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TECNOLÓGICO DE MONTERREY
Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud
Programa Multicéntrico de Especialidades Médicas
“Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes mellitus gestacional.”
Tesis para obtener el grado de: Especialista en Neonatología
presenta: Gelacio Jiménez Blanco
Director de tesis: Codirector de tesis: Dr. Med. Víctor Javier Lara Díaz Dr. Víctor Arízaga Ballesteros
Monterrey, Nuevo León, México Septiembre, 2019
III
Dedicatoria
Dedico este trabajo a mi esposa y a mi hija, quienes son mi alegría y la razón de
mi esfuerzo y dedicación.
IV
Agradecimientos
Agradezco a mi maestro y mentor el Dr. Víctor Javier Lara Díaz por su apoyo
durante todo el proceso de mi formación como especialista en neonatología, además del
invaluable apoyo que me brindó en la realización de este trabajo.
Agradezco a mis colegas y compañeros Dalia Liliana Rodríguez Reyes y Alan
Heriberto Montoya Rincón, quienes fueron pieza clave para la culminación de este
proyecto conjunto.
Agradezco a mis demás compañeros de residencia: Tania Moreno, Eduardo
González, Ángela Ruiz, y Jorge Moreno por su apoyo en las diferentes actividades
hospitalarias y académicas mientras nosotros trabajamos en este proyecto.
Agradezco a los médicos adscritos al servicio de neonatología del Hospital
Regional Materno Infantil de Alta especialidad, por todo su apoyo y facilidades brindadas
para poder llevar a cabo este trabajo.
Un agradecimiento especial al Dr. Cuauhtémoc Licona Cassani, por permitirnos
participar en este proyecto, y a todo al equipo de biotecnología del ITESM, quienes
fueron pieza fundamental para el procesamiento y análisis de muestras.
V
Glosario.
ACOG Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (por sus siglas en inglés)
ADN Ácido desoxirribonucleico ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosomal AGL Ácidos grasos libres ARN Ácido ribonucleico
ARNr Ácido ribonucleico ribosomal cm Centímetros
cm3 Centímetro cúbico CTOG Curva de tolerancia oral de glucosa
DM Diabetes mellitus DM1 Diabetes mellitus tipo 1 DM2 Diabetes mellitus tipo 2 DMG Diabetes mellitus gestacional DNA Ácido desoxirribonucleico (por sus siglas en inglés) ECN Enterocolitis necrosante EPO Eritropoyetina
FUM Fecha de última menstruación G Fuerza G g Gramos
g/L Gramos por litro HMD Hijo de madre con diabetes
hMmSCs Células progenitoras de la leche materna humana (por sus siglas en inglés)
HMO Oligosacáridos de leche humana (por sus siglas en inglés) HRMIAE Hospital Regional Materno-Infantil de Alta Especialidad
IgA Inmunoglobulina A IgE Inmunoglobulina E
IMC Índice de masa corporal Kg Kilogramo
Kg/m2 Kilogramo por metro cuadrado LCPUFA Ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados (por sus siglas en inglés)
m2 Metro cuadrado MCT Triglicéridos de cadena media (por sus siglas en inglés)
mg Miligramo mg/dL Miligramos por decilitro
mL Mililitro mm Milímetros
mmol/L Milimoles por litro ng Nanogramo
NIH Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (por sus siglas en inglés)
ºC Grados Celsius
VI
PCR Reacción en cadena de polimerasa (por sus siglas en inglés) pH Potencial de hidrógeno
PTG Prueba de tolerancia a glucosa RN Recién nacido
RNA Ácido ribonucleico (por sus siglas en inglés) RPM Ruptura prematura de membranas
rRNA Ácido ribonucleico ribosomal (por sus siglas en inglés) TLR-1 Receptor Toll tipo 1 (por sus siglas en inglés) TLR-2 Receptor Toll tipo 2 (por sus siglas en inglés)
UNICEF Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia (por sus siglas en inglés) VD Variable dependiente VI Variable independiente µg Microgramo µL Microlitro
VII
Índice de contenidos
Dedicatoria ........................................................................................................................ III
Agradecimientos ............................................................................................................... IV
Glosario. ............................................................................................................................. V
Índice de contenidos......................................................................................................... VII
Índice de tablas.................................................................................................................. XI
Índice de figuras ............................................................................................................... XII
Resumen .............................................................................................................................. 1
Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes
mellitus gestacional ........................................................................................................ 1
Capítulo 1. Planteamiento del problema ............................................................................. 2
Antecedentes .................................................................................................................. 2
Pregunta de investigación............................................................................................... 2
Hipótesis: ........................................................................................................................ 2
Objetivo general: ............................................................................................................ 3
Objetivos secundarios: ................................................................................................... 3
Objetivos exploratorios: ................................................................................................. 4
Justificación .................................................................................................................... 4
Alcance del estudio ........................................................................................................ 5
Capítulo 2. Marco Teórico .................................................................................................. 6
Introducción ................................................................................................................... 6
Lactancia materna .......................................................................................................... 9
Beneficios de la lactancia .......................................................................................... 9
Desarrollo de la glándula mamaria .......................................................................... 10
VIII
Anatomía de la glándula mamaria ........................................................................... 11
Maduración de la glándula mamaria ....................................................................... 12
Cambios en el embarazo .......................................................................................... 12
Producción de leche ................................................................................................. 13
Composición de la leche .............................................................................................. 15
Células de la leche humana ..................................................................................... 16
Microbioma humano .................................................................................................... 17
Importancia de la microbiota intestinal en el recién nacido .................................... 18
Caracterización de la microbiota en la leche materna y en tracto gastrointestinal
infantil ...................................................................................................................... 20
Efecto de intervenciones maternas en la microbiota materna y neonatal ................ 22
Microbiota del tracto digestivo adulto ..................................................................... 23
Microbiota del canal vaginal ................................................................................... 24
Microbiota oral materna .......................................................................................... 24
Microbiota del líquido amniótico ............................................................................ 24
Microbiota en meconio ............................................................................................ 25
Microbiota en placenta ............................................................................................ 25
Caracterización de la Diabetes mellitus gestacional .................................................... 26
Metabolismo de la glucosa ...................................................................................... 27
Clasificación ............................................................................................................ 28
Diagnóstico .............................................................................................................. 29
El impacto de la diabetes materna en el neonato ..................................................... 30
Efecto de la diabetes mellitus en el microbioma .......................................................... 34
Capítulo 3. Metodología ................................................................................................... 36
IX
Diseño del Estudio: ...................................................................................................... 36
Participantes: ................................................................................................................ 36
Tamaño de muestra ...................................................................................................... 37
Entorno: ........................................................................................................................ 38
Periodo del Estudio: ..................................................................................................... 38
Factores ambientales por controlar: ............................................................................. 38
Inclusión: ................................................................................................................. 38
Exclusión: ................................................................................................................ 38
Eliminación:............................................................................................................. 39
Variables: ..................................................................................................................... 40
Variables Cuantitativas ............................................................................................ 40
Variables Cualitativas .............................................................................................. 40
Definición operacional de las variables ................................................................... 40
Muestras Biológicas ..................................................................................................... 42
Etiquetado de las muestras ...................................................................................... 42
Reclutamiento y recolección de las muestras .......................................................... 43
Métodos de conservación y traslado ........................................................................ 46
Organizacion ................................................................................................................ 47
Métodos analíticos: ...................................................................................................... 48
Extracción de ADN ................................................................................................. 49
Preparación de bibliotecas y Secuenciación de 16S ................................................ 49
Fuente de los datos y detalles acerca de las mediciones: ............................................. 50
Análisis estadístico ....................................................................................................... 50
Aspectos éticos y regulatorios ...................................................................................... 50
X
Fondos .......................................................................................................................... 52
Capítulo 4. Resultados ...................................................................................................... 53
Muestras eliminadas ..................................................................................................... 53
Características de la muestra estudiada ........................................................................ 54
Vía de nacimiento .................................................................................................... 55
Características de las muestras de leche ....................................................................... 56
Determinación de ADN en leche materna.................................................................... 57
Extracción de ADN ................................................................................................. 57
Contenido de ADN en las muestras ......................................................................... 58
Pureza del ADN extraído ......................................................................................... 61
Capítulo 5. Análisis y discusión de resultados .................................................................. 62
Capítulo 6. Conclusión ...................................................................................................... 66
Apéndice ........................................................................................................................... 67
Apéndice 1. Formato de recolección de datos.............................................................. 67
Apéndice 2. Formato de registro de muestras recolectadas. ........................................ 70
Apéndice 4. Carta de aprobación del comité de ética de la Escuela de Medicina ....... 84
Apéndice 5. Carta de aprobación del comité de investigación de la Escuela de
Medicina ....................................................................................................................... 85
Apéndice 6. Carta de aprobación del comité de ética e investigación del Hospital
Materno Infantil............................................................................................................ 86
Apéndice 7. Constancia de registro de protocolo ante la Secretaría de salud de Nuevo
León. ............................................................................................................................. 87
Apéndice 8. Currículum vitae único de Conacyt ......................................................... 88
Bibliografía ....................................................................................................................... 89
XI
Índice de tablas
Tabla 1 Clasificación de White modificada de las mujeres con diabetes mellitus en
embarazo. .......................................................................................................................... 29
Tabla 2 Valores de corte de prueba de tolerancia a la glucosa para diagnóstico de
diabetes durante el embarazo. .......................................................................................... 30
Tabla 3 Valores de corte de prueba de tolerancia a la glucosa para diagnóstico de
diabetes durante el embarazo. .......................................................................................... 37
Tabla 4 Definición operacional de las variables cualitativas. ......................................... 40
Tabla 5 Definición operacional de las variables cuantitativas. ....................................... 41
Tabla 6 Características de la muestra estudiada.............................................................. 54
Tabla 7 Mujeres con nacimiento vía cesárea que tuvieron trabajo de parto. .................. 55
Tabla 8 Cantidad de leche extraída en los nacimientos vía vaginal. ............................... 56
Tabla 9 Cantidad de leche extraída en los nacimientos vía cesárea. ............................... 56
Tabla 10 Concentración de ADN obtenida de las muestras ............................................. 58
Tabla 11 Relación de números en placa de gel con ID de protocolo. .............................. 60
Tabla 12 Pureza del ADN extraído, mediante espectrofotometría. .................................. 61
XII
Índice de figuras
Figura 1: Diagrama de elegibilidad .................................................................................. 53
Figura 2: Volumen de leche obtenida por grupo. ............................................................. 57
Figura 3: Fotografía del ADN en gel muestras 1 a 6........................................................ 59
Figura 4: Fotografía del ADN en gel muestras 7 a 12 ..................................................... 59
Figura 5: Fotografía del ADN en gel muestras 13 a 19 ................................................... 59
Figura 6: Fotografía del ADN en gel muestras 42 a 49.................................................... 60
Figura 7: Fotografía del ADN en gel muestras 52 a 58.................................................... 60
1
Resumen
Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes
mellitus gestacional
El estudio de la microbiota ha sido un tema de investigación candente en la última
década. A la microbiota se le atribuyen efectos en la salud y en la enfermedad. Las
bacterias de la leche materna componen hasta 40% de las bacterias intestinales del recién
nacido durante el primer mes de vida. En este estudio se estableció una cohorte de
binomios materno-neonatales con embarazos normales y complicados con diabetes
mellitus gestacional. Esta cohorte, permitirá en una segunda etapa caracterizar la
microbiota mediante secuenciación de ADN. Se recolectaron muestras de 22 binomios
que cursaron embarazo sin complicaciones para el grupo control, y 19 binomios que
cursaron con diabetes mellitus gestacional para el grupo de estudio. Previa autorización
por comités de ética e investigación de todas las instituciones relacionadas, así como de
obtención de consentimiento informado por escrito, se tomaron muestras de leche, sangre
materna, sangre fetal, placenta, líquido amniótico y meconio. Las muestras fueron
procesadas por el departamento de biotecnología del Tecnológico de Monterrey y
posteriormente enviadas a un laboratorio nacional Conacyt, para la secuenciación.En
promedio,el contenido de ADN de las muestras fue de 86 ng/µL. Se extrajo y purificó
ADN de 34 muestras, 19 del grupo control y 15 del grupo que cursó con diabetes mellitus
gesatacional. La pureza del ADN obtenido fue ideal en el 88% de las muestras, y en 4 de
ellas (12%) el cociente A260/280 y A260/230 es sugestivo de contaminación por
proteínas, fenoles y sales.
2
Capítulo 1. Planteamiento del problema
Antecedentes
Existen ciertas condiciones en la salud materna bajo las cuales se compromete el
desarrollo fetal. En México existe una alta prevalencia de mujeres con sobrepeso y
obesidad, y gran número de mujeres embarazadas con sobrepeso que desarrollan diabetes
gestacional y preeclampsia.1,2 Se ha documentado que existe una correlación directa entre
el padecimiento de estas enfermedades durante el embarazo con el desarrollo fetal y
morbimortalidad neonatal. Es importante determinar si la leche humana de madres que
padecen sobrepeso, diabetes gestacional o preeclampsia tienen una diferente
caracterización de la microbiota, la cual puede tener un impacto en la composición de la
microbiota intestinal del neonato y lactante.
Pregunta de investigación
Las condiciones maternas bajo las cuales se origina y se desarrolla un embarazo
(Variable independiente) ¿Son capaces de modificar el metagenoma de la lecha materna
temprana (Variable dependiente)?
¿Es sensible la microbiota de la leche humana temprana (VD) a las condiciones
maternas bajo las cuales se origina y desarrolla un embarazo (VI)?
¿Que efecto tiene la composición taxonómica de la microbiota de la leche materna
de madres afectadas con los padecimientos mencionados (VI) sobre la microbiota
intestinal del bebe (VD)?
Hipótesis
Dado que se trata de un estudio observacional, descriptivo y transversal, no se
establece una hipótesis a priori.
