Cai si retele de transmitere a semnalelor celulare

Celulele organismului functioneaza ca un tot unitar. Ele emit

permanent ,,mesaje” sub forma de molecule specifice care dicteaza celulelor

receptoare ceea ce trebuie sa faca astfel incat organismul sa se adapteze permanent la

conditiile de mediu. Aceste mecanisme de semnalizare celulara sunt repartizate in

mai multe sisteme specializate.

Un sistem de specializare este un dispozitiv care permite transmiterea la

distanta a unei informatii numita semnal. Destinatarul trebuie sa capteze mesajul, s ail

inteleaga sis a il aplice adaptandu­si propriul comportament la ,,ordinul” primit.

Semnalizarea biologica corespunde acestei descrieri. Clasic se disting 2 tipuri majore

de semnalizari biologice: semnalizarea nervoasa si semnalizarea hormonala.

In primul caz, mesajul este transmis la distanta de­a lungul unui filet nervos prin

intermediul unui fenomen electric­influxul nervos. In al II­lea caz, mesajul este

transmis sub forma unei substante chimice cu structura definite­numita mesager

primar, care circula pe cale sangvina catre celulele de destinatie. Cele 2 tipuri de

semnalizare, odata ajunse la destinatie, folosesc acelasi tip de molecule si reactii

chimice.

In afara acestor 2 cai majore de semnalizare, exista si sisteme de mesagerie

localizata, care actioneaza la nivelul anumitor organe si care moduleaza sistemul

neuroendocrin.

Mesagerul primar

Liganzii naturali, extracelulari, care se fixeaza la un receptor si pe care ulterior

il activeaza se numesc mesageri primari. Acestia se pot clasifica in hormoni,

neurotransmitatori, citokine, limfocite, factori de crestere (GF), chemoatractanti, etc.

Fiecare din acesti termeni defineste o clasa de agenti care actioneaza intr­un mod

particular. Totusi actiunile acestor agenti se pot si suprapune. Exemple de agenti

chimici care functioneaza ca mesageri primari sunt ilustrate in tabelul I.

Tabel I. Exemple de mesageri primari gasiti in circulatie

Clasa Mesagerul Originea Celula tinta Efecte majore

Adrenalina MSR Cord

Tesut muscular

neted

Muschi si ficat

Tesut adipos

↑ frecventei cardiace

↑ tensiunii arteriale

Contractie sau

dilatatie

Glicogenoliza

Lipoliza

Noradrenalina MSR Arteriole Vasoconstrictie

Serotonina Trombocite Arteriole si venule Vasodilatatie si

↑permeabilitatii

vasculare

Mesageri derivati

din aminoacizi

Histamina Mastocite

Bazofile

Arteriole si

venule

Vasodilatatie si

↑permeabilitatii

vasculare

Insulina Celule

Β­pancreatice

Tesuturi multiple Glicogeneza

Intrarea glucozei in

celula

Proteingeneza

Lipogeneza

Factor de crestere

Glucagon Celule

α­pancreatice

Ficat

Tesut adipos

Glicogenolisa

Lipoliza

Gastrina Intestin Stomac Secretia HCl si a

pepsinei

Secretina Intestine subtire Pancreas Secretia si digestia

enzimelor

Colecistokinina Intestine subtire Pancreas Secretia si digestia

enzimelor

Factor natriuretic

atrial

Cord Rinichi Natriureza

Hormoni

peptidici

ACTH Hipofiza anterioara Tesut adipos Lipoliza

Producerea de

cortizol si

aldosteron

FSH Hipofiza anterioara Foliculi ovarieni Crestere

Sinteza de estrogeni

LH Hipofiza anterioara Foliculi ovarieni Maturare Sinteza de

estrogen si

progesterone

TSH Hipofiza anteriora Tiroida Sinteza si eliberarea

hormonilor

tiroidieni

PTH Paratiroida Rinichi Reabsorbtia Ca²+

Vasopresina Hipofiza posterioara Rinichi Reabsorbtia apei

Vasoconstrictie cu

cresterea tensiunii

arteriale

Ocitocina Hipofiza posterioara Uter

Canale galactofore

Stimuleaza travaliul

Ejectia laptelui

EGF (factor de

crestere

epidermic)

Multiple tipuri de

celule

Epiderm si alte

tipuri de celule

Crestere celulara

Somatotropina

(GH)

Hipofiza anterioara Ficat Productia de

somatomedine

Somatomedine 1

si 2 (IGF I si IGF

II)

Ficat Os, muschi si alte

celule

Crestere celulara

Factori de

crestere (GF)

(vor fi prezentati

intr­un capitol

separat)

TGF β Multiple locatii Multiple Controlul cresterii

celulare

Eicosanoide Prostaglandine Majoritatea celulelor Multiple Inflamatie

Vasodilatatie

Hormoni

tiroidieni, T3, T4

Tiroida Multiple Crestere si

diferentiere celulara

Hormoni

liposolubili

Progesterone Corp galben

Placenta

Endometru uterin Mentinerea sarcinii

Hormonii

Hormonii sunt in general secretati in cantitati mici de cellule la distanta de

organele tinta. Odata intrati in circulatie ei sunt diluati in masa de sange, o parte

degradati de enzimele existente iar o parte se fixeaza de proteinele transportoare. Toate

aceste 3 mecanisme micsoreaza foarte mult cantitatea de hormone liber, disponibil

pentru celula tinta. De aceea, pe celula tinta se gasesc receptori de mare afinitate, care

ii fixeaza rapid si declanseaza un raspuns din partea celulei.

GH

Sunt agenti de natura peptidica absolute necesari celulei sa depaseasca punctele

de control “check points” din ciclul cellular. In lipsa lor nu are loc replicarea ADN si

respective proliferarea celulara.

Ca si hormonii, GH au receptori de mare afinitate care pot declansa multiple cai

de semnalizare. Pe langa efectul stimulator (inhibitor) asupra ↑ celulare, acesti agenti

chimici mai pot initia moartea celulara programata (apoptoza), diferentierea celulara si

expresia genica. Fata de hormoni, in general GH actioneaza local, de tip paracrin /

autocrin.

Citokinele

In paralel cu descoperirea GH, s­au identificat si agenti chimici care

interactioneaza cu celulele sistemului imun. Deoarece acesti compusi activeaza /

moduleaza proliferarea acestei clase de celule, initial au fost denumite imunocitokine.

Dar pentru ca actioneaza si pe celule din afara sistemului imun, actual se accepta

termenul de citokine. Functia GH si a citokinelor e atat de diversa incat o distinctie

intre aceste 2 clase nu se poate face. Astfel citokinele includ atat GH de tipul PDGF,

EGF, insulina cat si molecule ca interferon, TNFα, numeroase interleukine, GM­CSF

si altii. Chemokinele sunt citokine care au rol in inflamatie prin recrutarea celulelor

inflamatorii ­ prin chemoxie ­ la nivelul focarului inflamator si ulterior activarea

acestor celule.

Agenti vasoactivi

Orice distructie tisulara (cauzata fizic sau de un agent infectios) genereaza un

raspuns inflamator. Pentru recrutarea leucocitelor are loc o vasodilatatie si o crestere a

permeabilitatii vaselor locale. Aceste fenomene sunt declansate de histamine (eliberata

din bazofile si mastocite), serotonina (eliberata de trombocite) si de agenti

proinflamatori ca bradikinina.

Eicosanoizii sunt o alta clasa cu efecte vasoactive. Ei deriva din acidul

arahidonic si cuprind prostaglandine (PG), tromboxani (Tx), leucotriene (LT). Acesti

agenti actioneaza in maniera paracrina si autocrina, controland multiple functii

celulare atat in conditii fiziologice cat si patologice.

Neurotransmitatori si neuropeptide

Neurotransmitatorii sunt de asemenea, mesageri primari dar sunt eliberati si

detectati la nivelul sinapselor. In celula presinaptica neurotransmitatorul este stocat in

niste vezicule. In momentul depolarizarii membranei presinaptice, se produce fuziunea

acestor vezicule cu membrana si elibereaza neurotransmitatori in fanta sinaptica. Din

fanta, prin difuzie, mediatorul ajunge la nivelul membranei postsinaptice unde se

fixeaza pe receptorul de mare afinitate, initiind un influx nervos sau raspuns cellular.

In SNC, glutamatul are efect in principal excitator, in timp ce acidul gma­aminobutiric

(GABA) si glicina sunt inhibitori. Acetilcolina (Ach) isi exercita functia in special pe

jonctiunea neuromusculara si are efect excitator.

Hormoni lipofilici

Aceasta clasa de hormoni difera de hormonii hidrosolubili prin mai multe

caracteristici. Din punct de vedere structural sunt steroizi si hormoni tiroidieni. Fiind

liposolubili, in plasma circula fixati de proteine transportoare. Odata ajunsi la nivelul

celulelor tinta, penetreaza membrana celulei si isi gaseste receptorul fie in citoplasma,

fie in nucleu.

Complexul H­R format va trece in nucleu, unde se va fixa pe o regiune

specifica din promotorul unei gene – numita HRE ( “hormone response element”) –

ceea ce va determina transcriptia acelei gene si secundar sinteza unei proteine. In afara

influentei asupra transcriptiei genice, acesti hormoni pot actiona si prin alte mecanisme.

