｅｕｇｌｅｎａｇｒａｃｉｌｉｓ）来源的烯脂酰 ＣｏＡ还原酶 ｅｇＴＥＲ

用于后期整合。将 ＡｔｏＢ、ＦａｄＢＡ和 ｅｇＴＥＲ的编码基因

整合到宿主菌（本身带有硫酯酶终止路径）中，进行多

轮功能逆转的 β氧化循环成功产出 ２６５ｍｇ／Ｌ链长

Ｃ６～１２的羧酸。在功能逆转的β氧化循环中选择不同的

终止路径可以高效合成不同碳链长度的脂肪酸［１５，４６］及

其衍生物，如ω羟基酸、二羧酸［４７］和脂肪醇［４８］等。

２．４　异源合成路径的整合

　　大肠杆菌内源碳链延长反应每个循环只能增加两

个碳原子，因此限制其只能合成偶数链的脂肪酸。但

在实际的燃料和化工领域应用中，为满足多种功能，需

要其产品在链长上具有更大的多样性（不同长度的奇

偶链、支直链）。为了打破大肠杆菌产物的局限性，Ｗｕ

和Ｓａｎ［１６１７］利用４种不同来源的β酮脂酰ＡＣＰ合成酶

ＩＩＩ（βｋｅｔｏａｃｙｌＡＣＰｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦａｂＨ）来增加碳链延伸起

