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CARACTERIZAO GENTICO-MOLECULAR DE LINHAGENS COM DUPLICAO CROMOSSMICA EM
Aspergillus nidulans
GATA CRISTIANE HUPPERT GIANCOLI
Tese apresentada Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de So Paulo, para obteno do ttulo de Doutor em Agronomia, rea de Concentrao: Gentica e Melhoramento de Plantas.
P I R A C I C A B A Estado de So Paulo - Brasil
Junho - 2004
i
CARACTERIZAO GENTICO-MOLECULAR DE LINHAGENS COM DUPLICAO CROMOSSMICA EM
Aspergillus nidulans
GATA CRISTIANE HUPPERT GIANCOLI Biloga
Orientador: Profa. Dra. ALINE APARECIDA PIZZIRANI-KLEINER
Tese apresentada Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de So Paulo, para obteno do ttulo de Doutor em Agronomia, rea de Concentrao: Gentica e Melhoramento de Plantas.
P I R A C I C A B A
Estado de So Paulo - Brasil Junho - 2004
i
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP
Giancoli, gata Crisitiane Huppert Caracterizao gentico-molecular de linhagens com duplicao cromossmica
em Aspergillus nidulans / gata Crisitiane Huppert Giancoli . Piracicaba, 2004. 186 p. : il
Tese (doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2004. Bibliografia.
1. Aspergillus Linhagens 2. Fungos filamentosos 3. Gentica molecular 4. Instabilidade mittica I. Ttulo
CDD 589.24
Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor
ii
... e, no entanto se move.(Galileu Galillei)
Um experimento conduzido em torno de meados da
dcada de quarenta (sculo XX) me preparou para
aceitar respostas inesperadas do genoma frente a
situaes de choque para as quais o genoma no est
preparado para enfrentar de forma ordenada e
programada.(Brbara McClintock, abertura do
discurso ao receber o Prmio Nobel de Medicina,
8/12/1983).
i
Dedico
memria de meu av Anafrin Huppert,
minha me Ivone Huppert Giancoli, os meus irmos Flaviana e Hermnio,
meu querido sobrinho Gabriel e ao meu amigo felino Jorge.
Ofereo
Rodrigo Migotto Seraide
v
AGRADECIMENTOS
A todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realizao desse trabalho
quero agradecer e, em especial a:
Profa. Dra. Aline Aparecida Pizzirani-Kleiner, minha orientadora, por sua orientao, apoio e amizade durante meu desenvolvimento acadmico. Prof. Dr. Joo Lcio de Azevedo, pelo apoio e amizade durante meu desenvolvimento acadmico. Dr. Fernando Gomes Barcellos, meu querido irmo, pela grande amizade durante todos estes anos, pelo incentivo, apoio e convivncia durante o perodo que estivemos cursando a ps-graduao. Dr. Welington Luiz Arajo, pela grande cooperao, apoio e sugestes durante o desenvolvimento das pesquisas, e principalmente pela sua grande amizade e compreenso. Prof. Dr. Andr Oliveira Souza Lima, pela amizade e pelos ensinamentos de bio-informtica. Profa. Dra. Margarida L. R. Aguiar-Perecin pela utilizao de seu laboratrio para a execuo nas anlises de microscopia de fluorescncia. Dr. Mateus Mondin pelo apio na utilizao do microscpio de fluorescncia. Jos Antnio da Silva (Zezo), grande e constante amigo, muito obrigado por sua colaborao tanto nos momentos bons como nos difceis. A Silvia C.M. Molina, pela ajuda na utilizao do microscpio de fluorescncia. As minhas grandes amigas Mayra e Joelma, pelo apoio, incentivo e amizade constante.
vi
Aos meus queridos e inesquecveis amigos do laboratrio de Gentica de Microrganismo os quais considero minha segunda famlia: Cristina Maki, Cristina Almeida, Adalgisa, Tas, Jlia, Carolina, Carol Almeida, Aline (Rom), Priscilla, Cludia, Ana Carolina, Luciana, Beatriz, Fernanda, Manuela, Lia, Ceclia, Snia, Vivian, Heloise, Clara, Rodrigo, Fernando, Rudi, Ricardo, Paulo Lacava, Guilherme, Srgio, Aldo, Kadu, Uir. A minha eterna amiga Maria Regina Priolli. A Lia, pelos servios prestados na secretaria da Ps-Graduao, pela amizade e agradvel convivncia. Ao Corpo Docente do Departamento de Gentica, os quais contriburam de forma admirvel para minha formao acadmica. A todos colegas do Curso de Ps-Graduao de Gentica e Melhoramento, pela convivncia, alegrias e esperanas compartilhadas. A minha av Ivone Kleiner Huppert A Famlia Seraide, Sr. Carmelo, Sra. Carolina, Pablo e Patrcia, pela calorosa acolhida. A Dimas e Gabriela, novos membros da minha famlia. A CAPES pela bolsa de Doutorado concedida. A Deus.
vi
SUMRIO
Pgina
LISTA DE FIGURAS............................................................................................ xii
LISTA DE TABELAS........................................................................................... xvi
RESUMO............................................................................................................... xvii
SUMMARY........................................................................................................... xviii
1 NTRODUO................................................................................................... 1
2 REVISO DE LITERATURA........................................................................... 3
2.1 O fungo filamentoso Aspergillus nidulans...................................................... 3
2.1.1 Ciclo Vegetativo de Aspergillus nidulans.................................................... 5
2.1.1.1 Germinao, Polarizao e Desenvolvimento da hifa............................... 5
2.1.1.2 Principais Mutantes para o Ciclo Celular e Migrao Nuclear................. 8
2.1.2 Aquisio da Competncia........................................................................... 19
2.1.3 Ciclo Assexual.............................................................................................. 20
2.1.3.1 Formao do Conidiforo.......................................................................... 20
2.1.3.2 Principais Mutantes para a Conidiognese................................................ 22
2.1.4 Interao entre Ciclo Celular, Migrao Nuclear e Conidiognese............. 30
2.2 Elementos de Transposio (TEs)................................................................... 32
2.2.1 Estrutura dos Elementos de Transposio.................................................... 33
2.2.2 Deteco de Elementos de Transposio...................................................... 39
2.2.3 Importncia do estudo dos Elementos de Transposio em Fungos
Filamentosos................................................................................................. 40
2.2.4 Elementos de Transposio em Fungos Filamentosos...................................... 42
2.3 Objetivos................................................................................................................ 51
viii
3 MATERIAL E MTODOS................................................................................ 53
3.1 Linhagens de Aspergillus nidulans utilizadas.................................................. 53
3.2 Tcnicas de Anlise Gentica.......................................................................... 54
3.2.1 Obteno de heterocrios.............................................................................. 54
3.2.2 Isolamento de diplides................................................................................ 55
3.2.3 Haploidizao............................................................................................... 55
3.2.4 Anlise Meitica por meio Ciclo Sexual...................................................... 56
3.2.5 Meios de Cultura e Solues........................................................................ 57
3.2.5.1 Meio Mnimo............................................................................................. 57
3.2.5.2 Meio Completo.......................................................................................... 57
3.2.5.3 Meio Completo lquido.............................................................................. 58
3.2.5.4 Meio Mnimo lquido................................................................................. 58
3.2.5.5 Meio Mnimo lquido acrescido de 4% de Meio Completo...................... 58
3.2.5.6 Soluo de vitaminas................................................................................. 58
3.2.5.7 Meio de Galactose..................................................................................... 59
3.2.5.8 Meio de Acetato de Amnio...................................................................... 59
3.2.5.9 Soluo de Tween 80................................................................................. 59
3.2.5.10 Soluo Salina......................................................................................... 59
3.2.5.11 Soluo de FA........................................................................................ 60
3.2.5.12 Soluo de suplementos adicionais para o meio mnimo........................ 60
3.3 Anlise Citolgica........................................................................................... 61
3.3.1 Colorao de Ncleo e Parede Celular com Corante Fluorescente.............. 61
3.3.2 Solues para Anlise Citolgica................................................................. 62
3.3.2.1 Soluo de Fixao.................................................................................... 62
3.3.2.2 Soluo de Albumina 20%........................................................................ 62
3.3.2.3 Soluo estoque de DAPI.......................................................................... 62
3.3.2.4 Soluo estoque de calcofluor................................................................... 62
3.3.3 Colorao de Ncleo com Giemsa-HCl....................................................... 62
3.3.3.1 Tampo Fosfato 0,2 M pH 7,0................................................................... 63
3.3.3.2 Soluo de KCl 0,6 M pH 7,0.................................................................... 63
ix
3.3.3.3 Soluo de fixao..................................................................................... 63
3.3.3.4 Soluo de HCl 1 N................................................................................... 64
3.3.3.5 Soluo Estoque Giemsa........................................................................... 64
3.3.3.6 Soluo Corante......................................................................................... 64
3.4 Isolamento de mutantes para nitrato redutase (niaD)...................................... 64
3.4.1 Metodologia para isolamento de mutantes de A. nidulans resistentes a
Clorato de Potssio 0,3 M............................................................................. 64
3.4.2 Meio de Cultura e Solues.......................................................................... 65
3.4.2.1 Meio Mnimo sem fonte de Nitrognio..................................................... 65
3.4.2.2 Soluo de Sais.......................................................................................... 65
3.4.2.3 Soluo traos............................................................................................ 65
3.4.2.4 Meio de Cultura para isolamento de mutantes para nitrato redutase......... 65
3.4.2.5 Meios de cultura com diferentes fontes de nitrognio............................... 66
3.4.3 Isolamento de mutantes para nitrato redutase (niaD) p meio do ciclo
sexual de A. nidulans.................................................................................... 66
3.4.3.1 Meio Mnimo com 10 mM de Nitrito de sdio mais 0,45 M de Clorato
de Potssio................................................................................................. 67
3.4.3.2 Meio Mnimo com 10 mM de Tartarato e amnia mais 0,45 M de
Clorato de Potssio.................................................................................... 67
3.4.3.3 Meio Mnimo com 10 mM de Cloreto de amnia de sdio mais 0,45 M
de Clorato de Potssio............................................................................... 67
3.4.3.4 Meio Mnimo com 0,7 mM de hipoxantina mais 0,45 M de Clorato de
Potssio...................................................................................................... 67
3.4.4 Teste de Reverso......................................................................................... 67
3.5 Anlises Moleculares....................................................................................... 68
3.5.1 Extrao de DNA de fungos filamentosos.................................................... 68
3.5.2 Solues........................................................................................................ 69
3.5.2.1 Tampo de extrao de DNA.................................................................... 69
3.5.2.2 Tris-HCl 1 M pH 8,0..... 69
3.5.2.3 Soluo de NaCl 5 M................................................................................. 69
x
3.5.2.4 cido Etileno Diamino Tetractico (EDTA) 0,5 M pH 8,0................ 69
3.5.2.5 Dodecil Sulfato Sdio (SDS) 10% (p/v).................................................... 70
3.5.2.6 Solues NaCl 3 M.................................................................................... 70
3.5.2.7 Fenol.......................................................................................................... 70
3.5.2.8 Clorofane................................................................................................... 70
3.5.2.9 Clorofil....................................................................................................... 70
3.5.2.10 Tampo Tris-EDTA (TE)........................................................................ 70
3.5.3 Purificao do DNA..................................................................................... 71
3.5.3.1 RNAse........................................................................................................ 71
3.5.4 Construo dos Primers................................................................................ 71
3.5.4.1 Construo dos Primers para o gene niaD................................................. 71
3.5.4.2 Construo dos Primers para amplificao do gene bristle....................... 71
3.5.4.3 Construo dos Primers para transposase.................................................. 72
3.5.4.4 Construo dos Primers para transcriptase reversa................................... 72
3.5.4.5 Construo dos primers para amplificao do transposons de
Aspergillus nidulans MATE...................................................................... 72
3.5.5 Condies para amplificao........................................................................ 74
3.5.5.1 Tampo de corrida para eletroforese (6x concentrado)............................. 76
3.5.5.2 Tampo TAE............................................................................................. 76
3.5.5.3 Soluo de Brometo de Etdio................................................................... 77
3.5.6 Purificao do produto de amplificao para
sequenciamento..........................................................................................
