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Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana

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Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes mellitus gestacionalPrograma Multicéntrico de Especialidades Médicas
“Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes mellitus gestacional.”
Tesis para obtener el grado de: Especialista en Neonatología
presenta: Gelacio Jiménez Blanco
Director de tesis: Codirector de tesis: Dr. Med. Víctor Javier Lara Díaz Dr. Víctor Arízaga Ballesteros
Monterrey, Nuevo León, México Septiembre, 2019
III
Dedicatoria
Dedico este trabajo a mi esposa y a mi hija, quienes son mi alegría y la razón de
mi esfuerzo y dedicación.
IV
Agradecimientos
Agradezco a mi maestro y mentor el Dr. Víctor Javier Lara Díaz por su apoyo
durante todo el proceso de mi formación como especialista en neonatología, además del
invaluable apoyo que me brindó en la realización de este trabajo.
Agradezco a mis colegas y compañeros Dalia Liliana Rodríguez Reyes y Alan
Heriberto Montoya Rincón, quienes fueron pieza clave para la culminación de este
proyecto conjunto.
Agradezco a mis demás compañeros de residencia: Tania Moreno, Eduardo
González, Ángela Ruiz, y Jorge Moreno por su apoyo en las diferentes actividades
hospitalarias y académicas mientras nosotros trabajamos en este proyecto.
Agradezco a los médicos adscritos al servicio de neonatología del Hospital
Regional Materno Infantil de Alta especialidad, por todo su apoyo y facilidades brindadas
para poder llevar a cabo este trabajo.
Un agradecimiento especial al Dr. Cuauhtémoc Licona Cassani, por permitirnos
participar en este proyecto, y a todo al equipo de biotecnología del ITESM, quienes
fueron pieza fundamental para el procesamiento y análisis de muestras.
V
Glosario.
ACOG Colegio Americano de Obstetricia y Ginecología (por sus siglas en inglés)
ADN Ácido desoxirribonucleico ADNr Ácido desoxirribonucleico ribosomal AGL Ácidos grasos libres ARN Ácido ribonucleico
ARNr Ácido ribonucleico ribosomal cm Centímetros
cm3 Centímetro cúbico CTOG Curva de tolerancia oral de glucosa
DM Diabetes mellitus DM1 Diabetes mellitus tipo 1 DM2 Diabetes mellitus tipo 2 DMG Diabetes mellitus gestacional DNA Ácido desoxirribonucleico (por sus siglas en inglés) ECN Enterocolitis necrosante EPO Eritropoyetina
FUM Fecha de última menstruación G Fuerza G g Gramos
g/L Gramos por litro HMD Hijo de madre con diabetes
hMmSCs Células progenitoras de la leche materna humana (por sus siglas en inglés)
HMO Oligosacáridos de leche humana (por sus siglas en inglés) HRMIAE Hospital Regional Materno-Infantil de Alta Especialidad
IgA Inmunoglobulina A IgE Inmunoglobulina E
IMC Índice de masa corporal Kg Kilogramo
Kg/m2 Kilogramo por metro cuadrado LCPUFA Ácidos grasos de cadena larga poliinsaturados (por sus siglas en inglés)
m2 Metro cuadrado MCT Triglicéridos de cadena media (por sus siglas en inglés)
mg Miligramo mg/dL Miligramos por decilitro
mL Mililitro mm Milímetros
mmol/L Milimoles por litro ng Nanogramo
NIH Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos (por sus siglas en inglés)
ºC Grados Celsius
VI
PCR Reacción en cadena de polimerasa (por sus siglas en inglés) pH Potencial de hidrógeno
PTG Prueba de tolerancia a glucosa RN Recién nacido
RNA Ácido ribonucleico (por sus siglas en inglés) RPM Ruptura prematura de membranas
rRNA Ácido ribonucleico ribosomal (por sus siglas en inglés) TLR-1 Receptor Toll tipo 1 (por sus siglas en inglés) TLR-2 Receptor Toll tipo 2 (por sus siglas en inglés)
UNICEF Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia (por sus siglas en inglés) VD Variable dependiente VI Variable independiente µg Microgramo µL Microlitro
VII
Resumen .............................................................................................................................. 1
Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes
mellitus gestacional ........................................................................................................ 1
Antecedentes .................................................................................................................. 2
Introducción ................................................................................................................... 6
Desarrollo de la glándula mamaria .......................................................................... 10
VIII
Cambios en el embarazo .......................................................................................... 12
Producción de leche ................................................................................................. 13
Células de la leche humana ..................................................................................... 16
Microbioma humano .................................................................................................... 17
Importancia de la microbiota intestinal en el recién nacido .................................... 18
Caracterización de la microbiota en la leche materna y en tracto gastrointestinal
infantil ...................................................................................................................... 20
Efecto de intervenciones maternas en la microbiota materna y neonatal ................ 22
Microbiota del tracto digestivo adulto ..................................................................... 23
Microbiota del canal vaginal ................................................................................... 24
Microbiota oral materna .......................................................................................... 24
Microbiota en meconio ............................................................................................ 25
Microbiota en placenta ............................................................................................ 25
Metabolismo de la glucosa ...................................................................................... 27
Clasificación ............................................................................................................ 28
Diagnóstico .............................................................................................................. 29
El impacto de la diabetes materna en el neonato ..................................................... 30
Efecto de la diabetes mellitus en el microbioma .......................................................... 34
Capítulo 3. Metodología ................................................................................................... 36
