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' C f f c c f C c t c c f c c c C C

JNOI.IBRL : Alberto M a r t í r i GuzmSri (:: c a n f e l l

J'E1,EFONO : 5 8 1 - 7 7 - 4 1

MATRICULA: 7 51 18 O R O

c IAV c :

TRIMESTRE:

HORAS SEMANA: 3 0

L,UGAR DONDE SE LLEVARA A CABO: Unidad I n v e s t i g a c i ó n Hiornédica -CMN (Temporalmente en l a F a c u l t a d d e M e d i c i n a UNAM)

I

FECHA DE IN IC IO : Ma r z o 2 de 1987 I /$ECHA DE TERMINACION:

/NOMBRE DE TUTOR EXTERNO: Dr. Juan José Hicks GÓmez

A g o s t o 2 de 1 9 8 7 .J Je fe S e c c i ó n E n d o c r i n o l o g í a M o l e c u l a r D i v i s i & R io1 .og í a d e l a Reproducc i ón 1

4 I T l J L O :

j I n v e i t i g d c i 6 i i tiiorn6dica - CMN i

E s t u d i o d e do:; g l i c o s i d a c a s e i .ncorporaciÓn d e glu osa a g l i c o c o n j u g a d o s en e l e n d o m e t r i o de la r a t a emba s a zada . j

I A/LUMNO :

TUTOR: I J J u a n Jose Hicks; Gornez

!

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C c c c L f c c c f c c f f C c f

1.

2 .

PROYECTO INICIAL

TITULO DEL PROYECTO IN ICIAL : Estudio de do4 gl icosidasas e incorporación de glucosa a g l i - cocon~ugados en e l endometrio de l a rata emqarazada.

JUSTIFICACION Y NATURALEZA DEL PROYECTO

E l estudio de l a bioquímica de l a reproducc& en mamíferos es

,

importante no s6lo por constituir un problema báj ico en biología del cual se desconoce gran parte, sino porque además4 los conocimientos generados por l a b io logía de l a reproducci6n ha permitido e l desarro - 110 de prácticas médicas en humanos y animales q\ie han sido de bene- f i c i o para e l hombre.

~

E l presente proye.cto, de naturaleza básica, lpretende contribuir en e l conocimiento de l o s mecanismos bioquímicos(que . . operan en e l f e - nóineno de ' l a reproducci6n en mamíferos, centránddse en l a implanta-- ci6n del blastocisto a l endometrio.

3 . INTRODUCCION Y ANTECEDENTES I

En l a rata , l a adhesi6n del blaetocisto a l e/ndometriQ se rea l iza en e l . quinto d ía post-coito,.;.?n unas regiones es ecial izadas del endo -

tan cambios morfoiógicos y f i s io lóg icos que no sd observan en l a s zo- nas adyacentes del ' endometrio conocidas como int$rsit ios de implanta-

metrio conocidas como s i t i o s ae implantación (S I ) , , Fi l a s cuales presen-

' ' ci6n (1).

Entre l o s cambios más sobresalientes en l o s sitios de implante - se pueden mencionar l o s siguientes: diferenciaci+ de l a s células es- tromales a células deciduales; incremento en l a plermeabilidad vascular

( 2 )

P

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I: c

y ü~sminucibn de l a polaridad membranal ( 3 , 4 ) . Por o t r o lado, se ha postulado l a modif icacibn s e l e c t i v a de giicoconjugados de supez f i c i e de l endometrio y10 b l as toc i s t o como un requisito prev io para l a implantación < 5 , 6 ) , participando l os carbohicp-atos .<-glucosa y U-manosa en gl icoconjugados membranales de l endometrio en es t e --

proceso ( 5 ) .

Un gran grupo de g l i copro te fnas íaqU6llas aon enlaces N-gl ico-

s fd i cos ) se b i os in t e t i zan con l a part ic ipac ión ae una c lase espe--- c i a1 de pol isoprenoides ( l o s do l i c o l e s ) , los cuales funcionan como intermediarios g l i c o s i l ados entre l o s donadores i n i c i a l e s de unida- des de carbohLdratos ( l o s nuclebtido-azúcares: MDP-azúcares) y los aceptores f i n a l e s ( l a s cadenas po l ipept íd i cas ) ( 7 , esquema 11).