77
3.5.7 Sequenciamento dos produtos de amplificao............................................ 77
3.5.8 Purificao do produto de PCR para o sequenciamento............................... 78
3.5.8.1 Soluo de Acetato de Sdio..................................................................... 78
3.5.8.2 Tampo Save money 2,5x.. 79
3.5.8.3 Soluo estoque de Tris-HCl 1M pH 9,0................................................... 79
3.5.8.4 Soluo de MgCl2 2M............................................................................... 79
3.5.9 Seqncias.................................................................................................... 79
xi
4. RESULTADOS E DISCUSSO....................................................................... 81
4.1 Anlise Macroscpica das Colnias................................................................ 81
4.2 Anlise Gentica.............................................................................................. 81
4.2.1 Anlise Mittica.................................................................................................. 83
4.2.2 Anlise Meitica................................................................................................. 83
4.2.3 Anlise Molecular do Variante Deteriorado V5........................................... 88
4.3 Analise Citolgica........................................................................................... 89
4.3.1 Anlise Macroscpica................................................................................... 89
4.3.2 Germinao em Meio Completo lquido...................................................... 92
4.3.3 Anlise Microscpica................................................................................... 94
4.3.3.1 Anlise das linhagens padres................................................................... 95
4.3.3.2 Anlise do Variante Deteriorado V101..................................................... 100
4.3.3.3 Anlise do Variante Deteriorado V102..................................................... 101
4.3.3.4 Anlise do Variante Deteriorado V103..................................................... 103
4.3.3.5 Anlise do Variante Deteriorado V104..................................................... 105
4.3.3.6 Anlise do Variante Deteriorado V5......................................................... 107
4.4 Isolamento de mutantes resistente ao clorato (niaD)....................................... 113
4.4.1 Anlise Molecular dos Mutantes niaD......................................................... 117
4.4.2 Anlise Molecular com primers niaD........................................................... 118
4.4.3 Anlise Molecular com primers para transposase e transcriptase reversa.... 122
4.4.4 Anlise Molecular com primers para Transposon MATE............................ 123
5 CONCLUSES.................................................................................................. 127
ANEXOS............................................................................................................... 128
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.................................................................. 143
APNDICE............................................................................................................ 167
xi
LISTA DE FIGURAS
Pgina
1 Conidiforo de Aspergillus nidulans. (h) hifa, (cp) clula p, (ht) haste do
conidiforo, (v) vescula do conidiforo, (m) mtula ou estergma primrio, (f)
filide ou estergma secundrio, (c) condios. Foto de microscopia eletrnica de
varredura..................................................................................................................... 21
2 Esquema da diviso de Classes dos Elementos de Transposio......................... 35
3 Esquema de Elementos de Transposio em Fungos Filamentosos..................... 37
4 Estrutura do elemento Helitron e o mecanismo de rolling-circle
transposio....................................................................................................... 38
5 Esquema de transposon trap................................................................................... 39
6 Fotos das linhagens padres (a - c) e variantes deteriorados (d - h). a) MSE; b)
A; c) PPY; d) V5; e) V101; f) V102; g) V103; h) V104. As linhagens foram
crescidas por 7 dias a temperatura de 37oC......................................................... 82
7 Micrografia. (a) conidiforo da linhagem G0248 (b - c) conidiforo do
variante deteriorado V5. Aumento de 1000x.................................................... 88
8 PCR com primers BrlF - BrlR. (a) MSE, (b) V5, (c) branco. Fragmento com
aproximadamente 1300 pb................................................................................... 89
9 Anlise do crescimento das colnias padres e variantes deteriorados em
diferentes temperaturas (cm). Linhagens padres PPY, MSE e A; variantes
deteriorados V5, V101, V102, V103 e V104............................................................ 90
10 Anlise em porcentagem dos condios germinados com 6 horas de crescimento
em diferentes temperaturas. Linhagens padres PPY, MSE e A; variantes
deteriorados V5, V101, V102, V103 e V104......................................................... 92
xiii
11 Germinao dos condios das linhagens padres temperatura de 37oC.
Linhagem MSE (a - i) 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 e 32 horas respectivamente.
Linhagem A (j - m) 4, 6, 8, 20 horas respectivamente. Linhagem PPY (n - p)
2, 16, 20 horas respectivamente. Figuras (a - f, i - k, n - o, aumento de 1000
x; Figuras g, h, l, m, p, aumento de 400 x.......................................................... 98
12 Germinao dos condios das linhagens padres temperatura de 28oC (a - h) e
42oC (i - k). Linhagem MSE (a - c) 4, 8 e 12 horas de desenvolvimento.
Linhagem PPY (d - e) 8 e 12 horas. Linhagem A (f - h) 8 e 12 horas,
Linhagem MSE (i) 12 horas de desenvolvimento. Linhagem PPY (j) 12
horas. Linhagem A (k) 12 horas. Aumento de 1000
x.......................................................................................................................... 99
13 Variante Deteriorado V101. (a) condio com o dobro do tamanho 4 horas; (b)
condio com tubo germinativo 8 horas; (c) condio com extenso tubo
germinativo no septado 12 horas; (d) condio com tubo vegetativo e
ramificaes anormal no h evidncias de septos 16 horas; (e, f) formao
de conidiforos anormais 32 horas. A seta indica final de uma anfase.
Aumento 1000x.................................................................................................. 100
14 Variante Deteriorado V101. (a - b) condios com 6 e 8 horas, temperatura de
28oC; (c) condio com tubo germinativo 12 horas, temperatura de 42oC.
Aumento 1000x.................................................................................................. 101
15 Variante Deteriorado V102. (a) condio com 0 hora (b) condio com incio da
formao do tubo germinativo 4 horas (c) condio com extenso tubo
germinativo 6 horas (d) condio com tubo vegetativo anormal no h
evidncias de septos 12 horas; (e) presena de grande quantidade de clulas
hlle, (f, g) formao de conidiforos anormais 32 horas, aumento
1000x.................................................................................................................. 102
16 Variante Deteriorado V102. (a - b) condios com 6 e 8 horas, temperatura de
28oC; (c) condio com tubo germinativo 6 horas, temperatura de 42oC.
