Material recopilado por Automatización del Hemograma

Carbia C Fink N Lazarowski A

INTRODUCCION La automatización proporciona mayor exactitud

y precisión que los métodos manuales. Durante losúltimos 20 años la automatización reemplazó casi ensu totalidad el recuento manual, con la posibleexcepción del recuento de plaquetas con contraste defase como un procedimiento confirmador. Numerososfabricantes de instrumentos desarrollaron y comercia-lizaron analizadores hemáticos. En los casos típicos,estos analizadores proporcionan en menos de unminutos, los ocho parámetros hemáticos estándar delhemograma completo [HC], más un recuento diferen-cial de leucocitos de tres componentes (o cinco com-ponentes en equipos más modernos), en 100 micro-litos de sangre entera. Por esto, la automatizaciónpermite el manejo más eficiente de mayor volumende trabajo (n° de muestras), así como el diagnóstico yel tratamiento más oportuno de la enfermedad.

tura, que tiene sensores y produce pulsos de voltajemedibles (fig. 1). En algunos instrumentos, las panta-llas del osciloscopio muestran los pulsos que generanlas células cuando éstas interrumpen la corriente.

Principios generales del equipamiento A pesar de la cantidad de analizadores

hemáticos disponibles de fabricantes diferentes y conlos distintos grados de sofisticación y complejidad,para el funcionamiento se utilizan sobre todo dosprincipios básicos: la impedancia electrónica (resis-tencia) y la dispersión óptica. La impedancia electró-nica, o la resistencia a la corriente continua (CC) debajo voltaje fue desarrollada por Wallace Coulter enla década de 1950 y es la metodología utilizada conmayor frecuencia. La radiofrencuencia (RF), o laresistencia a la corriente electromagnética de alto vol-taje a veces se utiliza junto con la impedancia electró-nica de la CC. La marca Technicon Instruments intro-dujo el barrido óptico con campo oscuro en la décadade 1960 y Ortho Diagnostics Systems siguió con uninstrumento óptico basado en láser en la década de1970. En el equipamiento hemático actual con fre-cuencia se emplea la dispersión óptica, que utiliza luzláser y no láser.

Figura 1. Principio Coulter para el recuento celular

El número de pulsos es proporcional al nú-mero de células contadas. El tamaño del pulso devoltaje es directamente proporcional al tamaño (volu-men) de la célula, lo que permite la discriminación yel conteo de células de tamaño específico mediante eluso de circuitos umbral. Los pulsos se reúnen y orde-nan (canalizan) según su amplitud mediante analiza-dores de la altura de los pulsos.

Los datos se trazan en un gráfico de distri-bución de frecuencia, o histograma de distribución detamaño, con el número relativo en el eje Y y el tama-ño (número del canal equivalente al tamaño especí-fico) en el eje X. El histograma producido representala distribución del volumen de las células contadas.En la figura 2 se ilustra la construcción de un gráficode distribución de frecuencia.

Los umbrales de tamaño separan las pobla-ciones celulares en el histograma, y el recuento co-rresponde a las células cuantificadas entre los umbra-les fijos, inferior y superior, para cada población. Loshistogramas de distribución por tamaño puedenutilizarse para la evaluación de una población celularo subgrupos dentro de una población. El uso de reac-tivos líticos de marca registrada, como el utilizado enel más antiguo Coulter S-Plus IV, STKR y el SysmexE-5000 para controlar la contracción y la lisis detipos celulares específicos, permite separar y cuan-tificar de los leucocitos en sangre en tres poblaciones(linfocitos, células mononucleares y granulocitos)para el “recuento diferencial de tres componentes”sobre el histograma de distribución de tamaño.

Impedancia electrónica El principio de la impedancia en el recuen-

to de células se basa en la detección y la medición decambios en la resistencia eléctrica producida por lascélulas cuando atraviesan una apertura pequeña. Lascélulas suspendidas en un diluyente conductor de laelectricidad, como solución fisiológica, se arrastran através de una apertura (orificio) en un tubo de vidrio.En la cámara de recuento, o ensamblaje del trans-ductor, se aplica la corriente eléctrica de baja fre-cuencia entre un electrodo externo (suspendido en ladilución celular) y uno interno (alojado dentro deltubo de apertura). La resistencia eléctrica entre losdos electrodos, o la impedancia en la corriente, seproduce a medida que las células atraviesan la aper-

Fig. 2: Osciloscopio e histograma de distribución de frecuencia (Coulter )

Varios factores pueden afectar las medi -ciones de tamaño o volumen en los instrumentosde desplazamiento de impedancia o volumen. Eltamaño de la apertura es crítico; para los eritro-citos y las plaquetas (PL) es más pe queño que parala apertura de los leucocitos para aumen tar la sen-sibilidad del recuento plaquetario. La acumulaciónde proteínas en la apertura disminuye el ta mañodel orificio, lo que reduce el flujo de células y au -menta la resistencia eléctrica a medida que las cé -lulas pasan. Esto produce recuentos celulares másbajos con volúmenes celulares con elevacionesfalsas. Los equipos de impedancia más viejos re -quieren la limpieza frecuente de las aperturas, perolos más nuevos incorporaron "circuítos de quema-do" u otros sistemas internos de lim pieza para pre-vénir o reducir la velocidad de acumulación deproteínas. El remanente de células de una muestraa la siguiente también se minimiza por estos sis te-mas de limpieza internos. El pasaje coincidente demás de una célula en un momento dado a travésdel orificio causa pulsos artificialmente grandes,lo que produce volúmenes celulares aumentadosfalsos y recuentos celulares disminuidos falsos.Esta reducción del recuento o pérdida por pasajecoincidente, puede predecirse de ma nera estadística(y, por consiguiente, corregirse mediante cálculosmatemáticos) debido a su relación directa con laconcentración y el tamaño celular o un volumeneficaz de apertura. La corrección de la coinciden-cia se completa por el analizador de la computado -ra antes del registro impreso final de los recuentoscelulares del equipo.

Otros factores que afectan la altura del pulso son la orientación de la célula en el centrode la apertura y la capacidad de deformación delos eritrocitos, que puede alterarse por la disminu -ción en el contenido de hemoglobina. La recir-culación de las células hacia atrás en la zona desensores crea pulsos erróneos y proporciona re -cuentos celulares con elevaciones falsas. Se agre -gó un mecanismo de retrolavado o flujo de barridopara prevenir la circulación retrógrada de las célu-las en la zona sensora y se eliminan en forma elec-trónica los pulsos anómalos. El uso del centradohidrodinámico evita muchos de los problemasinherentes a un sistema de apertura rígido. La co -rriente de la muestra está rodeada por un líquidode cubierta a medida que atraviesa el eje central dela apertura. El flujo laminar permite que la co -rriente central de la muestra se estreche lo sufí-ciente para separar y alinear las células en una solahilera para el pasaje a través de la zo na de

sensores. El líquido de cubierta externo minimizala acumulación de proteínas y la formación de ta -pones, elimina la circulación retrógrada de las cé -lulas hacia atrás en la zona de sensores con la ge -neración de pulsos espurios y reduce la irregu-laridad de altura del pulso, ya que se evita el pasa -je celular fuera del centro y se obtiene una reso-lución mejor de las células sanguíneas. La pérdidapor pasaje coincidente también se reduce, ya quelas células sanguíneas se alinean una detrás de laotra en la dirección del flujo.

Radiofrecuencia Como se describió antes, la impedancia de CC

de bajo voltaje puede utilizarse junto con la resis -tencia de RF, o corriente electromagnética de altovoltaje que fluye entre ambos electrodos, al mismotiempo. Por cuanto el volumen total de la célula es proporcional al cambio en la corriente continua, ladensidad interna celular (volumen nuclear, etc.) esproporcional al tamaño del pulso o el cambio en laseñal de RF. La conductividad, medida por estasonda electromagnética de alta frecuencia, se ate -núa por la relación núcleo-citoplasma, la densidadnuclear y la granulación citoplasmática. Los cam-bios de voltaje de la CC y la RF pueden detectarseen forma simultánea y separarse por acción de doscircuitos de procesamiento de pulsos diferentes.En la figura 3 se ilustra el uso simult áneo de CC ycorriente de RF. Pueden graficarse en forma com -parativa dos propiedades celulares diferentes, laimpedancia y la conducti vidad, para la formaciónde un citograma de distribución bidimensional untrazado de dispersión (fig. 3). Estos trazados mues-tran las poblaciones celulares como cúmulos, conel número de puntos en cada uno que representa laconcentración de ese tipo de célula. Luego el aná -lisis computarizado del cúmulo puede determinarlos recuentos absolutos para poblaciones celularesespecíficas.

Figura 3: Métodos de detección de RF y CC . Uso simul -táneo de corriente continua (CC) y radiofrecuencia (RF) .

El uso de varios métodos en u n equipodado para la determinación de por lo menos dospropiedades celulares permite la separación dife-rencial de los leucocitos en cinco componentes(neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos ybasófilos). La detección de CC y de RF son dosmétodos utilizados en los analizadores Sysmex pa -ra realizar los recuentos diferenciales de los leuco -citos.

puede realizarse en correlación con la absorción(Simens) o con el volumen (Coulter).

Dispersión Optica

La dispersión óptica puede utilizarse comola metodología primaria o en combinación con otrosmétodos. En los sistemas de dispersión óptica (citó-metros de flujo) una masa de muestra (centrada enforma hidrodinámica) se dirige por un canal decuarzo que genera un “flujo celular” (de a una porvez), sobre el que impacta la luz también “centrada”.La fuente suele ser de luz halógena, de tungsteno, olaser de helio y neón. La luz laser denominada “mo-nocromática” debido a que se emite con una longitudde onda individual, difiere de la producida por el“campo brillante”, por su intensidad y su cohesividad(circula o moviliza en fase), como así también por sudivergencia o escasa diseminación. Esto permite ladetección de “interferencia” en el haz de luz y posi-bilita su cuantificación, de modo tal de dar valoresque “caracterizarán a cada tipo celular”. Este sistemade dispersión óptica permite identifica leucocitos,plaquetas y eritrocitos. A medida que las células cir-culan por la “región sensora”, la luz impacta sobreellas y se interrumpe el flujo lumínico unidireccional.La luz se dispersa en todas direcciones con ángulosde desvío relativos a las características (densidad ytamaño) del cuerpo golpeado. Se generan a su vezprocesos de absorción, difracción y de dispersiónlumínica, que se convierten en señales eléctricas porfotoelectrodos, (fotodiodos y fotoamplificador [FTAm]) y en ángulos específicos. La luz dispersa secolecta con lentes se anula, así se genera un “saldo”neto de luz dispersa con diferentes ángulos que in-gresan al detector. Mediante filtros y espejos se se-paran las distintas longitudes de onda, y se presentana los fotodetectores, que traducen dichas longitudesde ondas y sus “cantidades” en señales eléctrónicasproporcionales. El FTA capta las señales más débi-les, producidas por un ángulos de 90°. Las señalesdigitalizadas, son procesadas por sistemas computa-rizados. La dispersión frontal de luz (0°) se corre-laciona con el volumen celular (tamaño), debidosobre todo a la difracción de la luz. En tanto, ladispersión ortogonal de la luz (90°), o dispersión“lateral”, es consecuencia de la refracción y reflexiónlumínica, provenientes de las estructuras más grandespresentes dentro de la célula (núcleo) y se correla-ciona con el grado de “complejidad” de dichas es-tructuras. La dispersión frontal de la luz, en ángulosbajos (2-3°), y en ángulos altos (5-15°), también secorrelacionan con el volumen celular y el índice derefracción, o la complejidad interna respectivamente.De allí surge una dispersión diferencial que utilizanlos sistemas H (Siemems), o los que otilizan los sis-temas Cell-Dyn (Abbott), que generan citogramas otrazados de dispersión bidimensionales. La gráfica

El análisis por computación de los cúmulosde los citogramas puede brindar información cuan-titativa y cualitativa.

Principales instrumentos para el recuento decélulas

Los analizadores hemáticos son fabricadospor varias compañías; entre otras figuran AbbottLaboratories, ABX Diagnostics, Bayer Diagnostics,"Beckman Coulter, Inc.," y Sysmex Corporation. Laexposición que sigue se limita a los equipos decuatro de estos proveedores. El énfasis no estápuesto en el tamaño o el manejo de la muestra, la ve-locidad, el nivel de automatización o la comparaciónlos equipos o fabricantes. Asimismo, como el avan-ce de la tecnología continúa, es posible que no semencionen los modelos más nuevos (o más re-cientes). En cambio, se da una descripción detalladade los principales métodos utilizados por estos fabri-cantes, para mostrar el uso y ampliar más los princi-pios presentados antes, así como para permitirle altécnico interpretar los datos de los pacientes en ellaboratorio de hematología, como los histogramas ylos citogramas generados por el equipo. En el cuadro1 se resumen los métodos utilizados para la deter-minación del hemograma en cuatro equipos funda-mentales para hematología. En el cuadro 2 se sinte-tizan los métodos para la determinación diferencialde los leucocitos en los mismos cuatro analizadores.