Por l o anteriormente expresado, e l presente proyecto t i ene por interés e l estudio de l a pos ib l e var iac ión en las act iv idades de -- g l i cos idasas y de l o s n i v e l e s de g l i copro te fnas y poli isoprenoles - g l icos ihados en e l endometrio de l a r a ta embarazjada, durante e l pe - r í odo de pre-impiantacibn; ya que s i e fect ivameate l a modificación s e l e c t i v a de l o s gl icoconjugados de l endometrio Ien l o s s i t i o s de - implante es un r e qu i s i t o para que se efectúe l a implantación, debe - riamos de encontrar d i f e renc ias en l a s act iv idaqes de g l i cos idasas y/o en l o s n i v e l e s de l o s glicoconjugados antes mencionados; entre l a s zonas de implante y l a s regiones adyacentes.

6

r r . OBJETIVOS

- Los ob j e t i vos de este-k-oyecto son:

a) Cuanti f icacidn de l a s act iv idades de &,manosidasa y w-

glucosidasa en e l endometrio de l a r a ta embarazaida en e l período de pre-implantaci6n, en las zonas de implante y regliones adyacentes.

Por supuesto, para e l l o se tendrán que estkblecer l a s condi- c iones óptimas de pH, concentración de sustratoq y tiempos de incu- bación.

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c c c c c E: .c c c f r c c f f c

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I- L ._

b) Desarrollar un método con los recursos de que se disponga que

permita evaluar en forma global l a biosíntesis de glicoproteínas en e l endometrio de l a rata.

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c e: c t c f c c c f c t c T L

PROGRAMA Y METODOLOGIA DE TRABAJO.

A. - PROGRAMA DE TRABAJO

a ) Aprender a determinar l a s fases d e l Ciclo e s t r a l y emba- razo de l a r a t a mediante c i t o l o g í a vaginal .

b) Aprendizaje de l a t6cnica de visualizacpbn y extracción de los s i t i o s de implantacibn d e l Útero1 de l a r a t a ; así como l a separacién da! los t e j i d o s e p i t e h i a l y estromal de este brgano.

I

c) Montaje y e s t a n d a r i z a c i h d e l método pa+ cuant i f i car - l a s act iv idades e n z i d t i c a s de l a s g l i cbs idaaas a estu- d i a r , primero empleando muestras de enzpmas comerciales y posteriormente los t e j i d o s uter inos. I

d) Cuanti f icaci6n de l a s act iv idades enzimgticas de las dos g l i cos idasas , en e l e p i t e l i o y e l estro4a endometriales, en e l So d ía de embarazo de l a r a t a (peifíodo justo antes de v e r i f i c a r s e l a implantacibn). Esto s+ r e a l i z a r á en -- l os s i t i o s de implantacibn (v isual izado4 por medio de l a t écn ica que se descr ib i rá posteriormentd) y zonas adyacec tes d e l endometrio, y usando animales dc$ una misma cepa, igual peso y mantenidas en condiciones dontroladas. ,

. e) Recopilaci6n de los datos obtenidos en qas determinacio- nes anter io res , para poder establecer 1 s pos ib les d i f e - renc ias e s t ad í s t i c a s en l a s act iv idades lenzimáticas en- tre los s i t i os de implante y l a s region& adyacentes.

f ) Debido a que se han reportado var ias i s enzimas para*-ma - nosidasa y d-g lucosidasa en otros brga os de l a r a t a -- ( 8 1 , se estudiará esta pos ib i l idad en ids t e j i d o s endome t r i a l e s . Esto será importante, ya que de han adjudicado d i s t i n t o s s i gn i f i cados f is iológicos a caida una de l a s -- isoenzimas.

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c t c c c i:

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g) Finalmente, y hasta l o posible, se trabajará (con l a meto-

dología que se mencionaird más adelante) eh e l desarrollo - de un método para evaluar en forma global l a biosfntcsis de glicoconjugados en e l endometrio de la1 rata.

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B.- METODOLOGIA DE TRABAJO

a ) I den t i f i cac i ón de l a s fases d e l c i c l o e s t r a l y diagnós- t i co de l embarazo.

Se u t i l i z a r án r a t& de l a cepa Long-Evans mantenidas en - condiciones controladas: v írgenes, adultas, de 2-3 meses de edad, con peso de 200 - 3Ogramo6, mantenidas en un cuarto con temperatura y luz controladas, alimentadas coq purina r a t chow y agua ad l ib i tum. de trío ( 2 hembras y 1 macho). Se rea l i zaran d r o t i s vaginales diariamente y por l a s mañanas. Las etapas de l c i c l o e s t r a l se i den t i f i ca rán de acuerdo a l a s imángenes c i t o l ó g i c a s de los -- f r o t i s ( 9 ) y en e l caso de aparecer espermatoqoides se conside rard como día cero de embarazo.

+

Las ra tas &e aparean mediante e l sistema

b) V isual i zac ión de l o s s i t i o s de implantqción y separación de los t e j i d o s e p i t e l i a l y estromal dell Útero.