Aumento 1000x.................................................................................................. 103
17 Variante Deteriorado V103. (a) condio com 0 hora (b) condio com inicio da
xiv
formao do tubo germinativo, 6 horas (c) condio com extenso tubo
germinativo septos com formao irregular, 12 horas (d) formao de hifas
ramificadas, 20 horas; (e, f) formao de conidiforos anormais 32 horas,
aumento 1000x.................................................................................................... 104
18 Variante Deteriorado V103. (a - b) condios com 6 e 8 horas, temperatura de
28oC; (c - d) condio com 6 e 8 horas, temperatura de 42oC. Aumento
1000x.................................................................................................................. 105
19 Variante Deteriorado V104. (a) condio com 0 hora (b) condios com o dobro
do volume celular, 4 horas (c) condio com tubo germinativo, 6 horas (d)
condios com tubo germinativo e septao irregular, 12 horas; (e) condios
com tubo germinativo e septao irregular, 16 horas; f) formao do miclio
com septao anormal, 20 horas, aumento 1000x.............................................. 106
20 Variante Deteriorado V104. (a - b) condios com 4 e 8 horas, temperatura de
28oC; (c - d) condio com 12 horas, temperatura de 42oC. Aumento
1000x.................................................................................................................. 107
21 Variante Deteriorado V5. (a) condio com 2 horas (b) condios com o dobro
do volume celular, 4 horas (c) condio com tubo germinativo, 6 horas (d - e)
condios com tubo germinativo e ramificaes, 8 - 12 horas; (f - h) hifas
globosas, 20 horas; (i) haste do conidiforo segmentada e com estrutura
globosa, 20 horas; (j - k) conidiforos anormais. Aumento
1000x.................................................................................................................. 109
22 Variante Deteriorado V5. (a - b) condios com 8 e 12 horas, temperatura de
28oC; (c) condio com 12 horas, temperatura de 42oC. Aumento
1000x.................................................................................................................. 110
23 Nmero de ncleos nos segmentos hifais nas temperaturas de 28oC, 37oC e
42oC das linhagens MSE, PPY, A e V5.................................................................... 112
24 Esquema da localizao dos primers dentro do gene niaD (seqncias de
cidos nuclicos)................................................................................................. 119
25 Esquema da localizao dos primers dentro da seqncia de aminocidos do
gene niaD............................................................................................................ 119
xv
26 Primers niaDF2 - niaDR4. (1) marcador 1 Kb, (2) MSE, (3) A, (4) G125, (5)
Sx1, (6) Sx2, (7) Sx3, (8) Sx4, (9) Sx5, (10) Sx6, (11) Sx7, (12) Sx8, (13)
Sx9, (14) Sx10, (15) Sx11, (16) Sx12, (17) Sx13, (18) Sx14, (19) Sx15, (20)
Sx16, (21) Sx17, (22) Sx18, (23) Sx19, (24) Sx20, (25) Sx21, (26) Sx22, (27)
Sx23.................................................................................................................... 120
27 Primers niaDF2 - niaDR2. (1) marcador 1 Kb, (2) MSE, (3) A, (4) G125, (5)
Sx1, (6) Sx2, (7) Sx3, (8) Sx4, (9) Sx5, (10) Sx6, (11) Sx7, (12) Sx8, (13)
Sx9, (14) Sx10, (15) Sx11, (16) Sx12, (17) Sx13, (18) Sx14, (19) Sx15, (20)
Sx16, (21) Sx17, (22) Sx18, (23) Sx19, (24) Sx20, (25) Sx21, (26) Sx22, (27)
Sx23, (28) branco................................................................................................ 120
28 Primers niaDCDSF - niaDCDSR. (1) marcador 1 Kb, (2) MSE, (3) A, (4)
G125, (5) Sx1, (6) Sx2, (7) Sx3, (8) Sx4, (9) Sx5, (10) Sx6, (11) Sx7, (12)
Sx8, (13) Sx9, (14) Sx10, (15) Sx11, (16) Sx12, (17) Sx13, (18) Sx14, (19)
Sx15, (20) Sx16, (21) Sx17, (22) Sx18, (23) Sx19, (24) Sx20, (25) Sx21, (26)
Sx22, (27 )Sx23, (28) branco.............................................................................. 121
29 Primers mateF - mateR. (1) marcador 1 Kb, (2) MSE, (3) A, (4)Sx1, (5) Sx2,
(6) Sx3, (7) Sx4, (8) Sx5, (9) Sx6, (10) Sx7, (11) Sx8, (12) Sx9, (13) Sx10,
(14) Sx13, (15) Sx14, (16) Sx15, (17) Sx18, (18) Sx19, (19) Sx22, (20)
Sx23.... 124
30 Primers mateF - mateR. (1) marcador 1 Kb, (2) MSE, (3) A, (4)V5, (5) V101,
(6) V102, (7) V103, (8) V104............................................................................. 124
xvi
LISTA DE TABELAS
Pgina
1 Grupos de Ligao e Marcadores Genticos das linhagens de A. nidulans
utilizadas............................................................................................................... 54
2 Requisitos nutricionais adicionados ao meio mnimo durante as analises
genticas............................................................................................................... 60
3 Quantidade de fontes de nitrognio adicionada ao meio mnimo de
cultura................................................................................................................... 66
4 Primers utilizados................................................................................................. 73
5 Reao de PCR utilizada...................................................................................... 74
6 Reao de PCR para sequenciamento.................................................................. 77
7 Seqncias depositadas no GeneBank - NCBI Home Page................................. 80
8 Descrio morfolgica dos variantes deteriorados isolados da linhagem A de
A. nidulans............................................................................................................ 82
9 Teste de Auxotrofia dos Variantes deteriorados e das linhagens padres................ 83
10 Anlise Mittica. Localizao dos determinantes de deteriorao nos grupos de
ligaes.................................................................................................................... 84
11 Resultado das Anlises Meiticas...................................................................... 85
12 Anlise Mittica V5 // G125 (biA1, niaD15)....................................................... 87
13 Resultado das Anlises Genticas...................................................................... 88
14 Assimilaes de fontes de nitrognio................................................................. 114
15 Mutantes para nitrato redutase isolados em diferentes fontes de nitrognio...... 115
16 Teste de reverso de mutantes niaD................................................................... 117
xvii
CARACTERIZAO GENTICO-MOLECULAR DE LINHAGENS COM
DUPLICAO CROMOSSMICA EM
Aspergillus nidulans
Autora: GATA CRISTIANE HUPPERT GIANCOLI
Orientadora: Profa. Dra. ALINE APARECIDA PIZZIRANI-KLEINER
RESUMO
A pesquisa de linhagens com duplicao cromossmica, como a linhagem
A de Aspergillus nidulans, teve oseu incio no final da dcada de 1970. Durante este
perodo foram isolados da linhagem A, diversos variantes deteriorados, que foram
caracterizados gentica e citologicamente. Neste trabalho de pesquisa, as analises
genticas demonstraram que os determinantes de deteriorao ou segmentos de insero
de V5, V101, V102, V103 e V104 esto localizados nos grupos de ligao VIII, III, IV,
VII e I respectivamente. As anlises citogenticas revelaram diversas alteraes no ciclo
celular e migrao nucleares nas fases iniciais de desenvolvimento. A duplicao
cromossmica da linhagem A e os variantes deteriorados foram investigados a nvel
molecular, por tcnica de PCR. Os resultados mostraram que o segmento de insero
consiste de um provvel Elemento de Transposio, denominado de MATE, o qual
caracterstico do fungo Aspergillus nidulans. Os segmentos de insero analisados
apresentam caractersticas tpicas de MATE, como o motivo Spe que encontrado por
toda seqncia dos Elementos MATE.
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CHARACTERIZATION GENETIC-MOLECULAR OF STRAINS WITH
CHROMOSOMES DUPLICATION IN Aspergillus nidulans
Author: GATA CRISTIANE HUPPERT GIANCOLI
Advisor: Profa. Dra. ALINE APARECIDA PIZZIRANI-KLEINER
SUMMARY
The research with chromosome duplication strains, as strain A of
Aspergillus nidulans, began during the 70's, with isolation of several deteriorates
variants of strain A and characterization by genetic and cytological analysis. In this work
the genetic analysis has demonstrated that the deterioration determinant or insertion
sequence in V5, V101, V102, V103 and V104 deteriorates variants are located in the
linkages groups VIII, III, IV, VII and I, respectively. The cytological analyses have
demonstrated changes in cellular cycle and nuclear migration in initial phases of
development. The chromosome duplication of strain A and the deteriorated variants
were investigated by PCR with designed primers to mobile elements, what have resulted
in the identification of the transposable element MATE, mainly by great similarity with
"Spe" motif sequence that is described as essential in activity of these elements.
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1 INTRODUO
Desde 1980, com o desenvolvimento de tcnicas moleculares, houve um
significativo avano nos conhecimentos da regulao do ciclo celular, migrao nuclear,
desenvolvimento e diferenciao de diversos organismos multicelulares.
O fungo filamentoso Aspergillus nidulans considerado modelo gentico
para diversos estudos, principalmente os estudos relacionados com ciclo celular,
migrao nuclear e desenvolvimento. Seu ciclo de vida marcado por quatro eventos
importantes: a germinao do condio uninucleado, seguido de um perodo de
crescimento vegetativo com a proliferao da hifa multinucleada, nesta fase as clulas
adquirem competncia, desencadeando os processo de reproduo assexual com a
formao dos conidiforos, seguido pela reproduo sexual com a formao dos
cleistotcios.
Os estudos referentes mitose e migrao nuclear em A. nidulans
iniciaram com trabalhos do Dr. Ron Morris (Morris, 1976, 1995), o qual identificaram
diversos mutantes com variaes nos padres de diviso, distribuio e migrao
nucleares. Paralelamente o Dr. John Clutterbuck iniciou os estudos gnicos da
Conidiognese (Clutterbuck, 1969). Essas duas linhas de pesquisa caminharam
separadamente at os trabalhos de Mirabito & Osmani (1994) e Ye et al. (1999) que
demonstraram a correlao entre ciclo celular, migrao nuclear e conidiognese. A
partir destes estudos ficou demonstrando que os eventos no desenvolvimento de A.
nidulans so regulados em cascata, isto , um evento geneticamente dependente do
outro para a entrada e regulao das etapas do ciclo de vida de A. nidulans.
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Os estudos genticos realizados pelo Dr. Morris e pelo Dr. Clutterbuck
basearam em mutantes obtidos por mutagnicos fsicos e ou qumicos. Nga & Roper
(1968a, b) e Azevedo & Roper (1970) estudando linhagens de A. nidulans com
duplicao cromossmica, verificaram que estas eram instveis e produziam setores
espontaneamente. Os setores poderiam ser melhorados (perda do segmento duplicado)
ou deteriorados (segmento duplicado se transpem para um dos oitos cromossomos de
A. nidulans). Estudos realizados por diversos autores sob orientao do Dr. Joo Lcio
de Azevedo e da Dra. Aline A. Pizzirani-Kleiner demonstraram que o determinante de
deteriorao da linhagem A de A. nidulans (duplicao no cromossomo I, translocada
para o II) salta pelos oito cromossomos de A. nidulans, produzido alteraes no ciclo
celular, desorganizao na migrao nuclear e alteraes morfolgicas na formao dos
conidiforos. Esse sistema de instabilidade foi considerado muito semelhante aos
elementos de transposio de milho, bactrias e drosfilas, sugerindo que a instabilidade
gentica que produz os setores deteriorados possa estar relacionada com os Elementos de
Transposio.
Os elementos de transposio tm sido descritos amplamente em fungos
filamentosos, como Fusarium sp, Aspergillus niger, Magnaporthe grisea, Neurospora
crassa entre muitos outros. O trabalho de Nishimura et al. (2000), foi considerado o
ponto de partida para o desenvolvimento deste trabalho de pesquisa. Estes autores
descreveram no fungo Magnaporthe grisea, uma insero do retrotransposon, o MGL.