3
Objetivo general
El presente trabajo corresponde a la primera sección de un trabajo de largo
aliento, en el cual se pretende estudiar y caracterizar los elementos diferenciales de la
microbiota de la leche humana temprana de binomios madre-hijo, de la zona
metropolitana de Monterrey con diversas patologías durante el embarazo. Las patologías
estudiadas en el trabajo principal son diabetes mellitus gestacional, obesidad materna,
preeclampsia, parto pretérmino, y obesidad en parto pretérmino.
El objetivo primario de la primera sección de este trabajo, consiste entonces en
establecer una cohorte de binomios materno-neonatales, atendiendo a la representación en
la misma de las principales patologías asociadas al embarazo en nuestro país, de modo
que en etapas sucesivas de esta cohorte, se procederá al estudio y caracterización de los
elementos diferenciales de la microbiota de la leche humana temprana de binomios madre
e hijo de la zona metropolitana de Monterrey, que cursaron con alguna de esas patologías
mencionadas. En el caso de esta tesis, la patología de interés inmediato es la diabetes
gestacional, cuya importancia epidemiológica se describe posteriormente.
Objetivos secundarios
1. Se describirá el metagenoma de la leche humana temprana en las condiciones de
un embarazo a término, en madres adultas, con edad entre 18 y 34 años, con
índice de masa corporal entre 18.5 y 24.9, sin complicaciones intercurrentes y
con control prenatal adecuado.
2. Se describirá el metagenoma de la leche humana temprana en madres adultas,
con edad entre 18 y 34 años, con índice de masa corporal entre 20 y 29.9, con
4
embarazo de cualquier duración, que reúnan los criterios de Diabetes mellitus
gestacional, con control prenatal adecuado.
3. Se determinará si existe diferencia en el metagenoma obtenido, en cuanto a la
proporción de los géneros de microorganismos y la diversidad de éstos,
considerando al grupo de mujeres sanas como el grupo control.
Objetivos exploratorios
1. Se caracterizará la microbiota intestinal de los neonatos pertenecientes a los
binomios estudiados.
2. Se caracterizará la microbiota del tejido placentario de los binomios estudiados.
3. Se caracterizará la microbiota de líquido amniótico de los binomios estudiados
que tuvieron nacimiento mediante cesárea.
4. Se compararán los hallazgos entre las diferentes muestras biológicas.
Justificación
No existen al momento de realizar este trabajo, estudios en los cuales se haya
descrito la microbiota de la leche materna en mujeres que cursaron con diabetes mellitus
gestacional. Solo existe un trabajo de caracterización de microbiota en leche materna de
mujeres mexicana, realizado por Amezcua y cols.3 En el estudio de Amezcua únicamente
se identificaron microorganismos del tipo Lactobacillus, debido a la tecnología utilizada,
que no ofrecía posibilidades más allá del cultivo de organismos ya conocidos, lo que deja
abierta la posibilidad de no haber incluido todos los organismos no cultivables.
El presente estudio pretende determinar los componentes taxonómicos
diferenciales de binomios madre-hijo de la microbiota de la leche materna de madres con
5
diabetes gestacional y de la microbiota intestinal de sus hijos, con respecto a un grupo
control de binomios sanos.
Alcance del estudio
Este trabajo se lleva a cabo en un hospital regional, que atiende a mujeres de la
zona metropolitana de Monterrey y el resto de los municipios de Nuevo León, por lo que
tiene una limitación geográfica a esa región. Los hallazgos no se pueden extrapolar a la
población que se encuentra fuera del área descrita. Una de las principales fortalezas del
estudio, es la cantidad de pacientes que se recolectan, además de ser el primer estudio de
caracterización de la microbiota de la leche materna mediante técnicas de secuenciación
de Ácido desoxirribonucleico (ADN) realizado en mujeres mexicanas. Debido a que es de
los primeros estudios de su tipo, se trata de un estudio exploratorio, transversal y
descriptivo. Tendrá la capacidad de originar nuevas hipótesis y preguntas de
investigación a partir de los resultados obtenidos. Se identifica un área de oportunidad en
la posibilidad de dar seguimiento a los sujetos recolectados, y realizar análisis de la
microbiota de manera longitudinal, para ver las características de la microbiota a través
del tiempo. Convirtiéndose de esta manera en un estudio longitudinal.
6
Capítulo 2. Marco Teórico
Introducción
Tradicionalmente, se consideraba que el feto humano sano se desarrollaba dentro
de un ambiente libre de bacterias, y al nacimiento, se expone a una amplia variedad de
microbios, muchos de los cuales son provistos por la madre durante y después del pasaje
a través del canal de parto, un ecosistema ricamente colonizado por una variedad
relativamente limitada de categorías taxonómicas bacterianas.4,5
Este concepto ha sido recientemente retado por Aagaard y colaboradores, quienes
han demostrado que, en placentas de embarazos considerados sanos, se alberga un
microbioma consistentemente diferente del de otras partes del cuerpo, limitado en
variedad, pero muy rico en actividad metabólica, con un perfil semejante al de la
microbiota oral. En condiciones específicas, la microbiota de la placenta guarda una
fuerte asociación en cuanto a su composición con antecedentes de infección urinaria
materna en el primer trimestre del embarazo y nacimiento pretermino.6
Los neonatos a término desarrollan tolerancia inmunológica generada a través de
la inducción materna preferencial de células T reguladoras,7 que favorecerían la
colonización neonatal por el inóculo de microorganismos presentes en su medio.
Solamente una fracción de los microbios a los que el neonato es expuesto inicialmente
colonizan permanentemente los nichos disponibles y contribuyen a la microbiota
distintiva alojada en el cuerpo del individuo adulto. 8–11 Se sabe también que,
independientemente de la vía de nacimiento, las comunidades bacterianas que alojan los
bebés son muy semejantes entre los diferentes sitios de su organismo, a diferencia del
individuo adulto, que alberga diferentes tipos de organismos en diferentes sitios de su
7
cuerpo. Se ha descrito que los bebés nacidos por vía vaginal se colonizan preferentemente
por organismos semejantes a la microbiota del canal vaginal materno, dominados por
Lactobacillus, Prevotella, o Sneathia spp. Los recién nacidos mediante cesárea alojan
comunidades bacterianas semejantes a las de la piel de sus madres, dominadas por
Staphylococcus, Corynebacterium, y Propionibacterium spp. Estos hallazgos establecen
un fundamento para el estudio y rastreo del desarrollo del microbioma en relación a la vía
de nacimiento.12
La leche humana contiene una serie de componentes de los que carecen las
fórmulas, entre los cuales se incluyen inmunoglobulinas, citocinas, factores de
crecimiento, lisozima, lactoferrina y oligosacáridos de la leche humana (HMO por sus
siglas en inglés). Los HMO son carbohidratos especialmente abundantes en la leche
humana, con función similar a los prebióticos, estimulan el crecimiento de
Bifidobacterium spp y quizá de Lactobacillus spp de tal modo que alteran la composición
microbiana del intestino del neonato y lactante. Se han descrito más de 200 HMO, la
mayoría contienen un núcleo de lactosa, modificado covalentemente por fucosilacion y/o
sialilacion. Algunos HMO comparten dominios estructurales de glicanos, los cuales se
cree que funcionan como señuelos que previenen la adhesión de patógenos a los
enterocitos. En neonatos alimentados predominantemente con fórmula, se ha reportado
mayor proporción de colonización por Clostridium, particularmente C. difficile.13–23
En recién nacidos pretérmino, los estudios acerca de la microbiota se han
enfocado principalmente a conocer los cambios asociados a condiciones con alta
morbilidad, como la enterocolitis necrosante, en los cuales se reporta que hay una
reducción en la diversidad microbiana intestinal, comparando con neonatos pretérmino no
8
enfermos,24 mientras que otros estudios han reportado una proporción más abundante de
Proteobacteria, incluyendo Citrobacter spp.25
Muy poco se sabe acerca de este proceso de establecimiento del microbioma en
otras condiciones perinatales que son relativamente más frecuentes en la práctica clínica,
entre ellas, el embarazo complicado por sobrepeso-obesidad materna, los estados de
diabetes gestacional, la preeclampsia, y especialmente, las diferencias entre la población
de neonatos a término y pretérmino tardío en estas condiciones, las cuales son el foco de
atención de este estudio.
9
Lactancia materna
Según el Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF), a nivel
mundial el 38% de los niños menores de 6 meses que viven en países en vías de
desarrollo reciben lactancia materna exclusiva. En México la lactancia materna es menor
a lo que recomienda la OMS, y desciende rápidamente con la edad del niño. Actualmente
la duración promedio de alimentación al pecho materno en México es de 10 meses, sin
embargo, solo 14% de las madres que dan pecho materno lo realizan de forma
exclusiva.26
Beneficios de la lactancia
Según datos del UNICEF, si todos los niños se alimentaran con leche materna
desde la primera hora de vida, de manera exclusiva hasta los 6 meses de vida, y
continuaran hasta los dos años, se evitarían 800 mil muertes infantiles cada año.27
La leche materna tiene beneficios demostrados en lo que corresponde a nutrición,
función gastrointestinal, sistema inmune, y bienestar psicológico. Varios de los
componentes de ésta, estimulan el desarrollo gastrointestinal y la motilidad, favoreciendo
la maduración del tracto gastrointestinal. Tiene además factores protectores para
disminuir el riesgo de enterocolitis necrosante y otras infecciones.28
La leche materna tiene función antimicrobial, ya que posee agentes
antimicrobianos que persisten incluso después de la lactancia. Estos agentes resisten a las
enzimas digestivas, y actúan como barrera a nivel de mucosas. Se componen de
proteínas: lactoferrina, Inmunoglobulina A (IgA) y lisozimas. Contiene lípidos, tales
como ácidos grasos libres y monoglicéridos, que actúan lisando virus, bacterias y
10
protozoarios.29 Los hidratos de carbono que contiene son oligosacáridos y glicoproteínas.
Éstos se encargan de favorecer la colonización intestinal por Bifidobacteria y
Lactobacillus.
Comparada con la fórmula, se ha demostrado que la leche materna incrementa la
velocidad de vaciamiento gástrico. Tiene beneficios específicos para los recién nacidos
prematuros, como incremento de la actividad de lactasa intestinal, disminución de la
permeabilidad intestinal, y disminución del riesgo de enterocolitis necrosante (ECN). El
efecto final de todas estas sustancias es que la leche materna, comparada contra la
fórmula, disminuye el riesgo de enfermedades mientras el lactante sea alimentado con
ésta.30 En países en vías de desarrollo la morbimortalidad es menor en los lactantes
alimentados al seno materno.31
Desarrollo de la glándula mamaria
La glándula mamaria del humano es el único órgano que no contiene todos sus
tejidos rudimentarios desde el nacimiento.32 Experimenta cambios importantes a través de
la vida de la mujer, desde la menarca, embarazo, lactancia y finalmente la involución.
El esbozo mamario aparece en la cuarta semana de gestación, cuando el embrión
mide apenas 2.5 milímetros (mm) de longitud. Posteriormente se convierte en la línea
mamaria en la quinta semana del embarazo y a las seis semanas, comienza su desarrollo
como glándula. Los conductos mamarios proliferan durante todo el desarrollo
embrionario. El pezón se forma a partir de la capa de ectodermo. A las 16 semanas de
gestación, la fase de ramificación ha producido entre 15 a 25 líneas epiteliales que se
convertirán en los alveolos secretores. A las 28 semanas de gestación las hormonas
11
placentarias entran a la circulación fetal e inducen la canalización del tejido mamario
fetal. Los conductos lactíferos y sus ramas se desarrollan de la excrecencia hacia el
lumen. Al término del embarazo ya existen entre 4 y 18 conductos mamarios que forman
la glándula mamaria.
Anatomía de la glándula mamaria
La glándula mamaria madura se localiza en la fascia superficial, entre la segunda
y sexta costillas y superficial al músculo pectoralis. Mide de 10 a 12 centímetros (cm) de
diámetro. El grosor central de la glándula es de 5 a 7 cm. En la fase no gestante tiene un
peso de aproximadamente 200 gramos, durante el embarazo aumenta a 400-600 gramos y
en la lactancia hasta 800 gramos.32
La piel de la glándula contiene el pezón y la areola. La piel que recubre la
glándula es delgada, flexible y elástica. El pezón es una elevación cónica en el centro de
la areola. Contiene fibras de músculo liso y es altamente rico en terminaciones sensitivas
y fibras de dolor. Tiene una superficie verrugosa y glándulas sebáceas y apócrinas, pero
no cabello. En la superficie de la areola se encuentran las glándulas de Montgomery, las
cuales sufren hipertrofia durante el embarazo y la lactancia. Las glándulas de
Montgomery son responsables de secretar un material seboso, que permite lubricar el
pezón y la areola mientras el bebé succiona. Cada pezón contiene entre 4 y 18 conductos
lactíferos, de los cuales 5 a 8 son conductos principales.33 Estos conductos terminan como
orificios pequeños en la punta del pezón, a través de los cuales sale la leche.
La sangre que llega a la glándula mamaria recibe irrigación de sangre a partir de
ramas de las arterias intercostales y ramas perforantes de la arteria torácica interna. La
12
fuente principal de sangre proviene de la arteria mamaria interna y de la arteria torácica
lateral. El drenaje linfático principal llega a los ganglios axilares y paraesternales,
siguiendo el trayecto de la arteria torácica.
Maduración de la glándula mamaria
Con el comienzo de la pubertad, hay un nuevo crecimiento de la glándula
mamaria, y agrandamiento del pezón, así como también hiper-pigmentación de éste. El
desarrollo que comienza en esta etapa de la vida se divide en dos procesos diferentes:
organogénesis y producción de leche. Se le llama organogénesis al crecimiento ductal y
lobular. Inicia en la pubertad y continúa a través de ésta. Se caracteriza por crecimiento
del parénquima del seno, y aumento de la grasa acompañante. Durante los ciclos
menstruales, continúa existiendo una proliferación microscópica y regresión del tejido
ductal. La glándula mamaria continúa creciendo lentamente, hasta los 28 años, a menos
que el embarazo interrumpa este proceso.