Los analizadores hemáticos tienen algunos componentes básicos comunes, como los sistemashidráulicos, neumáticos y eléctricos. El sistema hi-dráulico incluye la unidad de aspiración, los dis-pensadores, los diluyentes, las cámaras de demezclado, los baños de apertura, el flujo de células oambos, y un hemoglobinómetro.

En el sistema neu-mático se incluye elvacío y las presiones requeridas para que operen lasválvulas y transporten la muestra a través delsistema hidráulico El sistema eléctrico controla lassecuencias operacionales del sistema total e incluyeanalizadores electrónicos y circuitos computarizadospara el procesamiento de los datos generados. Algu-nos instrumentos tienen pantallas en el osciloscopio,que muestran los pulsos eléctricos en tiempo real amedida que se cuentan las células. Una unidad dedespliegue de datos recibe la información del anali-zador e imprime resultados, histogramas, citogramaso todos ellos.

El tamaño y volu-men celular con cambio de voltaje de la CC es com-parada con la me-dida y compleji-dad nuclear dada

Parámetro Coulter STKS Sysmex SE-9000 Abbott CELl-DYN 3500 Bayer.ADVIA 120

Leucocitos Impedancia Centrado hidrodinámico;detección por CC

Dis persión óptica (recuentoprimario), impedancia

. (recuento sec.undario) Impedanci.a

Centrado hidrodinámico;dis persión óptica y abs orción Centrado hidrodinámico;dis persión con láser de

, ángúlo bajo (2-3°) y de ángulo alto (5-15°) Cianometahemoglobina

. ,modificada (546 nm) (Eritrocitos x VCMl/10

Eritrocitos Impedancia Centrado hidrodinámico;detección por CC

Hb Cianometahemoglobina modificada (525 nm) (Eritrocitos x MCVJ/lO

Hemoglobina-SLS (555 nm) Detección de la altura de los puls os acumulados(Htojeritrocitos) x 10

Cianometahemoglobinamodificada (540 nm) (HC x VCMl/lO Hto

VCM Media del histograma de distribución del tamaño de los eritrocitos

(Hbjeritrocitos) x 10

(Hbj Hto) x 100

Impedancia (2-20 fU: Adaptación de los cuadrados mínimos del histograma de distribución de tamaño (0-70 fU CV (%) del histograma de eritrocitos (DE y VCM) x 100 Coloración s upravital (azul de metileno nuevo); volumen, conductividad, dis persión óptica (tecnología VCS)

Media del histograma de distribución del tamaño de los eritrocitos

Media del histograma dedistribución del tamaño . de los eritrocitos

HbCM

CHbCM

PL

(Hbjeritrocitos) x 10

(HbjHto) x 100

Centrado hidrodinámico; detección por CC (= 2-30 tU

(Hbjeritrocitos) x 10

(HbjHto) x 100

Impedancia (= 2-30 tL)

(Hbjeritrocitos) x 10

(HbjHto) x 100

Centrado hidrodinámico; dis persión con láser de ángulo bajo (2-3°) y de ángulo alto (5-15°) (1-60 fU

RDW RDW - DE (fU o RDW -CV (%) dis ponible

Valor relativo, equivalente al CV CV (%) del histograma deeritrocitos: (DE¡VCM) x 100 Coloración s upravital (Oxazina 750); dis persión óptica de ángulo bajo y de ángulo alto (2-3° y 5-15°) y abs orbancia

Recuento de reticulocitos

Coloración s upravital (auramina O); detección fluorescente

Coloración s upravital (azul de metileno nuevo N); dis persión óptica' de ángulos múltiples (10 y 90°) .

Abreviaturas: CHbCM, concentració n hemoglobinica corpus cular media; CC, corriente continua; CV, coeficiente de variación; DE, des viación estándar; Hb, hemoglobina; HbCM, hemoglobina corpus cular media; Hto, hematocrito; PL, recuento de plaquetas; RDW, amplitud de distribu- ción eritocitaria; SLS, lauril sulfato' de s odio; V CM, volumen corpus cular medio. Abbott CELL -DYN 4000 utiliza una coloración de marca registrada (CD4K530), dis pers ión de ángulos múltiples y detección fluorescente pa-

ra el recuento de reticulocitos.

El manejo de la muestra por cada equipodepende del grado de automatización. Los equiposvarían desde los analizadores "paso a paso" a lossistemas fáciles de usar con capacidad de "cargafrontend". Las funciones de la computadora tambiénvarían; los equipos más grandes tienen micro-pro-cesador extenso y pueden manejar datos. Los conte-nidos del programa de computación (software) pue-den incluir inicio y apagado automáticos, con auto-controles internos de diagnóstico y cierto grado demantenimiento; control de calidad (QC), con revi-

sión automática de datos del QC, cálculos, gráficos,promedios dinámicos y almacenamiento de archivosdel QC; almacenamiento y recuperación de datos delpaciente con controles delta, señalización de losvalores de emergencia o críticos, y la comprobaciónautomática de los resultados de pacientes basados enalgoritmos definidos del usuario; presentacionesinteractivas con el sistema de información del labo-ratorio o del hospital para permitir la comprobaciónseparada con acceso aleatorio; e incluso con un pro-grama de computación basado en especies animales.

Paránietro

Neutrófilos

.. Coulter. ST KS

Volumen, conductividad, dis persión (VeS)

Sysmex SE-9OOO

Detección por ee y RF

Ábbott CELL-DYN 3500

Separación por dis persión

Bayer ADVIA 120

Tinción con peroxidas a,

dis persión óptica y abs orciónpolarizada con ángulosmúltiples (M.A.P.S.S.) (00, 900,100,900 des polarizado) M.A.P.S.S. Linfocitos ves Detección por ee y RF Tinción con peroxidas a,

dis persión óptica y abs orciónTinción con peroxidas a, dis persión óptica y abs orciónTinción con pero)lidas a, dis persión óptica y abs orción

Monocitos ves Detección por ee y RF M.A.P.S.S.

Eosinófilos ves Lisis diferencial,contracción; detección por CC Lisis diferencial, contracción;

detección por ee

M.A.P.S.S.

Bas ófilos ves M.A.P.S.S. Lisis diferencial, contracción; dis persión con láser de ángulo

bajo (2.30) y de ángulo alto (5-150)

Equipos Coulter Beckman Coulter, lnc., fabrica una línea

extensa de analizadores hemáticos, como la serieONIX más pequeña, que proporcionan análisis com-pleto de eritrocitos, plaquetas y leucocitos con re-cuento diferencial de tres componentes; los más gran-des, MAXM y STKS, que realizan un RCS con re-cuento diferencial de cinco componentes y análisis dereticulocitos, que utiliza una preparación de lamuestra independiente; el más nuevo GEN-S System,que proporciona un análisis de reticulocitos en líneaautomatizado por completo. Además, el GEN-S tienecapacidad para realizar recuentos de CD4 y CD8.

El equipo Coulter tiene dos canales de me-dición en el sistema hidráulico para determinar losdatos del hemograma. Se considera que los recuen-tos de eritrocitos y leucocitos, y la determinación dehemoglobina (HGB) se miden en forma directa. Lamuestra de sangre entera aspirada se divide en dosporciones y cada una se mezcla con un diluyenteisotónico. La primera dilución se entrega a la cámarade apertura de eritrocitos y la segunda a la cámara deapertura de leucocitos. En el primer caso se cuentanlos eritrocitos y las plaquetas, y se diferencian por laimpedancia eléctrica a medida que las células pasana través de cada una de las tres aperturas con sen-sores de 50 u de diámetro, 60 u. de longitud). Laspartículas entre 2 y 20 femtolitros (fL) se cuentancomo plaquetas y las de más de 36 fL, comoeritrocitos. En la cámara de leucoci tos, se agrega unreactivo para lisar los eritrocitos y liberar lahemoglobina antes de contar los leucocitos en formasimultánea por la impedancia en cada una de las tresaperturas sensoras (100u de diámetro, 75u de lon-gitud). Como alternativa, algunos modelos empleanrecuentos consecutivos en la misma aper-tura de eri-trocitos o leucocitos. Después de que se completanlos ciclos de recuento, la dilución de leucocitos pasaal hemoglobinómetro para la determinación de laconcentración de la hemoglobina (lectura de trans-mitancia de la luz a una longitud de onda de 525nrn). Los pulsos eléctricos generados en los ciclos deconteo se envían al analizador para la revisión,corrección de la coincidencia y conversión digital.Dos de los tres recuentos obtenidos en los recipien-tes de eritrocitos y leucocitos deben concordardentro de los límites especificados para los recuentospara que el equipo los acepte. Este procedimiento deconteo múltiple previene los errores de los datos porobstrucciones de la apertura o valores estadísticosextremos, y permite la reproducibilidad excelente enlos instrumentos Coulter. La información digital ob-tenida de cada apertura se canaliza mediante losanalizadores de altura de pulso; se utilizan 256 cana-les para el análisis de leucocitos y eritrocitos, y 64canales para el análisis de las plaquetas. Se generanhistogramas de distribución del tamaño de pobla-ciones de leucocitos, eritrocitos y plaquetas. El vo-lumen corpuscular medio (VCM) eritrocitario es supromedio tomado de los datos de distribución de ta-maño. El hematócrito (Hto), la hemoglobina corpus-cular media (HbCM) y la concentración hemoglo-bínica corpuscular media (CHbCM) se calculan apartir de valores medidos y derivados. La amplitudde distribución eritrocitaria (en inglés, Red bloodcell Distribution Wídth, RDW) se calcula directa-mente a partir del histograma como el coeficiente de

variación (CV) de la distribución del volumeneritrocitario, con valores de referencia de 1l,5-14,S%.G La RDW es un índice de anisocitosis peropuede estar sesgado, porque refleja la relación entrela desviación estándar y el VCM. Esto es, unhistograma de distribución de eritrocitos con diver-gencia normal, pero con un VCM disminuido, puedeimplicar una RDW elevada, lo que indica un· au-mento falso de la anisocitosis. El instrumento utilizael VCM y la RDW para señalizar posibles aniso-citosis, microcitosis y macrocitosis.

Las plaquetas se cuentan dentro de loslímites de 2 a 20 fL Y se construye un histograma dedistribución del tamaño. Si ésta cumple los criteriosespecificados, a los datos en bruto se les aplica elajuste estadístico por cuadrados mínimos, lo que losadapta a una curva logarítrnica normal. Esta últimase extrapola de O a 70 fL Y el recuento final deriva deesta curva extendida. Este procedimiento de ajusteelimina las partículas que interfieren en la región delruido, como los detritos, y en la región más grande,como los eritrocitos pequeños.

Figura 5: Normograma de plaquetas que muestra la relación inversa del tamaño con el n° de plaquetas

El volumen plaquetario medio (VPM),análogo al VCM eritrocitario, también deriva delhistograma de plaquetaso Los valores de referenciapara el VPM son de alrededor de 7,8 a 11 fL yaumentan ligeramente a medida que la muestra seasienta en el anticoagulante, ácido etilendiamino-tetraacético (EDTA). Por lo general, el tamaño de lasplaquetas es inversamente proporcional al recuentode plaquetas, como se observó en el nomograma deplaquetas diseñado por Bessman y col (fig. 5).

Muchos instrumentos Coulter más anti-guos, como el STKR, y los modelos más nuevos ypequeños, como el ONIX, proporcionan análisis delas subpoblaciones de leucocitos en tres compo-nentes, que los diferencian en linfocitos, célulasmononucleares y granulocitos. En el canal de leuco-citos, un reactivo de lisis especial produce su contra-cción diferencial, lo que permite contar las distintascélulas y clasificarlas según el tamaño basado en suimpedancia. Se construye un histograma de leuco-citos de los datos canalizados. Las partículas entre 35y 90 fL se consideran linfocitos, entre 90 y 160 fL,"mononucleares" (monocitos, blastos, granulocitosinmaduros y linfocitos atípicos), y entre 160 y 450 fL,para los granulocitos maduros; de esta forma esposible realizar el cálculo de las cifras relativas yabsolutas de estas tres poblaciones. Los algoritmoscomputarizados de marca registrada permiten ademásseñalizar aumentos de eosinófilos, basófilos o ambos,así como la interpretación diferencial del histograma

para incluir la señalización de células anormales,como linfocitos atípicos y blastos. Cuando las pobla-ciones celulares se superponen o no hay una sepa-ración neta de poblaciones, puede activarse unaregión de alarma (señalización R), que indica el áreade interferencia en el histograma de distribución detamaño. Por ejemplo, una señalización RI representaexceso de señales en la región más baja del umbraldel histograma de leucocitos y un recuento leuco-citario cuestionable. Esta interferencia se visualizacomo un "despegue alto" de la curva y puede indicarla presencia de eritrocitos nucleados, plaquetas agru-padas, eritrocitos no lisados o ruido electrónico Y Enla figura 6 se observan los registros impresoscompuestos del Coulter STKR que incluye el"recuento diferencial interpretado".