A insero do retrotransposon provocou alteraes morfolgicas na conidiognese, por
meio desta mutao, o gene para o desenvolvimento do conidiforo foi isolado e
seqenciado, apresentando alta homologia com o gene medusa (med) de A. nidulans, que
gera alteraes no conidiforo. Esta evidncia aumentou as suspeitas que os setores
deteriorados gerados pela a linhagem A de A. nidulans, pudessem ser um caso tpico de
elementos de transposio.
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2 REVISO DE LITERATURA
Dentro da linha de pesquisa proposta pelo trabalho, a reviso de literatura
abordar dois assuntos distintos: o primeiro consiste de uma breve discusso sobre a
Gentica do Desenvolvimento do fungo filamentoso Aspergillus nidulans, cujo texto
pretende copilar e analisar algumas informaes disponveis sobre os genes e protenas
envolvidos no desenvolvimento e diferenciao celular, o segundo consiste de uma
breve discusso sobre os Elementos de Transposio (TEs), este texto pretende copilar e
analisar algumas informaes sobre os Elementos de Transposio (TEs) quanto sua
classificao, sua presena e importncia para o desenvolvimento cientfico em alguns
fungos filamentosos.
2.1 O fungo filamentoso Aspergillus nidulans
O fungo filamentoso Aspergillus nidulans foi descrito por Eidam (1883,
apud Pontecorvo et al., 1953). O estudo gentico de A. nidulans teve xito com pesquisas
realizadas por Guido Pontecorvo, na dcada de 50 (Pontecorvo et al., 1953), levando esse
microrganismo a consagrar-se como modelo biolgico para estudos acadmicos e
aplicados.
As vantagens desse fungo para pesquisas consistem: na presena dos ciclos
sexual, assexual e parassexual (Pontecorvo, 1952; Clutterbuck, 1997), ciclo de vida curto,
ser haplide e homotlico, onde o ciclo sexual se completa sem necessidade de cruzamento
entre linhagens sexualmente definidas, alm de ser facilmente cultivado em meio de cultura
definido a temperatura de 37oC.
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Atualmente o mapa gentico de A. nidulans bastante estudado sendo
possvel mapear novos genes com preciso. Com o avano da Gentica Molecular, foi
confirmado que A. nidulans possui oito cromossomos, por meio da tcnica de separao
de cromossomos por eletroforese de campo pulsado (pulsed field gel electrophoresis)
(Brody & Carbon, 1989). Alm disso, o mapa fsico dos cromossomos de A. nidulans foi
obtido baseado em dois bancos de cosmdios ordenados (pWee e pLorist) (Xiong et al.,
1996). O genoma de A. nidulans est completamente seqenciado e pode ser acessado
pelo site http://www-genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/aspergillus/. Com o banco de
dados completo possvel, por exemplo, um melhor estudo de correlao entre mapa
fsico e gentico, sendo til para a clonagem dos genes que no podem ser estudados
pelo mtodo tradicional de complementao da mutao, utilizando banco genmico. A
correlao entre mapas genticos e seqncias de DNA contidas nos cosmdios
conhecidos tem tornado a tcnica caminhando pelo cromossomo (chromosome
walking) vivel para a clonagem dos genes que apresentam fentipos sutis (Hamer,
1997).
Vrias classes de mutantes foram isoladas no decorrer dos anos, entre elas
mutantes auxotrficos, mutantes para vias metablicas, mutantes resistentes a diversas
drogas e mutantes morfolgicos. Esta ltima classe de mutantes pode ser subdividida em
mutantes para o crescimento e ciclo celular (Morris, 1976), mutante para aquisio da
competncia (Axelrod, 1972) e para a morfognese do conidiforo (Clutterbuck, 1969).
Estas trs subdivises podem ser consideradas como o estudo da Gentica do
Desenvolvimento.
O estudo da gentica do desenvolvimento extremamente complexo
envolvendo diversos processos morfogenticos que exigem refinado processo de regulao.
Cada tecido apresenta peculiaridades no seu desenvolvimento espacial e temporal durante
as sucessivas mitoses. Alm disso, ocorre restrita relao entre os ciclos de multiplicao
celular e os processos de diferenciao celular, nos quais uma quantidade enorme de genes
interage.
Neste aspecto, o fungo filamentoso A. nidulans um organismo modelo
para o estudo da Gentica do Desenvolvimento, devido a caractersticas como: ciclo de
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vida rpido, haploidia, presena de poucos tipos celulares distintos, mas com funo bem
diferenciada, alm de uma morfognese bem definida, possibilidade de sincronismo na
conidiognese, tornando vivel o isolamento e a anlise de compostos bioqumicos
especficos. (Miller, 1990; Morpurgo, 1994).
O fungo A. nidulans apresenta seu ciclo de vida dividido em trs fases:
a. Ciclo vegetativo;
b. Ciclo Assexual ou conidiognese;
c. Ciclo Sexual ou Ascoporognese.
Entre os ciclos de vida ocorre uma estreita relao. Em condies normais,
primeiramente ocorre o desenvolvimento vegetativo, aps ocorre o incio da conidiognese,
que acarreta diminuio do desenvolvimento vegetativo para o amadurecimento do
conidiforo, seguido pela diferenciao do cleistotcio (Adams et al., 1998).
2.1.1 Ciclo Vegetativo de Aspergillus nidulans
2.1.1.1 Germinao, Polarizao e Desenvolvimento da hifa
O desenvolvimento do ciclo vegetativo pode ocorrer por meio de
fragmentos de hifas, esporos sexuais e assexuais. Inicialmente ocorre o aumento do volume
do esporo, seguido de sucessivas divises mitticas, originando o tubo germinativo (Harris,
1997a; Harris & Hofmann, 1999; Harris, 2001) e estabelecendo o desenvolvimento
vegetativo. O prximo processo a aquisio da competncia, acarretando a entrada do
ciclo assexual, e quando este se completa, o fungo realiza o ciclo sexual (Axelrod et al.,
1973; Timberlake, 1990; Timberlake & Clutterbuck, 1994; Miller et al., 1985; Miller,
1990; Adams et al., 1998).
A primeira parte deste desenvolvimento tem incio com o condio, estrutura
reprodutiva do ciclo assexual de A. nidulans. O condio capaz de manter a dormncia por
um vasto perodo de tempo sem perder a viabilidade, ocorrendo uma situao favorvel,
como temperatura, umidade e nutrientes, o condio capaz de germinar e reproduzir uma
colnia com as mesmas propriedades daquela que lhe deu origem (Timberlake &
Clutterbuck, 1994).
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O primeiro passo para germinao a incorporao de gua, fazendo que
ocorra expanso do condio e aumento da adeso em seu substrato. O incio da
germinao do condio ocorre pelo reconhecimento da fonte de carbono
(preferencialmente glicose) (Osherov & May, 2000), que ativa todo o mecanismo RAS
desencadeando o processo MAPK e promovendo todo o desenvolvimento do condio
(germinao, desenvolvimento micelial, diviso e migrao nuclear) (Osherov & May,
2001). No perodo de aproximadamente 4 horas ocorre a primeira diviso mittica,
sendo o tempo necessrio para a quebra completa da dormncia. Aps 8 horas, o
contedo citoplasmtico aumenta em 10 vezes e o contedo de DNA aumenta em 8
vezes, ou seja, 3 divises nucleares se completam sincronicamente (Fiddy & Trinci,
1976). A partir da terceira diviso mittica ocorre perda gradual da sincronizao da
diviso celular (Rosenberg & Kessel, 1967).
Alm disto, ocorrem alteraes morfogenticas, com a formao do tubo
germinativo ao mesmo tempo em que ocorre a segunda diviso mittica. O tubo
germinativo apresenta desenvolvimento apical, estabelecimento um eixo de crescimento
polarizado na ponta do tubo germinativo, fazendo com que a hifa cresa nesta direo pela
deposio de parede celular (Gooday, 1983; Fiddy & Trinci, 1976). Com as divises
mitticas dos ncleos mais prximos do pice ocorre formao peridica de septos. Os
septos delimitam clulas com 2 a 10 ncleos e proporcionam a passagem de organelas e
ncleos entre as clulas (Morris, 1976). Aps o desenvolvimento do primeiro tubo
germinativo, um segundo tubo emitido em orientao oposta ao primeiro. Deste modo,
em meio de cultura slida, as hifas ramificam-se e crescem de forma subapical, formando
uma colnia com crescimento radial (Pontecorvo et al., 1953; Morris et al., 1995).
O processo de deposio da parede celular muito importante, pois se a
parede celular no for corretamente formada h perdas do crescimento polarizado
(McGoldrick et al., 1995). Doonan (1992) removeu por processo enzimtico a parede
celular, levando a formao de protoplastos esfricos e perda do crescimento polarizado,
mas com uma nova deposio de parede celular o eixo polarizado volta a se estabelecer.
Vrias tentativas foram feitas para isolar mutantes que modificassem especificamente a
polaridade do crescimento da hifa. A grande parte dos mutantes isolados afetam
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indiretamente a polarizao, alterando a composio da parede celular e a estabilidade
osmtica, isto ocorre por interferncia direta no processo de diviso nuclear, como se
pode observar no gene da calmodulina que afeta a diviso nuclear e, conseqentemente,
a polarizao (Rasmussen et al., 1990).
Aps a germinao do condio uninucleado, ocorrem eventos que revelam
uma coordenao entre mitose e citocinese (Harris et al., 1994).
Clutterbuck (1970a, b e 1994) e Fiddy & Trinci (1976) observaram que
depois da formao do tubo vegetativo h trs sries de divises mitticas, originando
oito ncleos que sero distribudos por toda a extenso do tubo germinativo, paralelo a
este processo ocorre formao de um septo, que deixa pelo menos um ncleo dentro do
condio em desenvolvimento.
Experimentos realizados com mutantes termossensveis para a diviso,
migrao nuclear e septao (Morris, 1976; Harris et al., 1994; Wolkow et al., 1996),
demonstraram que para ocorrer a septao necessrio que um volume celular
determinado seja alcanado, e isto s ocorre aps, pelo menos, uma diviso mittica.