Cambios en el embarazo
Durante el primer trimestre ocurre un rápido crecimiento y ramificación del
sistema ductal terminal gracias a las hormonas circulantes. Hay una infiltración cada vez
mayor del tejido intersticial con linfáticos, células plasmáticas y eosinófilos. En el tercer
trimestre, el crecimiento celular disminuye y los alveolos se empiezan a llenar de
calostro.32
13
Producción de leche
La lactancia se considera fisiológicamente como la finalización del ciclo
reproductivo. El ser humano se encuentra entre los mamíferos mas inmaduros y
dependientes al momento del nacimiento. La leche materna brinda los nutrientes más
apropiados para el recién nacido. Durante el embarazo, la glándula mamaria tuvo una
preparación para poder aportar los nutrientes al lactante. A partir de la semana 16, la
glándula mamaria se encuentra en condiciones para llevar a cabo una lactancia completa.
El control hormonal de la lactancia se puede describir con cinco procesos en la
glándula mamaria. En orden cronológico, estos procesos son: embriogénesis,
mamogénesis, crecimiento mamario, lactogénesis (iniciación de la secreción), lactancia
(secreción completa) e involución.32
La lactogénesis tiene dos etapas. La etapa I de lactogénesis se lleva a cabo durante
el embarazo y finaliza cuando la glándula está lo suficientemente diferenciada para
secretar leche. Las concentraciones elevadas de progesterona evitan que ocurra secreción
de leche antes de tiempo. La etapa II de lactogénesis consiste en el inicio de secreción
copiosa de leche, que ocurre posterior al parto y alumbramiento de la placenta. Los
niveles de progesterona disminuyen abruptamente en los primeros 4 días por un factor de
hasta 10 veces menos.34
Durante el embarazo las hormonas progesterona, prolactina y posiblemente
lactógeno placentario son las responsables del desarrollo del alveolo. La progesterona es
la hormona principal que inhibe la producción de leche. Durante el embarazo los niveles
de prolactina se mantienen superiores a 200 ng/mL. Los niveles de prolactina elevados de
manera sostenida, y el descenso de la progesterona son necesarios para el comienzo de la
14
etapa II de lactogénesis. La placenta es la fuente principal de progesterona durante el
embarazo, y al alumbrar la placenta, los niveles de progesterona bajan súbitamente.
Aproximadamente a las 36 horas posparto en multíparas y las 72 horas en primíparas,
ocurre un incremento de diez veces del volumen de leche producido, el cual aumenta de
50 a 500 mL al día. A este aumento se le conoce como la “bajada de leche”.
Además de la prolactina, la insulina y los glucocorticoides son esenciales para la
síntesis de leche. En mujeres que cursan con retención de placenta, operación cesárea,
diabetes o estrés durante el nacimiento se ha observado lactogénesis retrasada.35 En las
mujeres con diabetes durante el embarazo, son varios los factores que contribuyen a una
lactogénesis retrasada, entre ellos se incluyen: obesidad previa al embarazo, edad materna
avanzada, y uso de insulina.36 Cuando la extracción de leche no comienza en las primeras
72 horas, los cambios en la composición de la leche asociados con la lactogénesis ocurren
de forma reversa, y la probabilidad de que exista una lactancia exitosa disminuye.37
Las características principales de la leche inicial son concentraciones iniciales
elevadas de sodio, cloruro, inmunoglobulinas y lactoferrina, con poca lactosa y nula
caseína. En el primer día se puede llegar a producir hasta 100 mililitros de leche y para el
día 5, ya se producen entre 500 y 750 mililitros de leche. Este aumento del volumen de
leche es acompañado de una disminución en la concentración de sodio y cloruro en la
leche, así como un incremento en la lactosa. Los cambios en las características de la leche
durante la lactancia ocurren gracias a los cambios en la permeabilidad de las vías
paracelulares. La producción de lactosa es la que determina la producción de leche.
15
Composición de la leche
La leche humana es un fluido nutricional altamente específico de especie.
Contiene componentes como grasas, proteínas, lactosa y otros micronutrientes. El
contenido de grasa en la leche materna constituye un 50 a 60% de sus calorías. En
promedio hay 41 gramos de grasa por cada litro de leche (g/L), sin embargo, la
variabilidad entre madres es alta, pudiendo ser desde 22 g/L hasta 62 g/L. El glóbulo de
grasa esta compuesto por un núcleo de triglicéridos y una membrana de fosfolípidos,
colesterol, glicolípidos, proteínas y glicoproteínas. Los triglicéridos del núcleo son de
cadena corta, media y larga, incluyendo los ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados
(LCPUFA por sus siglas en inglés), entre los cuales destacan omega-3, ácido
docosahexaenoico, omega-6 y ácido araquidónico. La composición total de grasa es
independiente de la dieta materna, sin embargo, la calidad de la alimentación si influye en
la concentración de LCPUFA en la leche.38
El contenido de proteínas de la leche varía según la etapa de lactancia, con niveles
de hasta 15.8 g/L al comienzo de la lactancia y posteriormente disminuye hasta 6.9 g/L en
la leche madura. El contenido de proteínas en la leche materna es bajo, sin embargo, éstas
tienen una alta biodisponibilidad para el lactante.
La lactosa es el carbohidrato principal en la leche humana, aportando hasta un
40% de la energía contenida. Inicialmente la lactosa se encuentra en concentraciones
bajas de 19 g/L, y después de la activación secretora y bajada de leche, incrementa hasta
54 g/L. Los oligosacáridos de la leche humana (HMO) son el tercer componente mas
abundante de la leche. A comparación de la lactosa, su concentración es la más elevada
en el calostro, hasta 25 g/L y disminuye hasta 5 g/L en la leche madura. Existen más de
16
200 oligosacáridos de la leche humana y cada mujer puede llegar a tener entre 23 y 130
HMO diferentes. Estos oligosacáridos pueden actuar como prebióticos, es decir facilitan
un medio para el desarrollo de la microbiota en la leche materna.38
Recientemente se han descrito otros prebióticos diferentes a los HMO, entre los
cuales destacan: fructo-oligosacáridos, galacto-oligosacáridos, manano-oligosacáridos, y
xylo-oligosacáridos. Se propone que el mecanismo por el cual los prebióticos brindan un
beneficio al huésped, es creando un medio óptimo para el desarrollo de microbiota
benéfica. Entre los microorganismos que se han relacionado a los oligosacáridos
anteriores se encuentran las bifidobacterias, los bacteroidetes y los lactobacilos. Los
efectos descritos principalmente son inmunológicos, desde brindar un efecto
antiinflamatorio, hasta protección contra diarrea, enterocolitis necrosante o infecciones
del tracto respiratorio.39
Células de la leche humana
Las células mas abundantes en la leche materna son las células del epitelio
luminal CK18+, y lactocitos caseína positivos, que sintetizan proteínas de la leche. Estas
células constituyen el 98% de las células contenidas en la leche. El 2% restante de las
células, incluye una variedad muy amplia de células, incluyendo leucocitos y células
progenitoras, que se han designado células progenitoras de la leche materna humana
(hMmSCs por sus siglas en inglés).40
El calostro contiene hasta 146,000 células por mililitro (mL), las cuales
disminuyen a 27,500 células/mL en la leche de transición y 23,650 células/mL en la leche
17
madura. Los leucocitos constituyen hasta el 20% de las células del calostro, mientras que
en la leche madura son menos del 2% de las células.41
Estudios recientes han encontrado que la leche materna contiene células maternas
del sistema inmune, así como una variedad de otras células. Algunos tipos de células son
capaces de viajar desde la leche, a través del tracto gastrointestinal del bebé, y llegar a
sitios lejanos, como el bazo, el hígado y los nódulos linfáticos.40
Los leucocitos llegan a la leche materna por la vía paracelular, en un proceso
llamado diapédesis. En modelos animales los leucocitos de la leche materna sobreviven el
intestino neonatal y proveen soporte inmunológico al lactante durante el periodo que
recibe alimentación con leche materna. Los leucocitos encontrados en la leche materna
incluyen, granulocitos, linfocitos y macrófagos. En el calostro, los macrófagos son los
mas abundantes, alcanzando un 50% de los leucocitos totales. En segundo lugar, se
encuentran los neutrófilos con un 40% y finalmente los linfocitos en un 5 a 10%. Tanto
en calostro como en leche madura, la mayoría de los linfocitos corresponden a células T y
únicamente un 6% de los linfocitos son células B.38
Microbioma humano
Uno de los proyectos mas grandes de caracterizacion del microbioma humano es
el del Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (NIH), en el cual han descrito
una cohorte de 242 adultos, en quienes se ha caracterizado la microbiota de cavidad oral,
piel, tracto gastrointestinal y canal vaginal, este último en mujeres, mediante análisis de
la subunidad 16S y Whole genome shotgun.42
18
El microbioma humano es una colección de bacterias, arqueas, hongos, y virus,
todos residiendo dentro del cuerpo humano, incluyendo su material genético.43 La
microbiota se refiere a la población microbiana presente en los diferentes ecosistemas del
cuerpo.44
Importancia de la microbiota intestinal en el recién nacido
Las bacterias de la leche materna componen hasta un 40% de las bacterias
intestinales del recién nacido durante el primer mes de vida, cuando son alimentados
mayoritariamente con leche materna.45 Estudios previos sugieren que las bacterias
provenientes de la leche materna, y la piel areolar son transferidas al intestino del bebé.45
La leche materna estimula la proliferación de una microbiota balanceada y
diversa, que inicialmente favorece un cambio de un estado inmunológico predominante
Th2 a una respuesta balanceada Th1/Th2, con activación de las células T reguladoras por
medio de organismos específicos en la leche materna (Bifidobacteria, Lactobacillus y
Bacteroides).46 Un ejemplo de este efecto, es la fermentación de oligosacáridos por
medio de bacterias colónicas, las cuales producen un medio ácido que favorece la
proliferación bacteriana. Otro efecto de la leche materna es la activación por medio de
ácidos grasos de cadena corta, de los receptores en las células T reguladoras y genes
bacterianos que actúan como anti-inflamatorias y mediadores de la expresión de las
uniones intestinales respectivamente.46
Las bacterias que colonizan el organismo pueden actuar como un órgano auxiliar
del cuerpo humano. Existen hasta diez veces mas bacterias en el intestino, que células
eucariotas en el cuerpo humano y hasta 100 veces mas genes bacterianos que genes
19
humanos en el cuerpo humano.47 Al contenido genético diferente al del humano se le
conoce como metagenoma. Las microbiota intestinal es metabólicamente mas activa que
el hígado humano. Se considera que este órgano auxiliar, es esencial para el adecuado
funcionamiento y desarrollo del sistema gastrointestinal, especialmente en el recién
nacido, quien apenas se está adaptando al medio extrauterino.
Las bacterias comensales tienen un papel esencial en el desarrollo del intestino.
Estas bacterias, estimulan a los elementos linfoides del intestino. Otra función que llevan
a cabo es la de promover el desarrollo de microvellosidades que forman la barrera
mucosa del epitelio intestinal. Activan también la liberación de mucina de las células
caliciformes epiteliales, para formar una barrera antibacterial con el glicocalix.
Las bacterias comensales pueden afectar el desarrollo del sistema inmune innato y
también el adaptativo. El recién nacido tiene un predominio de TH2 para conferir
protección de un rechazo intrauterino. Se requiere de la colonización bacteriana para
favorecer una respuesta balanceada de células T cooperadoras y preparase para la
inmunidad adaptatva.46
Se ha descrito recientemente un incremento en enfermedades inmunológicas y una
disminución en las enfermedades infecciosas en el último siglo. Este cambio se explica
por la hipótesis de la higiene, el cual implica el estilo de vida occidental, acompañado de
una colonización bacteriana interrumpida.
En estudios recientes se ha sugerido que bacterias específicas pueden contribuir al
desarrollo de tolerancia. Estas observaciones son especialmente relevantes, ya que
muchas de estas bacterias están aumentadas en las primeras etapas de colonización en
lactantes alimentados al seno materno. Un ejemplo es el polisacárido A, un carbohidrato
20
de superficie de Bacteroides fragilis, que puede interactuar con el receptor Toll tipo 2
(TLR-2), para posteriormente facilitar la proliferación de células T reguladoras.47 De
manera similar, algunas especies de Clostridium, han demostrado incremento en las
células T reguladoras y protección contra enfermedades mediadas por Inmunoglobulina E
(IgE).48 La protección que confiere la leche materna parece ser mediada principalmente
gracias a la colonización bacteriana.