De exemplu, progesteronul are 2 efecte principale: intracelular activeaza transcriptia

unor proteine specifice implicate in mentinerea sarcinii, iar la nivel membranei

celulare stimuleaza internalizarea receptorului pentru oxitocina, scazand efectul

acestui hormon asupra uterului gravid.

Astfel in tabelul II sunt prezentate diferentele generale intre hormonii

hidrosolubili si liposolubili.

Tabel .II. Principalele caracteristici ale hormonilor hidrosolubili si liposolubili

Hormoni hidrosolubili Hormoni liposolubili

Transport sangvin Liber Legat de proteina specifica

T½ ↓ ↑

Receptor Membranar Intracelular

Mesager da nu

Receptori hormonali

Sensibilitatea unei celule la actiunea unui hormone este determinate de prezenta

pe suprafata / intracelular a unui component proteic capabil sa recunoasca hormonal,

sa­l fixeze sis a initieze raspunsul specific. Aceasta proteina se numeste receptor.

Specificitatea receptorului este foarte mare.

Substantele care fixate pe receptori ii activeaza se numesc agonisti, iar

substantele care fixate pe receptori ii inhiba se numesc antagonisti.

Dintre receptorii celulari, cei mai bine studiati sunt receptorii pentru Ach si receptorii

pentru adrenalina (A), noradrenalina(NA).

Receptorul pentru Ach

Ach este un mesager primar care interactioneaza cu receptorul si care nu are

functie hormonala. Se gaseste la nivelul sinapselor sistemului nervos somatic si in

sinapsele sistemului nervos parasimpatic.

Clasic receptorii pentru Ach sunt nicotinici si muscarinici.

Receptorii muscarinici se gasesc la nivelul cordului si prin stimulare scad frecventa

cardiaca si forta de contractie. Apartin familiei de receptori care traverseaza de 7 ori

membrane celulara (7TM – “seven transmembrane spanning”) si sunt cuplati cu

proteine G. Se cunosc 5 subtipuri de receptori muscarinici M1, M2, M3, m4 si

m5.Toate cele 5 subtipuri se gasesc in sistemul nervos central. Receptorii M1 sunt

exprimati la nivelul sinapselor ganglioare si intr­o serie de ganglioni secretorii. M2 se

gasesc in miocard si muschiul neted iar M3 se gasesc atat in muschiul neted cat si in

glandele secretorii ( tabelul III ).

Tabel III. Subtipuri de receptori muscarinici

Subtip Antagonist Tesut Transductor Efector

M1 Atropina

Pirenzipina

Sinapsa

Ganglioni

Gq Fosfolipaza C

(↑concentratia intracelulara a

calciului )

M2 Atropina

AF­DX 38Y

Miocard

Tesut muscular

Gi, Go Activarea canalelor de K + ,

inhibarea adenilat ciclazei

(AC)

M3 Atropina Tesut muscular

neted

Glande

secretorii

Gq Fosfolipaza C (↑Ca

intracitoplasmatic)

m4 Atropina

AF­DX 38Y

Gi, Go Inhibitor al adenilat ciclazei

m5 Atropina Gq Fosfolipaza C (↑Ca

intracitoplasmatic)

Ca si receptorii pentru A, semnalul intracelular este transmis mai departe prin

intermediul proteinelor G. M1 si M3 si probabil m5 activeaza fosfolipaza C (PLC),

ceea ce va determina liza fosfatidilinozitol4,5difosfat (PIP2) in diacil glicerol (DAG) si

inozitol trifosfat (IP 3 ), mesageri care vor mobiliza Ca 2+ din depozite. M2 si m4

activeaza subclasa Gi a proteinei G, cu inhibarea AC. si activarea canalelor pentru K + .

Receptori nicotinici

Se gasesc la nivelul placii motorii neuromusculare, stimuland contractia

musculaturii scheletice. Acest tip de receptori functioneaza ca niste canale nespecifice

atat pentru Na+ cat si pentru K.

Acesti receptori apartin familiei de receptori ionotropi alaturi de receptorii

pentru serotonina, glicina, GABA, ultimii 2 fiind canale pentru anioni, raspunzand la

liganzi care determina inhibitie.

Receptorul nicotinic este un hexamer membranar, cu doua subunitati identice, si

complexul cuprinde α2, β, γ (fig. 1)(fig. 3.7). Toate subunitatile sunt necesare pentru

buna functionare a receptorilor. ACH se fixeaza in niste buzunare formate la

interfetele celor doua subunitati α cu δ si γ. Ambele situsuri trebuie sa fie ocupate

pentru ca receptorul sa se activeze sis a trimita mai departe semnalul celular. Structura

primara a subunitatilor arata un grad mediu de omologie (35 ­ 40%) intre subunitati

sugerand ca ar avea un stramos ancestral comun.

Fig. 1 Organizarea receptorului nicotinic

Fiecare subunitate este alcatuita dintr­un peptid care traverseaza de 4 ori

membrane, aceste domenii transmembranare fiind notate M1, M2, M3, M4 si sunt

formate din aminoacizi hidrofobi. Atat capatul N terminal cat si C terminal al fiecarei

subunitate este localizat extracelular. Capatul N terminal este glicozilat (fig2)( fig.3. 9).

Canalul ionic propriu zis este format din fragmentul M2 care apartine tuturor celor 5

subunitati.

Fig. 2. Receptor nicotinic

a. Organizarea membranara a unui singur lant peptidic

b. Subunitatile membranare M2 formeaza un canal ionic

Alti receptori ionotropici

Receptorul pentru serotonina (5HT), GABA, glicina se aseamana cu receptorii

nicotinici. GABA si glicina regleaza canalele pentru Cl si neuronii inhibitori ai

sistemului nervos central. Cand aceste canale se deschid, Cl intra in celula

determinand hiperpolarizarea acesteia si in consecinta scaderea excitabilitatii acelui

neuron.

Glutamatul are receptori diferiti; in primul, acesti receptori au efecte

stimulatoare si sunt alcatuiti din subunitati, fiecare subunitate traversand numai de 3

ori membrane celulara, astfel incat capatul N­terminal si C­terminal se gaseste

extracelular , respective intracelular. In acesti receptori echivalentul subunitatii M2

este rudimentar, intra in membrana si iese de aceeasi parte ( citoplasmatica ).

Familia receptorului serpentina (superfamilia 7TM)

Sunt receptori alcatuiti dintr­un singur lant polipeptidic care traverseaza de 7 ori

membrane celulara. Capatul N­terminal este extracelular iar C­terminal in interiorul

celulei (fig. 3.)

Fig. 3. Structura receptorilor serpentina

a. Rodopsina

b. Receptor β2 adrenergic

Domeniile transmembranare sunt alcatuite din aminoacizi hidrofobi.

Fragmentele extracelulare au rol in recunoasterea H si ulterior transmiterea mesajului

catre sistemul transductor. In tabelul IV sunt exemplificate subtipurile de receptori

7TM si in (fig 4). sunt exemplificate situsurile de legare a mesagerilor primari.

Fig. 4. Situsurile de legare ale receptorilor serpentina

Tabel nr IV. Subtipuri de receptori serpentina

Proprietatile receptorului Ligand

Ligandul se fixeaza intr­un miez

alcatuit din toate cele 7 elicii

transmembranare

­ 11­cis retinal (rodopsina)

­ ACH

­ Catecolamine

­ Amine biogene (histamina, serotonina)

­ Nucleozide si nucleotide

­ LT, PG, PGi, Tx

Ligandul (un peptid scurt) se fixeaza

partial in regiunea hidrofoba la nivelul

buclelor extracelulare

­ Hormoni peptidici: ACTH, glucagon,

GH, PTH, calcitonina

Ligandul stabileste contacte atat cu

segmentul N­terminal cat si cu buclele

extracelulare

­ Hormoni hipotalamici (TRH, GnRH)

Ligandul induce o reorganizare a

segmentului N­terminal

­ Receptori pentru neurotransmitatori

(GABA, glutamate)

­ Receptori pentru Ca : de exemplu

receptorii de pe suprafata celulelor celulelor

paratiroidiene si tiroidiene (secretia de

calcitonina)

Liganzii activeaza functia proteinazica

a receptorilor

­ IIa , tripsina

Din clasa receptorilor 7TM, cei mai bine caracterizati sunt receptorii

adrenergici, cele doua clase de receptori adrenergici α si β, cu subclase α1, α2, β1, β2.

Efectele catecolaminelor pe receptorii adrenergici sunt redate in tab.V.