Estes dados demonstram a existncia de algum inibidor da septao, que est presente
em altas concentraes nos condios, e o aumento do volume celular dilui o inibidor at
o ponto em que no seja mais capaz de inibir a septao, conseqentemente, a citocinese
ocorre conjuntamente com a terceira diviso mittica.
medida que a hifa se expande na regio apical, os ncleos que ficam
nos compartimentos distais entram em dormncia, isto , no ocorre diviso mittica.
Porm os ncleos presentes nas pontas das hifas (cerca de 40) so mitoticamente ativos,
continuando a dividir-se de modo semi-sincrnico e fazendo parte dos compartimentos
septados (Rosenberg & Kessel, 1967). Os ncleos nos compartimentos distais, em
nmero varivel de dois a dez, eventualmente, podem voltar a se dividir para formar as
ramificaes laterais da hifa, mas primeiro necessrio que se estabelea um plo de
crescimento. Nem todos os compartimentos podem ser ativados para se ramificarem, e
desconhece-se o sinal que determina qual ser o compartimento selecionado (Harris &
Hofmann, 1999a). Dynesen & Nielsen (2003) demonstraram que as ramificaes so
coordenadas pelo crescimento das hifas em mitose, isto , para estabelecer a ramificao
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do miclio necessrio relao entre a progresso do ciclo celular e a migrao
nuclear. A partir do momento em que o tubo germinativo se ramifica, as pontas da hifa
deixam de ser o nico stio de crescimento polarizado e, ento, o miclio passa a ter
vrios pontos de crescimento ativo, e a colnia vai adquirindo o seu aspecto circular
quando crescida em meio de cultura slido. (Harris & Kraus, 1998).
2.1.1.2 Principais Mutantes para o Ciclo Celular e Migrao Nuclear
Os estudos de mutantes para a regulao do ciclo celular e migrao
nuclear tiveram incio com os experimentos de Morris (1976), sendo isolado uma srie
de mutantes termossensveis relacionados a diversos aspectos do ciclo celular de A.
nidulans (Osmani & Mirabito, 2004).
a Mutantes para desenvolvimento e septao das hifas
Em fungos filamentosos o tubo germinativo cresce por extenso apical, o
qual caracterizado pela adio de nova parede celular no pice da hifa (Wessel, 1986;
Xiang & Morris, 1999). O desenvolvimento do pice da hifa ocorre em relao ao alto
gradiente de clcio (Regalado, 1998) e pH (Robson et al., 1996).
Os primeiros mutantes termossensveis sep ("septation deficient") foram
isolados por Morris (1976). A anlise do mutante sepB3 mostrou a incapacidade das
clulas continuarem o crescimento alm da terceira diviso nuclear, morrendo logo em
seguida, justamente no momento da citocinese. Durante as primeiras divises nucleares
possvel observar um atraso transitrio da fase M da mitose, sendo que os ncleos
apresentam forma caractersticas de aneuplides. O gene sep foi clonado por Harris &
Hamer (1995) e o produto gnico apresentou homologia com a protena CTF4 de
Saccharomyces cerevisiae, que est intimamente relacionada com o metabolismo do
DNA cromossmico. Os mesmos autores sugerem que o funcionamento incorreto de
sepB pode levar a um acmulo de algum tipo especfico de dano cromossomal que no
permite que as clulas completem a citocinese.
Harris & Kraus (1998) confirmaram esta hiptese aps experimentos
realizados com doses subletais de hidroxiuria e diepoxioctano, os quais levam
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perturbaes do metabolismo do DNA cromossmico, levando a um bloqueio
semelhante ao observado no mutante sepB.
Harris et al. (1997b) realizaram estudos com o mutante para septao,
sepA, que apresenta incapacidade de formar septo e possui padro anmalo de
ramificao da hifa e dos conidiforos durante o crescimento em temperatura restritiva
(42oC). Este mutante tambm apresenta um aumento no dimetro da hifa, em ambas
temperaturas (restritiva e permissiva). Os autores sugerem que quando o mutante cresce
por um determinado tempo sob temperatura restritiva incapaz de depor o septo, porm,
quando a colnia transferida para a temperatura permissiva os septos so rapidamente
formados nas posies corretas. Na temperatura restritiva, o mutante incapaz de formar
o anel contrtil de actina na regio aonde o septo vai ser deposto. A clonagem e
caracterizao do gene sepA, demonstraram que a protena codificada pertence famlia
FH1/2, que possuem membros conhecidos em S. cerevisiae (bni1),
Schizosaccharomyces pombe (cdc12) e Drosophila diaphanous.
Estudos moleculares tem revelado vrios mutantes como suo ("suollen
cells") (suoA, suoB, suoC, suoD e suoF) que atuam na correta polarizao e migrao
nuclear nas hifas. Os genes suoC, suoD e suoF so requeridos para estabilizar a
polaridade da hifa em desenvolvimento, enquanto que suoA requerido para manter a
polarizao, isto demonstra que o estabelecimento e a constncia da polaridade
consistem em eventos geneticamente separados, sendo necessrio um outro sinal para a
extenso apical da hifa (Momany et al., 1999). Um destes sinais a enzima N-Myristoyl
transferase (NMTs), codificada por swoF (Shaw et al., 2002).
RHOA consiste de uma protena envolvida no crescimento, ramificao e
sntese da parede celular em A. nidulans. RHOA homologa a RHO1 pertencente
famlia das GTPase que esto envolvidas na estabilizao da polaridade e deposio da
parede celular de S. cerevisiae. O gene clonado rhoA (Rho GTPase homologue") (Guest
et al., 2004) apresenta agrupamento anormal na sntese da parede celular durante a
ramificao do miclio.
Kaminskyj & Hamer (1998) identificaram cinco locos para a
morfognese da hifa, hypA - hypE ("Abnormal hyphal morphology"), por meio de
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estudos de mutantes temperatura-sensvel. Estas linhagens hypercellular apresentam
morfologia aberrante, defeitos durante a morfognese em temperatura restritiva (mas no
so letais). As anlises do fentipo hyp sugerem que esta mutao promove a limitao
do crescimento apical das clulas basais, isto ocasionado aparentemente pela protena
HYPA que regula o trafico de endomembranas dentro da hifa (Kaminskyj, 2000; Shi et
al., 2004).
Os genes sepA, hypA, podB, podC e podD ("Polarity defective"), so
responsveis por estabilizarem e manterem a polaridade da hifa (Harris et al., 1999a, b).
Os genes sepA, hypA e podB so requeridos para mltiplos aspectos da morfognese da
hifa, j os genes sepA e podB so necessrios para a organizao do citoesqueleto. Em
contraste, os genes podC e podD codificam uma protena que aparentemente requerida
para o estabelecimento da polaridade da hifa durante a germinao do esporo. Estas
evidncias indicam que a integridade na formao do citoesqueleto de actina
necessria para o desenvolvimento normal do tubo germinativo. A caracterizao
molecular destes genes poder esclarecer muitos aspectos sobre a citocinese,
crescimento e migrao nuclear na hifa.
b Mutantes para a progresso do Ciclo Celular
O ciclo celular estabelecido por eventos bsicos como: replicao do
DNA cromossmico, a duplicao dos centrolos e formao das fibras do fuso mittico.
Esses eventos so altamente conservados em fungos e em todos eucariotos (animais e
vegetais) (Morris et al., 1989; Morris & Enos, 1992; Doonan, 1992; Nasmyth, 1996;
Lew & Kornbluth, 1996; Osmani & Ye, 1996). Partindo da importncia que o ciclo
celular apresenta para a sobrevivncia dos seres vivos, alguns pesquisadores iniciaram
na dcada de 1970 o estudo da gentica e bioqumica de mutantes que afetassem a
mitose em organismos simples. Entre estes organismos se destacaram S. cerevisiae
(Hartwell, 1974), S. pombe (Nurse, 1975) e A. nidulans (Morris, 1976). Desta forma, um
grande nmero de genes relacionados ao controle do ciclo celular foi descoberto em
animais e vegetais, graas ao conhecimento adquirido sobre a mitose em fungos
(Hartwell & Kastan, 1994).
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Bergen & Morris (1983) descreveram a cintica de diviso nuclear em A.
nidulans, estabelecendo que o ciclo celular ocorre durante a germinao do condio,
levando em torno de 75 120 minutos, dependendo da condio de crescimento. Na
temperatura de 37oC a fase M muito rpida, em torno de 5 minutos. G2 leva cerca de
30 minutos, S 25 minutos e G1 em torno de 15 minutos.
Um dos primeiros eventos que ocorre durante o ciclo de diviso celular
a duplicao da regio organizadora do fuso mittico (SPB spindle pole body). Esta
duplicao ocorre durante a intrfase, precisamente durante a fase S do ciclo celular.
Durante a metfase os dois SPB formados migram para lados opostos tendo entre si um
arranjo de microtbulos, nesta fase que o nuclolo torna-se menos distinto e
desaparece. As imagens geradas por microscopia eletrnica sugerem que em fungos,
apesar da membrana nuclear no desaparecer, ela se torna menos densa (Doonan, 1992).
O estudo da regulao celular em A. nidulans teve incio com Morris
(1976), partindo do isolamento de mutantes termossensveis. Foram isolados mutantes
bim ("Blocked in mitosis") e nim ("Never in mitosis"), este isolamento foi realizado com
base no aspecto adquirido pelo ncleo quando corados com corantes com afinidade por
cidos nuclicos. Os mutantes nim possuem ncleos que aparentam estar sempre em
interfase, isto , a cromatina corada nas bordas e na regio central descorada,
corresponde ao nuclolo. Os mutantes bim foram assim classificados uma vez que seus
ncleos apresentam um aspecto mittico, ou seja, sempre condensado, como um
pequeno ponto luminoso no interior da hifa (Morris, 1976).
A partir de estudos genticos e bioqumicos, comprovou-se que os
componentes regulatrios da mitose so conservados sendo possvel estud-los em A.
nidulans. Os estudos tm se direcionado, principalmente, para uma classe de protenas
denominadas de quinase dependente de ciclina (cdk). Estas protenas so as chaves
para a replicao do DNA, iniciao da mitose, formao do complexo promotor da
anfase e citocinese (Lew & Kornbluth, 1996; Nasmyth, 1996).