Caracterización de la microbiota en la leche materna y en tracto gastrointestinal infantil
La leche materna contiene bacterias, arqueas, virus y células eucariotas. El ADN
bacteriano constituye entre el 91 a 98% de los dominios microbianos en la leche materna,
mientras que las arqueas constituyen menos de 0.2%, los virus 0.8 a 8% y las células
eucariotas con ADN diferente al humano entre 1 y 4 %.49
Estudios previos han descrito que las comunidades bacterianas encontradas en
binomios madre e hijo pertenecen de manera predominante a las divisiones de
Proteobacteria en leche materna (Moraxellaceae, Enterobacteriaceae, y
Pseudomonadaceae), Firmicutes en la piel areolar (Staphylococcaceae y
Streptococcaceae), y Proteobacterias (Enterobacteriaceae) y Actinobacterias
(Bifidobacteriaceae) en las heces de los lactantes.45
En una revisión sistemática de la microbiota en la leche materna de mujeres sanas,
se reporta presencia de Streptococcus y Staphylococcus como los géneros predominantes
en el 50% de los estudios, seguido de Bifidobacterium en un 25% de ellos y Lactobacillus
el predominante un 17% de las veces. Estas diferencias dependen del tipo de tecnología
utilizada para la detección. Usando el método de PCR, Streptococcus y Staphylococcus
21
fueron los predominantes en 25% de los estudios y Bifidobacterium en el 38%. Cuando
se utilizó técnica de secuenciación de nueva generación se encontró a Streptococcus y
Staphylococcus como los géneros predominantes en el 100% de los estudios.50
Se han descrito bacterias en los filo Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, y
Bacteroidetes. En los Firmicutes se encuentran: Staphylococcus, Streptococcus,
Veillonella, Gemella, Enterococcus, Clostridia, y Lactobacillus. El filo Actinobacteria
incluye a: Bifidobacterium Propionibacterium, Actinomyces, y Corynebacterium. Las
Proteobacterias están compuestas por los géneros: Pseudomonas, Sphingomonas,
Serratia, Escherichia, Enterobacter, Ralstonia, Shigella, Klebsiella y Bradyrhizobium. El
género Prevotella pertenece al filo de los Bacteroidetes.51,52
Un determinante esencial para la colonización bacteriana intestinal es la leche
materna.46 Desde hace mas de 40 años, se conoce que la lactancia materna,
particularmente durante las primeras semanas de vida, puede estimular la proliferación de
varias cepas de bifidobacterias. Desde 1983 se reportan estudios usando técnicas estándar
de cultivos, en donde se compara la microbiota de lactantes alimentados con seno
materno y lactantes alimentados con fórmula. Durante las primeras tres semanas, los
lactantes alimentados al seno materno presentaron un aumento importante en
bifidobacterias y lactobacilos, comparado con los de fórmula, quienes tuvieron una
microbiota más madura, caracterizada por enterobacterias y enterococos.53 Parte del
efecto “bifidogenico” de la leche materna se atribuye a los ácidos grasos de cadena corta
y al potencial de hidrógeno (pH) ligeramente ácido de 5.0 comparado con la fórmula que
tiene un pH neutro de 7.1. En otros estudios se ha atribuido la proliferación de
bifidobacterias a la presencia de HMO, los cuales constituyen aproximadamente el 8%
22
del total de nutrientes de la leche materna. Los HMO, pasan sin digerir a través del
intestino delgado y llegan al colon, en donde son fermentados por la microbiota
endógena.54 El término prebiótico se ha utilizado para describir el efecto estimulador que
tienen los oligosacáridos sobre las bacterias.
En estudios recientes se ha descrito que la microbiota intestinal esta dominada por
tres grupos de bacterias, Flexibacter-Cytophaga-Bacteroides, proteobacteria y bacterias
Gram-positivas (Firmicutes y Actinobacteria).10 Las poblaciones microbianas intestinales
parecen comportarse de manera estable, es decir, los grupos taxonómicos que colonizan
inicialmente el tracto gastrointestinal se mantienen durante semanas a meses. La
población bacteriana que se desarrolla en etapas tempranas esta determinada hasta cierto
punto por las bacterias a las cuales está expuesto el organismo.10
Efecto de intervenciones maternas en la microbiota materna y neonatal
La vía de nacimiento, así como también la exposición a antibióticos intraparto,
tienen un impacto independiente en la microbiota de la leche materna durante el primer
mes después del nacimiento.55 Se ha sugerido que el trabajo de parto pueda aumentar la
permeabilidad intestinal, con la consiguiente translocación bacteriana y posterior
transferencia de bacterias del intestino materno a la leche materna De acuerdo con un
estudio realizado por Azad y colaboradores, el uso de antibióticos profilácticos intraparto
están asociados con alteraciones significativas de la microbiota intestinal de los lactantes
a los 3 y 12 meses, comparados con lactantes que no estuvieron expuestos.56
Akagawa y colaboradores describieron que los recién nacidos vía vaginal tuvieron
una microbiota diferente a los recién nacidos por vía cesárea. Se encontró mayor
23
proporción de Bacteroidales, Lactobacillales y Enterobacteriales en el tracto
gastrointestinal de bebés nacidos por vía vaginal comparados con cesárea. Así mismo se
describe que en los nacidos por cesárea hubo una mayor proporción de Bacillales. En las
familias de Bifidobacteriales, Actinomycetales y Clostridiales no se encuentran
diferencias.57
Los factores maternos que afectan la microbiota de la leche materna son obesidad
materna, la dieta, antecedentes de atopia y el estado inmunológico materno. Los factores
pre y posnatales que afectan a la microbiota de la leche materna son la edad gestacional,
la vía de nacimiento, el uso materno de antibióticos y la etapa de la lactancia en que se
encuentre la madre.51
Microbiota del tracto digestivo adulto
Los mayores cambios que ocurren durante el embarazo en la microbiota intestinal,
incluyen un aumento en la carga bacteriana, así como alteraciones en la variedad de
microorganismos, sobre todo en las etapas finales del embarazo.
En el primer trimestre las mujeres embarazadas tienen una microbiota similar a
los controles sanos. En el tercer trimestre ya hay una diferencia importante de las mujeres
embarazadas y los controles. Las mujeres embarazadas tienen una abundancia de
Actinobacterias y Proteobacterias en la mayoría de las muestras de tercer trimestre. Se
describe además disminución en la abundancia de Faecalibacterium y otros productores
de ácidos grasos de cadena corta en tercer trimestre.
Para el tercer trimestre, la microbiota de cada mujer diverge de una manera
impredecible de la caracterización del primer trimestre. El hallazgo más comúnmente
24
observado al final del embarazo fue abundancia de Proteobacterias, las cuales se han
descrito en otros estudios como asociadas a disbiosis y estados inflamatorios. 58
Microbiota del canal vaginal
El microbioma vaginal presenta cambios en su composición, caracterizado por
una diversidad disminuida significativamente, mayor estabilidad y mayor número de
especies Lactobacillus.59
Microbiota oral materna
Los cambios principales en la microbiota oral durante el embarazo incluyen una
mayor carga microbiana, niveles mayores de las bacterias patógenas, Porphyromonas
gingivalis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, y Cándida.60
Microbiota del líquido amniótico
Se ha estudiado poco el microbioma del líquido amniótico. Aún existe debate
sobre el momento en el cual el intestino neonatal comienza a adquirir bacterias
comensales, sin embargo estudios recientes han demostrado mediante secuenciación de la
subunidad 16S de ARN ribosomal (ARNr), que los perfiles bacterianos del líquido
amniótico y del meconio son similares.61 En un estudio realizado por Baldwin y
colaboradores, se encontró que en las mujeres con ruptura prematura prolongada de
membranas, la composición bacteriana se alteraba de manera importante con el uso de
antibióticos y con la duración de éstos. En caso de existir una conexión entre el
microbioma del líquido amniótico y el del recién nacido, muy posiblemente los
25
antibióticos prenatales en la madre jueguen un papel importante en el desarrollo de la
microbiota intestinal neonatal.62
Microbiota en meconio
Algunos estudios han identificado secuencias bacterianas de ADN en muestras de
meconio, lo cual apoya la teoría de un origen intrauterino del microbioma.25 En neonatos
alimentados con leche materna, la microbiota en meconio tiene un predominio de
Bifidobacteria spp, y Enterobacteria spp, mientras que en los neonatos alimentados con
fórmula se describe la presencia de Bifidobacteria, E. coli, C. difficile, Bacteroides spp,
Prevotella spp, y Lactobacillus spp.63
Microbiota en placenta
Son pocos los estudios que han estudiado la presencia de microorganismos en la
placenta. Aagaard y colaboradores estudiaron muestras de placenta mediante
secuenciación de genoma completo en escopeta (Whole-genome shotgun) y análisis de
ADN ribosomal (ADNr) de las subunidades 16S. Se caracterizó la microbiota de la
placenta mayoritariamente por bacterias comensales no patogénicas, de las phyla
Firmicutes, Tenericutes, Proteobacteria, Bacteroidetes, y Fusobacteria. Así mismo se
encontró asociación entre el microbioma placentario con infecciones de vías urinarias que
habían ocurrido de manera muy temprana, en primer trimestre.6
26
Caracterización de la Diabetes mellitus gestacional
La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad metabólica que se caracteriza por
ausencia parcial o completa del efecto de la insulina en el organismo, lo cual tiene como
resultado elevación de las concentraciones séricas de glucosa. Es la alteración metabólica
más común en mujeres embarazadas.
Las mujeres en quienes se detecta intolerancia a la glucosa por primera vez
durante el embarazo se clasifican con diabetes mellitus gestacional. La diabetes mellitus
gestacional (DMG), es el tipo de diabetes mas común detectado en el embarazo y la
frecuencia de ésta, está aumentando en todo el mundo.64
La DMG representa una falta de adaptación a los cambios fisiológicos normales
que ocurren durante el embarazo. En etapas tempranas del embarazo se asocian a
incremento de las reservas de grasa se incrementan y disminuyen los ácidos grasos libres.
Conforme avanza la gestación, la sensibilidad a la insulina disminuye en hígado y en
tejidos periféricos, como respuesta a las hormonas maternas. Las hormonas responsables
de la disminución en la sensibilidad a insulina son: lactógeno placentario humano,
progesterona, estrógeno, cortisol, prolactina y factor de necrosis tumoral alfa. Este
cambio metabólico tiene como función incrementar los niveles de glucosa, para así suplir
las necesidades nutricionales del feto. Normalmente la disminución de la sensibilidad a la
insulina causa un incremento en la insulina materna, sin embargo, en la DMG, este
incremento no es adecuado y se manifiesta como hiperglicemia. El diagnóstico se realiza
mas comúnmente entre las semanas 24 a 28 de gestación, que se han establecido como las
fechas de tamizaje de rutina para diabetes gestacional.
27
Se ha observado un incremento en la prevalencia de diabetes durante el embarazo
en los últimos 20 años.65 Se espera que para el 2050 se incremente otro 165% la
incidencia de este problema.66 En Estados Unidos, hasta el 7% de los embarazos cursan
con diabetes mellitus, mientras que en México la cifra es de hasta 17%.67 Los factores de
riesgo principales para desarrollar diabetes mellitus gestacional son un alto índice de
masa corporal (IMC) o un peso materno menor al percentil 15.
Metabolismo de la glucosa
El embarazo se considera un estado diabetógeno en el cual aumentan los niveles
postprandiales de glucosa, además existe una mayor respuesta a la insulina al final del
embarazo. En la etapa temprana del embarazo, se considera metabólicamente que existe
un estado anabólico, ya que aumentan las reservas maternas de grasa y disminuye la
concentración de ácidos grasos libres (AGL).68 Al comienzo del embarazo se observa una
disminución de los requerimientos de insulina, la cual puede ser consecuencia de un
aumento transitorio en la sensibilidad a la insulina, sobre todo en mujeres con
sensibilidad disminuida. Durante el embarazo existe un aumento del 30% en la
producción hepática de glucosa en ayuno, según avanza el embarazo.69
La concentración fetal de glucosa depende del tamaño del feto y de la edad
gestacional, además de la concentración materna de glucosa.70 Hay y colaboradores,
describieron en un modelo de oveja, que el tejido uterino, placentario y fetal, utilizan la
tercera parte de la glucosa materna.71 El principal transportador de glucosa en la placenta
es el GLUT1, ubicado en el sincitiotrofoblasto72. El GLUT1 se encuentra en las
microvellosidades de las membranas basales. El peso placentario al nacer se ha
28
correlacionado con el peso del bebé al nacer, es decir con la masa corporal grasa y
magra.73 La implicación de éstos datos, es que el metabolismo materno al comienzo del
embarazo, así como la resistencia y la respuesta a la insulina, pueden influir en el
crecimiento y en la expresión de los genes placentarios, lo cual se observa clínicamente
como un crecimiento fetal exagerado al final del embarazo.64
Clasificación
Las formas más comunes de diabetes son la diabetes mellitus tipo 1 (DM1) y
diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Durante el embarazo pueden ocurrir todas las formas de
la diabetes, entre ellas las diabetes de causa genética como el tipo MODY. La
clasificación de la diabetes en el embarazo se describió por la Dra. White desde 1949 y
actualmente es la que se continúa utilizando. En la clasificación de White modificada, se
toma en cuenta factores como la edad de diagnóstico, la duración de la enfermedad,
afección vascular y la necesidad de tratamiento, entre otros, para clasificar a las mujeres
embarazadas con DM y de acuerdo con su categoría establecer riesgo de morbimortalidad
materno-infantil.
La DMG comparte muchas de sus características metabólicas con la DM2. De
acuerdo con la clasificación de White, la DMG se puede clasificar en las categorías A1 y
A2. Cuando el control se logra únicamente con cambios en estilo de vida y alimentación
se considera categoría de White A1. En aquellos casos en los cuales la DMG requiere
tratamiento farmacológico de cualquier tipo, se considera categoría de White A2. La
diabetes tipo 2, se considera categoría B en la escala de White.
29
Tabla 1 Clasificación de White modificada de las mujeres con diabetes mellitus en embarazo.
Categoría: Edad del comienzo de la diabetes (años)
Duración (años) Enfermedad vascular
Necesidad de insulina o de medicación oral
Diabetes gestacional A1 Cualquiera Cualquiera No No A2 Cualquiera Cualquiera No Sí
Diabetes pregestacional B Más de 20 Menos de 10 No Sí C 10 a 19 O 10 a 19 No Sí D Menos de 10 O más de 20 Sí Sí F Cualquiera Cualquiera Sí Sí R Cualquiera Cualquiera Sí Sí T Cualquiera Cualquiera Sí Sí H Cualquiera Cualquiera Sí Sí Tomado de Obstetrics: Normal and Problem Pregnancies.64
Diagnóstico
La DMG se define como una intolerancia a los hidratos de carbono de severidad
variable, que se detecta por primera vez durante el embarazo. Hasta el 50% de las
mujeres con DMG desarrollan DM2 en el transcurso de su vida.74
Las mujeres con factores de riesgo, tales como embarazo previo con DMG,
alteración en el metabolismo de los hidratos de carbono, obesidad con un IMC mayor a
30, deben realizarse prueba de escrutinio a la semana 16 de embarazo. El resto de las
mujeres se deben realizar la prueba de escrutinio entre la semana 24 y 28.74
El abordaje actualmente recomendado por el Colegio americano de obstetricia y
ginecología (ACOG por sus siglas en inglés) es en dos pasos. La prueba de tamizaje
inicial se realiza con 50 gramos de glucosa oral, y el límite se fija en 135 miligramos por
decilitro (mg/dL) una hora posterior a la ingesta. Aquellas mujeres que exceden el límite
permitido deben realizarse una segunda prueba con 75 o 100 gramos de glucosa oral, y
curva de glucosa durante dos o tres horas, respectivamente. Para considerarse positiva la
prueba, se deben registrar o más valores por encima del límite establecido. 75 La curva de
30
tolerancia oral de glucosa (CTOG) con 75 o 100 gramos, se debe realizar por la mañana,
después de un ayuno durante la noche entre 8 y 14 horas, y haber llevado una dieta sin
restricciones (más de 150 gramos de carbohidratos por día) por al menos tres días, sin
límite en la actividad física. El sujeto debe permanecer sentado y no fumar durante la
prueba.76
Tabla 2 Valores de corte de prueba de tolerancia a la glucosa para diagnóstico de diabetes durante el embarazo.