Tabel V. Efectele biologice ale catecolaminelor

α β

Arteriole Vasoconstrictor in viscere

(cu exceptia ficatului)

Vasodilatator pe vasele

muschilor scheletici si

ficatului (β2)

Bronhiole ­ Bronhodilatator (β2)

Muschi uterin Contractie (α1) Contractie (β2)

Miocard ­ Efect inotrop pozitiv

(↑contractilitatea cordului,

β 1 )

Creste frecventa cardiaca

(β 1 )

Muschi intriseci ai globului

ocular

Pupilodilatator (α1) ↓ presiunii intraoculare (β 2 )

Muschi scheletici ­ Glicogenoliza (β 2 )

Ficat Glicogenoliza (α 1 ) Glicogenoliza (β 2 )

Tesut adipos Inhibarea lipolizei (α2) Lipoliza (β1)

Pancreas Inhiba secretia de insulina

(α 2 )

Stimuleaza secretia de

insulina (β 2 )

Tr Inhiba agregarea Tr (α 2 ) ­

Fixarea ligandului la receptor, determina modificarea informationala a acestuia,

cu deplasarea buclelor extracelulare (fig. 5) in jurul ligandului si a buclelor

intracelulare in jurul subunitatii α a proteinei G, ceea ce va determina activarea

acesteia.

Fig. 5. Deplasarea elicelor intramembranare determina modificarea conformatiei

proteinei G cu activarea sa

Fosforilarea receptorilor si inhibarea transmisiei celulare

Receptorii muscarinici si adrenergici, fosforilati la resturile de la serina/treonina

din capatul C terminal (fig. 3) devin tinte pentru legarea de arestina care astfel

ii ,,prepara” eliminarea lor prin endocitoza. Acest mechanism are importanta la nivelul

sinapselor, prevenind transmiterea in exces a influxului nervos in neuronal

postsinaptic/organul tinta.Mai mult, in timp ce fosforilarea previne comunicarea cu

proteinele G (desensibilizarea receptorilor), legarea (necovalenta) de arestina il

transforma in substrat pentru protein kinaza tirozin specifica solubila Src. Aceasta

noua fosforilare initiaza o noua cale de semnalizare pe seama MAP­kinazelor.

Pe masura ce concentratia stimulului creste, fosforilarea receptorului (si in consecinta

inactivarea lui) se realizeaza cu doua enzime: PKA (protein kinaza c­AMPdep) si

βARK (β adrenergic receptor kinase). Cele doua kinaze actioneaza situsuri diferite din

domeniul C terminal a receptorului (fig.3). Activarea PKA se face in conditiile unei

concentratii medii a stimulului, in timp ce activarea βARK se produce la concentratii

crescute ale ligandului. Prin fosforilare, receptorul devine inactive sin u mai poate

activa anticorpii, deci transmitere semnalului este blocata.

PKA fosforileaza atat receptorul care a activate­o cat si receptorii situati in apropiere si

care prezinta aceeasi secventa de aminoacizi (desensibilizare heterologa). βARK,

activata de sbunitatea βγ, fosforileaza numai receptorul care are in apropiere aceste

subunitati (desensibilizarea homologa) (fig. 6).

Fig. 6. Desensibilizarea receptorilor β adrenergici

a. de tip heterolog

b. de tip homolog

Proteinele G

Din punct de vedere structural se disting doua clase de proteine G: trimere (50

KDa) si monomere (21 KDa).Primele sunt permanent fixate de fata interna a

membranei plasmatice, pe cand proteinele mici, monomere, circula liber in citoplasma.

Ambele tipuri de proteine G (trimere si monomere) au rolul de a traduce celulei

semnalul primit de la complexul H­R, fenomen denumit transductie.

Proteinele G trimere­ au fost primele descries si sunt formate din 3 subunitati

α, β, γ. Subunitatea α contine situsul de fixare pentru GDP (in repaus). In repaus

proteinele G fixeaza GDP si este ancorata de fata interna a membranei prin legaturi

hidrofobe.

Activarea proteinelor G este redata in (fig7).

Fig. 7. (1) activarea proteinei G prin schimb cu GTP;

(2) activarea GTP­azei intrinseci cu revenirea la forma de repaus a proteinei G

In repaus, proteina G este in contact cu receptorii si are fixat de subunitatea α

nucleotidul GDP.In momentul fixarii H de R, are loc o modificare conformationala a

receptorilor si rapid subunitatea α pierde GDP si fixeaza GTP. In acest moment se

produce si disocierea complexului cu eliberarea H­R care poate fixa si active o noua

proteina G. Astfel, in acest punct are loc o prima amplificare a semnalului Indus de

ligand. Proteinele G disociaza: α­GTP de βγ, iar α­GTP va modula activitatea unei

enzime implicate in sinteza unei molecule­ mesager secund.

Ireversibilitatea ciclului este determinate de clivarea moleculei GTP in GDP si

Pa, de catre GTP­aza intriseca subunitatea α. GDP ramane fixata de subunitatea α, care

revine la forma de repaus, recupleaza βγ si ciclul se poate relua.

Recent s­au descoperit o clasa de proteine RGS (regulator of G­protein

signaling), care contine cel putin 20 de membri, implicate in activarea functiei GTP­

azice a subunitatii α a proteinei G; actionand ca reglatori de mare viteza a unor variate

procese fiziologice. Aceste proteine G heterotrimere sunt cuplate cu receptorul 7TM.

Proteinele G sunt diferite prin subunitatea α, care ii imprima functii diverse. Se cunosc

pana in present patru mari clase de proteine G: Gs, Gi, Gq111, G12 cu numeroase

subclase (fig. 8).

Fig. 8. Omologia structurala dintre subunitatile α ale proteinei G

Actual si dimerului βγ i se atribuie functii diverse:

• asigura localizarea , cuplarea efectiva si dezactivarea subunitatii α;

• regleaza afinitatea receptorului pentru liganzii sai;

• reduce tendinta GDP de a disocia pe subunitatea α (astfel stabilizand formele

inactive);

• toxina pertusis produce ADP­ribozilarea subunitatii α numai in prezenta

dimerului βγ;

• interactioneaza direct cu o serie de efectori situati mai jos in lantul de

transmitere intracelulara;

• regleaza fosforilarea unor receptori de catre kinazele specifice.

Proteinele G activate (forma α­GTP) transmit semnalul unor enzyme

generatoare de mesager second: astfel subgrupa αs­GTP activeaza AC, enzima

responsabila de transformarea ATP in cAMP, compus de numit mesager second

deoarece sinteza sa este dependenta de mesagerul primar­ hormonul. Mai mult, odata

sintetizat, mesagerul secund transmite intracelular semnalul preluat de la primul

mesager. cAMP este o molecula mica, hidrosolubila, care difuzeaza rapid in

citoplasma activand o kinaza specifica denumita protein kinaza cAMP dependenta

(PKA). Din punct de vedere structural PKA este un tetramer format din 2 subunitati

reglatorii R si 2 subunitati catalitice C (R2C2). Mediatorul secund cAMP se fixeaza de

subunitatile R ale PKa disociindu­le de subunitatile C, care fiind libere devin active.

PKa astfel activate, recunoaste numeroase substrate:

• fosforileaza proteine care devin “canale pentru apa”, asigurandu­se astfel

la nivel renal reabsortia apei;

• fosforileaza proteine de pe diverse cai metabolice – de exemplu

fosforilaz­kinaza care devenind active prin fosforilare, va active glicogen

fosforilaza, enzima implicata in glicogenoliza;

• fosforileaza unele proteine care migrand catre nucleu influenteaza

transcriptia unor gene.

Controlul transmiterii intracelulare se realizeaza prin modularea in sens negativ

a acestei cai, la diferite niveluri. Primul punct de control este la nivelul receptorului,

care prin fosforilare se produce fenomenul de desensibilizare. Al doilea punct de

control este la nivelul proteinei G, prin activarea GTP­azei intrinseci subunitatii alfa,

seproduce hidroliza GTP la GDP si fosfat anorganic. GDp ramane legat de subunitaea

alfa care astfel revine la forma de repaus. Al treilea punct de control este la nivelul

cAMP, in citoplasma existand fosfodiesteraze care il hidrolizeaza la AMP, astfel incat

T1/2 al acestui mesager second sa fie foarte scurt. Al patrulea punct de control este la

nivelul proteinelor fosforilate, in celula existand protein fosfataze care prin activare,

defosforileaza proteinele, influentand astfel functia lor.

In organism , in afara de subclasa Gs, mai exista si alte clase de proteine G.

Astfel proteina Gi (formata din αi­GDP βγ) prin activare (αi­GTP) determina inhibarea

activitatii AC, cu efecte opuse celor obtinute prin activarea proteinei Gs.

O alta clasa de proteine G, este reprezentata de proteinele Gq, care structural

sunt alcatuite tot din 3 lanturi αq­GDP βγ. Prin activare se formeaza αq­GTP care va

activa PLC. Aeasta enzima membranara va hidroliza un fosfolipid membranar PIP2 in

DAG si IP3. DAG este hidrofob si va ramane acorat in membrane si va active o clasa

de kinaze numite protein kinaze C (PKC). PKC va fosforila o serie de proteine

citoplasmatice, modificandu­le conformatile si respectiv functiile. Celalalt mesager

second, IP3 este hidrosolubil si va difuza in citoplasma, fixandu­se pe reticulul

endoplasmatic, unde va determina deschiderea unor canale de Ca2+, cu cresterea

concentratiei acestui cation in celula. Ca2+ are diverse efecte biologice, fiind

considerat mesager secund.