A clonagem de nimXp34 possibilitou a caracterizao em A. nidulans de
umas das principais protenas quinase, a qual estabelece o momento que o ciclo celular
deve ultrapassar as barreiras G1/S e G2/M (Osmani et al., 1994). O gene nimp34 faz parte
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de um complexo denominado de cdk (cicline dependent kinase), que para ser
ativado deve estar ligado a um ciclina (nimEcdc13). Mesmo que o complexo cdk seja
formado, ele s ser ativado, levando a progresso do ciclo celular quando a tirosina-15
da protena p34 for desfosforilada por ao de uma protena fosfatase codificada pelo
gene nimTcdc25 (OConnell et al., 1992). Em A. nidulans s uma ciclina conhecida,
nimEciclina-B, mas provvel que p34 associe-se a outros parceiros para promover as
transies entre G1/S e G2/M (Osmani & Ye, 1996). Para que a anfase se complete,
necessrio que haja quebra do complexo cdk, por meio da degradao da ciclina-B.
Acredita-se que o complexo promotor da anfase, ou ciclossomo seja responsvel pela
ubiquitinao da ciclina-B, caracterizando esta protena como alvo de protelise.
(Osmani & Ye, 1996; Wu et al., 1998).
NIMT no a nica fosfatase envolvida na progresso do ciclo celular em
A. nidulans, o gene bim tambm codifica uma fosfatase especfica da mitose, a
inativao da mesma impede que as clulas deixem os estgios mais tardios da mitose. A
seqncia de aminocidos de BIMG mostrou homologia com uma protena fosfatase
(PP1) de mamferos e de S. cerevisiae, as quais so essenciais para o sucesso da mitose
(Doonan et al., 1991).
Osmani et al. (1987) clonaram nimA, o qual fundador de uma famlia
gnica encontrada desde leveduras at mamferos. Este gene codifica uma protena
quinase do tipo Serina/Treonina. A princpio foi estabelecido que nimA funciona
especificamente na progresso entre as fases G2 e M, sua atividade fosforilativa, bem
como o acmulo de seu mRNA, comeou a elevar-se em G1 e S e apresenta seu pico em
G2, ao contrrio de p34 que possui nveis constantes tanto de seu mRNA quando da
protena durante todo ciclo celular. Durante a mitose os nveis de nimA comeam a
decair, e para que haja citocinese ela tem que ser abolida. As anlises citolgicas dos
mutantes nimA demonstraram que durante o crescimento na temperatura restrita no h
desorganizao dos microtbulos citoplasmticos, no h condensao da cromatina e
tambm no h formao do fuso mittico. Portanto, a atividade da protena NIMA
requerida para iniciar todos os aspectos da diviso nuclear (Pu & Osmani, 1995).
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Outro complexo que regula a progresso do ciclo celular designado de
APC/C (complexo promotor da anfase/ciclossomo). composto por pelo menos oito
polipeptdeos, dos quais dois so bem conhecidos bimA e bimE (ODonnell et al., 1991).
Ambos apresentam bloqueio para a terminao da fase M do ciclo celular,
permanecendo com os ncleos condensados indefinidamente quando em temperatura
restritiva. A mutao bimAPC3 capaz de superar parcialmente o bloqueio imposto pela
mutao em nimA, sendo que o duplo mutante capaz de realizar a condensao da
cromatina e organizar as fibras do fuso. Estes resultados indicam que nimA e bimA
agem em conjunto, direta ou indiretamente, ocasionando a passagem por G2, o que um
resultado inesperado, uma vez que se acreditava que o complexo APC/C tivesse funo
apenas a partir da metfase, finalizando a mitose (Lies et al., 1998).
O mutante bimD6 foi clonado por Denison et al. (1993), este mutante
sensvel a altas temperaturas e apresenta dificuldade de ligao entre o cromossomo e o
fuso mittico, resultando na perda do cromossomo. Holt & May (1996) identificaram
sete supressores extragnicos de bimD6, que foram denominados de sudA, sudB, sudC,
sudD ("Suppressor of bim"). Anaya et al. (1998) isolaram a mutao sudD,
determinando que seu transcrito SUDD membro da famlia SMC de protenas
topoisomerases II atuando na condensao e segregao cromossmica de leveduras, A.
nidulans e mamferos, aumentando a proporo de perda cromossmica atravs de no
disjuno (Holt & May, 1996). Um aspecto de SUDD consiste em sua alta concentrao
de serina e treonina (11%) sendo que este transcrito pode ser uma protena quinase.
Como a condensao cromossmica consiste de um evento regulado pelo ciclo celular,
possivelmente a funo de SUDD esteja relacionada com a regulao atravs da
fosforilao, sendo necessrio, mais estudos para comprovar este processo.
Outros genes fazem parte dos componentes estruturais da mitose, os quais
foram isolados a partir de mutantes, como o caso do gene benA ("Benlate resistence")
que foi isolado a partir de mutante resistente substncia anti-microtbulos benomil
(Dekker & Davidse, 1975). Os genes para a constituio da -tubulina, tubA ("Alpha-
tubulin") que componente dos microtbulos presentes durante o crescimento
vegetativo e tubB que desempenha funes durante a meiose (Doshi et al., 1991; Kirk &
14
Morris, 1991). Outro gene identificado por Oakley & Oakley (1989) foi da -tubulina.
Este gene est localizado na regio organizadora do centrolo, no sendo um
componente do microtbulo, mas requerido para iniciar a polimerizao dos
microtbulos (Oakley et al., 1990).
Outro gene que pode ser descrito como mutante para a progresso do
ciclo celular, o gene bnc ("binucleate"), que afeta todos os estgios do ciclo de vida do
fungo A. nidulans. A mutao do gene bncA estimula a rpida sada da fase G1,
impedindo a germinao do condio, eleva o ndice mittico do cromossomo (CMI)
promove mitoses desordenadas em hifas velhas, densidade e distribuio anormal dos
ncleos e morfognese anormal durante a germinao e desenvolvimento dos
estergmas. Este mutante produz uma alta freqncia de condios heterocrios, os quais
podem ser formados pelo movimento nuclear incorreto e, finalmente, estes mutantes so
hipersensveis a drogas anti-microtubulos. Estas observaes sugerem que o gene bncA
seja fundamental para a regulao do ciclo celular ou que seja requerido para o
funcionamento dos microtbulos (Pascon, 1998; Pascon et al., 2001). A mutao bncA
apresenta fentipo muito semelhante aos mutantes que afetam a duplicao do ciclo
celular, como os mutantes bim (Morris, 1976; Enos & Morris, 1990; ODonnell et al.
1991). Pascon et al., (2001) analisaram o fentipo desta mutao durante a germinao e
formao do conidiforo. Os autores sugerem que bncA codifica um componente
essencial, o qual requerido para a segregao cromossmica e para o movimento ou
posicionamento nuclear. A segregao cromossmica pode sofrer uma anormal
organizao ou orientao do fuso, levando a distribuio incorreta do ncleo durante a
diviso celular em hifa, j a alterao na formao do fuso contribui para a quebra
cromossmica, levando ao aumento da instabilidade (Pizzirani-Kleiner & Azevedo,
1986a, b; Pascon et al., 2001). O posicionamento nuclear muito importante para a
vescula do conidiforo, a qual possui um grande nmero de ncleos que esto alinhados
no pice das vesculas para poderem migrar para as mtulas em desenvolvimento
(Fischer & Timberlake, 1995), mutantes similares ao gene bncA foram observados em S.
cereviseae, o gene CDP1 confere o fentipo anucleado ou multinucleados as clulas de
leveduras (Foreman & Davis, 1996). O isolamento e caracterizao da mutao do gene
15
bncA de extrema importncia para o entendimento e conexo entre o ciclo celular e a
morfognese em fungos filamentosos.
c Mutantes que afetam a distribuio nuclear nas hifas e conidiforos
A migrao nuclear necessria para o crescimento e desenvolvimento
dos fungos filamentosos, Morris (1976) inciou seus estudos em mutantes de A.
nidulans, para a migrao nuclear, sendo identificado um mutante denominado de nud
("nuclear distribution") que afeta a distribuio nuclear.
A anlise microscpica dos mutantes nud, realizada por Morris (1976),
demonstrou que os ncleos no migravam, sendo incapazes de se distribuir normalmente
ao longo do tubo germinativo, contudo estas mutaes no afetam a mitose.
O gene nudA foi isolado e caracterizado por Xiang et al. (1994), a
mutao deste gene responsvel pelo bloqueio na distribuio dos ncleos ao logo do
tubo germinativo, sendo que os mesmos ficam acumulados nos condios, eventualmente
o ncleo quebra o bloqueio e migra, possibilitando o crescimento da hifa, mas este
muito lento. A determinao da seqncia de aminocidos demonstrou que a protena
NUD possui quatro stios de ligao ao ATP, sendo uma caracterstica de protenas da
cadeia pesada da dinena citoplasmtica, a qual uma protena motora encontrada em
todos os organismos, desde as leveduras at os mamferos. O complexo formado por
diversas cadeias da dinena tem funo no transporte de organelas membranosas
(Hirokawa, 1998). A descoberta deste gene em A. nidulans caracterizou a dinena como
o principal motor celular encarregado da distribuio nuclear na hifa vegetativa (Fischer,
1999).
Goldman & Morris (1995) isolaram supressores extra gnicos de nudA, a
seleo foi feita para os mutantes que contribussem para a melhora da distribuio
nuclear na hifa vegetativa e esta estratgia teve o objetivo de descobrir genes que
interagem com a cadeia pesada da dinena. A anlise mutacional identificou cinco genes
que so capazes de restaurar o crescimento vegetativo na ausncia de nudA.
O gene nudC3, apresenta incapacidade de distribuir seus ncleos, sendo
que ocorrem trs divises nucleares normais, porm os oitos ncleos nunca chegam a
16
serem distribudos ao longo da hifa vegetativa (Morris, 1976). A clonagem e o
mapeamento fsico deste gene no veio a esclarecer qual seria o mecanismo pelo qual
nudC age, uma vez que a seqncia de aminocidos possui homologia com protenas
que no tem funo conhecida. Porm, a protena bastante conservada, tendo
homlogos em Drosophyla melanogaster, Caenorhabditis elegans e Homo sapiens
(Osmani et al., 1990).