Cantidad de glucosa CTOG 2 horas CTOG 3 horas
75 gramos 100 gramos Glucosa en ayuno (minuto 0) t95 mg/dL (5.3 mmol/L) t95 mg/dL (5.3mmol/L)
Glucosa a los 60 minutos t180mg/dL (10mmol/L) t180mg/dL (10mmol/L) Glucosa a los 120 minutos t155mg/dL (8.6mmol/L) t155mg/dL (8.6 mmol/L) Glucosa a los 180 minutos No Aplica t140mg/dL (7.8 mmol/L)
Tabla con información obtenida de Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.76
El impacto de la diabetes materna en el neonato
Las mujeres con diabetes mellitus, durante el embarazo tienen una probabilidad
hasta 5 veces mayor de muerte fetal que las madres no diabéticas. Además, los fetos de
mujeres con complicaciones vasculares secundarias a la diabetes, experimentan
restricción del crecimiento fetal y muerte intrauterina, incluso en el segundo trimestre.64
La mortalidad fetal, en los embarazos complicados por diabetes, se ha relacionado
a la hipoxia intrauterina crónica.77 Un hallazgo que respalda esta hipótesis, es la
hematopoyesis extramedular encontrada frecuentemente en mortinatos, hijos de madre
con diabetes. En recién nacidos vivos, se ha encontrado en muestras de cordón
policitemia y acidemia láctica.64
Las malformaciones congénitas son la causa más común de pérdida perinatal en
los embarazos complicados con diabetes tipo 1 o 2. Actualmente las malformaciones
31
justifican el 30 al 50% de la mortalidad perinatal.64 La incidencia de malformaciones
mayores en los hijos de madre diabética, oscilan entre 7.5% a 10%.64 La exposición fetal
a la hiperglicemia materna puede provocar hiperinsulinemia en el neonato, así como
complicaciones a corto y largo plazo, entre ellas obesidad y resistencia a la insulina.78
Cuando los efectos teratogénicos de la diabetes se presentan antes de la séptima
semana de gestación, los riesgos de malformaciones mayores: anencefalia, espina bífida
abierta, y holoprosencefalia, se multiplican por diez. Las malformaciones cardíacas son
las más frecuentes en los hijos de madres con diabetes. De éstas, la comunicación
interventricular y otras lesiones cardíacas complejas se quintuplican. El defecto congénito
más característico de la embriopatía diabética es la agenesia de sacro o displasia caudal,
sin embargo, no se considera una malformación patognomónica de la diabetes.
La hiperglucemia materna se considera el factor teratógeno principal, sin
embargo, también se han considerado otras condiciones como factores teratogénicos.
Dentro de los agentes teratogénicos descritos en la diabetes gestacional, se encuentran la
hipercetonemia, hipoglucemia, exceso de inhibidor de somatomedina, exceso de radicales
libres y ausencia de ácido araquidónico.64
Macrosomía fetal.
Se ha definido según los autores como un peso mayor a 4500 gramos al nacer, así
como también aquellos recién nacidos con un peso superior al percentil 90 en las gráficas
de peso específicas para edad gestacional y sexo. Hasta un 50% de los embarazos con
diabetes gestacional, están asociados a macrosomía fetal. Comparado con mujeres sin
diabetes durante el embarazo, la incidencia de producto macrosómico es diez veces
mayor en las mujeres con diabetes durante el embarazo. Según la hipótesis de Pedersen,
32
la hiperglucemia materna origina hiperglucemia fetal, y ésta a su vez hiperinsulinemia
fetal, las cuales se consideran causante del crecimiento fetal excesivo.
Los hijos de madre con diabetes (HMD) tienen mayor tejido adiposo en
comparación con el tejido magro. El crecimiento de estos fetos es desproporcionado, y las
relaciones toracocefálica y hombro-cabeza son mayores que las de los hijos de madres sin
alteraciones en la glucosa. Estas diferencias antropométricas, pueden contribuir a la
mayor frecuencia de distocia de hombros y traumatismos obstétricos.
Hipoglucemia.
La hipoglucemia neonatal se debe a una caída brusca de la concentración
plasmática de glucosa después de pinzar el cordón umbilical. Es una consecuencia de la
hiperinsulinemia a la que se encuentra expuesto el feto y con una frecuencia de hasta el
50% en los hijos de madre con diabetes.
Síndrome de dificultad respiratoria.
La hiperglucemia y la hiperinsulinemia modifican la biosíntesis del surfactante
pulmonar. La insulina puede interferir en la cronología normal de maduración pulmonar.
La insulina bloquea la acción del cortisol en los fibroblastos y reduce la producción del
factor fibroblástico-neumocítico.
Otras alteraciones metabólicas.
Los hijos de madre con diabetes presentan una mayor frecuencia de hipocalcemia.
Aún así la frecuencia de esta alteración sigue siendo baja, alrededor de 5%. El
mecanismo por el cual se origina este problema se asocia con un déficit en la síntesis de
hormona paratiroidea, así como también en niveles bajos de magnesio.
33
Policitemia e hiperbilirrubinemia.
Los hijos de madre con diabetes presentan ictericia con una frecuencia de hasta
53% cuando se trata de diabetes pregestacional y con frecuencia de hasta 38% cuando se
trata de diabetes gestacional. La hiperbilirrubinemia puede ser independiente o asociada a
policitemia. En los fetos de madres con diabetes existe una mayor producción de
eritrocitos estimulada por aumento de eritropoyetina (EPO). Posiblemente el incremento
en la eritropoyetina se deba a un estado intrauterino de hipoxia.
Miocardiopatía.
Los hijos de madre con diabetes presentan una forma pasajera de miocardiopatía
caracterizada por hipertrofia septal. En los casos en que la hipertrofia es significativa,
puede causar sintomatología asociada a obstrucción del tracto de salida. La hipertrofia
septal se debe a la hiperinsulinemia fetal, la cual ocasiona un depósito de grasa y
glucógeno en el miocardio. En los bebés sintomáticos, los síntomas mejoran después del
paso de algunas semanas, y generalmente requieren solo tratamiento de soporte.
Restricción en el crecimiento fetal.
Sucede en las mujeres con diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2 de larga evolución, que
es complicada con enfermedad vascular o renal. Se sospecha que la restricción sea
secundaria a una vasculopatía uteroplacentaria. Otros factores de riesgo maternos son
cetoacidosis diabética, hipertensión y preeclampsia.
34
Efecto de la diabetes mellitus en el microbioma
La información actual sobre el efecto de la diabetes mellitus en la composición de
la leche materna es mínima. No se conoce hasta el momento si existe diferencia en la
microbiota de la leche materna comparada con mujeres sin diabetes mellitus.
En la hipótesis del origen de la salud y enfermedad, se sugiere que la deficiencia o
exceso de nutrientes in-útero y en la infancia temprana programa una susceptibilidad a
enfermedades metabólicas en etapas posteriores de la vida. La diabetes y la obesidad
materna son consistentemente los factores de riesgo con mayor impacto en la obesidad
infantil y otras patologías como DM2, enfermedad hepática no alcohólica y síndrome
metabólico, los cuales se están diagnosticando desde los 6 años.79
Estudios en mujeres con obesidad pregestacional describen diferencia en la
microbiota intestinal. Las mujeres con obesidad presentaron mayor abundancia de phyla
Firmicutes, y a nivel de genus mayor abundancia de Dialister, Coprococcus,
Catenibacterium, Actinomyces, Blautia y menor abundancia de Bacteroides.80
Grapov y colaboradores encontraron mediante análisis proteómico, que existe una
diferencia significativa en las proteínas del calostro de madres con diabetes mellitus,
comparadas con controles sanos.81
La microbiota intestinal de mujeres con diabetes mellitus tipo 2 presenta una
reducción en el filo de Firmicutes, además de haber una correlación positiva entre la
proporción de Bacteroidetes a Firmicutes con la glucosa plasmática, pero no con el IMC.
En mujeres con antecedente de diabetes mellitus gestacional, se encontró una abundancia
de la familia Preveotelleceae y a nivel de filo tuvieron una reducción en la proporción de
Firmicutes.79
35
En adultos con obesidad, se ha descrito una microbiota intestinal “obesogenica”,
caracterizada principalmente por Firmicutes, en lugar de Bacteroidetes. Se ha propuesto
que los Firmicutes facilitan la extracción de nutrientes de los alimentos, lo cual favorece
una absorción mayor de calorías, favoreciendo así la ganancia ponderal y el incremento
de grasa.82
En mujeres embarazadas con sobrepeso, su microbiota intestinal durante el
segundo trimestre del embarazo esta compuesta predominantemente por Staphylococcus,
Enterobacteriaceae y Escherichia coli, mientras que en mujeres con peso normal tienen
mayor proporción de Bifidobacterium y Bacteroides en el tracto gastrointestinal.83
36
Capítulo 3. Metodología
Diseño del Estudio:
Se trata de un estudio prospectivo, observacional, descriptivo, transversal y
comparativo.
Participantes:
Se reclutaron dos grupos de binomios, madre – hijo. El primer grupo se consideró
el grupo control, con madres sanas. El segundo grupo, fue el grupo de estudio, con
madres que tuvieron diabetes mellitus gestacional. Se consideró reclutar a 20 binomios en
cada grupo.
El grupo control estuvo conformado por madres adultas, con edad entre 18 y 34
años, con índice de masa corporal entre 18.5 y 24.9, con embarazo a término (igual o más
de 37 semanas) y sin eventos intercurrentes en el embarazo, con control prenatal
adecuado y que culminen su embarazo en el Hospital Regional Materno-Infantil de Alta
Especialidad (HRMIAE). Se recolectaron en total muestras de 22 binomios. Diez
binomios culminaron en cesárea y 12 binomios mediante parto.
El grupo de estudio estuvo conformado por madres adultas, con edad entre 18 y
34 años, con índice de masa corporal entre 20 y 29.9, con embarazo de cualquier
duración, que reúnan los criterios de diabetes mellitus gestacional, con control prenatal
adecuado y que culminen su embarazo en el Hospital Regional Materno-Infantil de Alta
Especialidad (HRMIAE). Se recolectaron en total muestras de 19 binomios,13 binomios
culminaron en cesárea y 6 binomios mediante parto.
37
Los criterios para considerar Diabetes Gestacional fueron:
1. Por definición se excluye a todas las mujeres con diagnóstico previo de diabetes
mellitus.
2. Intolerancia a los carbohidratos de severidad variable que se diagnostica por
primera vez durante el embarazo.
3. Se realiza curva de tolerancia oral a glucosa con 75 gramos o 100 gramos,
durante dos o tres horas respectivamente. Se considera positiva la prueba con dos o más
valores superiores al límite establecido. Previamente se considera un ayuno entre 8 y 14
horas. La elección de la cantidad de glucosa para la prueba fue decisión clínica del
obstetra que llevó el control prenatal. Las dos variantes de la prueba están aprobadas y
validadas para realizar diagnóstico de diabetes mellitus gestacional.
Tabla 3 Valores de corte de prueba de tolerancia a la glucosa para diagnóstico de diabetes durante el embarazo.
Cantidad de glucosa CTOG 2 horas CTOG 3 horas
75 gramos 100 gramos Glucosa en ayuno (minuto 0) t95 mg/dL (5.3 mmol/L) t95 mg/dL (5.3mmol/L)
Glucosa a los 60 minutos t180mg/dL (10mmol/L) t180mg/dL (10mmol/L) Glucosa a los 120 minutos t155mg/dL (8.6mmol/L) t155mg/dL (8.6 mmol/L) Glucosa a los 180 minutos No Aplica t140mg/dL (7.8 mmol/L)
Tabla con información obtenida de Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.76
Tamaño de muestra
Se reclutaron en total a 41 binomios en el estudio. Dado que se trata de un estudio
exploratorio y que no se buscó contrastar ninguna hipótesis en particular, no fue
necesario realizar una estimación probabilística del tamaño muestral. Debido a la
disponibilidad de recursos financieros, se limitó el estudio a un muestreo definido a
conveniencia, de casos consecutivos (secuencial), no probabilístico y no aleatorizado.
38
Entorno:
Hospital Regional Materno-Infantil de Alta Especialidad, de los Servicios de
Salud del Estado de Nuevo León, en la ciudad de Guadalupe, Nuevo León México.
Periodo del Estudio:
Se reclutaron pacientes entre las fechas de febrero de 2019 y agosto de 2019.
Factores ambientales por controlar:
Con el fin de controlar los efectos derivados del medio ambiente, se incluyeron
exclusivamente madres mexicanas, con residencia los últimos doce meses previos al
embarazo en la zona metropolitana de Monterrey (compuesta por los municipios de
Apodaca, García, Escobedo, Guadalupe, Juárez; Monterrey, San Nicolás, San Pedro y
Santa Catarina) 84, y sus hijos recién nacidos, con los siguientes criterios:
Inclusión:
1. Cumplir las características de un solo grupo de estudio.
2. Que acepten la invitación a participar en el estudio, y firmen el documento de
consentimiento informado, con sus anexos.
3. Con domicilio en la zona metropolitana de Monterrey.
Exclusión:
1. Haber recibido antibióticos durante los 3 meses previos al ingreso al hospital; o
haber estado sujetas a tratamientos antibióticos prolongados por más de 3 meses en
cualquier momento previo al nacimiento.