La CC de baja frecuencia mide el tamaño mientrasuna sonda electromagnética de alta frecuencia midela conductividad, un indicador del contenido internocelular. La señal de conductividad se corrige para elvolumen celular, lo que brinda una medición singulardenominada opacidad. Cada célula también se ana-liza con luz láser monocromático que revela infor-mación sobre la superficie celular como su estruc-tura, forma y reflectividad. El método singular dedetección de la dispersión de la luz rotada (DLR) delCoulter permite la separación de células con tamañosimilar pero características de dispersión diferentes.En cada muestra se analizan más de 8.000 leucocitos.

Esta combinación de tecnologías propor-ciona un trazado tridimensional o citógrafo de las po-blaciones de leucocitos que están separadas poranálisis computarizados de cúmulos. Los trazados dedispersión bidimensionales de las tres mediciones re-presentan imágenes diferentes del citógrafo. El tra-zado de dispersión de la función de discriminación 1(DF1) del volumen (eje y) versus dispersión de la luz(eje x) muestra una separación clara de linfocitos,monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Los basófilosestán ocultos detrás de los linfocitos en este trazadode dispersión, pero se separan por la conductividaddebido a su granulación citoplasmática. El trazado dedispersión DF-2 de volumen (eje y) contra la con-ductividad (eje x) muestra linfocitos, monocitos yneutrófilos como poblaciones predominantes. Cuan-do se elimina la población de neutrófilos del trazadode dispersión DF-2, puede visualizarse la poblaciónde basófilos (DF-3). También se dispone de histogra-mas de parámetros individuales de volumen, conduc-tividad y dispersión de la luz. La figura 7 representaun registro impreso del Coulter STKS de un pacientenormal que muestra un trazado de dispersión DF-l.

En todos los analizadores hemáticos se generandos tipos de señalizaciones de anormalidad de leuco-citos (alarmas o indicadores) que proporcionan un re-cuento diferencial: 1) definidas por el usuario, sobretodo para detectar anormalidades de distribución, co-mo eosinofilia o linfocitopenia (basado en el recuen-to absoluto de eosinófilos o linfocitos, respectiva-mente), y 2) específicas del instrumento, en mayormedida por anormalidades morfológicas. Para las se-ñalizaciones de distribución se establecen límites dereferencia y programa el equipo para marcar cada pa-rámetro como alto o bajo. Las señalizaciones sospe-chosas indican la posible presencia de células anor-males cuando las poblaciones celulares quedan fuerade las regiones esperadas o se exceden las limitacio-nes estadísticas específicas. Las señalizaciones "sos-pechosas" específicas del instrumento en el CoulterSTKS implican granulocitos inmaduros y en cayado,blastos, linfocitos variables, eritrocitos nucleados ycúmulos de plaquetas. La separación inadecuada delas poblaciones celulares puede rechazar el informede resultados diferenciales por el equipo y despuésmostrar una leyenda: "revisar el extendido".

Fig. 6. Tamaño de GB de Glóbulos Rojos y de plaquetasobsérvese la diferencia de fL de cada gráfica

Los instrumentos Coulter más recientes, STKS, MAXM y GEN-S, generan datos del hemo-grama (incluso el recuento leucocitario) exactamentecomo antes, pero utilizan tecnología de la marcaregistrada Coulter en un canal separado para evaluarla determinación diferencial leucocitaria en cincocomponentes. La tecnología VCS permite la clasi-ficación según el tamaño Volumétrico de las célulasmediante la impedancia, las mediciones de Conducti-vidad de las células y la dispersión (Scatter) de la luzláser, todas realizadas en forma simultánea para cadacélula. Después de lisar los eritrocitos y tratar losleucocitos con un reactivo estabilizador para mante-nerlos en un estado "casi nativo", una corriente de lamuestra centrada en forma hidrodinámica se dirige através del paso del flujo celular por la zona sensora.

DF1 Fig. 7- Coulter STKS: Trazado de dispersión bidimensional

que muestra el volumen determinado por la impedancia en eleje y con respecto a la dispersión de la luz (DF1) en el eje x

Equipamiento Sysmex Sysmex Corporation, antes TOA Medical

Electronics, Co., Ltd., fabrica una línea completa deanalizadores hemáticos, como el KX-21 pequeño y elK-4500, que proporcionan análisis completos de eri-trocitos, plaquetas y leucocitos con recuento dife-rencial de tres componentes; el SF-3000 más grandey el SE-9000 realizan un recuento diferencial decinco componentes, y los sistemas más nuevos queproporcionan además un recuento de reticulocitosautomatizado por completo. Se considera que los re-cuentos de leucocitos, eritrocitos, la determinación dehemoglobina (Hb), el hematocrito (Hto) y las pla-quetas (PL) se calculan de forma directa. Para deter-minar el hemograma se utilizan tres subsistemas hi-dráulicos: el canal para leucocitos, el canal para eri-trocitos/PL y un canal separado para Hb. En lascámaras del transductor de leucocitos y eritrocitos,las muestras diluidas se aspiran a través de aperturasdiferentes y se cuentan por medio del método deimpedancia (detección de CC) para el recuento y ladeterminación del tamaño celular. Dos característicassingulares refuerzan la tecnología de la impedancia: 1) El canal de eritrocitos utiliza una corriente lami-nada por centrado hidrodinámico para dirigir lascélulas a través de la apertura, lo que reduce elpasaje coincidente, la distorsión del tama ño de laspartículas y la recirculación de las células sanguí -neas alrededor de la apertura, y 2) los canales deleucocitos y eritrocitos utilizan los umbrales "flo-tantes" para diferenciar cada población celular.

Cuando las células atraviesan las apertu -ras, las señales se transmiten en secuencias al cir -cuito analógico y los circuitos de análisis de distri -bución del tamaño de las partí culas (ADP) para laconversión a datos acumulados de distribución deltamaño celular. Se construyen las curvas de distri -bución de tamaño de las partículas y se establecela posición óptima del nivel de auto discrimi -nación (esto es, umbral) mediante el micropro-cesador para cada población celular. Por ejemplo,el umbral más bajo de las plaquetas se ajusta enforma automática en el límite de tamaño de 2 a 6 fly el umbral superior en los 12 a 30 fl, sobre labase de la distribución del tamaño de las partí -culas. Asimismo, los umbrales inferiores y supe-riores de los límites de tamaño eritrocitario puedenestablecerse en 25 a 75 fl Y 200 a 250 fl, respec-

tivamente. Este circuito con "umbral flotante" per -mite la discriminación de poblaciones celulares,sobre la base de muestra por muestra. Los re -cuentos celulares presentan pulsos entre los nive-les de autodiscriminación inferior y superior, conrelación de dilución, volumen contado y el errordel pasaje coincidente considerado en las cifras fi -nales generadas por la computadora. En el canalde eritrocitos, el discriminador flotante tiene unautilidad particular en las separaciones de lasplaquetas de los eritrocitos pequeños.

El hematocrito también se determina enel canal de eritrocitos/PL, basado en el principiode que la altura del pulso generado por el eri -trocito es proporcional al volumen celular. El he -matocrito es entonces la altura del pulso acumu-lativa del eritrocito y se considera un volumenverdadero del porcentaje relativo de eritrocitos"·En la hemoglobina del flujo celular ésta se con -vierte a metahemoglobina que se combina conlauril sulfato de sodio (SLS) para convertirse enuna molécula hemicromática de SLS-hemoglo-bina, cuya concentración se mide como absor -bancia a 555 nm.

En el microprocesador se calculan los si -guientes índices, que utilizan parámetros medidosen forma directa o derivados: VCM, HbCM,CHbCM, RDW-SD; RDW-CV, VPM y plaque-tocrito (Pto). La RDW-CV es el ancho de la distri -bución de aritmética de eritrocitos medida en el20% de la altura de la curva eritrocitaria, infor -mado en fl con un intervalo de referencia de 37 -54fl. La RDW-CV es el ancho de la distribución deeritrocitos informada como coefi ciente de varia-ción. El Pto es la proporción del volumen de lasplaquetas, análogo al Hto. El VPM se calcula apartir del Pto y el recuento de PL así como elVCM de los eritrocitos se calcula a partir del Htoy el recuento de eritrocitos. La proporción de pla-quetas mayor que 12 fl para un recuento total deplaquetas puede ser un indicador de posible agru -pación plaquetaria, plaquetas gigantes, frág mentoscelulares o cualquier combinación de el1os.

El SE 9000/9500 utiliza cuatro cámarasde detección para analizar los leucocitos y obtenerun recuento diferencial de cinco componentes: lascámaras DIFF, IMl, Ea y BASO. En la cámara dedetección DIFF, los eritrocitos están hemolizados

y los leucocitos se analizan en fom1a simultáneamediante CC de baja frecuencia y corriente de altafrecuencia (método de detección CC y RF). Undiagrama de dispersión de las señales de detecciónde RF (eje y) contra las señales de detección deCC (eje x) permite separar los leucocitos en lin -focitos, monocitos y granulocitos. Los discrimi -nadores flotantes determinan la separación óptimaentre estas poblaciones. Los granulocitos se ana-lizan otra vez en la cámara de detecci ón IMI paraestablecer "información sobre (leuco citos) inma-duros". Los eritrocitos se lisan y los leucocitosdistintos de los granulocitos inmaduros se contra -en en forma selectiva por temperatura y reac-ciones químicas. El análisis de la muestra tratadaque utiliza el método de detección CC y RF per -mite la separación de células inmaduras en eldiagrama de dispersión de IMI. En las cámaras Ea

y BASO también se utiliza un método similar decontracción diferencial y lisis. Esto es, los eosi -nófilos y los basófilos se cuentan por impedancia(detección de CC) en cámaras separadas en lasque los eritrocitos se lisan y los leucocitos dis-tintos de los eosinófilos o los basóflios se contraenen forma selectiva por temperatura y reaccionesquímicas. Los eosinóflios y los basófilos se sus-traen de los recuentos de granulocitos derivadosdel análisis del diagrama de dispersión DIFF pa rala determinación del recuento de neutrófilos. Pue -den ser determinadas las señalizaciones de distri -bución definidas por el usuario y se activan lasseñalizaciones sospechosas específicas del equipo,similares a las descritas en el Coulter STKS, paradetectar las posibles anomalías morfológicas. Semuestra un mensaje POSITIVO o NEGATIVO.

Resultados del Beckman -Coulter. Las flechas indican presencia de su puestas células que en realidad corresponden a grasa subcutánea obtenida por una mala extracción de sangre

El Sysmex XE-2100 tiene citometría deflujo fluorescente agregada para aumenar la capa -cidad de análisis celular del equipo. Esta tecno-logía avanzada permite el recuento directo de eri -trocitos nucleados, un recuento diferencial mejorde leucocitos y el recuento óptico de las plaquetas.

independiente de la muestra; y el CELL-DYN4000 más nuevo, que proporciona un análisis de reticulocitos automatizado por completo con acceso aleatorio.

El sistema CELL-DYN 3500 tiene tres canalesde medición independientes para determinar el he -mograma y el recuento diferencial: 1) un canalóptico para el recuento leucocitario y datos dife-renciales; 2) un canal de impedancia para losdatos de los eritrocitos y plaquetas (PL), y 3) uncanal de hemoglobina (Hb) para determinarla. Seutiliza un canal de impedancia adicional para de -terminar un recuento por impedancia de leucocitos(RIL) como un con trol interno en oposición al re-cuento óptico de leucocitos primario (ROL).Cuando el RIL y el ROL difieren, un algo ritmoselecciona el valor más apropiado para los leuco-citos informados. Se consideran que los valores deleucocitos, eritrocitos, hemoglobina y plaquetas semiden en forma directa. Se utiliza una apertura de60 x 70 fL en el ensamblaje del transductor de eri -trocitos/PL asamblea para la determinación delrecuento y el tamaño de eritrocitos y plaquetas porel método de impedancia electró nica. Se colocauna placa de von Behrens en la cámara de conteode eritrocitos para minimizar la recirculación de

Equipamiento CELL-DYN Los equipos ofrecidos por Abbott Labo-

ratories son el CELLDYN 1700 más pequeño, queproporciona análisis com pleto de eritrocitos, pla-quetas y leucocito s con recuento diferencial de lostres componentes; los CELL-DYN más grandes3500R y 3700, que realizan un HC con recuentodiferencial de cinco componentes y análisis dereticulocitos mediante el uso de una preparación

células. Los pulsos se reúnen y ordenan en 256canales según su amplitud: las partículas entre 1 y35 fL se incluyen en los datos iniciales de plaque-tas y las mayores de 35fL se cuentan comoeritrocitos. Luego se utilizan los umbrales flotan-tes para establecer la mejor separación de la po-blación de plaquetas y eliminar del re cuento lainterferencia como el ruido, los detritos o los eri -trocitos pequeños. La pérdida por pasaje coinci -dente se corrige en los recuentos finales de eritro-citos y plaquetas. Antes de la derivación del VCMse aplica la revisión de pulso de eritrocitos paracompensar los pulsos aberrantes producidos porel pasaje no axial de los eritrocitos a través de laapertura. El VCM es el volumen medio de los eri-trocitos obtenido de los datos de distribución desu tamaño. La hemoglobina se mide en formadirecta mediante el método de cianhemoglobinamodificado que mide la absorbancia a 540 nro. ElHto, la HbCM y la CHbCM se calculan a partirde las mediciones directas o de parámetros deri-vados. La RDW, equivalente al coeficiente devariación, es un valor relativo, derivado del histo-grama de eritrocitos con los percentiles 20 y 80.Otros índices disponibles son el VPM y Pto (aná-logo al hematocrito).