Receptori intracelulari

Hormonii liposolubili (hormonii steroizi, vit.A, hormonii tiroidieni) au receptori

nucleari. Unii hormoni steroizi (aldosteron, estrogeni) au atat receptori nucleari cat si

membranari. Receptorii pentru glucocorticoizi (cei mai bine caracterizati), progesteron,

testosteron, se gasesc in repaus, in citoplasma cuplati cu proteime hsp (,,heat sheck

proteins”) in momentul fixarii ligandului de receptor, proteinele hsp se decupleaza si

formeaza ca niste ,,canale” la nivelul membranei nucleare, permitand complexului H­

R sa treaca din ciitoplasma in nucleu (fig. 9). In nucleu complexul H­R se fixeaza in

promotorul unei gene pe o secventa numita HRE (,,hormone response element”).

Aceasta secventa HRE este bine definita si pentru a activa transcriptia genei,

complexul H­R dimerizeaza formand homodimeri.

Fig. 9. Receptorii intracelulari de clasa I in repaus sunt cuplati cu proteine hsp;

in nucleu formeaza homodimeri

In cazul hormonilor de clasa II (hormoni tiroidieni, vit. D, vit. A), receptorii se

gasesc in nucleu, deja fixati pe secventa HRE sub forma de heterodimeri, unul din

componentele acestui dimer fiind receptorul pentru acidul 11 cis retinoic (RXR).

Fixarea ligandului de receptor, activeaza o cascada de fenomene (chiar si in lipsa

ligandului pentru RXR) care in final vor permite transcriptia genei cu sinteza unei

proteine (ceea ce reprezinta raspunsul celulei la actiunea hormonului) (fig. 10).

Fig. 10. Receptorii de clasa II formeaza heterodimeri cu RXR (H 2 )

In cazul receptorilor pentru glucocorticoizi, s­a evidentiat faptul ca acesti

receptori se pot fixa nu numai pe ADN, ci si direct pe factorul de transcriptie ca de

exemplu AP1 si NFKB pentru a inhiba transcriptia unor factori implicati in inflamatie

(de ex: diverse interleukine, proteine de faza acuta, etc.) sau in imunitate (lantul usor al

imunoglobulinei) si prin aceste mecanisme se poate explica efectul antiinflamator al

glucocorticoizilor.

FACTORI DE CREŞTERE

1. INTRODUCERE Factorii de creştere sunt polipeptide care se

leagă de receptori celulari modulând creşterea,

diferenţierea şi funcţia celulei respective.

Aceasta este o definiţie largă care include

multe substanţe ­hormoni, diferite peptide,

citokinele ­care pot funcţiona ca factori de

creştere. Totuşi, prin convenţie, o serie de peptide

sunt cunoscute sub numele de factori de creştere

ACRONIME UTILIZATE

EGF ="Epidermal growth factor"

TGFa, TGFp="Transforming growth

factor"

FGF="fibroblast growth factor"

PDGF="platelet­derived growth factor"

IGF="insulin like growth factor"

VEGF="vascular endothelial growt factor"

NGF="nerve growt factor"

ESF="Erythropoesis stimulating factor"

(Fc). Aceste peptide reglează diverse momente

din ciclul celular (figura. 1).

CSF="Colony stimulating factor"

IL=interleukine

Figura 1: Fazele ciclului celular.

Clasic sunt cunoscute patru faze ale ciclului celular: faza S, de replicare a ADN

şi faza M, de mitoză, separate prin două faze "gap" ­ G] şi G2. Factorii de creştere

controlează atât trecerea din Go în Gi (şi invers) cât şi o serie de "puncte de control"

("chekpoints") pentru siguranţa evenimentelor ce au loc în timpul ciclului celular.

"Punctele de control" permit celulei să­şi repare ADN, iar dacă leziunile ADN sunt

ireversibile, sunt activate o serie de mecanisme care declanşează fenomenul de

apoptoză.

Importanţa cunoaşterii unor factori de creştere rezultă din faptul că o serie de

afecţiuni includ în patogenia lor o proliferare anormală a unor celule: neoplaziile,

ateroscleroza, bolile reumatoide, ciroza hepatică etc.

Numărul factorilor de creştere descrişi până acum e relativ mare şi mereu se

descriu alţi factori. Cunoştinţele privind factorii de creştere au permis gruparea lor în

familii după asemănări structurale, după natura celulelor asupra cărora acţionează şi a

modului în care intervin în proliferarea şi diferenţierea celulară.

2. CLASIFICARE Unii factori de creştere au acţiuni asupra mai multor tipuri de celule, în timp ce alţii

acţionează numai pe un singur tip celular. Astfel, din prima categorie fac parte:

­ familia EGF ("Epidermal growth factor") cuprinde EGF, α­TGF (α

"Transforming growth factor"), amfiregulina, "heparin­binding EGF­ like growth

factor", betacelulina, epiregulina şi neureguline;

­ familia FGF ("fibroblast growth factor") cuprinde FGF1 (FGF acid), FGF2 (FGF bazic) şi încă cel puţin 17 peptide înrudite;

­ familia PDGF ("platelet­derived growth factor") cuprinde ca reprezetant

PDGF;

­ familia TGFβ ("Transforming growth factor (3") cuprinde trei izoforme

TGFβi, TGF(β2 şi TGF(β3, BMP ("bone morphogenic protein") şi activina;

­ familia IGF ("insulin like growt factor") cuprinde IGF I (somatomedina C)

şi IGF II;

­ familia VEGF ("vascular endothelial growth factor") cuprinde şase mebri:

VEGF­A, VEGF­B, VEGF­C, VEGF­D, VEGF­E, PIGF. Pe lângă aceşti factori există

şi alţii care acţionează numai pe un anumit grup de celule;

­ NGF ("nerve growth factor") stimulează diferenţierea şi creşterea

terminaţiilor axonale;

­ eritropoietina (ESF ­ "Erythropoesis stimulating factor") stimulează

eritropoieza;

­ familia CSF ("Colony stimulating factor") cuprinde factori de creştere care

stimulează proliferarea precursorilor leucocitari. S­au descris patru tipuri:

o "granulocyte­macrophage CSF"

o "granulocyte­CSF" "macrophage­CSF"

o "multi CSF" (identic cu interleukina 3)

o interleukinele (IL) ­ limfocitele produc o serie de proteine (altele decât

imunoglobuline) care acţionează autocrin, paracrin sau endocrin,

exercitând funcţii asupra componentelor sistemului imun.

3. STRUCTURĂ

Din punct de vedere strucutral factorii de creştere sunt formate dintr­un singur

lanţ (EGF) sau din două lanţuri polipeptidice (PDGF, CSF etc).

Mai multe se cunosc despre factorii de creştere ce formează familia EGF

care toţi au un domeniu comun care este format din 45­55 de aminoacizi şi care

include şase resturi de cisteină ce formează, datorită legăturilor S­S, trei bucle. Acest

domeniu este bine conservat de la un factor la altul al familiei EGF şi are rol atât în

ataşarea factorului de creştere de receptorul specific cât şi în activarea acestuia.

Factorii IGF din punct de vedere structural se aseamănă cu proinsulina (vezi

cap. ) având omologie structurală de 52% cu insulina, între cei doi factori existând o

omologie structurală de 62%.

PDGF din punct de vedere structural este dimer, fiecare lanţ conţinând câte

aproximativ 112 aminoacizi. Există două tipuri de lanţuri A şi B care pot forma

molecula de PDGF. Din combinarea acestor două tipuri de lanţuri rezultă trei izoforme

pentru PDGF: AA, BB şi AB.

Factorii FGF (FGF1, FGF2) sunt proteine cu aproximativ 146 aminoacizi şi 18

kD care conţin un domeniu de fixare la heparan­sulfat/heparină esenţial pentru funcţia

lor.

Factorii VEGF sunt homodimeri, cu organizare structurală similară PDGF. S­

au descris şi VEGP heterodimeri.

4. RECEPTORII PENTRU FACTORII DE CREŞTERE

Receptorii pentru factorii de creştere sunt proteine transmembranare care

străbat o singură dată membrana celulei. Prezintă un domeniu extracelular, N­terminal,

un domeniu transmembranar cu structură de tip oc­helix şi un domeniu

intracitoplasmatic, C­terminal.

Domeniul N­terminal are rolul de a fixa ligantul (factorul de creştere);

domeniul C­terminal prezintă o funcţie enzimatică intrinsecă de tirozinkinază (TK)

care se activează în momentul fixării ligandului de receptor. Odată activată, TK

intrinsecă fosforilează resturi de tirozină din structura unor proteine adiacente

receptorului. Receptorul fosforilat poate transmite mai departe semnalul mitogen.

În funcţie de structura lor, receptorii pentru factorii de creştere se pot grupa în:

­ Receptori de clasa I ­ pentru EGF cuprinde patru receptori:

­ receptor pentru EGF (sau Erb 1 )

­ proteina HER2 (sau Erb2/neu) la care nu s­a descris încă un ligand

­ proteina HER 3 (sau Erb 3 )

­ proteina HER4 (sau Erb4).

Prezintă un domeniu extracelular relativ bine conservat printre membrii acestei

familii, prezentând două domenii bogate în cisteină, cu rol în fixarea ligandului

(figura.2). Domeniul TK intrinsec se repetă o singură dată în structura receptorului, iar

în proteina Erb 3 funcţia TK este scăzută, sau chiar anulată, deşi unii autori susţin că

Erb3 poate fixa ATP la nivelul TK citoplasmatice.