2. Haber recibido tratamiento con esteroides en dosis inmunosupresoras o
inmumoduladoras. No se incluye a la administración de agentes de maduración pulmonar.
39
3. Tener una dieta vegana, ovolactovegetariana, o que excluya algún grupo de
nutrientes (ej. Dieta cetogenica).
4. Antecedente de cirugía bariatrica.
5. Historia de trastornos de la alimentación. Anorexia nervosa, bulimia, comedora
compulsiva, etc.
6. Haber recibido tratamiento antineoplásico de cualquier tipo durante su vida.
7. Antecedente de haber tenido una cirugía complicada en los 12 meses previos a
la toma de muestra.
8. No tener una FUM confiable.
9. Haber recibido antagonistas de H2-histamina y/o inhibidores de bomba de
protones.
10. Haber padecido diarrea durante las dos semanas previas al nacimiento.
11. Historia de uso de medicamentos biológicos (anticuerpos monoclonales).
12.Historia de cualquier enfermedad crónica no transmisible diferente a
sobrepeso/obesidad (Enfermedades autoinmunes, insuficiencia renal, hipertensión
arterial, etc.) que requiera tratamiento, aunque no lo haya recibido.
Eliminación:
1. Recibir antibióticos (la madre) por vía parenteral por más de 24 horas después
del nacimiento.
2. Que la madre o el bebé requieran cuidado intensivo posterior al nacimiento.
3. Cualquier otra causa que impida la obtención de la muestra de leche.
40
Variables:
Se analizaron variables de tipo cualitativo y cuantitativo.
Variables Cuantitativas
Volumen de leche recolectado, fecha de nacimiento del bebé, fecha de la
extracción de leche, edad materna, gesta, partos previos, cesáreas previas, abortos
previos, índice de masa corporal, fecha de última menstruación (FUM), edad gestacional,
ruptura de membranas, peso del RN, talla del RN, perímetro cefálico del RN.
Variables Cualitativas
Tipo de leche recolectado, consumo de tabaco, consumo de alcohol, consumo de
otras drogas, portadora de tatuajes, antecedentes patológicos diferentes a los definidos en
la variable independiente, estado civil, diabetes mellitus gestacional, infección de vías
urinarias, cervicovaginitis, recibió antibióticos tres meses previos, recibió antibióticos
intraparto, presentó trabajo de parto, vía de nacimiento, fue cesárea de urgencia, sexo del
RN, embarazo a término, control prenatal adecuado.
Definición operacional de las variables
Tabla 4 Definición operacional de las variables cualitativas.
Variable Definición operacional Tipo de leche Especificar si la muestra de leche recolectada corresponde a calostro,
leche de transición o leche madura. Consumo de tabaco Consumo de tabaco antes o durante el embarazo. Sí o no. Consumo de alcohol Consumo de alcohol antes o durante el embarazo. Sí o no. Consumo de drogas Consumo de otras drogas diferentes a tabaco o alcohol antes o durante el
embarazo. Sí o no. Tatuajes Se ha realizado algún tatuaje. Sí o no.
Antecedentes patológicos
Tiene alguna enfermedad diferente a la diabetes mellitus gestacional. Sí o no, especificar en caso de respuesta afirmativa
Estado civil Estado civil de la madre al momento de la entrevista. Soltera, casada, unión libre, viuda o divorciada.
Diabetes mellitus gestacional
Se realizó diagnóstico de diabetes mellitus gestacional con los criterios descritos en la tabla 2. Si o no.
41
Infección de vías urinarias
Presentó infección de vías urinarias durante el embarazo. Sí o no.
Cervicovaginitis Presentó cervicovaginitis durante el embarazo. Sí o no. Antibióticos tres meses previos
Recibió antibióticos en los tres meses previos al nacimiento, sin contar los administrados durante el periodo intraparto. Sí o no.
Antibióticos intraparto
Recibió antibióticos en el periodo intraparto, caracterizado por ± 2 horas de la fecha y hora de nacimiento del producto. Sí o no.
Trabajo de parto Tuvo trabajo de parto. Sí o no. Vía de nacimiento Vía por la que se obtuvo el producto. Parto o cesárea.
Cesárea de urgencia La cesárea se tuvo que realizar en condiciones de urgencia, debido a alguna situación que comprometía la seguridad del feto o la madre. Sí o
no. Sexo del RN Sexo del recién nacido. Masculino, femenino o indefinido.
Embarazo a término El embarazo llegó a término, definido como una duración mayor o igual a 259 días (37 semanas). Sí o no.
Control prenatal adecuado
La madre recibió control prenatal adecuado durante el embarazo, definido como 5 o más consultas prenatales. Sí o no.
Tabla 5 Definición operacional de las variables cuantitativas.
Variable Definición operacional Volumen de leche
recolectado Cantidad de leche en microlitros que se logró recolectar.
Fecha de nacimiento Fecha de nacimiento del bebé, en el formato dd/mm/aa. Fecha de la
extracción de leche Fecha en que se realizó la extracción de leche materna, en el formato
dd/mm/aa. Edad materna Edad materna en años cumplidos.
Gesta Número de embarazos, incluyendo el actual. Partos previos Número de partos previos, sin contar el actual.
Cesáreas previas Número de cesáreas previas, sin contar la actual. Abortos previos Número de abortos previos. Índice de masa
corporal Índice de masa corporal en las unidades de Kg/m2, calculado al dividir
el peso en kilogramos, entre la talla en metros elevada al cuadrado. Número racional redondeado a la décima mas cercana.
FUM Fecha en que presentó el primer día de la última menstruación. En el formato dd/mm/aa.
Edad gestacional Días transcurridos desde la fecha de última menstruación hasta la fecha de nacimiento. Puede ser en días enteros o convertido a semanas y
días. Ruptura de membranas
Diferencia de tiempo desde que se presenta la ruptura de membranas, hasta el momento del nacimiento del bebé. En horas cumplidas.
Peso del RN Peso en gramos del recién nacido. Talla del RN Talla en centímetros del recién nacido.
42
Perímetro cefálico del RN
Perímetro de circunferencia de la cabeza en centímetros del recién nacido.
Muestras Biológicas
Se obtuvieron de cada binomio las siguientes muestras biológicas:
1. Sangre total, suero y plasma maternos.
2. Leche materna temprana.
3. Líquido amniótico en los casos de cesárea.
4. Meconio.
5. Sangre total, suero y plasma de la placenta, cara fetal.
6. Tejido placentario.
Etiquetado de las muestras
Se utilizaron etiquetas autoadheribles previamente impresas en una etiquetadora
electrónica P-touch 1890, Brother®.
El formato de etiquetado fue el siguiente: el texto “CMH2019” para identificación
del protocolo, seguido de un espacio y después el número de grupo, en numeración
arábiga a un dígito, seguido de una letra para designar si la muestra fue materna o fetal
(letra “A” para las muestras de la madre y letra “B” para las muestras del bebé),
posteriormente un guion, seguido del número secuencial de muestra, en numeración
arabiga a tres dígitos. Por ejemplo: “CMH2019 1A-001” para la muestra materna número
uno del grupo uno. Al final del código se incluyo en texto el tipo de muestra. Las
muestras de la madre correspondieron a sangre total, suero, plasma, líquido amniótico,
placenta y leche materna. Las muestras del bebé correspondieron a: sangre total, suero,
43
plasma y meconio. Al momento de recolectar una muestra, se registraba en ese momento
en un formulario electrónico (Google forms®, Google®, Mountain View, California,
Estados Unidos) el código y fecha de recolección para llevar un registro de las muestras
obtenidas.
Reclutamiento y recolección de las muestras
El reclutamiento se realizó en el área de labor y tococirugía del HRMIAE. A las
madres elegibles, se les invitó a participar en el estudio, y se les explico a detalle en que
consistía el estudio, incluyendo el consentimiento informado. Una vez teniendo la
autorización por parte de la madre para la participación en el estudio, se inició la
recolección de las muestras. Al momento de reclutar al binomio al estudio, se le asignó
un número de muestra de manera consecutiva, correspondiente al grupo que pertenecía.
La rotulación de los tubos se realizó mediante las etiquetas previamente impresas.
Recolección de sangre materna.
Gracias al apoyo del personal de enfermería, se obtuvieron las muestras de sangre
materna en el mismo momento de la toma de muestras solicitadas por sus médicos
tratantes. No se realizó ninguna veno-punción adicional a la madre para la obtención de
muestras de sangre. El volumen extraído fue de aproximadamente 15 a 20 mililitros en
total de sangre materna, lo cual corresponde aproximadamente al 0.5% del volumen
circulante de sangre materno. Se tomaron tres tubos diferentes, aproximadamente 5 mL
en cada tubo. Primer tubo para sangre total, en tubos estériles BD Vacutainer® con
EDTA K2 (tubo con tapa lila). Segundo tubo para suero, en tubos estériles con gel
separador BD Vacutainer® SSTM (tubo con tapa amarilla). Tercer tubo para plasma, en
44
tubos estériles con gel separador y EDTA K2, BD Vacutainer® PPTTM (tubo con tapa
blanca). El tubo de sangre total fue refrigerado inmediatamente posterior a la recolección,
en un ambiente de 4 – 6ºC. Los tubos de suero y plasma se llevaron al laboratorio para
centrifugación a 10,000 G durante 5 minutos, lo cual permitió la separación del suero y
plasma de la masa eritrocitaria. Posteriormente se llevaron a refrigerar ambos tubos a un
ambiente de 4 – 6ºC.
Recolección de líquido amniótico.
En aquellos nacimientos que culminaron en cesárea, se recolectó líquido
amniótico. Previo al inicio del procedimiento quirúrgico, se explicó el protocolo al
equipo de obstetricia y se solicitó su apoyo para la recolección del líquido amniótico al
momento de la punción del saco amniótico. El líquido fue recolectado con una jeringa
estéril de 5 mL, y posteriormente se depositó en un tubo de recolección de muestras
plástico, estéril, y sin aditivos BD Vacutainer®. Posterior a su recolección, fue etiquetado
y llevado a un refrigerador, en donde se almacenó a 4-6ºC.
Recolección de sangre de placenta.
Mediante el uso de técnica estéril, se realizó veno-punción del cordón umbilical
unido a la placenta. Se obtuvieron aproximadamente 5 – 10 mililitros de sangre fetal. La
sangre obtenida de esta manera no representa extracción de sangre para el bebé. Se
distribuyó la sangre en tres tubos diferentes, aproximadamente 3 mL en cada uno, para la
obtención de sangre total, suero y plasma. Primer tubo para sangre total, en tubos estériles
BD Vacutainer® con EDTA K2 (tubo con tapa lila). Segundo tubo para suero, en tubos
estériles con gel separador BD Vacutainer® SSTM (tubo con tapa amarilla). Tercer tubo
para plasma, en tubos estériles con gel separador y EDTA K2, BD Vacutainer® PPTTM
45
(tubo con tapa blanca). El tubo de sangre total fue refrigerado inmediatamente posterior a
la recolección, en un ambiente de 4 – 6ºC. Los tubos de suero y plasma se llevaron al
laboratorio para centrifugación a 10,000 G durante 5 minutos, lo cual permitió la
separación del suero y plasma de la masa eritrocitaria. Posteriormente se llevaron a
refrigerar ambos tubos a un medio de 4 – 6ºC.
Recolección de tejido placentario.
Se recolectó tejido placentario en tubos plásticos, estériles, sin aditivos, a los que
previamente se les había adicionado con 3 mL de líquido RNA-later®. Se obtuvo la
muestra de placenta, mediante cortes limpios, en la cara fetal de la placenta, con una hoja
de bisturí, estéril y nueva. El tamaño de tejido placentario obtenido fue de
aproximadamente 1 centímetro cúbico (cm3) y posteriormente se introdujo en el tubo,
para sumergirse por completo en el líquido de RNA-later®. Las muestras fueron
almacenadas temporalmente a un refrigerador a 4 – 6 ºC.
Recolección de meconio.
Se recolectó a partir de la primera o segunda evacuación. En todos los casos fue
antes de las 24 horas de nacimiento. Con guantes y abatelenguas estériles se depositó en
un tubo estéril, sin aditivos. La cantidad recolectada fue aproximadamente de 2 - 5
gramos. Posteriormente rotulado y almacenado en un refrigerador temporalmente a 4-
6ºC.
Recolección de leche materna.
La recolección de la leche se realizó con el apoyo del departamento de la Clínica
de lactancia. Al ser un hospital amigo del niño y de la madre, se respetaron en todo
momento los protocolos establecidos en el hospital. La secreción de leche fue facilitada
46
por un suave masaje circular que se realizó previamente. Posterior al masaje, se realizó
un lavado de las glándulas mamarias con agua y gasas estériles, ya que por protocolo del
hospital no se permite el uso de jabones para el aseo de las glándulas mamarias. La
enfermera especialista fue la encargada de la extracción de leche, siguiendo la técnica de
asepsia completa. Se realizó una extracción manual de la leche materna de ambas
glándulas mamarias. Se depositó la muestra en tubos estériles Corning® de 15 mL. El
volumen de leche materna fue muy variable. Se intentó obtener al menos 0.5 mL en la
mayoría de las muestras. Se almacenó la muestra temporalmente en un refrigerador a 4-
6ºC.
Métodos de conservación y traslado
La leche materna se recolectaba una o dos veces por semana, por parte del equipo
de biotecnología, y directamente llevada al laboratorio de Biotecnología en el
Tecnológico de Monterrey, campus Monterrey. Para una conservación adecuada, se
congeló a -20ºC y se mantuvo así hasta que fue el momento de la extracción de ADN.
EL resto de las muestras se almacenaron en el Laboratorio Nacional de Medicina
de Sistemas de Conacyt con sede en la Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud del
Tecnológico de Monterrey ubicado en el edificio CITES. El traslado de las muestras se
realizó una vez por semana, con ayuda de bolsas de hielo en gel y hielera. Una vez en el
laboratorio, se dejaron las muestras almacenadas a diferentes características. El meconio
se almacenó a -80 ºC. El resto de las muestras: sangre total, suero, plasma, líquido
amniótico y placenta se almacenaron a -20ºC. La totalidad de las muestras fueron
recolectadas por el equipo de biotecnología, al momento de realizar el análisis de ADN.