Los recuentos leucocitario y diferencialderivan del canal óptico que utiliza la separaciónpor dispersión polarizada con múltiples ángulos(M.A.P.S.S.) patentado por CELL-DYN. Unacorriente de la muestra centrada en forma hidro-dinámica se dirige a través de un cuarzo paraflujo celular, por el que pasa una fuente de luzcentrada, un láser de helio-neón polarizado ensentido vertical. La luz dispersa se mide en variosángulos: la dispersión frontal de la luz de 0° seutiliza para determinar el tamaño celular, ladispersión ortogonal de 90° para determinar lalobularidad celular, la dispersión de la luz en

ángulo estrecho de 10° se correlaciona con lacomplejidad celular, y la dispersión de la luzdespolarizada de 90 (90ºD) para evaluar la granu-laridad celular. La dispersión ortogonal de la luzes hendida, con una porción dirigida a un TFM de90° y la otra dirigida a través de un polarizador aun TFM 90ºD. La luz que cambió la polarización(despolarizada) es la única que puede detectarsepor el TFM 90ºD.

Se utilizan varias combinaciones de estascuatro mediciones para diferenciar y cuantificarlas cinco subpoblaciones leucocitarias principales:neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosinófilos ybasófilos. En la figura 9 se ilustra la tecnologíaMAP.S.S de Abbott.

Fig. 9. Tecnología M.A.P.S.S. (dispersión polarizada con múltiples ángulos) que muestra la medición e identificación de células media nte 'el estudio de dispersión de la luz en cuatro ángulos diferentes

Las señales de dispersión de la luz se con -vierten en eléctricas, ordenadas en 256 canales so-bre la base de su amplitud para cada ángulo de luzmedida y se presenta en forma gráfica como undiagrama de dispersión. La información de ladispersión en ángulos diferentes se traza en variascombinaciones: 902 a 102, o lobularidad contracomplejidad; 02 a 102, tamaño contra complejidad,y 90ºD a 902, granularidad contra lobularidad. Lalobularidad (eje y) graficada con respecto a lacomplejidad (eje x) permite la separación de las

subpoblaciones mononucleares (MONO) y poli-morfonucleares (POLY). (Los basófilos se agru -pan con los mononucleares en este aná lisis porquelos gránulos de los basófilos se disuelven en elreactivo de la cubierta y el basófilo desgranulado esuna célula menos compleja.) Cada célula en los doscúmulos se identifica como un MONO o POLY parala evaluación adicional.

La subpoblación MONO se grafica en un trazado de dispersión, con el tamaño en el eje y y lacomplejidad en el x. Se observan con claridad tres

poblaciones (linfocitos, monocitos y basófilos). Eneste trazado de dispersión, los eritrocitos nucleados,los eritrocitos no lisados, las plaquetas gigantes y loscúmulos de plaquetas se incluyen con e! cúmulo delinfocitos y se excluyen de los recuentos leucocitarioy diferencial. Para diferenciar estas partículas se uti-liza la información adicional del canal de impedan-cia de leucocitos. La subpoblación POLY se gra-fica en un trazado de dispersión 90°D a 90°, con lagranularidad en el eje y, y la lobularidad en el x.Debido a la naturaleza singular de los gránulos delos eosinófilos, éstos dispersan la luz más de 90°D,lo que permite la separación clara de eosinófilos yneutrófilos. Para obtener una separación mejor de laspoblaciones diferentes en los distintos trazados de

dispersión se utilizan los umbrales dinámicos. Cadatipo celular se identifica con un color distinto demodo que, después de realizar todas las clasi-ficaciones y graficar el tamaño (Oº) con respecto a lacomplejidad, el operador puede visualizar con faci-lidad cada población celular en la pantalla terminalde los datos. También se dispone de otros trazadosde dispersión y pueden desplegarse a demanda deloperador. Como en los instrumentos descritos antes,pueden establecerse las señalizaciones de distribu-ción definidas por el usuario, y las señalizacionessospechosas específicas del equipo pueden alertar aloperador sobre la presencia de células anómalas. Enla figura 10 se representa un registro impreso delpaciente proveniente del CELL-DYN 3500.

Cell-Dyn 3500

Eosinófilos

Diferentes tamaños celulares graficados en el Cell-Dyn 3500 Cell-Dyn 3500. Separación de leucocitos por sistema MAPSS

Equipamiento Bayer (Siemmens)

Bayer Corporation fabrica el ADVIA 120Hematology System.'" Este aparato utiliza gran partede la tecnología de los sistemas Technicon H-1, H-2Y H-3 más antiguos. Bayer simplificó la hidráulica ylas operaciones del analizador mediante el reemplazode los sistemas hidráulicos complejos múltiples conun montaje unificado de circuito de líquidos (UnifiedFluids Circuit, UFC) o tecnología de líquidosunificados (Unifluidics). El ADVIA 120 proporcionaun hemograma completo y un recuento leucocitariodiferencial con un recuento de reticulocitos automa-tizado por completo. Se utilizan cuatro canales demedición independientes para determinar el hemo-grama y el recuento diferencial: 1) canal para eritro-citos y PL; 2) canal para hemoglobina; 3) canal para

peroxidasa (PEROX), y 4) canal para lobularidad debasófilos (BASO) para recuento leuocitario y datosdiferenciales. Los leucocitos, los eritrocitos, la hemo-globina y las plaquetas se miden en forma directa. Lahemoglobina se determina con el método de cianme-tahemoglobina modificado, que mide la absorbanciaen una cubeta de flujo por colorimetría a 546 nm. Elmétodo para eritrocitos y PL utiliza mediciones dedispersión de la luz por citometría de flujo deter-minadas a medida que las células pasan a través deun flujo de corriente laminar por un ensamblajeóptico de láser (la fuente de luz proviene de un diodode láser). Antes de entrar en el flujo celular, loseritrocitos y las plaquetas se clasifican según laesfericidad por características isovolumétricas con el

a- Sactter 90° (lobularidad) vs Scatter 10° (Com- plejudad). Permite separa PMN de células mono- nucleares.

b- Scatter 90D (depol) vs 90°, permite distinguir Eo (que depolarizan) de los PMN (no depol)

c- Scatter 0° (tamaño) vs Scatter 10° (complejidad). Discrimina los diferentes tipos de células mononu-leares y separa Monocitos de linfocitos y basófilos degranulados.

d- Scatter 0° (tamaño) vs 90° (lobularidad).

fin de eliminar el ruido de la orientación óptica. Enforma simultánea se determina la dispersión de la luzláser a dos intervalos angulares diferentes (ángulobajo [2° a 3°], se correlaciona con el volumen celular

o e! tamaño, y e! ángulo alto [5 a 15°] se correlaciona con la cOinplejidad interna [esto es, índice derefracción11).

o concentración de hemoglobina]) (fig.

Esta técnica de "dispersión diferencial" singular,junto con las características de clasificación por es-fericidad isovolumétrica, elimina el efecto adverso dela variación en la concentración de hemoglobinacelular en la determinación del volumen eritrocitario(como se observa por las diferencias en la capacidadde deformación celular que afecta la altura del pulsogenerado en los equipos por impedancia).","'Se uti-liza la teoría de Mie de dispersión de la luz de lasesferas dieléctricas para trazar las señales de dis-persión de intensidad proveniente de dos ánguloscomparadas cada una con e! volumen de cadaeritrocito (eje y) contra la concentración de hemo-globina (eje x) (fig. 12)." También se trazan histogra-mas independientes de volumen eritrocitario y con-centración de la hemoglobina. En el Technicon H-Systems las plaquetas se cuentan y clasifican segúnel tamaño a partir de señales de ángulo alto y se ge-nera un histograma de distribución por tamaño de lasplaquetas. El ADVIA 120 utiliza el análisis bidi-mensional (ángulos bajo y alto) de las plaquetas quepermite distinguirlas de las partículas que interfierencomo fragmentos de eritrocitos y eritrocitos peque-ños. En consecuencia, las plaquetas más grandespueden incluirse en el recuento. De las medicionesdescritas derivan varios parámetros e índices. ElVCM y el VPM son la media del histograma delvolumen eritrocitario y el histograma de las pla-quetas, respectivamente. El hematocrito, la HbCM yla CHbCM se computan en forma matemática a partirde los valores de eritrosis-tos, hemoglobina y VCM.

La RDW se calcula como el CV del histogramade volumen eritrocitario, mien-tras que la amplitudde distribución de hemoglobina (HbDW), un índiceanálogo se calcula como la desviación estártdar delhistograma de concentración de la Hb eritrocitaria.

El intervalo de referencia para la HbDW es2,2-3,2 g/dL. La concentración hemoglobínica cor-puscular media medida (CHbCM) deriva de lamedición directa en cada célula de la concentraciónde hemoglobina. Las interferencias en el método co-lorimétrico para la Hb, como lipemia o ictericia,afectan la CHbCM calculada pero no alteran laCHbCM medida. Esta última, por lo general no seinforma como un resultado del paciente pero elequipo la utiliza como un control interno con res-pecto a la CHbCM calculada y está disponible para eloperador para cálculos posteriores de hemoglobina, sihay interferencias. Señalizaciones singulares de loseritrocitos derivadas de la CHbCM son la varianza dela concentración de hemoglobina (HbC VAR),hipocrornía (HYPO) e hipercrornía (HYPER). Losanalizadores hemáticos de Bayer determinan el re-cuento leucocitario total y diferencial de seis com-ponentes (neutrófilos, linfocitos, monocitos, eosi-

nófilos, basófilos y células no coloreadas grandes [eninglés, large unstained cells, LUC]) por citoquímicay citometría de flujo óptica, utilizando los canalesPEROX y BASO.

SSiisstteemmaa PPAANNDDAA

La absorbancia se traza en el eje x del cito-grama y la dispersión en el eje y. Se obtiene unrecuento total de leucocitos (L-PEROX o LP) de lasseñales ópticas en este canal y se utiliza como uncontrol interno del recuento leucocitario primarioobtenido en el canal de basófilos-lobularidad (L-BASO o LB). Si se produce una interferencia signi-ficativa en e! recuento de LB, el instrumento sustitui-rá el LP. El análisis computarizado del cúmulopermite la clasificación de las diferentes poblacionescelulares, entre las que se incluyen cúmulos anorma-les de eritrocitos nucleados y plaquetas. Los neutró-filos y los eosinófilos contienen la máxima cantidadde PX y un cúmulo a la derecha del citograma. Losmonocitos adquieren una coloración débil y por con-siguiente el cúmulo se observa en la región media delcitograma. Los linfocitos, los basófilos y los LVC(que abarca los linfocitos atípicos y los blastos) nocontienen PX y aparecen en la izquierda del cito-grama, con los LVC que aparecen sobre el área de loslinfocitos. El cúmulo de basófilos se ubica con loslinfocitos pequeños y requiere análisis adicionalespara la correcta clasificación.

La actividad peroxidasa de la progeniemieloide es nula en los blastos indiferenciados, y seincremente paulatinamente a medida que dichaprogenie avanza en su diferenciación, hasta alcanzarun máximo de actividad en el Pormielocitos, y luegodeclina pero manteniendo alta actividad en todos losestadíos de diferenciación. Gracias a esta particu-laridad, la correlación entre la intensidad de lareacción citoquímica (PEROX), con la complejidadnuclear, nos brinda una información muy valiosa ala hora de clasificar el tipo celular presente, de granayuda en los casos de leucemias agudas, y procesosmieloproliferativos.

Canal de peroxidasa (PEROX) En el canal PEROX, los eritrocitos se lisan

y los leucocitos se tiñen por su actividad de pe-roxidasa (PX). La reacción siguiente es catalizadapor la PX celular, que convierte el sustrato a unprecipitado oscuro en las células que contienen PX.Una porción de la suspensión celular se coloca en lacorriente laminar de un flujo celular donde se utilizaun sistema óptico halógeno de campo oscuro contungsteno para la medición de la absorbancia (pro-porcional al contenido de PX de cada célula) y ladispersión frontal (proporcional al tamaño de cadacélula).

inmaduros (GO, eritrocitos nucleados o plaquetasgrandes y cúmulos de plaquetas. En la figura 13 serepresenta un registro impreso de un pacientegenerado en el equipo ADVIA 120.