始阶段的底物选择性，让丙酰 ＣｏＡ代替乙酰 ＣｏＡ进行

缩合反应，从而得到奇数链长的游离脂肪酸。当采用

枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中的ＦａｂＨ时，奇数链脂

肪酸占总脂肪酸的比例可以达到８３．２％［１６］。

　　在大肠杆菌中异源表达脂肪酸合酶除了能够增加

脂肪酸的产品种类外，还能够拓展脂肪酸类产品的合

成方式。大肠杆菌中脂肪酸衍生物的合成都是基于脂

酰ＣｏＡ中间体的转化，但这些都涉及游离脂肪酸的释

放／活化反过程的循环，Ｈａｕｓｈａｌｔｅｒ等［４９］将棒状杆菌

（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）的Ｉ型脂肪酸合酶整合到

大肠杆菌中，成功构建了无需硫酯水解／再生反过程的

脂酰ＣｏＡ合成体系。

３　发酵过程优化

　　研究表明，对生产菌株进行分批补料培养可以得

到２．５～７ｇ／Ｌ脂肪酸，远高于分批培养［１５，２２，４０］。在分

批补料发酵系统中同时应用产物提取的单元操作可以

减弱培养基中高浓度脂肪酸对细胞的抑制作用，产出

约９ｇ／Ｌ的脂肪酸［１０］。在连续培养过程中细胞可以保

持在最佳条件和最适生长期，对大肠杆菌生产菌株（用

ＵｃＴＥ替换ｆａｄＤ、ｆａｄＥ和 ｆａｄＡＢ）进行连续培养，脂肪酸

的产率比分批培养高１５％［５０］。

　　有关脂肪酸生产的研究多以碳源作为培养基配方

中的限制性营养素，因此限制了细胞的潜能［５０］。通过

限制碳源、氮源、磷酸盐来培养生产菌株，其中限制磷

酸盐的结果最佳：碳源（葡萄糖）合成脂肪酸的转化率

为０．１，最高特定生物质产率为０．０６８ｇ脂肪酸每克细

胞干重每小时，与限制碳源相比分别提高了约４５％和

３００％［５１］。

４　结论和展望

　　利用脂肪酸代谢途径将可再生原料转化为高能量

密度的燃料和高价值油脂化学品已成为近年来研究的

热点。产油微生物（如酵母等）体内会积累大量的脂

类，但其生长速率较慢并且脂肪酸调控机制过于复杂。

通过敲除脂酰ＣｏＡ合酶基因（ｆａａ１、ｆａａ２、ｆａａ４和ｆａｔ１）、

ＡＢＣ转运蛋白基因 ｐｘａ１和脂酰 ＣｏＡ氧化酶基因 ｐｏｘ１

并过表达三酰甘油酰基转移酶基因 ＤＧＡ１和三酰甘油

脂酶基因 ＴＧＬ３，酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）细

胞最高可以产出２．２ｇ／Ｌ游离脂肪酸［５２］；在解脂酵母

（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）细胞中过表达加州月桂来源的硫

酯酶基因 ＵｃＴＥ，可以实现 １．２ｇ／Ｌ的 Ｃ１６脂肪酸的合

成［５３］。相比之下，大肠杆菌生长速率快且其脂肪酸代

谢调控的机制也更为清晰，因此工程大肠杆菌合成游

离脂肪酸及其衍生物的研究已取得重大进展。应用代

谢工程手段来优化脂肪酸代谢路径，大肠杆菌脂肪酸

的产量可以达到９ｇ／Ｌ［９１０］；联合应用合成生物学策略，

不仅进一步提高了脂肪酸的产量，还加快了工程菌株

的构建，丰富了产物的多样性。

　　大肠杆菌传统的基因敲除和过表达手段耗时长、

效率低，所以应用新技术实现高通量基因组靶向基因

的筛选和多重改造是构建脂肪酸高产菌株的一个重要

研 究 方 向。ＣＩＲＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ 干 扰 （ＣＲＩＳＰＲ

ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＣＲＩＳＰＲｉ）［５４］、ＣＲＩＳＰＲ 激 活 （ＣＲＩＳＰＲ

ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，ＣＲＩＳＰＲａ）、ｓＲＮＡ［５５］和 ＲＮＡ干 扰 （ＲＮＡ

ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＲＮＡｉ）［５６］是近年来被广泛开发的基因组改

造手段，具有高通量基因组基因扰动的应用潜力，通过

特异性抑制和增强靶向基因的表达，高通量地筛选基

因组中对脂肪酸合成产生影响的一系列基因。目前，

本课题组利用ＣＲＩＳＰＲｉ技术对大肠杆菌脂肪酸代谢路

径中的１２０个相关基因进行抑制，在２周内完成全部菌

株的构建，对其中的１５个基因进行单一抑制后脂肪酸

产量提高２０％以上，最高达１．６倍。后期我们拟采取

４９

２０１６，３６（１１） 房立霞 等：工程大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究进展

不同强度的基因扰动，并将多位点、多强度扰动进行组

合，以期大幅度提高游离脂肪酸产量。

　　脂肪酸的积累会影响膜的稳定和细胞活力，特别

是当脂肪酸积累到一定程度时，其毒性作用不容忽

视［３］。因此，产物毒性的减弱及解除也是未来研究的

一个重要方向。首先，基于现有的毒性作用机制，如膜

组分的改变或细胞酸化，通过工程改造提高大肠杆菌

膜上饱和脂肪酸的比例来增强膜对脂肪酸的耐受性；

构建脂肪酸的流出系统并阻断胞外脂肪酸的再吸收以

减弱细胞酸性。其次，以脂肪酸作为选择压力，对大肠

杆菌进行定向进化，筛选脂肪酸耐受性菌株。最后，利

用转录组学和蛋白质组学等分析手段深入研究不同碳

链长度脂肪酸的毒性作用机制，为工程改造耐酸性大

肠杆菌菌株提供方向。

　　通过基因组的多重改造和产物毒性的解除，必将

大幅度提高脂肪酸的产量。当工程改造的菌株能够产

出脂肪酸接近理论产率（０．３～０．４ｇ／ｇ葡萄糖）时，结合

发酵过程放大优化工艺有可能取代现有的石油化工技

术，实现脂肪酸及其衍生物生产的可持续性和环境友

好型。

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ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓｆｒｏｍｇｌｕｃｏｓｅｔｈａｔｃｏｎｔａｉｎｍｅｄｉｕｍｃｈａｉｎ

ｌｅｎｇｔｈｍｏｎｏｍｅｒｓｖｉａｔｈｅｒｅｖｅｒｓｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄβｏｘｉｄａｔｉｏｎｃｙｃｌｅｉｎ

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ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆβｏｘｉｄａｔｉｏｎｒｅｖｅｒｓａｌａｎｄωｏｘｉｄａｔｉｏｎｐａｔｈｗａｙｓｆｏｒ

ｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｍｅｄｉｕｍｃｈａｉｎωｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄｃａｒｂｏｘｙｌｉｃａｃｉｄｓ．

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２０１６，３６（１１） 房立霞 等：工程大肠杆菌合成游离脂肪酸的研究进展

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ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉｆｏｒ

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ｍｏｄｅｌｉｎｇｏｆｆｒｅｅｆａｔｔｙａｃｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｂａｓｅｄｏｎ

ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆａｐｌａｓｍｉｄｆｒｅｅｓｔｒａｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄ

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ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｕｎｄｅｒｐｈｏｓｐｈａｔｅｌｉｍｉｔｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ

ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，９７（１１）：５１４９５１５９．

［５２］ＬｅｂｅｒＣ，ＰｏｌｓｏｎＢ，ＦｅｒｎａｎｄｅｚＭｏｙａＲ，ｅｔａｌ．Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ

ａｎｄｓｅｃｒｅｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓｔｈｒｏｕｇｈｄｉｓｒｕｐｔｅｄｎｅｕｔｒａｌｌｉｐｉｄ

ｒｅｃｙｃｌｅｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ． ＭｅｔａｂｏｌｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，

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［５３］ＲｕｔｔｅｒＣＤ，ＺｈａｎｇＳ，ＲａｏＣＶ．ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＹａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ

ｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｍｅｄｉｕｍｃｈａｉｎｆａｔｔｙａｃｉｄｓ．ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ

ａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，９９（１７）：７３５９７３６８．

［５４］ＷｕＪ，ＤｕＧ，ＣｈｅｎＪ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｉｎｇｆｌａｖｏｎｏｉｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙ

ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙｔｕｎｉｎｇｔｈｅｃｅｎｔｒａｌｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙｓｂａｓｅｄｏｎａ

ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ

Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１５，５：１３４７７１３４９０．

［５５］ＮａＤ，ＹｏｏＳＭ，ＣｈｕｎｇＨ，ｅｔａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆ

ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｕｓｉｎｇｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓｍａｌｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（２）：１７０１７４．

［５６］ＳｉＴ，ＬｕｏＹ，ＢａｏＺ，ｅｔａｌ．ＲＮＡｉａｓｓｉｓｔｅｄｇｅｎｏｍｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎ

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｆｏｒｃｏｍｐｌｅｘｐｈｅｎｏｔｙｐｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．

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ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｔｏＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅＦｒｅｅＦａｔｔｙＡｃｉｄｓ：ＡＲｅｃｅｎｔＰｒｏｇｒｅｓｓ

ＦＡＮＧＬｉｘｉａ　ＣＡＯＹｉｎｇｘｉｕ　ＳＯＮＧＨａｏ［ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｙｓｔｅｍｓＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ），

ＳｙｎＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈＰｌａｔｆｏｒｍ，ＣｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ

Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｔｉａｎｊｉｎ），ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ　３０００７２，Ｃｈｉｎａ］

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｆａｔｔｙａｃｉｄｓａｒｅｋｅｙｐｌａｔｆｏｒｍｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ｗｈｉｃｈａｒｅｅａｓｉｌｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｏａｌｋａ（ｅ）ｎｅ，ｅｓｔｅｒ，ｆａｔｔｙａｌｃｏｈｏｌｓａｎｄｏｔｈｅｒｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｉｎｅｎｅｒｇｙａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｆｒｅｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓ（ＦＦＡｓ）ｏｆｆｅｒｓａｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅａｎｄｇｒｅｅｎｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｔｏｆｏｓｓｉｌｏｒｐｌａｎｔ／ａｎｉｍａｌｂａｓｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｔｔｒａｃｔｉｎｇｅｘｔｅｎｓｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅｌａｓｔｄｅｃａｄｅ．ＴｈｅａｂｕｎｄａｎｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｅｎａｂｌｅｄｄｉｖｅｒｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅＦＦＡｓａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｆｒｏｍｔｒａｃｅａｍｏｕｎｔｔｏａｂｏｕｔ９ｇ／Ｌ，ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｎｇＥ．ｃｏｌｉａｓａｐｒｏｍｉｓｉｎｇｈｏｓｔｆｏｒｔｈｅｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓ．Ｎｏｖｅｌｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｆｅｅｄｂａｃｋｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｍａｌｏｎｙｌＣｏＡｓｅｎｓｏｒａｃｔｕａｔｏｒａｎｄｉｎｖｉｔｒｏｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ，ｈａｖｅｂｅｅｎｅｘｐｌｏｉｔｅｄｆｏｒＦＦＡｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＥ．ｃｏｌｉ．Ｉｎａｄｄｉｔｉｏｎ，ｂｒａｎｄｎｅｗｏｒｍｏｒｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔＦＦＡｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｏｕｔｅｓｏｒｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅａｌｓｏｄｅｖｅｌｏｐｅｄｂｙｒｅｖｅｒｓｉｎｇｔｈｅβｏｘｉｄａｔｉｏｎｃｙｃｌｅａｎｄｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｍｕｌｔｉｐｌｅｘｐａｔｈｗａｙｓｆｒｏｍｖａｒｉｏｕｓｓｐｅｃｉｅｓ．ＲｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆＦＦＡｓｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＥ．ｃｏｌｉｔｈｒｏｕｇｈｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙｗｅｒｅｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ，ａｎｄｉｔｓｆｕｔｕｒｅｔｒｅｎｄｗａｓｅｘｐｌｏｒｅｄ．　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　Ｆａｔｔｙａｃｉｄｓ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｂｉｏｌｏｇｙ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ

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