47
Organizacion
Gelacio Jiménez Blanco. Pediatra. Residente de neonatología del Programa
Multicentrico en Neonatología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Campus
Monterrey, Tecnologico de Monterrey. Autor principal, elaboración de este documento y
recolección de muestras.
Dr. En medicina Víctor Javier Lara Díaz, Profesor-Investigador, Escuela de
Medicina y Ciencias de la Salud, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Director de tesis.
Dalia Liliana Rodríguez Reyes. Pediatra, Residente de neonatología del Programa
Multicentrico en Neonatología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud , Tecnologico
de Monterrey. Apoyo en recolección de las muestras y autora de proyecto paralelo de
microbiota de leche materna en madre con embarazo pretérmino.
Alan Heriberto Montoya Rincon. Pediatra, Residente de neonatología del
Programa Multicentrico en Neonatología, Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud ,
Tecnologico de Monterrey. Apoyo en recolección de las muestras y autor de proyecto
paralelo de microbiota de leche materna en madre con obesidad.
Mario Rene Alcorta García, Pediatra y Neonatologo, Hospital Regional Materno
Infantil de Alta Especialidad, Servicios de Salud de Nuevo Leon.
Víctor Arízaga Ballesteros, Pediatra y Neonatologo, Hospital Regional Materno
Infantil de Alta Especialidad, Servicios de Salud de Nuevo Leon.
Marion E. G. Brunck, PhD, Profesor-Investigador, Centro de Biotecnología
FEMSA, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
48
Cuauhtemoc Licona Cassani, PhD, Profesor-Investigador, Centro de
Biotecnología FEMSA, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Dr. En Ciencias Jose Manuel Aguilar Yanez, Profesor-Investigador, Centro de
Biotecnología FEMSA, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Fabiola Castorena Torres, PhD, Profesor-Investigador, Escuela de Medicina y
Ciencias de la Salud, Campus Monterrey, Tecnologico de Monterrey.
Métodos analíticos:
Estudios previos que han estudiado la microbiota intestinal durante el embarazo,
han utilizado técnica de reacción en cadena de polimerasa para ampliar la región V1 y V2
de la subunidad 16S de RNA ribosomal en muestras de heces y análisis de muestras
mediante pirosecuenciación.58 Se ha descrito además análisis de los HMO mediante el
uso de cromatografía de intercambio aniónico de alto desempeño. Así como análisis de la
actividad bacteriana en leche materna mediante la composición de ácidos grasos de
cadena media.85
Jiménez y colaboradores describen la técnica utilizada para la determinación del
metagenoma de la leche materna en mujeres sanas y mujeres con mastitis. Realizaron una
recolección en tubos estériles, mediante extracción manual utilizado guantes estériles.
Previamente se realizó un aseo de la areola y tejido mamario con jabón y agua estéril,
además de empaparlos con clorhexidina. Las primeras gotas (aproximadamente 500 µL)
fueron descartadas. Para la extracción de más de 500 nanogramos (ng) de ADN,
aproximadamente 10 mL de leche se centrifugaron a 11,000 G durante 5 minutos a 4 ºC.
Posteriormente se lavó con buffer y se suspende en acetato de sodio. La lisis mecánica se
49
realiza mediante agitación con granos de sílice y zirconio. Después sigue incubación,
para la cual se agrega proteinasa K durante 60 minutos. Se centrifuga nuevamente a
16,000 G durante 5 minutos y el sobrenadante se separa. Se precipita el ADN mediante la
adición de isopropanol e incubación a -20 ºC durante 1 hora. Finalmente el ADN se
peletiza mediante centrífuga a 16,000 G durante 10 minutos y se lava con etanol al
70%.49
Extracción de ADN
Las muestras de leche correspondientes se descongelaron y posteriormente
centrifugaron a 10,000 G durante 10 minutos para separar las células y la grasa del suero.
Posteriormente, se aisló el ADN total de los gránulos utilizando el Kit de ADN QIAamp
Mini (Qiagen). Las muestras de heces fecales fueron procesadas con el mismo kit de
extracción de ADN.
El ADN se aisló a partir de muestras fecales utilizando un método de extracción
de fenol y cloroformo, combinado con la disrupción física de las células bacterianas y un
kit de limpieza de ADN comercial (Qiagen DNeasy® Blood and Tissue extracción kit,
Qiagen). El ADN fecal fue aislado y cuantificado usando un Nanodrop (Thermo
Scientific, Asheville, NC) antes de ser utilizado para el análisis microbiológico
subsiguiente.
Preparación de bibliotecas y Secuenciación de 16S
Las extracciones de ADN fueron enviadas a un proveedor tercero especializado
para la elaboración de las librerías y la secuenciación del gen de ARN ribosomal 16S.
50
Fuente de los datos y detalles acerca de las mediciones:
Sesgos potenciales y estrategias para evitarlos: El sesgo principal de este estudio
es que las observaciones realizadas no permiten generalizarlas al total de la población.
Únicamente se pueden generalizar a la población que es usuaria habitual de los servicios
de salud del HRMIAE. Excluye a los estratos socioeconómicos más altos, con ingreso
superior a 8 salarios mínimos mensuales. Tampoco se pueden aplicar los hallazgos a
poblaciones que recientemente han migrado a la región, ni a poblaciones en tránsito.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó con estadística descriptiva, no paramétrica, dado
el número pequeño de sujetos en cada grupo de estudio. Las variables continuas se
expresaron como medianas y rangos intercuartiles, las variables discretas como
frecuencias y proporciones.
El análisis de la diversidad taxonómica la microbiota se realizara mediante la
plataforma bioinformática QIMME. Los datos de secuenciación se filtrarán, se depurarán
y procesarán utilizando parámetros estándar para la selección de unidades de taxonomía
(OTU).
Aspectos éticos y regulatorios
Este protocolo se ha diseñado de acuerdo con las recomendaciones de la
Declaración de Helsinki86 y los acuerdos de Buenas Prácticas Clínicas de la ICH87. Se
apega a lo estipulado por la Ley general de Salud en materia de Investigación para la
51
Salud de los Estados Unidos Mexicanos, y a los lineamientos publicados acerca del
Formato de Consentimiento Informado.88
El estudio fue aprobado por el Comité de ética e investigación de la Escuela de
medicina del Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey, con número
de registro del Comite de Ética en investigación ante la Comisión Nacional de Bioética
“CONBIOETICA 19 CEI 011-2016-10-17”. Se recibió autorización por parte del Comité
de ética en investigación del Hospital Regional Materno Infantil, y posteriormente
registrado ante la Secretaría de Salud de Nuevo Leon, con número de registro “DEISC-
PR-190118019”. El formato de consentimiento informado se puede encontrar en los
anexos de este documento.
El resguardo de las muestras biológicas se realizó bajo la premisa garantizada de
anonimato, ya que las muestras solamente serán identificadas por un código alfanumérico
de 5 campos, uno para el grupo de estudio, uno para la identificación de muestra materna
(A) o neonatal (B), y tres para el número consecutivo de muestra.
Las muestras serán utilizadas exclusivamente para los propósitos declarados en
este estudio, así como para estudios de caracterización génica y/o identificación de
biomarcadores futuros, pero no para la generación de líneas celulares inmortales. Se
conservarán por hasta 15 años, bajo ultracongelación, en el Laboratorio Nacional de
Medicina de Sistemas de Conacyt con sede en la Escuela de Medicina y Ciencias de la
Salud. Estarán disponibles para la comunidad científica debidamente acreditada.
52
Fondos
Los fondos para llevar a cabo este estudio se obtuvieron de una aportación de
FEMSA al equipo investigador.
53
Capítulo 4. Resultados
Muestras eliminadas
Se reclutaron 53 binomios, de los cuales únicamente se logró una recolección de
muestra de leche adecuada en 41 binomios. En 12 pares la muestra recolectada fue
mínima y no fue posible realizar el análisis de ADN en estas muestras, por lo que el
volumen extraído de leche se considero 0 microlitros por el equipo de biotecnología, y
por lo tanto se eliminaron del análisis. De los binomios eliminados, 5 correspondieron al
grupo control y 7 al grupo de estudio. La eliminación se realizó tan pronto se cumplieron
los criterios para ésta, y se continuó la recolección de muestras con un orden secuencial.
Las muestras eliminadas no se consideraron en el número de sujetos necesarios para
alcanzar la muestra deseada.
Figura 1: Diagrama de elegibilidad
55 binomios elegibles
53 binomios incluidos
41 binomios incluidos en análisis
22 binomios en el grupo control
10 nacimientos vía cesárea
12 nacimientos vía parto
19 binomios en el grupo de estudio
13 nacimientos vía cesárea
6 nacimientos vía parto
12 eliminados ya que no se logró recolectar muestra de
leche
2 no cumplieron criterios de inclusión
54
Características de la muestra estudiada
Se encontró que los grupos estudiados no tuvieron diferencias estadísticas
significativas en la mayoría de las características demográficas.
Tabla 6 Características de la muestra estudiada.
Control (n=22) DMG (n=19) p a Edad materna, años mediana, (Q1-Q3) 23 (22-26.5) 24 (21.5-25.5) 0.94b
Estado civil (unión libre) n, (%) 22 (84.6%) 17 (70.8%) 0.21 Índice de masa corporal, kg/m2 media, (D.E.) 22.6 (±1.9) 25.8 (±2.6) 0.00007c
Antecedentes patológicos positivos n, (%) 1 (4.5%) 3 (15.8%) 0.32 Consumo de Tabaco n, (%) 1 (4.5%) 1 (5.3%) 1
Consumo de Alcohol n, (%) 1 (4.5%) 2 (10.5%) 0.59 Consumo de Drogas n, (%) 1 (4.5%) 0 (0.0%) 1
Portadora de Tatuajes n, (%) 6 (27.3%) 6 (31.6%) 1 Edad gestacional en semanas y días media, (D.E.) 39 5/7 (±8) 39 2/7 (±10) 0.4c
Número de gesta mediana, (Q1-Q3) 2 (1 - 3) 2 (1 - 2.5) 0.50b Primigesta n, (%) 7 (31.8%) 7 (36.8%) 0.75
Tuvo trabajo de parto n, (%) 21 (95.5%) 13 (68.4%) 0.04 Recibió antibióticos intraparto n, (%) 13 (59.1%) 10 (52.6%) 0.76
RPM previa al nacimiento, horas mediana, (Q1-Q3) 0 (0-3.3) 0 (0-0) 0.11b Vía de nacimiento (cesárea) n, (%) 10 (45.5%) 13 (68.4%) 0.21
Infección urinaria durante el embarazo n, (%) 6 (27.3%) 4 (21.1%) 0.72 Cervicovaginitis durante el embarazo n, (%) 5 (22.7%) 4 (21.1%) 1
Sexo de RN (femenino) n, (%) 11 (50.0%) 11 (42.1%) 0.76 Peso al nacer, gramos media, (D.E.) 3323.6 (±354.8) 3277.4 (±568.1) 0.75c
Talla al nacer, cm media, (D.E.) 50.4 (±1.5) 50.1 (±2.5) 0.68c Perímetro cefálico al nacer, cm media, (D.E.) 34.3 (±1.4) 34.5 (±1.7) 0.68c
Tamaño al nacer, PBEG n, (%) 1 (4.5%) 0 (0.0%) 1 Tamaño al nacer, PGEG n, (%) 0 (0.0%) 0 (0.0%) 1 Tamaño al nacer, PAEG n, (%) 21 (95.5%) 19 (100.0%) 1
a Prueba exacta de Fisher b Prueba U de Mann Whitney c Prueba t de dos colas, no pareada d No se consideran los antecedentes patológicos previamente definidos en las variables del estudio.
55
Se realizo la prueba de Kolmogorov-Smirnov para determinar el tipo de
distribucion de las variables estudiadas. Las variables de edad gestacional, índice de masa
corporal materno, peso , talla y perímetro cefálico del recién nacido presentaron una
distribucion de tipo normal. Con estas variables se utilizó estadística paramétrica, entre
ellas, la prueba T de Student. El resto de las variables tuvieron una distribucion de tipo no
normal, por lo que se utilizó estadística no paramétrica.
Vía de nacimiento
Del total de los binomios analizados, 18 culminaron en parto (43.9%) y 23 en
cesárea (56.1%). Segmentados en los grupos de estudio, se observó que el grupo control
tuvo una frecuencia similar de parto (54.5%) y de cesárea (45.%). El grupo de estudio,
presentó una mayor frecuencia de cesáreas 68.4%, comparado con 31.6% de parto. La
mayoría de las mujeres que culminaron en cesárea tuvieron trabajo de parto (69.6%).
Tabla 7 Mujeres con nacimiento vía cesárea que tuvieron trabajo de parto.
Grupo control (n=10) Grupo de estudio (n=13) pa Trabajo de parto, n (%) 9 (90%) 7 (53.8%) 0.09
a Prueba exacta de Fisher
Todas las mujeres que culminaron en parto tuvieron por definición trabajo de
parto. En las mujeres que culminaron su embarazo mediante vía cesárea, la mayoría
tuvieron trabajo de parto. Las mujeres con DMG presentaron una menor frecuencia de
trabajo de parto.
56
Características de las muestras de leche
La mediana de tiempo de recolección de la muestra de leche fue de 1 día, sin
diferencia significativa entre grupos, ni tampoco entre tipo de nacimiento.
La totalidad de las muestras analizadas correspondió a calostro. En una de las
muestras excluidas se obtuvieron 8,000 microlitros de leche de transición, sin embargo,
se encontró durante la revisión del expediente electrónico que la madre recibió
tratamiento con antibiótico un mes previo al nacimiento, por lo que no se incluyó en el
análisis.
Tabla 8 Cantidad de leche extraída en los nacimientos vía vaginal.