Inclusión: ................................................................................................................. 38
Exclusión: ................................................................................................................ 38
Muestras Biológicas ..................................................................................................... 42
Reclutamiento y recolección de las muestras .......................................................... 43
Métodos de conservación y traslado ........................................................................ 46
Organizacion ................................................................................................................ 47
Preparación de bibliotecas y Secuenciación de 16S ................................................ 49
Fuente de los datos y detalles acerca de las mediciones: ............................................. 50
Análisis estadístico ....................................................................................................... 50
X
Vía de nacimiento .................................................................................................... 55
Determinación de ADN en leche materna.................................................................... 57
Extracción de ADN ................................................................................................. 57
Pureza del ADN extraído ......................................................................................... 61
Capítulo 5. Análisis y discusión de resultados .................................................................. 62
Capítulo 6. Conclusión ...................................................................................................... 66
Apéndice 2. Formato de registro de muestras recolectadas. ........................................ 70
Apéndice 4. Carta de aprobación del comité de ética de la Escuela de Medicina ....... 84
Apéndice 5. Carta de aprobación del comité de investigación de la Escuela de
Medicina ....................................................................................................................... 85
Apéndice 6. Carta de aprobación del comité de ética e investigación del Hospital
Materno Infantil............................................................................................................ 86
Apéndice 7. Constancia de registro de protocolo ante la Secretaría de salud de Nuevo
León. ............................................................................................................................. 87
Bibliografía ....................................................................................................................... 89
Índice de tablas
Tabla 1 Clasificación de White modificada de las mujeres con diabetes mellitus en
embarazo. .......................................................................................................................... 29
Tabla 2 Valores de corte de prueba de tolerancia a la glucosa para diagnóstico de
diabetes durante el embarazo. .......................................................................................... 30
Tabla 3 Valores de corte de prueba de tolerancia a la glucosa para diagnóstico de
diabetes durante el embarazo. .......................................................................................... 37
Tabla 4 Definición operacional de las variables cualitativas. ......................................... 40
Tabla 5 Definición operacional de las variables cuantitativas. ....................................... 41
Tabla 6 Características de la muestra estudiada.............................................................. 54
Tabla 7 Mujeres con nacimiento vía cesárea que tuvieron trabajo de parto. .................. 55
Tabla 8 Cantidad de leche extraída en los nacimientos vía vaginal. ............................... 56
Tabla 9 Cantidad de leche extraída en los nacimientos vía cesárea. ............................... 56
Tabla 10 Concentración de ADN obtenida de las muestras ............................................. 58
Tabla 11 Relación de números en placa de gel con ID de protocolo. .............................. 60
Tabla 12 Pureza del ADN extraído, mediante espectrofotometría. .................................. 61
XII
Figura 2: Volumen de leche obtenida por grupo. ............................................................. 57
Figura 3: Fotografía del ADN en gel muestras 1 a 6........................................................ 59
Figura 4: Fotografía del ADN en gel muestras 7 a 12 ..................................................... 59
Figura 5: Fotografía del ADN en gel muestras 13 a 19 ................................................... 59
Figura 6: Fotografía del ADN en gel muestras 42 a 49.................................................... 60
Figura 7: Fotografía del ADN en gel muestras 52 a 58.................................................... 60
1
Resumen
Caracterización de la microbiota, en leche humana temprana, de madres con diabetes
mellitus gestacional
El estudio de la microbiota ha sido un tema de investigación candente en la última
década. A la microbiota se le atribuyen efectos en la salud y en la enfermedad. Las
bacterias de la leche materna componen hasta 40% de las bacterias intestinales del recién
nacido durante el primer mes de vida. En este estudio se estableció una cohorte de
binomios materno-neonatales con embarazos normales y complicados con diabetes
mellitus gestacional. Esta cohorte, permitirá en una segunda etapa caracterizar la
microbiota mediante secuenciación de ADN. Se recolectaron muestras de 22 binomios
que cursaron embarazo sin complicaciones para el grupo control, y 19 binomios que
cursaron con diabetes mellitus gestacional para el grupo de estudio. Previa autorización
por comités de ética e investigación de todas las instituciones relacionadas, así como de
obtención de consentimiento informado por escrito, se tomaron muestras de leche, sangre
materna, sangre fetal, placenta, líquido amniótico y meconio. Las muestras fueron
procesadas por el departamento de biotecnología del Tecnológico de Monterrey y
posteriormente enviadas a un laboratorio nacional Conacyt, para la secuenciación.En
promedio,el contenido de ADN de las muestras fue de 86 ng/µL. Se extrajo y purificó
ADN de 34 muestras, 19 del grupo control y 15 del grupo que cursó con diabetes mellitus
gesatacional. La pureza del ADN obtenido fue ideal en el 88% de las muestras, y en 4 de
ellas (12%) el cociente A260/280 y A260/230 es sugestivo de contaminación por
proteínas, fenoles y sales.