O mutante nudF foi identificado por Morris (1976), posteriormente,
durante a tentativa de clonar o gene nudC, nudF, sendo identificado como um supressor
multicpia de nudC. A relao entre nudC e nudF foram estabelecidas quando se
detectou que a ausncia de nudC que regula nudF. Este resultado demonstrou que nudF
se encontra sob controle do promotor da lcool desidrogenase (alcAp) em condies de
induo. Estes dados sugerem que nudC regula nudF de forma ps-transcricional,
elevando os nveis desta protena. possvel que estas duas protenas faam parte de um
complexo sendo que, NUDC no est presente e NUDF est sujeita a degradao (Xiang
et al., 1995a).
Morris et al. (1997) iniciaram uma estratgia para identificar genes
responsveis pela induo, por prolactina, em culturas de clulas T de rato. Neste estudo,
os autores identificaram um clone, o c15, sendo que seu sequenciamento demonstrou
homologia de 68% com o gene nudC. Neste trabalho foi possvel provar que existe
homologia funcional entre o clone c15 e nudC, sendo que c15 capaz de complementar
a mutao nudC3, e tambm de restaurar os nveis de nudF.
Xiang et al. (1995b), realizando estudos com nudF, demonstraram que
seu transcrito constitudo por 444 aminocidos, alm de apresentar 41% de homologia
com a protena LIS1. O mutaes no gene lis1 causam deficincias durante o
desenvolvimento cerebral por falhas na migrao dos neurnios, originando a sndrome
de Miller-Dieker (Reiner et al., 1993; Nigro et al., 1997).
O gene lis1 ("lissencephaly") est localizado no cromossomo 17p13.3
(Leventer et al., 2000; Ledbetter, 1992; Reiner, 1993) e codifica a protena LIS1 (a qual
composta por duas subunidades PAFAH1B1 que pode atuar como uma protena
associada aos microtbulos e PAFAH), que altamente conservada entre ratos e
17
humanos. Estudos realizados demonstraram que a subunidade PAFAH1B1 possui 42%
homologia com nudF (Leventer et al., 2000). Matsumoto & Ledbetter (1999) realizaram
estudos de hibridizao in situ entre lis1 e nudC isolados de humanos, demonstrando
que ambos so co-expressados e pertencentes as protenas MAPs ("Microtubule
Associated Proteins"). Um dos ltimos mutantes nuds descrito, foi o gene nudG, que
codifica a cadeia leve de dinena (Beckwith et al., 1995), este gene esta restritamente
relacionado com o gene nudA, onde ambos codificam subunidades da protena motora
dinena (Xiang et al., 1994). As protenas NUDG e NUDA provavelmente esto
diretamente envolvidas na translocao nuclear (Holzbaur & Vallee, 1994).
Clutterbuck (1994) isolou dois novos mutantes para o desenvolvimento
aspA e aspB, estes mutantes bloqueiam o desenvolvimento assexual na fase de mtula, o
bloqueio est associado falha na migrao nuclear da vescula para a mtula do
conidiforo. Por causa da caracterstica de mtula anucleada este mutante foi
denominado de aps (anucleate primary sterigmata), alm disto hifa vegetativa deste
mutante apresenta uma distribuio anormal dos ncleos (Clutterbuck, 1994; Fischer &
Timberlake, 1995). Suelmann et al. (1997) demonstraram que a distribuio anormal na
hifa vegetativa no era permanente, sendo que ocorre a reorganizao nuclear aps
algum tempo. A provvel causa para o agrupamento dos ncleos durante o
desenvolvimento da hifa vegetativa que os ncleos iniciam seu movimento para uma
regio especfica, movimento direcionado, e aps um determinado perodo esta direo
mudada para um outro local diferente. Para tentar compreender como corre a interao
entre desenvolvimento anormal do conidiforo com a distribuio anormal de ncleo nas
mtulas, Fischer (1999) props duas hipteses: a primeira consiste, que o ncleo no
migra para a mtula; e a segunda sugere que os ncleos migram para as mtulas, como
ocorre nas linhagens selvagens, mas devido ao aumento da motilidade dos ncleos, eles
deixam a clula antes que o septo esteja formado.
Um mutante supressor foi isolado por Krger & Fischer (1996), este
mutante recuperou o fentipo asp dos conidiforos. Aparentemente os mutantes asp no
apresentam anormalidades na migrao nuclear, mas ocorre uma alterao no
posicionamento do ncleo no interior da hifa e conidiforos, sugerindo que o gene asp
18
possui funo relacionada com a regulao do posicionamento do ncleo. Suelmann et
al. (1997) sugeriram que o nvel do regulamento na posio do ncleo pode ocorrer
durante a migrao do ncleo pela hifa vegetativa e que este ncleo ao chegar em um
determinado local poderia ocorrer dois eventos, primeiramente a desconexo da fora
motriz e mais a fixao do ncleo. Embora estes eventos no estejam completamente
compreendidos a protena do gene asp pode estar envolvida na regulao da fixao do
ncleo.
O gene asp foi clonado e seqenciado, apresentando uma protena de 183
kDa, que possui um alta probabilidade para a formao de uma estrutura em espiral
(coiled-coil) (Fischer & Timberlake, 1995). A funo da protena no clara, mas
devido a presena de um domnio PH encontrado na cadeia C-terminal, ela pode ser
descrita como um protena transcricional (Gibson et al., 1994; Lemmon et al., 1996;
Musacchio, 1993).
O domnio PH responsvel pelo direcionamento da protena APSA para
membrana plasmtica (Suelmann et al., 1997). Trabalhos realizados com imuno
localizao demonstraram que esta protena est presente junto ao crtex da hifa, e a
remoo deste domnio resultou na agregao citoplasmtica do polipeptdeo (Salim et
al., 1996). A protena APSA apresenta homologia com a protena NUM1p ("nuclear
migration") de leveduras. A mutagnese realizada em num1 resultou em uma alta
freqncia de clulas binucleadas (Kormanec et al., 1991). Recentemente, um gene
homlogo a aps foi clonado em Podospora anserina, os mutantes para este gene
produzem microcondios anucleados (Fischer, 1999).
Um segundo gene envolvido no posicionamento nuclear, o apsB foi
clonado em A. nidulans (Suelmann et. al., 1998), este codifica uma protena de 121 kDa
com alta probabilidade para formao de uma estrutura em espiral (coiled-coil), isto ,
possui domnios espiralizados. A identificao de componentes interagindo com as
protenas APSA e APSB so necessrias para melhor compreenso da funo destas
protenas.
Queiroz & Azevedo (1998) descreveram um novo mutante para a
distribuio nuclear em hifas durante a conidiognese, este gene se encontra no
19
cromossomo VII, sendo denominado de anuA ("anucleate - Multinucleate conidia and
hypha compartments").
2.1.2 Aquisio da Competncia
Uma vez estabelecido o crescimento polarizado da hifa e suas ramificaes,
tem incio a colonizao do substrato para a formao do tecido vegetativo, o miclio.
O fungo A. nidulans pode manter-se indefinidamente no estgio vegetativo
do seu ciclo de vida, sendo que a conidiognese normalmente ocorre aps este perodo
(Kronstad & Staben, 1997; Morris, 1976). A esporulao assexual e sexual ocorrem
unicamente na exposio de superfcies aeradas e aproveitando-se desta condio,
possvel sincronizar e induzir o desenvolvimento da conidiognese (Axelrod, 1972; Law &
Timberlake, 1980).
O estabelecimento da competncia dependente de condies particulares
empregadas para cada meio de cultura, mas geralmente a competncia adquirida aps 20
horas de crescimento a 37oC, antes deste perodo, as colnias so incapazes de entrar na
conidiognese mesmo que ocorra a induo por aerao. Axelrod et al. (1973) e Miller
(1990) observaram que antes de 20 horas de crescimento, as clulas no respondem
induo, e aps este perodo a resposta leva horas para se realizar, as clulas capazes de
responder imediatamente induo so consideradas como competentes. O processo de
controle para aquisio da competncia obedece a um controle endgeno, isto porque
fatores como densidade de clulas e fornecimento contnuo de meio de cultura no surtem
efeito sobre o incio da conidiognese (Pastushok & Axelrod, 1976).
O incio da conidiognese dependente de aerao, mas os mecanismos que
controlam este evento no so compreendidos, o provvel sinal para o incio da conidiao
possivelmente no est associado com mudanas nos nveis de O2 e CO2 nas superfcies
aerada e lquida (Snchez-Garcia & Rabbitts, 1994), mas que sejam induzidos por sinais
genticos. A conidiao tambm dependente de luz. Em linhagens selvagens de A.
nidulans a conidiao ocorre devido a presena do alelo do gene velvet (veA+), que
20
dependente de luz vermelha. As linhagens que apresentam a mutao veA1 so capazes de
promover a conidiao na ausncia de luz (Vierula & Mais, 1997).
Butnick et al. (1984a, b) isolaram diversos mutantes termossensveis
(temperatura de 28oC), trs mutantes apresentaram bloqueios especficos de fase de pr-
competncia. As anlises de alternncia de temperatura mostraram que os produtos destes
genes so necessrios durante o mecanismo de crescimento submerso, sendo que todos os
trs mutantes foram incapazes de desempenharem o ciclo assexual e sexual corretamente
(Yager et al., 1982).
Os mecanismos genticos que coordenam a aquisio da competncia so
pouco conhecidos, mas apresentam enorme relevncia, uma vez que todas as clulas que se
diferenciam dependem de tal mecanismo para adaptao e sobrevivncia do organismo.
2.1.3 Ciclo Assexual
2.1.3.1 Formao do Conidiforo
A germinao do esporo leva a formao de hifas tubulares que crescem de
forma polar por extenso apical e ramificam-se formando redes interconectadas de clulas
denominadas de miclio. Aps 16 horas, aproximadamente, da germinao do esporo,
ocorre a primeira evidncia fenotpica de especializao da hifa a qual observada dentro
da colnia (Lee & Adams, 1994a, b). A hifa area ramificada diferencia-se em um
conidiforo, estrutura reprodutora do ciclo assexual de A. nidulans (Adams et al., 1998). O
processo de desenvolvimento e de diferenciao do conidiforo, at a formao dos
condios, constitui a Conidiognese.