Recuento automatizado de reticulocitos El recuento de reticulocitos fue e! último de los

procedimientos manuales de conteo celular en auto-matizarse y fue principal adelanto en los analiza-dores hemáticos durante los últimos años. La impre-cisión y la inexactitud del recuento manual de reti-culocitos se deben a numerosos factores, comovariabilidad de la coloración, errores de distribuciónen el porta objeto, errores estadísticos de muestreo yerrores surgidos entre los observadores." Todos ellosexcepto quizá la variabilidad de la coloración, soncorregibles con el recuento automatizado de reticu-locitos. Al aumentar el número de eritrocitos conta-dos aumenta la precisión. Esto se evidenció por elestudio piloto sobre competencia de los reticulocitosrealizado por el College of American Pathologists en1993 (Set RT-A, Sample RT- 01) en el que el CVpara los resultados manuales informados fue del3S% comparado con el 8,3% para el método porcitometría de flujo." La precisión en los métodosautomatizados cada vez es mayor. Los resultadospor métodos manuales de reticulocitos para unamuestra en el 2000 Retyculocite Survey SetRT/RT2-A mostró un CV de 28,7% comparado conel 2,8% para uno de los métodos automatizados.'"Los analizadores automatizados de reticulocitos pue-den contar hasta 32.000 eritrocitos comparado conlas 1.000 células del método manual habitual."

Se dispone de los siguientes analizadoresautomatizados de reticulocitos: sistemas de cito-metría de flujo como el Becton Dickinson FACS oCulter EPICS; Sysmex R-3S00, R-SOO y SE-9S00/9000+RAM-1; sistemas CELL-DYN 3500R,3700 Y 4000; Coulter GEN-S, STKS y sistemasMAXM, y sistemas Bayer ADVIA 120 YTechnicon H-3 RTC y RTX. Todos estos anali-zadores evalúan los reticulocitos basados en la dis-persión óptica o la fluorescencia después de tra-tarlos eritrocitos con colorantes fluorescentes o lacoloración del ácido nucleico para teñir el RNAresidual en los reticulocitos. Dado que por lo gene-ral el FACS y el sistema EPIC no están disponiblesen el laboratorio de hematología de rutina, la expo-sición se limita a los otros analizadores.

El Sysmex R 3000/3500 es un analizador dereticulocitos independiente que utiliza Auramina O,un colorante fluorescente supravital y mide la dis-persión frontal y la fluorescencia lateral cuando lascélulas se dirigen a través de un flujo celular laminarpor el que pasa un láser de argón. Las señales setrazan en un diagrama de dispersión con intensidadde dispersión frontal que se correlaciona con el tama-ño, graficado con respecto a la intensidad de la fluo-rescencia, que es proporcional al contenido de RNA.La discriminación automática separa las poblacionesen eritrocitos maduros y reticulocitos. Estos últimosquedan comprendidos en las regiones de fluores-cencia baja, fluorescencia media o fluorescencia alta,con los reticulocitos menos maduros que muestranfluorescencia más alta. La fracción de reticulocitosinmaduros (en inglés Irnmature Reticulcyte Fraction;IRF) es la suma de las relaciones de fluorescencia

Sistema Perox del ADVIA-120. Permite pre-clasificar las Leucemias acordes a la densidad nuclear y la expresión de PX

Canal de lobularidad de basófilos (BASO)

En el canal BASO las células se tratan conun re activo que contiene un surfactante no iónico enuna solución ácida. Los basófilos tienen una resis-tencia particular a la lisis en esta reacción controladapor la temperatura, mientras que los eritrocitos y lasplaquetas se lisan y otros leucocitos (no basófilos) sedespojan de su citoplasma. El láser óptico, con elmismo sistema de dispersión frontal en dos ángulos(2°-3° y 5°-15°) del canal de eritrocitos y PL, seutiliza para analizar las células tratadas. La disper-sión con ángulo alto (proporcional a la complejidadnuclear) se traza en el eje x y la dispersión conángulo bajo (proporcional al tamaño de la célula), enel eje y. El análisis del cúmulo permite identificar ycuantificar cada población celular. Los basófilosintactos son identificables por su gran dispersión enángulo bajo. Los núcleos restantes se clasifican co-mo núcleos de mononucleares (MN), polimorfonu-cleares (PMN) y blastos según su complejidad (for-ma y densidad celular) y la dispersión en ánguloalto.

Los basófilos quedan comprendidos por encima de un umbral horizontal en e! citograma. Losnúcleos despojados de su citoplasma quedan debajode los basófilos, con los PMN a la derecha y los MNa la izquierda a lo largo de! eje x. El cúmulo deblastos se ubica debajo de las células mononu-cleares. La falta de' separación neta entre loscúmulos nucleares de PMN y MN indica inmadurezde los leucocitos o sospecha de una desviación de lafórmula a la izquierda. Como se indicó antes, estecanal proporciona el recuento leucocitario primario,L-BASO o LB. Los resultados diferenciales (%) secomputan al dividir los números absolutos de lasclasificaciones celulares diferentes por el recuentoleucocitario total. La información proveniente de loscanales PEROX y BASO se utiliza para generarseñalizaciones de morfología diferencial que indicanla posible presencia de linfocitos atípicos (ATYPS),blastos, desviaciones a la izquierda, granulocitos

media y alta, e indica la proporción de reticulocitos inmaduros con respecto al total en una muestra. Las plaquetas, que también se cuantifican, quedan com-prendidas por debajo de una línea discriminadora másbaja. El módulo Sysmex SE-95001 9000+RAM-1utiliza la misma metodología de la citometría de flujopara el recuento de reticulocitos que el R-3500. No serequiere la preparación separada de la muestra. ElSysmex R-500 más pequeño utiliza citometría deflujo con un láser semiconductor como fuente de luzy el colorante fluorescente supravital Polyrnethinepara proporcionar los recuentos automatizados de re-ticulocitos. El CELL-DYN 3500R realiza el análisisde reticulocitos midiendo la dispersión a 10° y 90° enel canal óptico (tecnología MAP.S.S.) después delograr esfericidad isovolumétrica de las células paraeliminar el ruido de la orientación óptica. Los eritro-citos se colorean con el colorante de tiazina azul demetileno N (nuevo) en una preparación independientede la muestra antes de que ésta se introduzca en elequipo. El operador simplemente debe cambiar lasfunciones computarizadas en el instrumento antes dela aspiración de la preparación de reticulocitos." ElCELL-DYN 4000 utiliza la tecnología M.A.P.S.S.pero agrega la detección fluorescente para permitir lacomprobación de reticulocitos automatizada porcompleto y con acceso aleatorio. Los eritrocitos secolorean con un colorante fluorescente, que atraviesala membrana, de marca registrada (CD4KS30), quese une de modo estequiométrico con el ácido un-cleico y emite luz verde a medida que las célulasatraviesan un flujo celular laminar por el que pasa unláser del ion argón. Las plaquetas y los reticulocitosse separan de acuerdo con la intensidad de fluores-cencia verde (dispersión medida a 7° y 90°) y se .de-termina el recuento de reticulocitos junto con la 1RF.

El Coulter también incorporó métodos parareticulocitos en su instrumentación de conteo prima-rio de células, éstos son, los sistemas GEN-S, STKSy el MAXM. Para el STKS y el l\1AXM serequieren coloraciones antes de introducidas en elaparato, pero se utilizan las mismas ópticas láser em-pleadas en el recuento de células para la cuanti-ficación de retículocitos. El método de Coulter utili-za una coloración con azul de metileno nueva y latecnología de VCS descrita antes. El volumen segrafica con respecto a la dispersión de la luz (trazadode dispersión DF 5) Y a la conductividad (trazado dedispersión DF 6), que se correlaciona con la opa-cidad del eritrocito. Los reticulocitos teñidos mues-tran mayor dispersión óptica y opacidad que loseritrocitos maduros. Se informan los recuentos rela-tivos y absolutos de reticulocitos, junto con el vo-lumen del reticulocito medio (VRM) y el índice demaduración (1M) o 1RF. Los sistemas BayerADVIA 120 y Technicon H-3 RTC o RTX cuan-tifican los reticulocitos en el mismo flujo de célulasóptico con láser utilizado en los canales eritrocitos yPL Y BASO descritos antes. Los sistemas H-3 re-quieren una preparación independiente de la muestrafuera del aparato. El reactivo para reticulocitosproduce la esfericidad isovolumétrica eritrocitaria ycolorea los reticulocitos con oxazina 750, un colo-rante que se une al ácido nucleico. Tres detectoresmiden la dispersión en ángulo bajo (2°-3°), la dis-persión en ángulo alto (5°-15°) y la absorbancia enforma simultánea a medida que las células pasan a

través del flujo celular. Se generan tres citogramas:1) dispersión en ángulo alto con respecto a laabsorción; 2) dispersión en ángulo bajo con respectoa la dispersión en ángulo alto (citograma Mie o mapaeritrocitario), y 3) volumen con respecto a laconcentración de hemoglobina. El citograma deabsorción permite la separación y la cuantificaciónde los reticulocitos, con subdivisión adicional encélulas absorbentes bajas, medias y altas basadas enla cantidad de coloración. La suma de las célulasabsorbentes medias y altas refleja el IRF. El volu-men y la concentración de hemoglobina para cadacélula derivan del mapa eritrocitario que utiliza lateoría de dispersión Mie. Se proporcionan variosíndices de reticulocitos (VCMr, CHbCMr, RDWr,HDWr, CHbr y ADCHr). El contenido de hemo-globina (CHp) de cada célula se calcula como elproducto del volumen celular y la concentración dehemoglobina celular. Se construye un histograma deun solo parámetro de CHp con una amplitud calcu-lada de distribución correspondiente (ADCHr). Estosíndices de reticulocitos no están disponibles en el re-gistro impreso del paciente de rutina, pero lo estánpara el operador. En la figura 14 se observa un regis-tro impreso de reticulocitos de un ADVIA 120 quemuestra los citogramas y los índices de reticulocitos.

pero el método de cianmetahemoglobina aún es elúnico estándar disponible en hematología para la ca-libración y el control de calidad6; La calibración desangre entera que históricamente fue el método pre-ferido para la calibración de analizadores hemáticosmulticanales, se reemplazó casi por completo por eluso de calibrado res comerciales probados contra losmétodos de referencia. El sesgo de la calibración esposible con el uso de estos calibradores debido a lasdiferencias inherentes en las suspensiones celularesestabilizadas y conservadas. En consecuencia, es ese-ncial que las calibraciones se lleven a cabo demanera adecuada y verificadas mediante la compara-ción con métodos de referencia o la revisión de losdatos del control de calidad después de la calibracióny con estudios de comparación externos, como lacomprobación de la competencia.

Limitaciones del equipo

Los avances continuos en automatizaciónaumentaron la sensibilidad y la especificidad de lasseñalizaciones del equipo, con la detección de posi-bles interferencias en los datos. Sin embargo la opti-mización paralela de los equipos de fácil uso obliganal tecnólogo a conocer y comprender las limitacionesdel equipo y a reconocer los factores que pueden' in-terferir y provocar resultados erróneos del laborato-rio. Las limitaciones y las interferencias pueden rela-cionarse con la metodología o los problemas inheren-tes a la muestra de sangre. Cada instrumento tienelimitaciones relacionadas con la metodología queestán definidas con claridad en los manuales de ins-trucción y en la bibliografía. Una limitación comúndel método es la incapacidad de un instrumento paradistinguir las células de otras partículas o fragmentosde células del mismo tamaño de manera confiable.Por ejemplo, pueden contarse los fragmentos celula-res como plaquetas en las muestras de pacientestratados con quimioterapia con aumento de la fragili-dad de los leucocitos. Asimismo, los esquistocitos oeritrocitos pequeños pueden interferir en el recuentode las plaquetas. Los cúmulos de plaquetas másgrandes pueden contarse como leucocitos, lo queproduce un recuento de plaquetas falsamente dismi-nuido y un posible recuento aumentado de leucocitos.Los micromegacariocitos pueden contarse comoeritrocitos nucleados o leucocitos. Los eritrocitos quecontienen alguna variante de hemoglobina como S oC a menudo son resistentes a la lisis, con células nolisadas que se cuentan por error como eritrocitos un-cleados o leucocitos, e interfieren en la reacción deHb. Este fenómeno fue más evidente con los dilu-yentes y reactivos para la lisis menos potentes, de losanalizadores con tecnología diferencial automatizadade los leucocitos. La ausencia de lisis también puedeobservarse en la enfermedad hepática grave, con eltratamiento con quimioterapia y en los recién naci-dos (con niveles aumentados de hemoglobina F) enlos instrumentos Sysmex más antiguos y con nivelesséricos elevados de nitrógeno de la urea en losinstrumentos Technicon H. Los sistemas TechniconH pueden proporcionar un recuentos leucocitario co-rrecto del canal BASO (es decir, LB) con su reactivolítico más potente. El ADVIA 120 informa ahora losLB como recuento primario de los leucocitos. En elCELL-DYN 3500 se puede utilizar un ciclo de lisis

Limitaciones e interferencias La automatización en el laboratorio de

hematología requiere la evaluación crítica de losmétodos, las limitaciones y los objetivos del rendi-miento del equipo para cada laboratorio en particular.El National Cornmitee for Clinical LaboratoryStandards (NCCLS) aprobó un estándar para losobjetivos del rendimiento para comprobar la calidadinterna de los analizadores hemáticos multicanales60.Este estándar proporciona pautas de calibración delequipo y valoración de los criterios de rendimiento,como exactitud, precisión, linealidad, sensibilidad yespecificidad. La exactitud clínica (sensibilidad yespecificidad) de los métodos debe permitir que elinstrumento identifique de manera adecuada a lospacientes enfermos y a los individuos sanos, respecti-vamente" Los sistemas de control de calidad debenreflejar los objetivos de rendimiento establecidos porel laboratorio y garantizar que el dentro de sus límites especificados.

equipo trabaja

Calibración La calibración es crítica para definir la

exactitud (comparada con la precisión) de los datosproducidos. La calibración, o el proceso de corregirun equipo electrónicamente para el sesgo analítico(diferencia numérica con el valor "verdadero") pue-de lograrse con el uso apropiado de métodos de refe-rencia, materiales de referencia, calibradores prepa-rados en forma comercial o cualquier combinaciónde ellos. Dado que pocos equipos están precalibradospor el fabricante, la calibración debe realizarse en elmomento de la instalación inicial y debe verificarseal menos cada 6 meses según el Clinical LaboratoryImprovement Act de 1988 (CLlA 88). Pueden reque-rirse calibraciones periódicas después de repara-ciones importantes del equipo que requieren alinea-ción óptica o 'reemplazo de partes.