Figura 2: Structura EGF­R

o Receptori din clasa a II­a

In această clasă intră: receptorul pentru insulina (IR), receptorul pentru (IGF r R),

receptorul pentru IGFn/Man­6P care poate lega IGFn sau liganzi care conţin în anumite

situsuri resturi de manoz­6­fosfat şi doi receptori ai căror liganzi nu se cunosc încă:

"insulin­receptor­related receptor" (IRR) şi "insulin­IGF 1 hybrid receptor (IR/IGF­I­R).

Structural aceşti receptori sunt tetrameri, fiind formaţi din două subunităţi a şi

două subunităţi β (vezi cap. I). Subunităţile α au numai domeniu extracelular şi conţin

un segment bogat în resturi de cisteină cu rol în fixarea ligandului. Subunităţile β ale

receptorului sunt transmembranare, segmentul intracitoplasmatic conţine un domeniu

tirozinkinazic. Subunităţile a se leagă de subunităţile β prin legături disulfidice; de

asemenea şi între subunităţile β există legături S­S.

Această familie de receptori prezintă o omologie structurală de peste 80% la

nivelul domeniului kinazic pe când, în domeniul extracelular identitatea aminoacizilor

este foarte mică de la un membru la altul al acestei familii

Figura 3: Structura IR

Receptorul pentru insulina Fig.3 este sintetizat sub forma unei singure proteine

(proreceptor) care derivă de la o singură genă localizată pe braţul scrurt al

cromozomului 19. Proreceptorul suferă un proces de proteoliză rezultând

heterotetramerul matur.

Există un grad înalt de omologie între IR şi IGF r R atât la nivelul genelor care îi

codifică cât şi la nivelul organizării structurale. în ciuda acestei omologii, IR este mai

puţin potent în transmisia semnalului mitogen decât IRF r R. Totuşi, dacă în mediu

există cantităţi crescute de IGF n , atunci IR poate contribui la mitogeneză.

(IGFn/Man­6­P)R este un receptor bifuncţional, care poate lega atât IGFn cât şi

liganzi care conţin manoz­6­fosfat în anumite situsuri. Acest receptor are un rol

important în traficul enzimelor lizozomale şi în degradarea IGFU, în schimb rolul său

în transducţia semnalului de creştere rămâne controversat.

Din punct de vedere structural este format dintr­un lanţ polipeptidic care

străbate o singură dată membrana celulară.

În ultimii ani s­a demonstrat existenţa in vivo a unor receptori pentru insulina şi

IGF atipici, capabili să lege unul sau mai mulţi liganzi cu afinitate relativ crescută.

Astfel IRR prezintă o omologie structurală de aproximativ 55% cu IR şi IGF r R. în

schimb domeniul C terminal intracitoplasmatic situat după domeniul tirozinkinazic

este mult mai scurt. Acest receptor nu fixează nici insulina, nici IGFi, IGFn,

proinsulina sau relaxina şi de aceea până în prezent IRR rămâne un receptor orfan,

căreia nu i s­a descoperit încă un ligand.

Receptorul IR/IGFi este un receptor hibrid heterodimeric format dintr­un "α­β

hemireceptor" provenit de la IR şi un "α­β hemireceptor" provenit de la IGFjR. Acest

receptor hibrid se pare că este prezent în multe ţesuturi, în unele ţesuturi fiind

receptorul exprimat în cantitatea cea mai mare. Totuşi, diferenţele de transmisie a

semnalului intracelular între IGFjR şi IR/IGFiR n­au fost încă stabilite.

o Receptorii din clasa a III­a sunt receptori pentru PDGF, CSF 1 ("colony

stimulating factor") şi SCF ("ster cell factor").

Pentru PDGF se cunosc două tipuri de receptori ­ Ra şi RR fiind proteine cu 170

şi respectiv 180 kDa.

Extracelular, aceşti receptori conţin cinci domenii imunoglobulin­like, iar

intracelular conţin domenii tirozinkinazice. Genele pentru receptorii acestei clase se

găsesc localizate pe cromozomii 4 (pentru R« al PDGF şi SCF) şi 5 (pentru RR al

PDGF şi CSF­1). Deoarece izoformele PDGF sunt dimeri, fixarea ligandului pe

receptor determină dimerizarea receptorului (figura.4).

Figura 4: Procesarea şi acţiunea izoformelor PDGF. Izoformele A şi B ale

PDGF sunt sintetizate ca precursori care formează ulterior dimeri legaţi prin punţi

S­S. Izoformele dimerice ale PDGF determină dimerizarea receptorului cu

specificităţi diferite. Receptorul prezintă cinci domenii extracelulare imunoglobulin­

like, primele trei fiind implicate în fixarea ligandului şi a patra fiind răspunzătoare

de dimerizarea receptorului. Intracelular receptorul prezintă două domenii

tirozinkinazice(TK).

Rα leagă atât lanţurile A cât şi B ale PDGF cu aceeaşi afinitate, în timp ce Rp

fixează numai lanţurile B ale PDGF. Astfel izoforma PDGF­AA induce numai

dimerizarea aoc a receptorului, PDGF­AB induce dimerizarea oca sau a(3. pe când

PDGF­BB poate induce toate cele trei combinaţii ale receptorului (oca. a(3, P(3).

Receptorii dimeri aa şi P(3 induc semnale mitogene, pe când homodimerul a(3 are

proprietăţi unice.

­ Receptorii din clasa a IV­a conţin receptori pentru FGF (până în prezent

prezintă patru membri), care datorită "splicing­ului" alternativ pot exista în mai multe

variante.

Structural receptorul prezintă trei domenii inumoglobulin­like, iar intracelular

prezintă două domenii tirozinkinazice separate printr­un domeniu neenzimatic (figura

5).

Pentru o potenţare a activităţii receptorului, FGF "se prezintă" receptorului după

ce s­a fixat de heparan­sulfat sau heparină. Această prezentare implică crearea unui

complex ternar format din FGF­heparan sulfat/heparină­receptor FGF care determină

stimularea celulei.

Figura 5: Structura FGF­receptor

Receptorii din clasa a V­a conţin receptori pentru VEGF, care se prezintă sub

trei forme: VEGF R­l, VEGF R­2 şi VEGF R­3. Structural cei trei receptori sunt

asemănători, prezentând în domeniul extracelular şapte domenii imunoglobulin­like;

domeniul intracitoplasmatic conţine segmentul tirozin­kinazic (figura 6) care este

împărţit în două subdomenii de un segment cu funcţie neenzimatică, de lungime

variabilă.

Figura 6: Structura receptorului pentru VEGF

­ Receptorii din clasa a Vi­a sunt receptori pentru TGF3, proteina morfogenică

osoasă BMP şi activina, care conţin în segmentul intracitoplasmatic un domeniu

serin/treonin kinazic (S/TK).

Aceşti receptori sunt organizaţi în două subtipuri ­ subtipul 2 de receptor care

fixează ligandul, moment în care dimerizează cu subtipul 1 de receptor pe care îl

activează şi îl fosforilează. Heterodimerul nou format este activ, iar S/TK din structura

subtipului 1 devine activă şi fosforilează mai departe alte proteine citoplasmatice

(figura 7).

Figura 7: Structura receptorului pentru TGF/3 S/TK­ domeniu serin/treonin kinaza

5. MECANISMUL DE TRANSMISIE A SEMNALULUI INTRACELULAR

Receptorii pentru factorii de creştere sunt proteine membranare, care în

momentul în care fixează un factor de creştere îşi modifică conformaţia şi dimerizează,

iar ulterior se activează domeniul kinazic intracitoplasmatic (TPK).

Iniţial s­a descoperit că în urma legării factorilor de creştere de receptori,

aceştia formează hemodimeri. Recent s­a demonstrat că în cadrul unei familii

receptorii pot forma şi heterodimeri. De exemplu, în familia receptorilor pentru EGF,

receptorul orfan HER2 (ErbE^) joacă un rol central, fiind "partenerul" preferat de

ceilalţi receptori în condiţiile formării unui heterodimer. Mai mult, în cazul HER 3 ,

receptorul HER2 este absolut necesar pentru funcţia sa tirozin­kinazică, ştiind că HER3

are o activitate kinazică intrinsecă abolită.

Dimerizarea receptorului pentru PDGF şi TGF(3 a fost prezentată în figura 4,

respectiv figura 7.

In urma dimerizării receptorului are loc activarea domeniului tirozin­kinazic

intracitoplasmatic care va determina fosforilarea receptorului: un domeniu tirozin­

kinazic de pe un receptor din complex va fosforila celălalt receptor şi invers (figura 8).

Aceşti receptori fosforilaţi sunt activi şi transmit mai departe semnalul mitogen.

Figura 8: Autofosforilarea receptorului

Fc ­factor de creştere; TK­domeniu tirozin kinazic

Studii mai ample s­au făcut asupra mecanismului de transmisie prin intermediul

receptorului pentru EGF fiind primul descris.