Los s i t i o s de implante serdn v isual i zados mediante l a inyes ciÓn endovenosa de 0 .5 m l de una solución sa l jna de azul de tri - pbn a l a s ra tas en e l So día de embarazo. E l qolorante a l extra - basarte en l o s s i t i o s de implante (debido a l a gran vasaular iza ciÓn y permeabilidad en estas zonas) t i ñ e claxtamente de azul e s ras regiones (lO).Los t e j i d o s d e l endometrio s/erbn separados m e cánicamente por e l método de FAGG y c o l . (11)

c) Método para cuant i f i car l a s act iv idaded enzimdticas.

E l método que se usar6 s e d básicamente ell de SHOUP Y TOUSTER (12) : se emplearán l o s sutratos a r t i f i c i a l e s a-nitrofenoi-d -D- glucopiranósido y p-nitrofenol -6 - D manopir+6sido. La reacci6n enzimática es l a s iguiente :

'a3

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I

El p-nitrofenol liberado se cuantifica espectrofotométricamen - te ( 1 m ~ . r ~ 4 0 0 n * ), con l a ayuda de una curva patrón previa- mente realizada.

Cuando se desee cuantificar las actividades einzimdticas ucan- do los tejidos uterinos, se adicionará al siqtema de incubación el detergente no iónico Trit6n X-100, para sqlubilizar a las isoenzimas asociadas a membranas celulares. (18).

d.- Separaci6n de las posibies isoenzimas die las glicosida- sas. Para este fin, se empleará la técnica de eletroforesis en gel empleado por SHOUP Y TOUSfER ( 1 2 ) , en la bual se incuban los geles con el sustrato después de haberse pealizado la sepa - ración. Las regiones conteniendo la actividad1 enzimbtica'serán teñidas de amarillo a pH alcaiino debido a la liberación del - p-nitrofenol. Si este método funciona, se pod/rb determinar las actividades enzimdticas de cado isoenzima por densitometría del gel.

8 . - Evaluaci6n global de la biosfntesis de blicoconjugados. Los estudios de biosfntesis de glicoconbugados usan gene -

ralmente los NDP-azúcares con marca radioactika en el carbohi- drato, seguido posteriormente de la separacióp de los glicocvn - jugados, a los cuales se les determina la inc@rporación del car - bohidrato radioactivo. Sin embargo, en el lugbr donde se traba- jará no se dispone de estos reactivos, por eska raz6n se inten- tará usar glucosa marcada papa estos fines. Ebto se intentará aunque de antemano se espera una gran dilució$ de la marca de- bido a la diversidad de rwcciones enzimdticab en que participa este carbohidrato, de tal manera que s610 unalfracción muy pe- queña se espera que se incorpope a glicoconju$ados (ver esquema 11) . Los glicoconjugados serán separados del sisteha de incubacidn básicamente por la metodología empleada por WdECHTER y col. ( 1 3 ) '

El método se basa en las diferencias en las cgracterísticas de solubilidad de las distintas especies de polifsoprenoles y gli- coproteínas: los poliisoprenoles -fosfo-mono-$licosilados se a-

- .

,

.-

pi

L

c . c c c c f

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i II

traen con la mezcla de cioroformo/metanol (211) y los poiiiso- prenoles-difosfo-poliglicosilados con la mezcla de cloroformo /metanol/H20 (10/10/3), siendo las giicoproteíhas insolubles - en estos sistemas de solventes.

La incorporacib- de glucosa marcada se realiza+ en un contador de centelleo líquido. La parcial caracterización de las fracciones q$e se obtengan se

hard tentativamente con el criterio empleado pbr el grupo de - LELOIR (llr).

r L

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES.

A C T I V I D A D

Tipo de Actividad:

a) Aprendizaje de la determinación de las fast estral de la rata.

b) Aprendizaje de l a extracción de los sitios

c) Montaje de los métodos de cuantificacidn er

d) Determinación de las ac.?,vidades enzimdtica ferentes tejidos endometriales y recopilaci para pruebas estadísticas.

e) Separacih y cuantificacidn de las posibles por tecnicas eiectroforéticas.

y tejidos endometriales.

f) Desarrollo de un método de evaluación de la de glicoconjugados

del ciclo

e implante

i d t icas . en los di-

n de datos

isoenzimas

>iosíntesis

r L

c f c c c c c .E f c c c f c c I: c c

i .. B I B L I O G R A F I A

1.- GIL, U, COLLADO, M HICKS,J.J. (1978) Nuevos dos con la implantación. Ginec. Obstet. Mex

2.- PHYCHOYOS, A. (1973) Hormonal control of ov and Hormons. 31: 201

3.- NILSSON, O. (1975) Blastocyst surface charg in the mouse. Contraception 11:441

4.- LEVIN, A. (1973). A critique on the relevan tials to the mechanism of nidation. J. Endc

5.- HICKS, S. Y GUZMAN A.M. (1979). Inhibition intraluminal administration of concanavalin 20:129

6 . - MURPHY, C. and ROGERS, A.W. (1981) The surf the apex of the luminal epithelium. Cell Bi

7.- LENNARZ, N. (Editor) The biochemistry of gl proteoglucans. Plennum Press. 1980.