La calibración de muestras de sangre enteraque utiliza muestras de sangre entera recientes pre-cisa métodos, materiales y procedimientos de refe-rencia para determinar los valores "verdaderos". Elcomité internacional para estándares en hematologíaestableció pautas para seleccionar un contador decélulas sanguíneas de referencia para este propósito,

La automatización de los reticulocitos permitió mayor precisión y exactitud, así como un análisis mucho más amplio de los eritrocitos inmaduros, lo que propor-ciona parámetros nuevos e índices que pueden ser útiles en el diagnóstico y el tratamiento de las anemias. La IRF es un indicador confiable de cambios en la actividad eritropo-yética y una herramienta valiosa para el monitoreo tera- péutico en los pacientes con insu-ficiencia renal crónica. La medición de la madurez de retículocitos también puede ser útil para evaluar la supresión de la médula ósea durante la quimioterapia, el monitoreo de la regeneración remato-poyética después del trasplante de médula ósea o células troncales, la supervisión de la aceptación del transplante renal y la supervisión de la eficacia del tratamiento para la anemia. Los otros índices de reticulocitos provenientes del ADVIA 120 son útiles en el seguimiento de la respuesta al tratamiento de eritropoyetina y CHbr, en particular son útiles en la detec-ción temprana y el diagnóstico de la eritropoyesis ferropénica en los niños. La utilización

extendido y los equipos más nuevos pueden propor-cionar un recuento por impedancia de leucocitos(RIL), correcto cuando también hay pre-sencia deeritrocitos resistentes a la lisis. Los Sysmex SE-9000y 9500 tienen un canal de impedancia de leucocitosadicional. La supresión de datos automatizados, enparticular los datos de la fórmula diferencial deleucocitos, se puede producir cuando fallan los con-troles internos del equipo o la validez de los datos esdudosa. Algunos fabricantes dan a conocer resol-tados con códigos de error o señalizaciones especí-ficas pata una revisión más extensa. La tasa de re-chazo de los diferentes equipos varía; en un estu-diose observó que los instrumentos Coulter y Sysmexmuestran la mayor supresión más alta de datos y losanalizadores Bayer (Technicon) y CELL-DYN lamenor. La supresión automatizada de datos dife-renciales exige un recuento diferencial manual, mien-tras que la aparición de datos con señalizacionesadecuadas plantea la necesidad de una revisión cui-dadosa de los datos y tal vez de un extendido desangre. Esto sugiere una diferencia de criterios entrelos fabricantes y obviamente repercute en el volumende trabajo de maneras diferentes. Es importante des-tacar que cada laboratorio debe establecer suscriterios propios para la revisión dirigida de losextendidos de sangre, basada en los objetivos de ren-dimiento establecidos, las señalizaciones del instru-mento y las limitaciones inherentes a él. En el cuadro3 figura el algoritmo de los "criterios de revisión"para el Bayer ADVIA 120 utilizado en el VanderbiltUniversity Hematology Laboratory.

logía, pero no en forma manual, ofrecen otra visiónen algunos cuadros clínicos. La RDW, una estima-ción cuantitativa de la anisocitosis de los eritrocitos,se utilizó junto con el VCM para la clasificación delas anemias. Se propusieron diversos discriminantes(fórmulas matemáticas o funciones discriminantes)que utilizan estos dos valores para la diferenciaciónentre la ferropenia y la talasemia menor, basada en elpatrón típico de ferropenia que tiene un VCM bajocon una RDW alta y la -talasemia menor que pre-senta un VCM bajo con una RDW normal. Se de-mostró que la RDW no es un discriminador con-fiable si se los utiliza en forma aisladas en las ane-mias microcíticas. La medida directa de la CHb eri-trocitaria en los sistemas Bayer mostró ser una he-rramienta valiosa en la detección temprana de lasanemias ferropénicas y para diferenciarla de la tala-semia menor. Si la CHb medida en forma directatambién se utilizó en la detección de la eritropoyesisferropénica en los sujetos con concentración de Feelevada tratados con eritropoyetina recombinante. ElVPM puede ser útil para determinar si la función dela médula ósea es correcta. Un VPM bajo puedeindicar hipoproducción medular y un VPM elevadoplantea la sospecha de un trastorno mieloproli-ferativo. Sin embargo, la metodología, la anticoa-gulación y el tiempo de almacenamiento influyen enel VPM, que reduce la utilidad de este parámetro.

El recuento leucocitario diferencial auto-matizado tuvo un impacto importante en el volumende trabajo del laboratorio porque el recuento diferen-cial manual es muy dificultoso. Se demostró que losrecuentos diferenciales de tres componentes disponi-bles en los primeros equipos suelen ser apropiadospara la detección sistemática diferencial de los leu-cocitos y para identificar las muestras que requerianotros estudios o un recuento diferencial manual. Sinembargo, se observó que los recuentos diferencialesparciales no sustituyen un recuento diferencial com-pleto en las poblaciones anormales. Los recuentosautomatizados de cinco componentes de los equiposmás sofisticados se evaluaron de manera extensa yparecen tener sensibilidad y especificidad clínicaaceptable para la detección de anomalías de distribu-ción y morfológicas. Las células anormales (blastosy los eritrocitos nucleados) en concentración baja nopueden detectarse mediante los equipos, pero igualpueden omitirse en el recuento diferencial manual ovisual de rutina realizado sobre 100 células. ElCELLDYN 4000, con tecnología de detección fluo-rescente agregada, mostró tener sensibilidad y espe-cificidad elevadas para la señalización de eritrocitosnucleados y cúmulos de plaquetas. Los avances tec-nológicos disminuyen la necesidad de la revisión deextendidos de sangre para confirmar la presencia decúmulos de plaquetas o eritrocitos nucleados y losrecuentos exactos de leucocitos para la interferenciade cúmulos de plaquetas o eritrocitos nucleados. Lasevaluaciones del instrumento basadas en los están-dares H20-T o H20-A del NCCLS (ReferenceLeukocyte Differential Count [Proportional] y Eva-luation of Instrumental Methods) que utilizan ya seaun recuento diferencial manual de leucocitos de 800o 400 células, respectivamente, como método dereferencia mostraron coeficientes de correlaciónaceptables para todos los tipos de leucocitos, con laposible excepción de los monocitos.

Limitaciones debidas a la muestra Entre las limitaciones debidas a los proble-

mas inherentes a la muestra se incluye la presenciade factores como crioaglutininas, ictericia y lipemia.Las crioaglutininas se presentan con un patrón clá-sico de VCM aumentado (con frecuencia mayor que130 fL), recuentos de eritrocitos notablemente dismi-nuidos y CHbCM aumentada (con frecuencia mayorque 40 gldL). El examen detallado de los histogra-mas y citogramas de los equipos puede brindarindicios de esta alteración."La ictericia y la lipemiaafectan las mediciones de la Hb y los índices relacio-nados. El tiempo transcurrido desde la obtención dela muestra y el manejo inadecuado de la muestrapueden tener un gran impacto en la confiabilidad delos resultados de las pruebas hematológicas. Estosfactores tienen una importancia aun mayor cuandolos hospitales derivan las muestras, a los laboratoriosde referencia que manejan grandes cantidades demuestras. Los problemas específicos con las mues-tras más viejas son el aumento de la fragilidad de losleucocitos, aumento del tamaño y posible lisis eritro-citaria así como alteración de las plaquetas. Debenrealizarse los estudios de estabilidad antes de utilizarun equipo y es preciso establecer pautas específicaspara el manejo y el rechazo de la muestra.

Utilidad clínica de los equipos automatizados en hematología

Los analizadores automatizados para losrecuentos celulares afectaron de manera directa ladisponibilidad, la exactitud y la utilidad clínica delHC y el recuento leucocitario diferencial. Algunosparámetros disponibles en los equipos de remato-

Otros estudios que utilizan anticuerpos mo-noclonales como método de referencia para cuan-tificar monocitos sugieren que los analizadoresautomatizados ofrecen una evaluación más exacta delas monocitosis que los métodos manuales. Los his-togramas y los citogramas, junto con la señalizacióndel equipo proporcionan información valiosa para eldiagnóstico y el tratamiento de los trastornos de loseritrocitos y los leucocitos. En numerosos informesse indicó la eficacia de los histogramas y los cito-gramas para detectar algunas situaciones anormales,como trastornos eritrocitarios como crioaglutininas yenfermedades de los leucocitos como leucemias ytrastornos mielodisplásicos. Los fabricantes princi-pales de instrumentos publicaron libros de estudiosde casos prácticos con histogramas y citogramas pa-ra ayudar al técnico en la interpretación de los datosdel instrumento. Por último, los fabricantes estándesarrollando puestos de trabajo integrados de hema-tología para la automatización y la eficacia máximasdel laboratorio. Por ejemplo, el Sysmex Total Hema-tology Automation System (series HST) une de ma-nera robótica el SE-9000, el R-3500 (analizador au-tomatizado para reticulocitos) y el SP-100 (aparatopara preparar en forma automática los portaobjetos yteñirlos) para automatización completa o sistema-tización de la evaluación hematológica, El SE-Alphaes una versión más pequeña que une el SE-9000 y elSP-lOO.3D Los otros fabricantes desarrollan siste-mas similares. La selección de un analizador remato-lógico para cada laboratorio individual requiere laevaluación cuidadosa de las necesidades del labora-torio y conocer en forma exhaustiva el funciona-miento del equipo, incluso sus especificaciones y losrequisitos del sistema, los métodos, los requisitospara el mantenimiento, el uso de reactivos, el manejode datos, la respuesta del personal y los gastos acorto y a largo plazos. Las indicaciones de todos losinstrumentos alegan mejorar la eficacia del labora-torio, ya sea a través de la mayor automatización quemejora el volumen de trabajo y obtiene resultadosmás rápidos, o mediante el agregado de parámetrosnuevos que pueden tener importancia clínica. Elequipo seleccionado debe "adaptarse" al trabajo y ala población de pacientes, y mejorar sus resultados.Por ejemplo, la selección para un centro oncológicopuede ser diferente de la que se precisa para un hos-pital de la comunidad. No obstante, en la selección

final del equipo pueden prevalecer las preferencias individuales.