Antecedentes
Existen ciertas condiciones en la salud materna bajo las cuales se compromete el
desarrollo fetal. En México existe una alta prevalencia de mujeres con sobrepeso y
obesidad, y gran número de mujeres embarazadas con sobrepeso que desarrollan diabetes
gestacional y preeclampsia.1,2 Se ha documentado que existe una correlación directa entre
el padecimiento de estas enfermedades durante el embarazo con el desarrollo fetal y
morbimortalidad neonatal. Es importante determinar si la leche humana de madres que
padecen sobrepeso, diabetes gestacional o preeclampsia tienen una diferente
caracterización de la microbiota, la cual puede tener un impacto en la composición de la
microbiota intestinal del neonato y lactante.
Pregunta de investigación
Las condiciones maternas bajo las cuales se origina y se desarrolla un embarazo
(Variable independiente) ¿Son capaces de modificar el metagenoma de la lecha materna
temprana (Variable dependiente)?
¿Es sensible la microbiota de la leche humana temprana (VD) a las condiciones
maternas bajo las cuales se origina y desarrolla un embarazo (VI)?
¿Que efecto tiene la composición taxonómica de la microbiota de la leche materna
de madres afectadas con los padecimientos mencionados (VI) sobre la microbiota
intestinal del bebe (VD)?
Hipótesis
Dado que se trata de un estudio observacional, descriptivo y transversal, no se
establece una hipótesis a priori.
3
Objetivo general
El presente trabajo corresponde a la primera sección de un trabajo de largo
aliento, en el cual se pretende estudiar y caracterizar los elementos diferenciales de la
microbiota de la leche humana temprana de binomios madre-hijo, de la zona
metropolitana de Monterrey con diversas patologías durante el embarazo. Las patologías
estudiadas en el trabajo principal son diabetes mellitus gestacional, obesidad materna,
preeclampsia, parto pretérmino, y obesidad en parto pretérmino.
El objetivo primario de la primera sección de este trabajo, consiste entonces en
establecer una cohorte de binomios materno-neonatales, atendiendo a la representación en
la misma de las principales patologías asociadas al embarazo en nuestro país, de modo
que en etapas sucesivas de esta cohorte, se procederá al estudio y caracterización de los
elementos diferenciales de la microbiota de la leche humana temprana de binomios madre
e hijo de la zona metropolitana de Monterrey, que cursaron con alguna de esas patologías
mencionadas. En el caso de esta tesis, la patología de interés inmediato es la diabetes
gestacional, cuya importancia epidemiológica se describe posteriormente.
Objetivos secundarios
1. Se describirá el metagenoma de la leche humana temprana en las condiciones de
un embarazo a término, en madres adultas, con edad entre 18 y 34 años, con
índice de masa corporal entre 18.5 y 24.9, sin complicaciones intercurrentes y
con control prenatal adecuado.
2. Se describirá el metagenoma de la leche humana temprana en madres adultas,
con edad entre 18 y 34 años, con índice de masa corporal entre 20 y 29.9, con
4
embarazo de cualquier duración, que reúnan los criterios de Diabetes mellitus
gestacional, con control prenatal adecuado.
3. Se determinará si existe diferencia en el metagenoma obtenido, en cuanto a la
proporción de los géneros de microorganismos y la diversidad de éstos,
considerando al grupo de mujeres sanas como el grupo control.
Objetivos exploratorios
1. Se caracterizará la microbiota intestinal de los neonatos pertenecientes a los
binomios estudiados.