5.1. Mecanismul de transmisie intracelular pentru EGF

După fixarea EGF pe receptor, se produc modificări conformaţionale în

structura acestuia, ceea ce permite interacţiunea cu un al doilea receptor legat de

ligandul său. Dimerul rezultat activează domeniile tirozin­kinazice citoplasmatice care

iniţiază fosforilarea unor resturi de tirozină din structura receptorului. Aceste

tirozine fosforilate reprezintă situri de recunoaştere pentru proteine care prezintă un

domeniu specific numit SH2. Domeniul SH2 este un fragment conservat de

aproximativ 100 aminoacizi care se poate fixa de resturi de tirozină fosforilată din

mediu.

Observaţii recente au arătat că moleculele care intervin în transducţia

(transmiterea) semnalului conţin diverse alte domenii care mediază interacţiunea dintre

diferite proteine care intervin în căile de semnalizare intracelulară. De exemplu, în

afară de domeniile SH2 şi domeniile PTB sunt implicate în recunoaşterea resturilor de

fosfotirozină. Mai mult, domeniile SH3 recunosc secvenţe bogate de prolină,

domeniile PH recunosc fosfolipide membranare şi domeniile PDZ recunosc carboxilul

terminal al resturilor de valină.

In cazul EGF, un număr crescut de proteine cu fragment SH 2 se pot fixa de

dimerul fosforilat; unele proteine au funcţie enzimatică: src, ras­GAP, PLCy

(fosfolipaza y), PI­3K (fosfotidilinozitol­3kinaza), altele nu sunt enzime dar intervin în

transducţia semnalului mai departe şi se numesc proteine adaptor: Grt>2, Grby, shc,

Nck, Crk etc. Fixarea unei proteine sau a altei proteine de receptorul fosforilat este

dependentă de modalitatea de dimerizare (homo/heterodimerizare).

Odată ataşate prin domeniul SH2 de receptorul fosforilat, proteinele enzime cât

şi proteinele adaptor îşi modifică conformaţia şi transmit mai departe semnalele pe căi

diferite de la o proteină la alta.

Semnalul mitogen poate fi transmis pe mai multe căi, dar principala cale este

aşa numita cale a "MAP­kinazelor". Această cale (figura 9) implică mai multe proteine

atât citoplasmatice cât şi nucleare.

Proteinele Grb 2 /SOS. Proteina Grt>2 este o proteină adaptor care conţine un

domeniu SH2 şi trei domenii SH3. Prin domeniul SH 2 se fixează de receptorul

fosforilat, iar de un domeniu SH3 fixează o altă proteină citoplasmatică SOS.

Formarea complexului Grb 2 /SOS determină activarea unei noi proteine numită

ras (p21 ras ). Proteina ras, din punct de vedere structural, este formată dintr­un singur

lanţ polipeptidic şi are omologie structurală cu subunitatea a a proteinei trimere G. De

altfel, unii autori susţin că proteinele ras formează o familie de proteine G monomerice,

deoarece au capacitatea de a fixa nucleotide cu guanină; astfel, în repaus ras fixează

GDP, pe când în forma sa activă se găseşte cuplată cu GTP. Schimbul de nucleotide

GDP/GTP pe proteina ras este realizat de proteina SOS. In momentul formării

complexului GriVSOS este activat schimbul de nucleotide şi deci se activează proteina

ras. La fel ca şi subunitatea a a proteinelor G trimere şi proteina ras prezintă activitate

GTP­azică, dar această funcţie este mai puţin activă.

Cuplată cu receptorul pentru EGF există o proteină GAP ("GTP­ase activated

protein") care are rol în activarea funcţiei GTP­azice intrinseci a proteinei ras. Proteina

GAP se activează numai în momentul dimerizării şi fosforilării receptorului. Deci

stimularea receptorului pentru EGF intervine în modularea activităţii proteinei ras, atât

în sens stimulator cât şi inhibitor.

Figura 9: Mecanismul de transmisie a semnalului mitogen de la EGF

Proteina ras activată este capabilă să transmită semnalul la o protein­kinază

citoplasmatică numită raf. Proteina raf activată va declanşa un lanţ de fosforilări prin

activarea proteinei MEK sau MAPKK ("mitogen­activated proteinkinase kinases").

Proteina MEK, prin fosforilare, devine activă şi va fosforila proteina MAPK ("mitogen

activated proteinkinase"). MAPK sub formă fosforilată va deveni activă şi are

capacitatea de a intra în nucleu unde activează, prin fosforilare, factorii de transcripţie

jun, myc şi fos. Deoarece semnalul a ajuns în

nucleu, în celulă încep o serie de procese, care o pregătesc pentru diviziune şi

proliferare.

Etapele descrise reprezintă principala cale activată în momentul stimulării

receptorului pentru EGF de către ligandul său. Dar receptorul fosforilat poate să se

cupleze şi cu alte proteine (enzime sau proteine adaptoare) cu domeniu SH2, astfel

încât sunt şi alte căi modulate de fixarea EGF pe receptor. De exmplu, fosfolipaza C

Yi (PLC Yi) are domeniu SH2 şi se fixează de un rest de fosfotirozină de pe receptorul

pentru EGF. Ulterior PLC­Yi este fosforilată şi devine activă. Studii in vitro au

demonstrat că PLC­Yi nu este implicată în transmiterea semnalului mitogen de la

receptorul pentru EGF, dar se pare că intervine în mobilizarea calciului din reticulul

endoplasmatic în celula musculară netedă.

O altă protein­enzimă care este activată de receptorul pentru EGF fosforilat est

fosfatidilinozitol­3 kinaza (PI­3K). Această enzimă este formată din două subunităţi: o

subunitate reglatorie p85 şi o subunitate catalitică pi 10. Fosforilarea p85 pe un rest de

tirozină determină activarea enzimei care va cataliza fixarea unui fosfat în poziţia 3 a

fosfatidil inozitol 4,5 difosfatului [PI(4,5)P2] cu formarea fosfatidil inozitol 3,4,5

trifosfatului [PI(3,4,5)P3]. Acest compus funcţionează ca un mesager secund fiind

implicat în diferite căi intracelulare de răspuns: creşterea celulară, chemotaxia, efecte

antiapoptotice. Interesant, unii autori au arătat că proteina ras şi PI3K se pot asocia şi

se pot activa una pe cealaltă. Mai mult, formarea heterodimerilor influenţează diferit

timpul de înjumătăţire a MAPK şi deci a semnalului de creştere celulară. De exemplu,

"co­expresia" HER2' cu receptorul pentru EGF sau cu HER3 determină creşterea

afinităţii receptorului pentru EGF şi HER 3 pentru liganzii specifici şi se intensifică

activitatea MAPK, iar timpul de înjumătăţire se alungeşte. Astfel, este generată o largă

"reţea" de interacţiuni ligand­receptor, care în final va determina stimularea mai

multor semnale către nucleu.

5.2. Mecanismul de transmisie intracelular pentru PDGF

Autofosforilarea receptorilor pentru PDGF indusă de dimerizarea lor serveşte la

două funcţii importante. Pe de o parte, fosforilarea anumitor resturi de tirozină din

interiorul domeniului kinazic determină creşterea activităţii acestui domeniu, iar pe de

altă parte, autofosforilarea unor tirozine din afara domeniului kinazic crează situsuri de

recunoaştere pentru moleculele care intervin în transducţia semnalului (molecule cu

domeniul SH2 şi care pot fi enzime sau proteine adaptoare).

Receptorul pentru PDGF, ca şi receptorul pentru EGF, poate fixa enzime (ca

PI3K, PLC­Y, familia Src de tirozin­kinaze, tirozinfosfataza SFfl^ sau proteina GAP

care activează funcţia GTP­azică a proteinei ras) sau proteine adaptor (Grf>2, Grb 7 ,

Nck, Shc, Crk) (figura 10). Receptorul pentru PDGF fixează şi membri ai familiei de

proteine Stat. Aceste proteine Stat sunt factori de transcripţie care după fosforilare pe

resturi de tirozină dimerizează şi sunt translocate în nucleu unde influenţează

transcripţia unor gene specifice.

Figura 10 : Transmisia semnalului intracelular de la receptorul pentru PDGF

Astfel, fixarea proteinei adaptor Grb 2 (prin domeniul său SH2) de un rest de

tirozină fosforilată din structura receptorului pentru PDGF determină asocierea

acestuia cu proteina SOS. Complexul Grb 2 /SOS va activa proteina ras datorită

schimbului de nucleotide GDP/GTP realizat sub acţiunea proteinei SOS. Proteina ras­

GTP activă va iniţia calea MAP­kinazelor (la fel ca la receptorul pentru EGF) care în

final va determina stimularea unor factori de transcripţie nucleari implicaţi în creşterea

celulară.

Fixarea enzimei PI­3K pe un rest de tirozină fosforilată din receptor va

determina fosforilarea subunităţii p85 cu activarea subunităţii catalitice pi 10. Această

enzimă joacă un rol central în transmisia semnalelor intracelulare de chemotaxie,

creştere celulară şi are efect antiapoptotic. Astfel PI­3K poate interacţiona cu proteina

ras activându­se reciproc. Un alt rol al proteinei PI­3K este acela că prin produsul său

de reacţie PI(3,4,5)P3 intervine în "ancorarea" enzimei PLC­yîn membrană.