8. - OPHEIN, A. and TOUSTER, O. (1978). Lusosoma of the rat liver. Purification and comparat cy'tosalic -D-Mannosidases. J. Biol. Chem 2

9.- FOX, R., LAIR, C. (1970). Sexual cycles, en Reproduction and breeding techniques for la Febiger, Philadelphia. E.U.A. pp. 107-122

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A simple method tor removing the luminal er uterus for biochemical studies. J. ReDrod.

12.- SHOUP, V. A. E TOUSTER, O. 11976). "Purific tion of the - D-Mannosidasa of rat liver c

11.- FAGG, B., MARTIN, L., ROGERS, L., CLARK, 3.

251(13). 3845-3852 13.- WAECHTER, C. J. LUCAS, J.J. & I€NNARZ, W. (

synthesis of mannosyl phosphoryl polyisopre mannosyldonor in glycoprotein synthesis J.

14.- PARODI, A, LELOIR, L.F. (1979) The role of . 7570-7579.

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implantation vit. 47: 212

and implantation

8 of membranal poten- rinol. 54:141 € implantation by A. Contraception

ze carbohydrates at physics 3:305 zoproteins and

- D - Mannosidase 3n with the golgi and

HAFEZ, E. (Editor). 3(4) 1017-1023

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973) Enzymatic 01 and its role as a io1 chem. 248(21):

ipid intermediates ryotic cell.

... -”-.-- e-- ~

, ’

Méxlc0, D.F., 7 de tepti*nbre, 1987.

NOMBRE : TELEFONO: 581.77.41 MATRICULA: 751 18080

Alberto Hart% G u z d 6renfell

23.12.28.87 Blologla, área de concan~rrcf6n em

f P Blologta EXprrlrnnt.1 1 . !*Imm: :ms SWW: SO

[LUGAR WM)E SE RUltIZO: Unidad de inveatigacl6n BfolOdica,

centro n641Co Hactonal, I.tqS5S. (frponllante rn la Facultad de Wlclna.

Marzo 2, 1987 U.N.A.M.)

FECHA DE INICIO: FECHA DE TERnINACION: S a p t i d m 2, 1987

Doctor Juan JorC HIcb 6&z Jefe de la Sacci6n de EnQnlnolQgifa Vlolaerrlar Dlvlsión de Biología de la Roprodrvcc18n UnlW de Invaitl iBn 8laJdlca C a m Mdlco Nac 4” awl, I.M.S.S.

i TiiüLO:

ALwywo:

N í o R :

“Estudlo de dos gl lcorldaru e Imrporaclón da glucosa a glicoconjugador en el Mdawtrlo de la

$ IINIOAD IZTAPALAPA I

- ..

ACTIVIDADES DESARROLLADAS

I. ~UANTIFICACION DE LAS ACTIVIDADES DE MANOSIDASA Y ..LUCOSIDASA EN ENDOMETRIO DE LA RATA EMBARAZADA

I N 1- R O D U C C I O N .- - __. ... 3 .. rata, la adhesión del blastocisto al endometrio se realiza

en iuinto día post-coito, en reoiones especializadas del endo

r s t r a conocidas como sitios de implantation (SI); las cuales -- Fres+:-ntan cambios morfol6qicos y fisiológicos que no se observan

en ]..:is zonas adyacentes del endometrio conocidas como intersitios

de imtplantación (iSi) ( 1 ) .

-

Entr, los cambios más sobresalientes en los sitios de implante se

puedc:%n mencionar los siguientes: diferenciacion de células estro-

=ale a cElulas deciduales; incremento en la permeabilidad vascu-

lar 1 2 ) ; disminución de la polaridad membranal ( 3 , 4 ) . Por otro l a

do, :,e ha postulado La modificacidn selectiva de glicoconjugados

de superficie del endometrio y/o blastocisto como requisito para - l a iiiiplantación (5,6) ; participando los carbohidratos a-glucosa y

a-maiiosa eii glicoconjugados del endometrio en este proceso (5).