Garantía de calidad en el laboratorio de Hematología : conceptos básicos

La garantía de calidad comprende a todasaquellas acciones planificadas y sistemáticas necesa-rias para proporcionar adecuada confianza de que unproducto, proceso o servicio cumple determinadosrequerimiento para la calidad. Es una herramientapara asegurar la confiabilidad de los datos de labo-ratorio y tiene como objetivo lograr exactitud y pre-cisión. Para ello se basa en cuatro pilares fundamen-tales que son:

1-2-3-4-

Control interno de calidad Evaluación externa de calidad Estándares y estandarización Vigilancia de la calidad. La exactitud se define como la medición de

la concordancia entre el valor medido y el valor ver-dadero. Se expresa como error sistemático o sesgo.La precisión puede definirse como la concordanciaentre repeticiones de una misma muestra. Se expresacomúnmente como desviación estándar y es una me-dida del error aleatorio. La imprecisión y/o la inexac-titud ocurren como consecuencia de una mala estan-dardización o de reactivos dañados, de una incorrec-ta calibración instrumental o del uso de un métodopobre desde el punto de vista analítico (poco especí-fico, reacciones incompletas, etc). La precisión puedeser controlada mediante la duplicación de medidas,de pruebas de control en muestras cuantificadas pre-viamente y por análisis estadísticos de datos. Laexactitud solo puede controlarse si se posee un ma-terial de referencia. Un material de referencia se defi-ne como un material o sustancia con una o más ca-racterísticas lo suficientemente homogéneas y perfec-tamente establecidas, usado para la calibración de unaparato, la valoración de un método de medida, opara asignar valores a los materiales. Este material noes lo mismo que un material de control que se definecomo una sustancia usada de forma rutinaria en ellaboratorio para monitorear el desempeño de un pro-ceso analítico. En la tabla 1 se detallan los materialesde control y/o calibradores empleados en Hematolo-

MATERIAL CONTROL O CALIBRADOR

METODO CV% Nº DE REPETICIONES

Hemolisado

Hemoglobina

HiCN < 2 20

Sangre entera

preservada

Glóbulos rojos

Hematocrito

Automatizado Manual Macro Micro

< 3 < 3 < 2

5 en 2 alícuotas

Glóbulos rojos

fijados

Glóbulos rojos

Hematocrito

Automatizado Manual Micro

< 3 < 2

5 en 2 alícuotas

Pseudoleucocitos

Recuento de glóbulos blancos

Manual

< 5

5 en 2 alícuotas

Plaquetas fijadas Recuento de plaquetas Manual < 5 5 en 2 alícuotas

gía, según lo descripto por la OMS (1), donde sedescriben la imprecisión que debe lograse para cadamétodo y cada analito, e indica asimismo el númerode alícuotas y repeticiones que deben emplearse, paraasignarle valores. Control de calidad interno (CCI):procesos que proveen una vigilancia contínua de losprocedimientos analíticos que se llevan a cabo en ellaboratorio y de la evaluación de los resultados, conel objeto de decidir si son lo suficientemente confia-bles para ser emitidos. Incluye: 1-Medición de mate-riales control 2-Mediciones repetidas sobre muestrasde pacientes 3-Análisis estadístico, día a día, de losdatos obtenidos en las pruebas de rutina. Permiteevaluar la precisión de una medición pero no siem-pre la exactitud. Evaluacion externa de la calidad (EEC): consisteen la evaluación retrospectiva y objetiva, por parte deuna entidad ajena, del desempeño de un grupo delaboratorios que analizan materiales proporcionadosespecíficamente para ese propósito. Vigilancia de la Calidad implica la evaluación detodos los aspectos de las pruebas de laboratoriodonde además de CCI y EEC se tiene en cuenta latoma de muestra , rotulado, transporte y conservaciónde la muestra antes de la realización de la prueba y lalectura y el informe de los resultados. Calidad de la fase analítica: Para asegurar la garan-tía de calidad de la fase analítica hay tres aspectosbásicos a tener en cuenta y son (1): a) Calibracióndel equipo, b) Control interno de calidad y c)Evaluación externa de calidad. La calibración delcontador hematológico es punto crítico. Un instru-mento de medición directa es uno que lleva a cabomediciones directamente, sin la necesidad de cali-bración. Un buen ejemplo de este tipo de instrumentoes el espectrofotómetro, que mide la hemoglobinadirectamente a partir de la absorbancia del complejocianmetahemoglobina a 540 nm. Los contadores au-tomatizados de células sanguíneas no son instru-mentos de medición directa, al menos para la ma-yoría de las mediciones que realizan. La única excep-ción se da, en términos de recuento de células, dondeunos pocos fabricantes suministran instrumentos quemiden recuentos por unidad de volumen de dilución.Cuando se usan ese tipo de contadores, todo lo quenecesita el usuario es controlar que el instrumentoesté trabajando correctamente y llamar al proveedoren caso contrario; es decir el usuario no puede reca-librar el instrumento. Todos los otros instrumentosmiden recuentos por unidad de tiempo en vez derecuentos por unidad de volumen de dilución. Por lotanto, tienen que ser calibrados para convertir los re-cuentos por unidad de tiempo en recuentos por uni-dad de volumen. Esto se hace analizando una muestrade sangre cuyo recuento celular por unidad de volu-men ha sido determinado independientemente me-diante un método de referencia, obteniendo un factorde calibración que el propio equipo calcula e ingresapara proveer los resultados de las muestras (3).

La forma más práctica es proceder a la calibración con materiales comerciales para los quecada fabricante provee un instructivo de los pasos aseguir para el uso de los mismos y un inserto dondeconstan los valores asignados. Una vez cumplidos losrequisitos previos para el procesamiento del calibra-dor, es necesario seguir los pasos que indique elmanual del equipo para el procedimiento de cali-

bración. En caso de no disponerse de ese tipo de ma-teriales, se puede recurrir al uso de sangre fresca enla que los valores pueden ser establecidos de acuerdoa los métodos de referencia recomendados por orga-nismos internacionales según lo indicado en la Tabla2. Esto es sumamente dificultoso por el tiempo queconsume, que no permite hacer más de una o doscalibraciones, durante el período en el que el materialpermanece estable.

Tabla 2. Métodos de referencia para la asignación de valores verdaderos

Control de calidad interno El proceso de calibración, ya sea con

calibradores de sangre fresca o preservada, y el usode controles para controlar la inexactitud, forman elnúcleo del control de calidad del recuento de célulassanguíneas. Para ello, el material usado para el con-trol de la calidad debe ser lo más similar posible, entodos sus aspectos, a la sangre entera fresca y deberáestar sujeto a los mismos procedimientos que losmuestras de los pacientes, tanto en el tratamientoprevio a la medición de la muestra control comodurante la fase analítica. Este aspecto es clave porque la falta de estabilidad de los materiales de controlconstituye un problema serio (2).

Los métodos para control de calidad interno son los siguientes: 1. Análisis de material comercial preservado

Estos materiales son provistos por losfabricantes. Se usan tres niveles de control diferentes:bajo, medio y alto, se analizan al menos una vez aldía y, en el caso de los laboratorios con mucho tra-bajo, al menos una vez por turno. Se debe utilizar laDE esperada para el analizador, que se estableció almomento de la instalación del mismo. Otra alterna-tiva es trabajar inicialmente con los valores provistospor el fabricante y luego de un número de determi-naciones que permitan aplicar métodos estadísticos,obtener valores de dispersión de los materiales decontrol, medidos en el propio aparato.

Es conveniente, en caso de no ser provistospor el contador hematológico, hacer gráficos de con-trol para visualizar las tendencias. Estos materialestienen sus inconvenientes porque sólo son establespor 30 a 90 días y, generalmente, son específicospara cada tecnología empleada. Se trata de materialescostosos y el deterioro temprano del mismo, proba-blemente, no sea reconocido en tiempo. Lamentable-mente, las variedades y amplitud de los rangosprovistos por los fabricantes son demasiado ampliaspara que permitan realizar un control efectivo de cali-

Analito Método de referencia

Hemoglobina

Hematocrito

Recuento de glóbulos rojos

Recuento total de leucocitos

Recuento diferencial de

leucocitos

Recuento de plaquetas

Recuento de reticulocitos

ICSH (4), NCCLS (5)

ICSH (6), NCCLS (7),

OMS (8)

En preparación (ICSH)

En preparación (ICSH)

NCCLS (9)

OMS (10)

ICSH & NCCLS (11)

dad en un laboratorio en particular. Esto puede ser mejorado con otras estrategias de control.

en general, realizaban sólo ocho pruebas. La intro-ducción de los análisis de XM se hizo con la intención de afinar más esas medias móviles y deproporcionar una mejor indicación de los pequeñoscambios en la deriva del instrumento. La teoría sobrela que se basa la definición de XM establece quemediante la combinación de medidas de control, delos pacientes como de fuentes comerciales de tandasanteriores como las de las mediciones en realización,es posible estimar los errores sistemáticos de maneramás eficiente.

2. Exámenes repetidos de muestras conservados delos pacientes

Los resultados deben haber sido obtenidoscon la certeza que el sistema estaba bajo control yse analizan en repetidas oportunidades durante el día.Tienen la ventaja de que se utiliza sangre fresca y eluso de dicho material aporta información sobre laderiva e imprecisión pero no sobre exactitud. Sirvencomo controles en el mismo día, aunque algunosextienden su uso hasta 24 horas. Tienen como des-ventaja la falta de estabilidad de algunos parámetroscomo el VCM, el recuento total de glóbulos blancosy plaquetas; el recuento diferencial de glóbulos blan-cos también se deteriora. La hemoglobina y eritro-citos son estables durante 24 horas.

Tabla 3. Tamaño muestral requerido para la obtención de promedios móviles

3. Promedios móviles Este método está relacionado con el

principio de que el valor medio de los lotes de losresultados de los pacientes para un analito perma-necerá aceptablemente constante en el tiempo. Es unaforma de análisis válido para muchos analitos cuandosólo se incluyen los resultados normales, aunquetambién es válido para los índices de glóbulos rojos,inclusive cuando se incluyen resultados anormales,siempre que las anomalías se presenten en formaaleatoria. Permite detectar la deriva en el lote másreciente, al comparar su valor medio con la media delos resultados de los pacientes conocida y previa-mente establecida para el analito. Para obtener lospromedios móviles, el tamaño muestral es un aspectoclave a considerar, ya que depende de la relación dela variabilidad biológica con la variabilidad analítica.Se sabe que cuanto menor es la proporción de la va-riabilidad biológica a la analítica, menor es el tamañodel lote requerido (Tabla 3). Cuando se utilizan lospromedios móviles, otro punto crítico es establecerlos límites de corte para la exclusión de datos delpaciente. Todas estas operaciones están programadasdentro de la mayoría de los analizadores hemato-lógicos de parámetros múltiples. Para estos cálculosse emplea el algoritmo de Bull (2) que permiteanalizar datos crudos, mejorar las curvas, reducir elefecto de datos alejados de la media y por con-siguiente, el de los valores de los pacientes muyanormales. Los promedios móviles XB, se aplicancon el fin de establecer normas de acción paradetectar errores analíticos, sin excesivos falsos recha-zos de lotes. Es necesario hacer la verificación inicialde que los índices eritrocitarios de la población delpaciente son similares a los índices obtenidos encualquier otro lugar. Para establecer los índices me-dios estables de pacientes, inicialmente hay que obte-ner, al menos, 500 valores de pacientes consecutivospara VCM, HCM y CHCM. Es necesario que elanalizador esté bajo control con el material de controlcomercial preservado, durante un mes (Tablas 4 y 5).Otro parámetro empleado mas recientemente es elXM o promedio móvil exponencialmente ponderado(EWMA), que está bien establecido como normapara el control interno de calidad. Los promediosmóviles de Bull que mencionamos anteriormente, sehan sido de utilidad durante la década de 1980cuando los analizadores eran relativamente simples y,

Tabla 4. Normas de acción según muestras para el control interno

Muestras comerciales preservadas

Correr controles bajos, medios y altos Si todos los valores directamente medidos se encuentran dentro de las 2 SD de la media, es factible que el análisis esté bajo control Si cualquier resultado de control está a más de 3 SD de la media ( norma I 3s ) tomar acciones correctivas Si dos de tres resultados de control se encuentran a más de

2 SD de la media, del mismo lado (norma (2 de 3) 2s ), o en lados opuestos ( norma R4s ) tomar acciones correctivas Para los resultados calculados tales como HCM, CHCM y hematocrito, la norma I3s no es adecuada, porque los valores directamente medidos están bajo control

Muestras de pacientes conservadas

Se retienen tres muestras de pacientes de valores normales y se las re- analiza, previo aireado de las muestras retenidas, cada vez antes de realizar un análisis, a intervalos regulares, por ejemplo cada 8 horas. Los laboratorios más pequeños pueden utilizar sólo una muestra de paciente retenida La norma (2 de 3) 2s es la más efectiva- 2 de cada 3 resultados de control se encuentran a más de 2 SD del resultado original del mismo lado de la media

Promedios móviles

La prueba está fuera de control si el promedio Bull para un lote es más que un 3% en ambas direcciones, diferente de su valor medio usual La prueba está fuera de control si el promedio de las últimas tres medias Bull es mayor que un 2% a partir de la media usual en ambas direcciones Tamaño de lote efectivamente más grande

Analito

Proporción

VB/VA

Tamaño de lote

requerido

Hemoglobina

Glóbulos blancos

Plaquetas

CHCM

VCM

23

12

6

1,7

11

800

300

70

20

250

Tabla 5. Aplicación de métodos de control de calidad, según analito

La OMS y el ICSH (1) han publicado un informesobre el control de calidad en Hematología, del cualhemos tomado un listado de acciones a cumplimentarpara asegurar la confiabilidad de los datos, que seresumen en la Tabla 6 y que pueden ser tenidas encuenta al momento de implementar medidas para lamejora de la calidad en un laboratorio de Hemato-logía.