PLC­y activată de receptorul fosforilat şi "ancorată" în membrana celulară va

transforma fosfatidilinozitol 4,5 difosfat (PIP2) în diacilglicerol (DAG) şi

inozitol 1,4.5 trifosfat (IP3). DAG activează o serie de protein­kinaze C (PKC), iar IP3

mobilizează Ca 2+ din rezervele intracelulare ale celulei. Totuşi, PLC­y nu are rol de

transductor de primă importanţă în stimularea creşterii celulare sau motilităţii celulare;

totuşi, unii autori au arătat că anumite izoforme de PLC­y pot influenţa aceste căi.

O altă enzimă care se poate fixa de receptorul pentru PDGF fosforilat este

proteina SHP2. Această proteină, din punct de vedere funcţional, este o tirozin

fosfatază care modulează atât în sens pozitiv cât şi în sens negativ transmisia

intracelualră a mesajului. SHP 2 este o tirozinfosfatază care prezintă două domenii SH2,

prin ambele domenii, enzima fixându­se la două resturi de tirozină fosforilată pentru

ca activarea enzimei să fie maximă. Având capacitatea de a defosforila receptorul

pentru PDGF cât şi substratele protein­kinazelor intrinseci receptorului, SHP2 este un

potenţial modulator negativ al transmisiei semnalului intracelular. Pe de altă parte,

SHP 2 poate fi şi modulator pozitiv al semnalizării intracelulare deoarece poate juca rol

de proteină­adaptor care este recunoscută de grt^/SOS şi care alterior activează

proteina ras.

Se cunosc şi alţi modulatori negativi în calea de semnalizare intracelulară

iniţiată de receptorul pentru PDGF. De exemplu, MAP­kinaza, care este activată

printr­un mecanism dependent de proteina ras, fosforilează proteina SOS şi o

inactivează (blocând astfel, activarea a noi proteine ras).

Un alt mecanisnm de feed­back negativ este dependent de AMP C . Acest

mesager secund sintetizat în celulă în urma stimulării sintezei de prostaglandine şi a

activării ulterioare a adenilat ciclazei, activează protein­kinaza A­AMP C dependentă

(PKA). Această serină­kinază fosforilează, şi astfel inactivează, mai multe proteine

implicate în calea de transmisie a semnalului intracelular. Alt mecanism inhibitor,

descris deja la EGF, este activarea proteinei GAP de către receptorul pentru PDGF

fosforilat. Această proteină, prin funcţia sa de activator al GTP­azei intrinseci proteinei

ras, intervine în inactivarea acestei proteine.

Se poate spune că receptorul pentru PDGF fosforilat activează simultan atât

proteine implicate în transmisia semnalului intracelular, cât şi în blocarea acestuia,

acest control fiind necesar în buna desfăşurare a activităţii celulare. Orice dezechilibru

în această balanţă ­ transmisia exagerată a semnalului stimulator şi/sau insuficienta

blocare a semnalului intracelular poate determina o creştere celulară exagerată cu

apariţia tumorilor.

5.3. Mecanismul de transmisie intracelular pentru FGF

Până în prezent se cunosc 19 peptide înrudite care formează familia FGF şi care

se pot fixa. cu afinitate mare, pe unul sau mai mulţi receptori pentru FGF. Pentru

activarea maximă a receptorului, ligandul trebuie să fie "prezentat" acestuia de către

heparan sulfat sau heparină. Această "prezentare" poate implica formarea unui

complex ternar ­ receptor­FGF­heparan sulfat cu rol în dimerizarea receptorului,

activarea tirozin­kinazei intrinseci şi autofosforilarea receptorului pe cel puţin şapte

resturi de tirozină.

Căile intracelulare de transmisie a semnalului sunt asemănătoare celor descrise

la EGF sau PDGF. Astfel, receptorul fosforilat poate fixa atât proteine adaptor ­ shc,

FRS2, Crk, care în final vor activa proteina ras sau poate fixa enzime ­ fosfolipaza y

(PLC­y) sau src ­ o tirozin­kinază citoplasmatică care vor activa, proteina raf (figura

11).

Mecanismele de interacţiune între aceste proteine au fost descrise la EGF şi

PDGF.

Figura 11: Mecanismul de transmisie intracelulară a semnalului indus de FGF

5.4. Mecanismul de transmisie intracelular pentru VEGF

VEGF este implicat în angiogeneza normală cât şi patologică, arătându­se că o

serie de celule tumorale secretă VEGF care va stimula o proliferare anormală a vaselor

sanguine în tumora respectivă.

Din punct de vedere al mecanismului de transmisie intracelular, VEGF se

aseamănă cu FGF. Astfel fixarea VEGF de receptor determină

dimerizarea receptorului şi activarea tirozinkinazei intrinseci. Această enzimă va

fosforila receptorul cât şi proteine care se fixează de receptor deoarece au în

componenţa lor secvenţe ­SH2. Proteinele care transmit mai departe semnalul pot fi

enzime sau proteine adaptor care deşi nu au funcţie enzimatică pot fixa alte enzime pe

care le activează. Astfel, receptorul pentru VEGF activează un semnal mitogen atât

dependent de calea RAS/MAP­kinazelor (mai ales în celulele endoteliale) cât şi un

semnal independent de ras. Acest mecanism este dependent de PLCy care legată de

receptorul fosforilat, se activează şi hidrolizează PIP2 în DAG şi IP3. DAG este

implicat în activarea proteinkinazei C care va activa proteina raf şi în final se activează

MAP­kinaza. Se pare că această cale de activare a raf dependentă de PKC este

implicată în migrarea celulei endoteliale.

Şi receptorul pentru VEGF, ca şi receptorul pentru PDGF, activează o

fosfotirozin fosfatază SHP­1 cu rol de modulator negativ al transmisiei celulare

(defosforilează proteine implicate în transducerea semnalului).

5.5 Mecanismul de transmisie intracelular pentru IGF

Mai multe date se cunosc despre transmisia intracelulară mediată de receptori

pentru IGFj. IGFi este un peptid sintetizat atât în ficat cât şi în alte ţesuturi, având

puternic efect mitogen.

Spre deosebire de ceilalţi receptori pentru factorii de creşterem care sunt

formaţi dintr­un singur lanţ polipeptidic, receptorii pentru IGF sunt dimeri preformaţi.

Fixarea IGFi pe receptor determină o modificare conformaţională a receptorului cu

activarea domeniilor kinazice ale subunităţilor (3 şi autofosforilarea receptorului.

Domeniile kinazice ale receptorului fosforilează şi alte substrate, dintre care proteinele

IRS ('"insulin receptor substrate") şi shc sunt cele mai bine caracterizate (figura 12).

Astfel, proteinele IRS (se cunosc până în prezent 4 izoforme) fosforilate

recunosc şi activează PI­3K care va genera fosfotidilinozitol 3,4,5­P3 care ulterior va

stimula proliferarea generală şi va inhiba apoptoza.

Efecte proliferative şi antiapoptotice se vor obţine şi prin stimularea căii

ras/MAP­kinazelor.

Datele cunoscute din literatură sugerează ipoteza că toate aceste căi de

semnalizare intracelulară interacţionează şi "comunică" una cu alta, existând la nivel

intracelular interacţiuni între receptorii tirozinkinazici şi alte tipuri de receptori (de

exemplu receptorul serpentină, receptorii pentru citokine) sau cu integrine.

MEK

Figura 12: Mecanismul molecular al semnalizării intracelulare

p58 şi pi00 reprezintă unitatea reglatorie respectiv catalitică a fosfatidil

inozitol­3 kinaza (PI­3K)

PI4,5P2­fosfatidil inozitol 4,5 difosfat

PI3A5P3 ­ fosfatidil inozitol 3,4,5 trifosfat

PI3,4P2 ­ fosfatidil 3,4 difosfat

(+) stimulare; (­) inhibiţie

Şi alte căi de semnalizare intracelulară sunt activate în condiţiile activării

receptorului pentru IGF: de exemplu unele izoforme ale proteinkinazei C (PKC) sunt

reglate de IGF! care ulterior pot stimula calea MAP­kinazelor. Ca şi receptorii pentru

PDGF şi receptorii pentru IGF activează o fosfoprotein fosfatază (SH­PTP2) implicată

în defosforilarea receptorului şi a unor proteine intracelulare, modulând astfel negativ

aceste căi de transmisie ale semnalului.

6.MECANISME MOLECULARE IMPLICATE IN CREŞTEREA CELULARĂ

Importanţa factorilor de creştere în diviziunea celulară rezultă din faptul că sub

acţiunea acestora, celulele pot depăşi "punctele de control" ale ciclului celular şi trece

într­o nouă fază. Fixarea unui factor de creştere pe receptorul său specific induce o

serie de modificări intracelulare care ulterior se transmit în nucleu.

Astfel se ştie că MAP­kinaza fosforilată (activă) poate fi translocată în nucleu unde

intervine în fosforilarea unor proteine numite cicline. Aceste cicline se fixează de o

proteinkinază (cdk) pe care o activează. Complexul ciclină­cdk fosforilează o serie de

proteine care intervin în diviziunea celulară. Un substrat cunoscut al complexului cdk­

ciclină este complexul format din două proteine: E2F­Rb. Prin fosforilarea acestui

complex, la nivelul proteinei Rb, E2F este eliberat şi acţionează ca factor de

transcripţie a unor proteine implicate în creşterea celulară (figura 13). Alte substrate

ale complexelor ciclină­cdk pot fi urmărite în tabele I şi II.