2. Se caracterizará la microbiota del tejido placentario de los binomios estudiados.
3. Se caracterizará la microbiota de líquido amniótico de los binomios estudiados
que tuvieron nacimiento mediante cesárea.
4. Se compararán los hallazgos entre las diferentes muestras biológicas.
Justificación
No existen al momento de realizar este trabajo, estudios en los cuales se haya
descrito la microbiota de la leche materna en mujeres que cursaron con diabetes mellitus
gestacional. Solo existe un trabajo de caracterización de microbiota en leche materna de
mujeres mexicana, realizado por Amezcua y cols.3 En el estudio de Amezcua únicamente
se identificaron microorganismos del tipo Lactobacillus, debido a la tecnología utilizada,
que no ofrecía posibilidades más allá del cultivo de organismos ya conocidos, lo que deja
abierta la posibilidad de no haber incluido todos los organismos no cultivables.
El presente estudio pretende determinar los componentes taxonómicos
diferenciales de binomios madre-hijo de la microbiota de la leche materna de madres con
5
diabetes gestacional y de la microbiota intestinal de sus hijos, con respecto a un grupo
control de binomios sanos.
Alcance del estudio
Este trabajo se lleva a cabo en un hospital regional, que atiende a mujeres de la
zona metropolitana de Monterrey y el resto de los municipios de Nuevo León, por lo que
tiene una limitación geográfica a esa región. Los hallazgos no se pueden extrapolar a la
población que se encuentra fuera del área descrita. Una de las principales fortalezas del
estudio, es la cantidad de pacientes que se recolectan, además de ser el primer estudio de
caracterización de la microbiota de la leche materna mediante técnicas de secuenciación
de Ácido desoxirribonucleico (ADN) realizado en mujeres mexicanas. Debido a que es de
los primeros estudios de su tipo, se trata de un estudio exploratorio, transversal y
descriptivo. Tendrá la capacidad de originar nuevas hipótesis y preguntas de
investigación a partir de los resultados obtenidos. Se identifica un área de oportunidad en
la posibilidad de dar seguimiento a los sujetos recolectados, y realizar análisis de la
microbiota de manera longitudinal, para ver las características de la microbiota a través
del tiempo. Convirtiéndose de esta manera en un estudio longitudinal.
6
Introducción
Tradicionalmente, se consideraba que el feto humano sano se desarrollaba dentro
de un ambiente libre de bacterias, y al nacimiento, se expone a una amplia variedad de
microbios, muchos de los cuales son provistos por la madre durante y después del pasaje
a través del canal de parto, un ecosistema ricamente colonizado por una variedad
relativamente limitada de categorías taxonómicas bacterianas.4,5
Este concepto ha sido recientemente retado por Aagaard y colaboradores, quienes
han demostrado que, en placentas de embarazos considerados sanos, se alberga un
microbioma consistentemente diferente del de otras partes del cuerpo, limitado en
variedad, pero muy rico en actividad metabólica, con un perfil semejante al de la
microbiota oral. En condiciones específicas, la microbiota de la placenta guarda una
fuerte asociación en cuanto a su composición con antecedentes de infección urinaria
materna en el primer trimestre del embarazo y nacimiento pretermino.6
Los neonatos a término desarrollan tolerancia inmunológica generada a través de
la inducción materna preferencial de células T reguladoras,7 que favorecerían la
colonización neonatal por el inóculo de microorganismos presentes en su medio.