Grupo control Grupo de estudio pa Volumen en µL,
media (D.E.) 2263 (±1371) 808 (±525) 0.02
aPrueba U de Mann Whitney
Tabla 9 Cantidad de leche extraída en los nacimientos vía cesárea.
Grupo control Grupo de estudio pa Volumen en µL,
media (D.E.) 1440 (±866) 1762 (±971) 0.32
aPrueba U de Mann Whitney
57
Figura 2: Volumen de leche obtenida por grupo.
Determinación de ADN en leche materna
Extracción de ADN
En esta primera fase del proyecto se realizo la extracción de ADN. Posterior a la
extracción y purificación de ADN, éste se envió al laboratorio de servicios genómicos
Langebio (CINVESTAV, Irapuato, México) para la secuenciación metagenómica y
determinación de la diversidad filogenética mediante interpretación del genotipo.
En 7 muestras, a pesar de tener una cantidad adecuada de leche, no se logró
extraer ADN, debido a las características de la muestra y las condiciones en las que fue
almacenada. Las muestras en las que no se logró la extracción de ADN fueron: 1-008, 1-
011, 1-022, 6-008, 6-012, 6-014, y 6-016. Se purificó ADN de 34 muestras en total, de
las cuales 19 pertenecieron al grupo control y 15 al grupo de estudio.
0
1
2
3
4
5
6
7
Volumen de leche obtenida en µL
GRUPO CONTROL GRUPO DE ESTUDIO
58
Contenido de ADN en las muestras
Se obtuvieron muestras de leche, con un promedio de 86 ng de ADN por cada µL
de leche. La concentración promedio de ADN en el grupo control fue de 91 ng/µL y 79
ng/µL en el grupo de estudio.
Tabla 10 Concentración de ADN obtenida de las muestras
Grupo control Grupo de estudio ID
protocolo Concentración de ADN en ng/µL
ID protocolo
Concentración de ADN en ng/µL
1-001 80.73 6-001 91.56 1-003 48.79 6-004 95.44 1-005 89.63 6-005 78.59 1-006 116.14 6-006 83.17 1-008a 6-007 104.15 1-011a 6-008a 1-012 270.52 6-009 50.39 1-013 255.46 6-010 55.71 1-014 72.72 6-012a 1-015 99.61 6-013 22.43 1-016 130.2 6-014a 1-017 18.18 6-016a 1-018 30.01 6-017 134.87 1-019 122.67 6-018 121.44 1-020 91.42 6-019 109.22 1-021 102.28 6-020 83.26 1-022a 6-023 13.96 1-023 22.27 6-024 79.18 1-024 64.93 6-027 63.44 1-025 29.79 1-026 13.16 1-027 87.94
a No se logró extraer ADN
Se realizó la extracción y purificación de ADN, mediante placas de gel. En las
figuras 3 a 7 se observan las fotografías de las placas de gel mediante las cuales se realizó
la extracción de ADN. El código de protocolo correspondiente al número en la fotografía
de gel se puede revisar en la tabla 11.
59
Figura 3: Fotografía del ADN en gel muestras 1 a 6
Figura 4: Fotografía del ADN en gel muestras 7 a 12
Figura 5: Fotografía del ADN en gel muestras 13 a 19
60
Figura 6: Fotografía del ADN en gel muestras 42 a 49
Figura 7: Fotografía del ADN en gel muestras 52 a 58
Tabla 11 Relación de números en placa de gel con ID de protocolo.
Etiqueta en Gel ID de protocolo Etiqueta en Gel ID de protocolo 1 1-001 18 1-026 2 1-003 19 1-027 3 1-005 42 6-001 4 1-006 43 6-005 5 6-004 44 6-006 6 1-012 45 6-007 7 1-013 46 6-009 8 1-014 47 6-010 9 1-015 48 6-013
10 1-016 49 6-017 11 1-017 50 6-018 12 1-019 51 6-019 13 1-020 52 6-020 14 1-021 53 6-023 15 1-023 54 6-024 16 1-024 55 6-027 17 1-025 56 1-018
61
Pureza del ADN extraído
Se determinó la pureza del ADN extraído, mediante la técnica de
espectrofotometría en los rangos de longitud de onda de 230, 260 y 280 nm. Cuatro
muestras tuvieron un cociente 260/280 inferior a 1.8 (1-018, 6-013, 6-018 y 6-023), cinco
muestras tuvieron cociente 260/230 inferior a 1.5 (1-018, 6-013, 6-017,6-018 y 6-023) y
tres muestras tuvieron un cociente 260/280 mayor a 2(1-017, 1-023 y 1-026). En la tabla
12 se observan los cocientes 260/280 y 260/230 de todas las muestras.
Tabla 12 Pureza del ADN extraído, mediante espectrofotometría.
Grupo control Grupo de estudio
ID de protocolo
Cociente de espectrofotometría
260/280
Cociente 260/230
ID de protocolo
Cociente de espectrofotometría
260/280
Cociente 260/230
1-001 1.86 1.98 6-001 1.91 2.74 1-003 1.97 2.65 6-004 1.92 1.58 1-005 1.98 2.46 6-005 1.93 3.12 1-006 1.95 2 6-006 1.91 2.6 1-008a 6-007 1.89 2.55 1-011a 6-008a 1-012 1.9 2.46 6-009 2 3.25 1-013 1.93 2.61 6-010 1.9 2.47 1-014 1.91 2.58 6-012a 1-015 1.92 2.72 6-013 1.51b 0.96c 1-016 1.87 2.73 6-014a 1-017 2.04 b 1.81 6-016a 1-018 1.59b 0.52c 6-017 1.81 1.2c 1-019 1.9 2.55 6-018 1.62b 0.81c 1-020 1.9 2.84 6-019 1.9 2.59 1-021 1.91 2.24 6-020 1.87 2.68 1-022a 6-023 1.55b 1.34c 1-023 2.17b 2.72 6-024 1.83 2.53 1-024 1.84 2.79 6-027 1.84 2.46 1-025 1.91 2.32 1-026 2.19b 2.19 1-027 1.88 2.4
a No se logró extraer ADN. b Muestra con posible contaminación. Se consideran muestras óptimas, aquellas con un Cociente espectrofotometría de 260/280 entre 1.8 y 2.89 c Muestra con posible contaminación. Se consideran muestras óptimas, aquellas con un Cociente de espectrofotometría de 260/230 superior a 1.5.89
62
Capítulo 5. Análisis y discusión de resultados
La tasa de cesárea reportada en el estudio es alta desde 45% a 68%, en el grupo
control y el de estudio respectivamente. Pareciera que es una frecuencia muy elevada de
cesáreas, sin embargo, este dato, por si solo, no demuestra la frecuencia real de cesáreas
del hospital. Desde el diseño inicial del estudio, se busco incluir una cantidad igual o
similar de mujeres que culminaran su embarazo en parto y en cesárea, específicamente
diez binomios de cada vía de nacimiento en cada grupo. El hecho de que en ambos
grupos se acerque la frecuencia de cesáreas al 50%, se puede interpretar como un
reclutamiento exitoso de binomios.
En las mujeres que culminan su embarazo mediante cesárea en el HRMIAE,
aquellas que cursaron con DMG presentaron una mayor frecuencia de cesárea sin trabajo
de parto, 47% comparado con 10% de las mujeres sin DMG, OR 7.7 (IC95 0.7 – 79).
Esta diferencia, aunque sin significancia estadística (p=0.09), puede ser explicada según
los protocolos del HRMIAE; las mujeres embarazadas con diagnóstico de diabetes
mellitus gestacional que llegan a embarazo a término son programadas para operación
cesárea según el criterio del obstetra que lleva el control prenatal.
Otro fenómeno que se observó durante el reclutamiento de binomios fue que una
cantidad considerable de las mujeres con DMG que inicialmente tenían planeado parto,
culminaron su embarazo en cesárea. Este fenómeno dio como resultado una mayor
cantidad de cesáreas (68%) comparado con partos (32%) en el grupo de madres con
diabetes mellitus gestacional. De nuevo, este resultado puede ser explicado de manera
parcial, debido a los protocolos de obstetricia y del manejo de la mujer embarazada con
DMG que se siguen en el Hospital Regional Materno Infantil de Alta especialidad.
63
Se observa que en los nacimientos vía cesárea no existe diferencia en el volumen
de leche materna que se logro recolectar, siendo muy similares entre ambos grupos. En
aquellas mujeres que culminaron el embarazo vía vaginal, se encontró que el grupo de
mujeres sanas produjeron mas leche al momento de la recolección de la muestra. Las
mujeres del grupo control que culminaron en parto, produjeron hasta tres veces mas leche
(2263 µL vs 808 µL, p=.002), al momento de la toma de muestra, que las mujeres con
diabetes gestacional que terminaron en parto.
Comparado con estudios previos, en el estudio actual se recolectaron cantidades
inferiores de leche a las que han reportado otros autores. En algunos estudios se menciona
que se recolectan hasta 10 mL de leche de cada madre. De acuerdo con la fisiología de la
lactancia, en el estudio actual se explica que el volumen recolectado sea bajo, ya que la
extracción se realizó en las primeras 24 horas posnatales. El aumento en la producción o
“bajada de la leche”, ocurre a las 36 horas en multíparas y en 72 horas en primíparas.37
El HRMIAE tiene una política de alta temprana, en la cual los binomios son
egresados a las 24 horas posnatales en caso de parto y a las 48 horas posnatales en caso
de cesárea, por lo que fue imposible recolectar la muestra una vez ocurrida el alta. Se
detectó además como área de oportunidad, que algunos de los bebés fueron egresados,
con una producción muy baja de leche materna, por lo que se consideraron en riesgo para
desarrollar deshidratación, ictericia e hipoglucemia. A estos pacientes se les solicitó
acudir a la clínica de lactancia a las 72 horas para evaluar la producción de leche materna,
sin embargo, la mayoría de ellos no acudieron a su cita de control.
Los factores posnatales que afectan a la microbiota de la leche materna son la
edad gestacional, la vía de nacimiento, el uso materno de antibióticos y la etapa de la
64
lactancia en que se encuentre la madre.51 Una fortaleza de este trabajo es que en la
muestra analizada, no existió diferencia entre grupos en todas estas variables. La única
variable de las que se han descrito causa alteración en la microbiota, fue el índice de masa
corporal de las madres. El IMC promedio en las mujeres sanas fue de 22.6 Kg/m2,
mientras que en las del grupo de DMG fue de 25.8 Kg/m2 (p=0.00007). Esta diferencia se
explica debido al diseño del estudio, en el cual desde un principio se planteó reclutar a
mujeres con IMC 18.5-24.9 para el grupo control, y a mujeres con IMC entre 20 y 29.9
para el grupo de DMG. Se considera que, durante el embarazo, las mujeres con un IMC
mas alto son las que presentan mayor riesgo de desarrollar DMG, motivo por el cual se
decidió incluir a mujeres con un IMC mayor en el grupo de estudio.
La cantidad de ADN en la mayoría de las muestras fue superior a los requisitos
determinados por el laboratorio de Cinvestav-Langebio. Se necesita un mínimo de 50
ng/μL de ADN en la muestra para poder realizar una secuenciación adecuada.90 En 8
muestras, la concentración de ADN fue menor a 50 ng/μL y en 26 muestras fue superior.
La mayoría de las muestras se consideraron con una alta pureza. Para determinar
la pureza del ADN extraído, se utilizó la técnica de absorbancia mediante
espectrofotometría, en las longitudes de onda de 230, 260 y 280 nm. La relacion
A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza optima tiene un valor
entre 1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relacion A260/280 >
1.6. Un valor A260/280 < 1.6 indica una posible contaminacion por compuestos
aromáticos como fenoles y proteínas. Una relación A260/280 > 2.1 podría deberse a la
presencia de ARN en la muestra. En la longitud de onda de 230 nm, se absorben
contaminantes como sales, fenoles y carbohidratos. En general, se considera que el ADN
65
es puro cuando el ratio A260/230 se sitúa en torno 1.5-2.2. Un cociente menor de 1.5
indicaría presencia de contaminantes en la muestra.89
En las muestras obtenidas, únicamente 4 muestras tienen una relación 260/280 y
260/230 sugestiva de contaminación de la muestra. El resto de las muestras se encuentran
dentro de los valores recomendados.
66
Capítulo 6. Conclusión
En este trabajo se describe la microbiota de la leche materna de mujeres que
cursan embarazo con diabetes mellitus gestacional y se compara además los resultados,
con la microbiota de la leche materna de mujeres que cursan embarazo sin
complicaciones y que llega a término.
El volumen de recolección de leche producido durante las primeras 24 horas, es
en promedio de 0.8 a 2.2 mL por cada extracción.
El ADN obtenido de la leche materna tiene una concentración promedio de 86
ng/μL. La pureza del ADN obtenido es ideal en el 88% de las muestras, y en 4 de ellas el
ratio A260/280 y A260/230 es sugestivo de contaminación.
En la segunda parte de este trabajo, se espera recibir la secuenciación por parte del
laboratorio de Cinvestav-Langebio y la determinación filogenética de los organismos
presentes en la leche materna.
67
Apéndice
Apéndice 1. Formato de recolección de datos.
68
69
70
Apéndice 2. Formato de registro de muestras recolectadas.
71
07/09/19 18(11Muest ras recolectadas
Página 5 de 5ht tps://docs.google.com/forms/d/1mD…ct re8vBEnmKGQUC2uU5Dv5F3Q/print form
Con la tecnología de
12. Líquido amnioticoMarca solo un óvalo.
Si
No
Pendiente
13. Leche maternaMarca solo un óvalo.
Si
No
Pendiente
14. MeconioMarca solo un óvalo.
Si
No
Pendiente
72
Apéndice 3. Hoja de información y formato de consentimiento informado.
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
Apéndice 4. Carta de aprobación del comité de ética de la Escuela de Medicina
85
Apéndice 5. Carta de aprobación del comité de investigación de la Escuela de Medicina
86
Apéndice 6. Carta de aprobación del comité de ética e investigación del Hospital Materno
Infantil.
87
Apéndice 7. Constancia de registro de protocolo ante la Secretaría de salud de Nuevo
León.
89
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