A ultraestrutura do desenvolvimento e diferenciao do conidiforo de A.
nidulans, analisada por Mims et al. (1988) e revisada por Timberlake & Clutterbuck
(1994), pode ser dividida em cinco estgios de desenvolvimento:
1. o primeiro estgio do desenvolvimento do conidiforo envolve a
transformao de uma clula de hifa em uma clula p (Figura 1), estrutura que sustenta e
desenvolve o conidiforo. A clula p pode ser distinguida das outras clulas por possuir
duas camadas de parede celular. A camada exterior ou parede primria constituda pela
21
parede da prpria hifa basal e a camada mais interna ou parede secundria limita o incio e
o final da clula p (Oliver, 1972). Em relao ao ncleo, a clula p pode ser uninucleada,
ou ocorrer mais de um ncleo, como foi demonstrado em heterocrios (Clutterbuck &
Spathas, 1984; Pizzirani-Kleiner & Azevedo, 1986a, b). A partir da clula p, h o
desenvolvimento da haste do conidiforo, que multinucleada e asseptada. A regio apical
da haste rica em vesculas que possuem substncias precursoras e polimerizadoras da
parede celular. As vesculas fundem-se membrana plasmtica promovendo o
alongamento da haste (Gooday, 1983);
v
h
c
f m
ht
cp
Figura 1 - Conidiforo de Aspergillus nidulans. (h) hifa, (cp) clula p, (ht) haste do conidiforo, (v) vescula do conidiforo, (m) mtula ou estergma primrio, (f) filide ou estergma secundrio, (c) condios. Foto de microscopia eletrnica de varredura, aumento 1500 x (Giancoli, 2000)
2. a partir da clula p forma-se a haste do conidiforo, que sofre
alargamento gradual do seu pice formando uma vescula, que tambm possui dupla
camada de parede celular. Durante a formao da vescula do conidiforo, ocorre acmulo
de vesculas intracelulares, que possuem em seu interior substncias precursoras e
polimerizadoras da parede celular no pice da vescula (Oliver, 1972). A vescula do
conidiforo possui vrios ncleos que sofrem diviso mittica;
22
3. com a vescula formada, tem incio o desenvolvimento das mtulas, as
quais surgem como protuberncias na superfcie interna da parede da vescula, isto
provavelmente pela dissoluo da parede secundria. Durante o desenvolvimento das
mtulas, so observados agregados nas protuberncias das vesculas, de onde emergem as
mtulas. As vesculas citoplasmticas persistem no pice das mtulas at seu completo
desenvolvimento, a sua funo, provavelmente, est relacionada com a formao da parede
celular do fungo. Oliver (1972) tambm observou um grande nmero de vesculas
citoplasmticas, que esto aderidas na parede celular das mtulas, provavelmente
responsveis pela sntese de novas paredes celulares. Em relao ao ncleo, ocorre a
migrao nuclear da regio apical da vescula para a mtula, tornando-a uninucleada, e
posteriormente sofre diviso mittica. A delimitao entre vescula e mtula ocorre pela
deposio de um septo descontnuo, com poro central que permite a comunicao
citoplasmtica entre os dois compartimentos;
4. no pice das mtulas ocorre o brotamento das filides. O ncleo presente
na mtula sofre diviso mittica, originando um ncleo filho, que migra para a filide,
sendo que outro ncleo permanece na mtula. A comunicao citoplasmtica entre a
mtula e filide ocorre pela formao de septos descontnuos com poro central;
5. ao completar o desenvolvimento das filides tem incio a formao dos
condios primrios, os quais so originrios do pice das filides, durante este processo
ocorre uma diviso mittica do ncleo presente na filide, o ncleo filho migra para o
condio em formao (Bergen & Morris, 1983; Pascon, 1994). A formao da parede
celular dos condios tem incio com o prolongamento das paredes primrias e secundrias
das filides e no decorrer da maturao dos condios ocorre deposio de novas
membranas, tornando-os impermeveis e garantindo a sua dormncia.
2.1.3.2 Principais Mutantes para a Conidiognese
Clutterbuck (1969) e Martinelli & Clutterbuck (1971) foram os primeiros a
estudarem e descreverem mutantes para o desenvolvimento em A. nidulans. A anlise de
mutantes para os diferentes passos da conidiognese tem permitido esclarecer o
23
desenvolvimento e diferenciao em A. nidulans. Esses mutantes se enquadram em duas
classes de acordo com Timberlake (1990):
a - Classe I, mutantes relacionados com a aquisio de competncia, isto ,
genes que controlam a transio do crescimento indiferenciado da hifas para a
diferenciao do conidiforo.
B - Classe II, mutantes que afetam a formao do conidiforo e condio.
Essa ltima classe subdividida em quatro grupos conforme, Clutterbuck
(1969):
b1 - mutantes para alteraes conidiais yA ("yellow conidia, laccase I");
wA ("white conidia, polyketide synthase"); fwA ("fawn conidia"); wetA ("wet-white
conidia");
b2 - mutantes com alterao no conidiforo, mas que no afetam a formao
dos condios stuA ("stunted"); medA ("medusa");
b3 - mutantes que bloqueiam a formao dos condios brlA ("bristle") abaA
("abacus");
b4 - mutantes que afetam a pigmentao dos condios ivoA ("ivory"); ivoB.
Em outra classificao, Miller et al. (1991 e 1992) e Miller (1993)
dividem os mutantes em dois grupos: "bristle" e "stunted", sendo que no primeiro esto
includos trs genes (brlA-bristle abaA-abacus wetA-wet-white) que atuam em
cadeia episttica e sem os quais no h formao do conidiforo e dos condios e no
segundo grupo, dois genes esto envolvidos stuA medA.
a Mutantes de Classe I
Os genes pertencentes classe I, isto , mutantes relacionados com a
aquisio da competncia, so inmeros. O gene velvet (veA) merece destaque, pois em
linhagens selvagens so responsveis pela dependncia da luz como estmulo inicial para a
conidiognese (Mooney & Yager, 1990). Esse gene pleiotrpico, sendo que o mutante
veA1 no produz hifas areas tpicas, como da linhagem selvagem (Kafer, 1960; 1961),
alm de ser incapaz de produzir cleistotcios a 42oC (Champe et al., 1981).
24
Outro mutante de interesse o flu ("fluffy"), que apresenta miclio areo
indiferenciado e invasivo, perdendo a inibio por contato e crescendo sobre outras
colnias (Ball & Azevedo, 1964; Tamame, et al., 1983). Estes mutantes se caracterizam
pela formao de grandes quantidades de hifas areas que nunca chegam a diferenciar
conidiforos e so incapazes de respeitar os limites de crescimento de uma colnia vizinha
que apresenta desenvolvimento normal.
O tratamento das hifas com 5-azacitidina interfere na expresso do fentipo
flu, este agente mutagnico incorporado no lugar da citosina e inibe a ao da enzima
metiltrasferase, causando hipo-metilao e a ativao imprecisa de genes silenciados por
meio da metilao de bases. Vrios mutantes flu foram isolados por esta metodologia e a
realizao do mapeamento gentico demonstrou que todos os mutantes so alelos de um
mesmo gene que foi mapeado no cromossomo VIII, tendo estreita ligao com o
centrmero (Tamame & Santos, 1988).
Diversos mutantes flu, como acoD684 ("aconidial") foram descritos e
estudados por gentica clssica e molecular (Yager et al., 1992; Wieser et al., 1994; De
Vries et al., 1995; Yu et al., 1996; Marhoul & Adams, 1996; Adams et al., 1998; Pascon,
1998).
b Mutantes da Classe II
Por meio de estudos moleculares, foi possvel demonstrar que a
conidiognese possui dois genes principais descritos e identificados o brlA e abaA, os
quais so requeridos especificamente para o desenvolvimento normal dos condios, no
afetando o incio do desenvolvimento do ciclo assexual (Clutterbuck, 1969). Juntamente
com um terceiro gene o wetA, brlA e abaA, podem ser considerados como os genes
principais, que atuam no caminho central da regulao do desenvolvimento da
conidiognese Estes trs genes, juntamente com outros genes, so responsveis pelo
controle da expresso gnica da conidiao, determinando a ordem da ativao durante o
desenvolvimento e maturao do esporo (Boylan et al., 1987).
Os mutantes "bristle" (brl) e "abacus" (aba) so classificados como
mutantes aconidiais. Os mutantes brl foram includos neste grupo devido a algumas
25
linhagens desenvolverem apenas a haste do conidiforo, que se alongam at 2 - 3 mm e no
desenvolvem vesculas nem qualquer outra estrutura subseqente na diferenciao do
conidiforo. Entretanto, muitos outros mutantes brandos para o gene brl desenvolvem
conidiforos aberrantes, com cadeias de mtulas que se diferenciam e originam novos
conidiforos. Os condios podem ser formados em maior ou menor quantidade, de acordo
com o nvel de comprometimento dos conidiforos (Rocha, 1997; Castro-Prado & Rocha,
1998). Clutterbuck (1969) observou que entre 36 mutantes brl, muitos apresentavam
fentipos intermedirios entre "bristle" grave, onde ocorre apenas a formao da haste do
conidiforo ao fentipo normal sugerindo a formao de um gradiente de fentipos
"bristle" grave ao fentipo normal. Este gradiente entre fentipos foi comprovado por
estudos de mutantes "bristle" sensveis temperatura e osmolaridade (Clutterbuck, 1970a,
b).
O gene "bristle" de linhagens selvagens de A. nidulans foram isolados por
complementao de mutantes (Boylan et al., 1987; Johnstone et al., 1985), demonstrando
que o mesmo codifica um fator de transcrio do tipo zinc-finger (Evans & Hollenberg,
1988). Os resultados obtidos mostram duas unidades de transcrio denominadas de brlA
e brlA. A unidade brlA possui 2,1 kb e a unidade brlA apresenta 2,5 kb. Estas
unidades ao serem transcritas em polipeptdio apresentam uma diferena de 23
aminocidos a mais para a unidade brlA. Durante o incio da transcrio, ocorre
sobrepo