Solamente una fracción de los microbios a los que el neonato es expuesto inicialmente
colonizan permanentemente los nichos disponibles y contribuyen a la microbiota
distintiva alojada en el cuerpo del individuo adulto. 8–11 Se sabe también que,
independientemente de la vía de nacimiento, las comunidades bacterianas que alojan los
bebés son muy semejantes entre los diferentes sitios de su organismo, a diferencia del
individuo adulto, que alberga diferentes tipos de organismos en diferentes sitios de su
7
cuerpo. Se ha descrito que los bebés nacidos por vía vaginal se colonizan preferentemente
por organismos semejantes a la microbiota del canal vaginal materno, dominados por
Lactobacillus, Prevotella, o Sneathia spp. Los recién nacidos mediante cesárea alojan
comunidades bacterianas semejantes a las de la piel de sus madres, dominadas por
Staphylococcus, Corynebacterium, y Propionibacterium spp. Estos hallazgos establecen
un fundamento para el estudio y rastreo del desarrollo del microbioma en relación a la vía
de nacimiento.12
La leche humana contiene una serie de componentes de los que carecen las
fórmulas, entre los cuales se incluyen inmunoglobulinas, citocinas, factores de
crecimiento, lisozima, lactoferrina y oligosacáridos de la leche humana (HMO por sus
siglas en inglés). Los HMO son carbohidratos especialmente abundantes en la leche
humana, con función similar a los prebióticos, estimulan el crecimiento de
Bifidobacterium spp y quizá de Lactobacillus spp de tal modo que alteran la composición
microbiana del intestino del neonato y lactante. Se han descrito más de 200 HMO, la
mayoría contienen un núcleo de lactosa, modificado covalentemente por fucosilacion y/o
sialilacion. Algunos HMO comparten dominios estructurales de glicanos, los cuales se
cree que funcionan como señuelos que previenen la adhesión de patógenos a los
enterocitos. En neonatos alimentados predominantemente con fórmula, se ha reportado
mayor proporción de colonización por Clostridium, particularmente C. difficile.13–23
En recién nacidos pretérmino, los estudios acerca de la microbiota se han
enfocado principalmente a conocer los cambios asociados a condiciones con alta
morbilidad, como la enterocolitis necrosante, en los cuales se reporta que hay una
reducción en la diversidad microbiana intestinal, comparando con neonatos pretérmino no
8
enfermos,24 mientras que otros estudios han reportado una proporción más abundante de
Proteobacteria, incluyendo Citrobacter spp.25
Muy poco se sabe acerca de este proceso de establecimiento del microbioma en
otras condiciones perinatales que son relativamente más frecuentes en la práctica clínica,
entre ellas, el embarazo complicado por sobrepeso-obesidad materna, los estados de
diabetes gestacional, la preeclampsia, y especialmente, las diferencias entre la población
de neonatos a término y pretérmino tardío en estas condiciones, las cuales son el foco de
atención de este estudio.
Lactancia materna
Según el Fondo de las Naciones Unidas para la Infancia (UNICEF), a nivel
mundial el 38% de los niños menores de 6 meses que viven en países en vías de
desarrollo reciben lactancia materna exclusiva. En México la lactancia materna es menor
a lo que recomienda la OMS, y desciende rápidamente con la edad del niño. Actualmente
la duración promedio de alimentación al pecho materno en México es de 10 meses, sin
embargo, solo 14% de las madres que dan pecho materno lo realizan de forma
exclusiva.26
Beneficios de la lactancia
Según datos del UNICEF, si todos los niños se alimentaran con leche materna
desde la primera hora de vida, de manera exclusiva hasta los 6 meses de vida, y
continuaran hasta los dos años, se evitarían 800 mil muertes infantiles cada año.27
La leche materna tiene beneficios demostrados en lo que corresponde a nutrición,
función gastrointestinal, sistema inmune, y bienestar psicológico. Varios de los
componentes de ésta, estimulan el desarrollo gastrointestinal y la motilidad, favoreciendo
la maduración del tracto gastrointestinal. Tiene además factores protectores para
disminuir el riesgo de enterocolitis necrosante y otras infecciones.28
La leche materna tiene función antimicrobial, ya que posee agentes
antimicrobianos que persisten incluso después de la lactancia. Estos agentes resisten a las
enzimas digestivas, y actúan como barrera a nivel de mucosas. Se componen de
proteínas: lactoferrina, Inmunoglobulina A (IgA) y lisozimas. Contiene lípidos, tales
como ácidos grasos libres y monoglicéridos, que actúan lisando virus, bacterias y
10
protozoarios.29 Los hidratos de carbono que contiene son oligosacáridos y glicoproteínas.
Éstos se encargan de favorecer la colonización intestinal por Bifidobacteria y
Lactobacillus.
Comparada con la fórmula, se ha demostrado que la leche materna incrementa la
velocidad de vaciamiento gástrico. Tiene beneficios específicos para los recién nacidos
prematuros, como incremento de la actividad de lactasa intestinal, disminución de la
permeabilidad intestinal, y disminución del riesgo de enterocolitis necrosante (ECN). El
efecto final de todas estas sustancias es que la leche materna, comparada contra la
fórmula, disminuye el riesgo de enfermedades mientras el lactante sea alimentado con
ésta.30 En países en vías de desarrollo la morbimortalidad es menor en los lactantes
alimentados al seno materno.31
Desarrollo de la glándula mamaria
La glándula mamaria del humano es el único órgano que no contiene todos sus
tejidos rudimentarios desde el nacimiento.32 Experimenta cambios importantes a través de
la vida de la mujer, desde la menarca, embarazo, lactancia y finalmente la involución.
El esbozo mamario aparece en la cuarta semana de gestación, cuando el embrión
mide apenas 2.5 milímetros (mm)…