Figura 13: Un mecanism intranuclear al acţiunii unui factor de creştere asupra

unei celule; cdk — kinază dependentă de ciclină; (+) stimulare

S­a constatat că există mai multe tipuri de cicline (A, B, D, E) şi de cdk (2, 4, 6).

Pentru a putea depăşi un "punct de control" al ciclului celular, o ciclină se conbină cu o

anumită kinazâ (cdk) (figura 14).

Acest complex funcţionează până când celula reuşeşte să depăşească "punctul

de control"; odată depăşit, ciclina este degradată şi cdk se inactivează

Figura 14: Cuplarea ciclinelor cu kinazele specifice (cdk) în "punctele de control"

ale ciclului celular

Legătura exactă între calea de semnalizare intracitoplasmatică, iniţiată de

receptori pentru factori de creştere şi sinteza ciclinelor, nu se cunoaşte în totalitate, dar

s­a observat că aceste proteine (cicline) se sintetizează în celulă numai dacă celula a

fost stimulată de un factor de creştere. Durata de viaţă a ciclinelor este scurtă, acestea

degradându­se după ce celula a trecut de "punctul de control" al ciclului celular.

Tabelul 1 Substrate ale complexului cdk­ciclină Ia trecerea Gi/S şi

în faza S a ciclului celular

1 Proteine implicate în ADN polimeraze

replicare Ribonucleotid reductaza

2 Proteine implicate în ­ factori de transcripţie (p53, E2F)

transcripţie ­ factori reglatori ai factorilor de transcripţie

(pllORb, pi07)

­ ARN polimeraza II

Tabelul 2 Substrate ale complexelor cdk­ciclină Ia trecerea G2/M şi

în faza M a ciclului celular

1 Componentele cromatinei Histona Hi HMG I, Z, P,

2 Proteine nucleare ­ Nucleolina

3 Proteine ale citoscheletului ­ Vimentina ­ Componenta reglatoare a

lanţului uşor al miozinei

4 Proteine asociate microtubilor MAP4/MAP1B

5 Factori de transcripţie şi de

translaţie

c­myb subunităţi ale EFj

6 Protein kinaze şi fosfataze p60 src CKII CDC25

7 Proteine G şi alţi reglatori Rap 1 GAP

6.1. Inhibitori ai complexelor cdk­ciclină

Aceşti inhibitori acţionează nu atât prin blocarea ciclului celular ca răspuns la

factori mitogeni, cât mai ales asigură blocarea apariţiei unor noi evenimente la nivel

celular până când procesele anterioare nu sunt complet încheiate.

Un rol important i s­a acordat proteinei nucleare p53, care se activează prin

fosforilare şi care induce transcripţia unei gene cu sinteza unei proteine specifice p21

waf. Această proteină p21 waf poate inhiba mai multe tipuri de complexe cdk­ciclină,

probabil prin blocarea interacţiunii lor cu substrate specifice. Prin blocarea

complexului cdk­ciclină se măreşte timpul între faza G şi S, ceea ce permite

intervenţia enzimelor reparatorii asupra moleculei de ADN. Dacă leziunile ADN sunt

excesive, activitatea p53 creşte şi este indusă apoptoza celulelor ("moarte programată a

celulelor").

Se pare că acţiunea apoptotică a proteinei p53 se manifestă, cel puţin în parte,

prin inhibiţia promotorului genei pentru receptorii pentru IGF, ştiind că acest receptor

odată stimulat are un puternic efect mitogen şi antiapoptotic.

7. PROTOONCOGENE. ONCOGENE. ANTIONCOGENE

Actual se ştie că proliferarea malignă a celulelor este o maladie genetică

datorită fie activării şi modificării unor protooncogene sau prin pierderea funcţiilor

unor gene supresoare de tumori.

Astfel, o oncogenă este o genă care generează (induce) creştere tumorală.

Oncogenele provin prin diferite tipuri de mutaţii din protooncogene (Tabel III).

Protooncogenele sunt gene normale ale căror produşi sunt implicaţi în diferite

etape ale creşterii şi diferenţierii celulare.

Pornind de la această definiţie se poate afirma că practic toate proteinele

implicate în transmisia normală a semnalului mitogen sunt protooncogene.

Tabelul 3 Clasificarea oncogenelor şi tipurile de tumori pe care le pot induce

Tipul Localizare Funcţie Tip de tumoră

1 .Factori de creştere

sis

hst secretaţi de celule familia PDGF Sarcom

int­2 familia FGF Neoplasm gastric

familia EGF Neoplasm mamar

2. Receptori tirozin

kinazici Tirozin

kinaze

erbB membranare receptor EGF Glioblastom

"trunchiat"

met receptor HGF sarcom şi carcinom

renal

3. Tirozin kinaze citoplasmă

membranare nucleu

src mediază semnalul sarcom

integrinelor

abl mediază

transcripţia

leucemie unilocitară

şi legarea ADN cronică

4. Proteine G membrană

monomere

K­ras semnal de

joncţiune

cancer colorectal şi

de pancreas

H­ras semnal de

joncţiune

cancer colorectal şi

de pancreas

5. Serin/treonin citoplasmă

kinaze

rafPKC fosforilează MEK tumori pulmonare şi

hepatice

fosforilează

proteine

cancer mamar şi de

citoplasmatice piele

6. Factori de nucleu

transcripţie

myc legare de ADN neuroblastom

jun legare de ADN neoplasm de

(activarea piele/osteosarcom

transcripţiei) ne

Studiul oncogenelor şi protooncogenelor este foarte intens pentru a putea

permite înţelegerea mecanismelor moleculare de generare a unei tumori şi de încercare

a depistării şi tratării acestora în stadii incipiente.

De exemplu, proteina erbB2 (HER) care este un receptor trunchiat pentru EGF

este protooncogenă deoarece atunci când se exprimă exagerat generează transmisia

semnalului mitogen în lipsa factorului de creştere, deci a devenit oncogenă. Actual

detectarea unor niveluri mari de erbB 2 în cancerul mamar reprezintă un factor de

prognostic nefast pentru supravieţuire.

Actual, în terapia cancerului mamar metastazat cu proteina erbB2 pozitivă se

utilizează un medicament ­ Herceptin® care de fapt este un anticorp monoclonal

umanizat care blochează proteina erbB2 de pe celula neoplazică, blocând astfel

multiplicarea acesteia.

Un alt receptor larg răspândit la nivelul diferitelor celule tumorale este

receptorul pentru IGFt datorită efectelor sale proliferative şi antiapoptotice. Din

această cauză se încearcă şi pentru receptorul pentru IGF1 găsirea unor anticorpi

blocanţi ai receptorului sau analogi structurali ai liganzilor care să blocheze receptorul.

O altă direcţie de cercetare în terapia cancerului este inhibiţia angiogenezei

(formarea de noi vase de sânge) în tumori, care este dependentă de VEGF şi FGF. într­

adevăr, în multe tipuri de tumori s­au găsit exprimaţi VEGF­A şi FGF2. Aceşti factori,

prin stimularea formării de noi vase sanguine, permit expansiunea tumorală. Astfel,

noi strategii în terapia cancerului încearcă să utilizeze anticorpi monoclonali care să

blocheze receptorii pentru VEGF şi FGF sau droguri care să inhibe tirozinkinaza

intrinsecă acestor receptori.

în afara protooncogenelor şi oncogenelor, o atenţia deosebită se acordă şi

antioncogenelor ­ gene care în mod normal intervin în inhibarea creşterii celulare.

Dintre antioncogene ­ mai cunoscute sunt pRb şi p53 a căror funcţie a fost descrisă

anterior.

Antioncogenele prin nefucnţionalitate sau prin funcţionare deficitară duc la

creştere tumorală. Astfel, pRb deficitară s­a descris în tumori pulmonare cu celule mici,

adenocarcinoame de prostată, tumori ale retinei, tumori osoase etc.

Deficitul de funcţionare a p53 s­a descoperit, de asemenea, în multe tumori

hepatocelulare, ale colonului, creierului.

În concluzie, studiul proteinelor implicate în creşterea celulară are o importanţă

majoră deoarece numărul persoanelor noi cu cancer este în creştere iar mortalitatea

prin cancer ocupă locul al II­lea în lume după bolile cardiovasculare.

Mai mult, studiul acestor particule implicate în oncogeneză permite găsirea

unor markeri biologici specifici pentru depistarea precoce a cancerului.

Terapia cancerului în viitor se va adresa atât oncogenelor cât şi genelor

supresoare de tumori. Direcţiile acestei terapii sunt:

1) Terapia prin introducerea în organism a "genei normale" pentru a compensa gena

defectă sau lipsă ("gene therapy") în cazul nefuncţionării antioncogenelor;

2) Terapia prin anticorpi monoclonali "umanizaţi" care să inhibe eficient acţiunea

unei proteine produsă de o oncoproteină;

3) Terapia prin "anti­sense RNA", care are ca efect blocarea transcripţiei genei­ţintă,

deci anularea sintezei produsului oncogenei.