Evaluación externo de calidad (interlaboratorial)

Los Programas de Evaluación Externa de Calidad(PEEC) han sido diseñados para disminuir la variabi-lidad entre laboratorios. El concepto de evaluaciónexterna de la calidad comprende diferentes procesosmediante los que se llevan a cabo evaluaciones de lacalidad de los resultados, coordinados por una orga-nización externa a la red de laboratorios. General-mente, la evaluación externa de calidad se basa enprogramas de comparación interlaboratorial. Las aso-ciaciones profesionales, los organismos oficiales vin-culados al sector Salud o fabricantes de materiales decontrol suelen ser los interesados y responsables dela organización de dichos Programas. Aunque existenesquemas operativos variables entre los Programas,suelen tener principios básicos semejantes. El con-cepto central es que los laboratorios de la red midenuno o muchos analitos, en porciones o alícuotas deun mismo material de control y cuyos valores le sondesconocidos. El ente organizador recopila los datosde los laboratorios, de la metodología, del instru-mental y de las unidades empleadas y toda otra in-formación relevante, lleva a cabo un estudio de los

Período Acción En todas las oportunidades

Establecer sistemas de correlación de - Informes acumulados - Relación entre extendidos y

recuentos celulares Diariamente

Pruebas con muestras control - Realización de muestras

control para cada lote - Preparación de gráficas de

control - Introducción de mediciones

duplicadas de algunas muestras de pacientes (4-5 de cada lote)

- Realización de pruebas de control en pocas muestras de pacientes del lote anterior (por lo general 4-5)

Análisis estadístico de los datos de los pacientes - Con contadores

automatizados: medias de VCM, HCN, CHCM

- Con contadores manuales: media de CHCM solamente

Diaria o semanalmente

Calibración de contadores automatizados, espectrofotómetros y otros elementos

Mensual o trimestralmente

Participación en un programa de evaluación externa de calidad, nacional o regional

Al inicio y cuando se indique

Calibración de pipetas y dispensadores automáticos

Analito

Materiales de control

preservados

Muestras retenidas

en pacientes Promedios móviles

Sugerencias

Glóbulos rojos

Deriva, error aleatorio

Deriva

Deriva

Utilizar tres niveles de material de control preservado al comienzo de cada día o de cada turno y luego monitorear el resto del turno con especimenes retenidos de pacientes y promedios móviles

Glóbulos blancos y plaquetas

Son útiles

Son útiles

No son útiles debido a los amplios grados de variabilidad biológica de los glóbulos blancos

Utilizar tres niveles de material de control preservado al comienzo de cada día o de cada turno. Reanalizar continuamente las muestras retenidas de pacientes para monitoreo continuo. Los recuentos de plaquetas pueden bajar hacia el final del período de 24 horas

Recuento diferencial de glóbulos blancos

Razonablemente satisfactorio. Ahora están disponibles para cada tecnología

Tienen estabilidad limitada para muchos analizadores

No son convenientes debido a la amplia variabilidad biológica. El recuento diferencial manual no puede usarse como chequeo de control de calidad en el recuento diferencial del analizador, debido a la gran imprecisión del mismo

Utilizar tres niveles de material de control preservado, diseñados específicamente para el analizador al comienzo de cada turno o de cada día. Reanalizar las muestras retenidas de pacientes dentro del marco tiempo en el que los resultados del recuento diferencial están estables para el analizador

resultados que, luego entrega a cada participante, enun periodo variable, después del momento de haberrealizado las mediciones. Este análisis no es útil parael control interno y es una de las causas por las quese dice que el control interno y la evaluación externason complementarios y no excluyentes. Cada progra-ma establece la periodicidad de las entregas en elmismo, el número de observaciones y el número demateriales distintos que utiliza. Algunos programasson específicos para un analito determinado mientrasque otros incluyen numerosos analitos en un mismomaterial de control. Cuando un laboratorio ingresa ala red, se le otorga un código para conservar suanonimato y debe enviar información sobre los pro-cedimientos de medida y unidades que emplea. Aliniciarse el programa, los laboratorios participantesreciben los materiales de control junto con instruc-ciones sobre su manipulación, condiciones de con-servación y datos de estabilidad.

Como dijimos, la evaluación externa nosustituye al control interno de la calidad, pero locomplementa por ser capaz de detectar errores en unprocedimiento de medida en condiciones de esta-bilidad del mismo, mientras que el control internosolo detecta desviaciones del comportamiento estable(12). Los diferentes programas de evaluación externade la calidad pueden tener distintos objetivos (uno ovarios), lo que condiciona en cierta manera su formade operar. Pueden clasificarse esos objetivos en dosgrupos (tabla 7).

característico de un método• Establecer una clasificación de los métodosexistentes en función de su nivel de calidad • Escoger un método entre varios o descartarun método por su nivel de calidad • utilizados

Averiguar cuales son los métodos más

Por otra parte, continuamente se implementan en ellaboratorio procedimientos para medir nuevasmagnitudes de los que es difícil evaluar su calidadmetrológica precisamente por su novedad. En estoscasos una acción limitada de intercomparación entredistintos laboratorios proporciona información sobrela dispersión de resultados, de lo que puede resultarevidente la necesidad de mayor normalización (porejemplo, preparar un material de referencia regionalo internacional) (12).

En relación a la evaluación del laboratorioparticipante, permite la evaluación continuada y alargo plazo del error sistemático de las mediciones.Además, en aquellas magnitudes para las que noexisten elementos de referencia (método o material),es la mejor alternativa para que el laboratorio estimeel error sistemático del procedimiento de medida(12).El PEEC debe estimular a averiguar las causas dediscrepancias y corregirlas para aproximarse a losdemás laboratorios. Este es un proceso continuo quea largo plazo tiende a armonizar los resultados entrelaboratorios. - Evaluación del estado actual de la calidad

metrológica de los métodos (“estado del arte”)- Evaluación del nivel de calidad del labora- Hay programas de evaluación externa de la calidad

obligatorios, en algunos países, en los que ellaboratorio debe obtener resultados aceptables parapoder funcionar. A veces se requiere una prueba deaptitud para la acreditación del laboratorio. A modode ejemplo, las normas CLIA´88 establecen losrequisitos que los laboratorios deben cumplir en laspruebas periódicas de aptitud para se considerados

torio participante Con respecto a la evaluación de los méto-

dos, el nivel de calidad metrológica de los métodosde medida debe formar parte de su diseño y desa-rrollo, siendo por tanto, responsabilidad del fabri-cante que debe demostrarlo disponiendo de los opor-tunos estudios pero también lo es el usuario que de-be validar el método en su laboratorio. “suficiente”, “a prueba” o “suspendido” . Una

variante de lo anterior, son las auditorías externas delSistema de la Calidad , llevadas a cabo por unaorganización externa a la red de laboratorios

Tabla 7. Objetivos de los programas de control externoen la evaluación del nivel de calidad

De los métodos

Del laboratorio . Evaluación del error sistemático . Armonizar resultados entre laboratorios. Implantar o mejorar el

Sistema de la Calidad . Formación . Prueba de aptitud . Auditoría externa

Otra información que se obtiene es la estimación delerror referido a un valor verdadero estimado pordiferentes formas, que son:

A) Media de resultados de laboratoriosUn programa de este tipo indica la dispersión deresultados entre laboratorios que utilizan un mismométodo y, aunque también da alguna indicaciónsobre el nivel de calidad del método, no deberelacionarse con la imprecisión entre series que sedetermina por el control interno.

seleccionados que utilizan un método definitivo o de referencia. B) Media de resultados de un grupo delaboratorios seleccionados por el elevado nivel decalidad de sus resultados. C) Media de resultados de un número elevadode laboratorios (valor de consenso). Pueden emplearse los datos de un programa externo

para: La aplicación de uno u otro forma de obtención depende de varias circunstancias como pueden ser los• Establecer el error sistemático

objetivos del programa, la existencia o no de métodos de exactitud conocida (definitivos, de referencia), el analito, el costo del programa, etc. En todos los casossuelen eliminarse los valores marginales antes deestablecerse la media definitiva. En relación a losinformes, pueden haberlos de distinto tipo y perio-dicidad (preliminares, mensuales) y finales, porejemplo anuales. En general se brindan datos sobre ellaboratorio individual, sobre el conjunto de labora-torios y sobre los métodos de medida.

Una etapa final en una EEC es la inter-pretación de los datos, con el objetivo de llevaracciones correctoras de anomalías. Para ello se con-sideran errores en cada observación individual y alfinalizar un determinado periodo. La evaluaciónexterna de la calidad proporciona información sobreel error total cometido en las mediciones.

Los PEEC tienen imitaciones ya que losdatos que proporciona un programa externo de con-trol, deben tomarse con precaución. Antes de ejerceracciones correctoras debe tomarse en consideraciónla posibilidad de que se presenten alguna de lascircunstancias que pueden desvirtuar el significadode las observaciones de control, como ser la obten-ción de un valor verdadero incierto o de valor ver-dadero inadecuado o que ocurra una estimación in-correcta del error.

En muchos países las encuestas voluntariasinterlaboratorios han mejorado exitosamente el rendi-miento de las pruebas de laboratorio y han dismi-nuido la variabilidad entre los mismos. Además deser usados por organismos regulatorios para pruebasde proficiencia obligatorias para el otorgamiento delicencias y acreditación, algunos programas mantie-nen un fuerte sesgo educativo al tiempo que losgobiernos los consideran para propósitos regulato-rios.

Los PEEC constituyen una forma útil derealizar control de calidad externo. Le posibilitan allabo-ratorio comparar sus resultados con los de otroslaboratorios usando analizadores iguales o similaresen las mismas muestras. Estos PEEC ayudan aidentificar y corregir las causas de los resultados quedifieren en gran medida de los obtenidos en otroslaboratorios que utilizan los mismos instrumentos.Asimismo, proporcionan información principalmenteacerca de sesgos de la media de un grupo, enresultados de un conjunto de laboratorio. También,como mencionamos, presentan inconvenientes. No escomún que la muestra que se emplea sea de sangreentera fresca; lo más probable es que sea sangrepreservada. Debido a las diferentes tecnologías, esprobable que el material no se desempeñe igualmentebien en todos los analizadores, es decir que los datosobtenidos sean de materiales no conmutables, enespecial para el recuento diferencial. Los resultadosdel analizador deben agruparse con otros analizado-res usando los mismos sistemas de registros, incluí-sive para modelos diferentes del mismo fabricante.

Asimismo, los métodos diferentes decalibración y los diferentes calibradores puedenocasionar mayor variabilidad dentro del grupo. Puedeocurrir también que el grupo correspondiente a unanalizador puede ser demasiado pequeño para pro-porcionar resultados estadísticamente válidos.

Como conclusión, podemos decir que elcontrol de calidad de los analizadores hematológicos

es complejo, que para cierto tipo de células hayestrategias diferentes, que unas pueden ser másconvenientes que otras y que este tipo de control estácomplementado por la evaluación externa de calidad.

Referencias bibliográficas (Control de Calidad)

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2. Fernández Espina C, Mazziotta D. Gestión de la calidaden el laboratorio clínico. Bs As. Ed. Médica Panamericana2005.

3. Groner W, Simson E. Practical guide to modern hematology analyzers. Chicester: John Wiley, 1995;95-117.

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6. International Council for Standardization in Haematology(ICSH). Recommendations for “Surrogate Reference”Method for the packed cell volume (ICSH standard 2003).Lab Hematol 2003; 9,1-9

7. National Committee for Clinical Laboratory Standards.Procedure for determining packed cell volume by themicrohematocrit method: approved standard. 3 ed. WaynePA: NCCLS, 2000 (Standard H07 -A3).

8. World Health Organization. Recommended method for the determination of packed cell volume by centrifugation. Geneva: WHO (WHO/DIL/00.2). http://whqlibdoc.who.int/hq/2000/WHO_DIL_00.2.pdf [Consulta 2003-02-06].

9. National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference leukocyte differential count (proportional) andevaluation of instrumental methods: approved standard.Wayne PA: NCCLS, 1992 (Standard H20-A).

10. World Health Organization. Recommended methods forthe visual determination of white blood cell count and platelet count. Geneva: WHO, 2000. http://whqlibdoc.who.int/hq/2000/WHO_DIL_00.3.pdf [Consulta 2003-02-06].

11. National Committee for Clinical Laboratory Standards,International Council for Standardization in Haematology.Methods for reticulocyte counting (flow cytometry andsupravital dyes): approved guideline. Wayne PA: NCCLS,ICSH, 1997 (Standard H44-A).

12. Gella F.J. Control de Calidad en el Laboratorio Clínico.Barcelona: BioSystems S.A; 2005.

Nota: La presente recopilación fue realizad por losparticipantes de la Mesa: Informe Automatización delHemograma: Entre la ayuda, la confusión y la controversia.