. -

considerando lo anterior, l a s actividades de a-Glucosidaca y a-Ma-

nosi<lasa podrían intervenir en la modificación regional de glico-

conjttgados del endometrio y/o blastocisto para que este último re-

conozca y se adhiera al sitio de implantación

O B , J E T I V O .-

El objetivo de esta primera parte del trabajo fué el de

estudiar las actividades de las enzimas a-Glucosidasa y

a-Manosidasa en el endometrio de la rata embarazada en

el qi~into dla de embaraza. Para ello se establecieron

las condiciones óptimas de pH, concentracion de sustra-

to, y tiempos de incubation.

M E ‘1) O D O L O G I A .-

Se utilizaron ratas Long-Evans en condiciones controla-

das; las cuales fueron apareadas con machos de fertili-

dad comprobada. En el quinto día de embarazo (tomando - como df;, O el dfa en que se observaron espermatozoides

en un frotis vaginal) Eueron sacrificadas previa inyec-

cion de 0.5 ml de Azul de Tripán al 1 % en solucián sali

na, para visualizar los sitios de implantation en el -- útero ( 7 ) . El epitelio de SI y IS1 fue separado del Cite

io mediante la técsica de FAGG y coi ( 8 ) . El ectroma

restante se separd mediante raspado u homogenizacidn sua

ve del. resto de los tejidos.

estroma se hornogeneizaron en un regulador de citratos -- 0.05M, pH 6.5 y se sometieron a centrifugacion diferen-

cial para obtener las siguientes fracciones crudas: nu-

clear (800gllOmin), mitocondrial-lisosomal ( 1 6 U00 g/30

min) y citosólica (sobrenadante ;le 100 OOOg/ 60 min}.

-

-

- Tanto el epitelio como el

I

i

I. I

.. . , ,

Las tictividades de las enzimas fueron rutinariamente mc-

didas usando el siguiente medio de incubación:

CUSTIIATO ( p-Nitro fenil a-D-Glucopiran6sido 6 p-Nitro

Peni L a-D-Manopiran6sido) . . . . . 5mM)

TritGn X-100 . . . .0,1% Regulador de citratos 0 . 0 5 M a pH deseado

Fuente enzimdtica .... 50 pl En un volumen total de Uml.

Incubaci6n a 37OC con agitación moderada

La reaccidn se paró con la adición de 250 pl de un regula-

dor de carbonatos 0.5M, ph 10.5, y l a liberación de p-Ni-

tro F'enol se cuantificó en un espectrofotómetro a una lon-

gitud de onda de 400 nm, usando una curva de calibración

previamente realizada.

La actividad se expres6 en nmoles de p-Nitrofenol liberado

/mg de protefna/hora.

La cuantificación de proteínas se realizó por la técnica

de microbiuret (9).

1 c

-----__- . ~

11. INCORPORACION DE 14c GLUCOSA A GLICOI'ROTEIE:;.L GLICOLIPIDOS DE ENDOMETRIO DE RATA

I N T R O D U C C I O N .-

Uno de los cambios bioquímicos que se preSentan E;:. '.

tracto reproductor de la rata hembra es el de la .:?:..

ción tanto cualitativa como cuantitativa de las g l r -,',:,:,,

tefnas. A estos qlicoconjugados, los cuales depexf+c. 5,.

la acción hormonal ( principalmente de estróqenos y

gesterona ) , se les ha involucrado en el proceso 6- I#;:.

tilización y de implantación (3,s).

Dado que un gran grupo de qlicoproteínas (aquéiizz :'.:

enlaces N-glicosfdicos ) se biosintetizan con la ?:*.:,;;

paci.6n de una clase especial de poliisoprenoides ':.-.-.*,,,,,~,

tamente los Dolicoles ) , los cuales funcionan Coz.:: ;;.+,5ic

mediarios qlicosilados, entre l o s donadores inicis:?? c 7

unidades de carbohidratos ( los nucleótido-a~6Cas+%: !;',;-,

Azúcares ) y los aceptores finales ( cadenas polip;?:~;,

cas ) ( 1 2 ) ; es de 'interés el estudiar los niveles zar.*/,

de glicoprotefnas como de estos poliisoprenoles q l ; - f & i ~ , ~

dos, en diferentes estados hormonales y durante el as$.'+

do de pre-implantación.

',, .: , . , ..

."

O B J E T I V O . - *

El objetivo inicial de este trabajo fue el de de==5lZqc

un método para evaluar en forma global la biosfr'-- .-=r-5 .&

qlicoproteínas y glicollpidos en e1 endometrio de -e fir+ii

mediante la cuantificación de l a incorporación enzimáti - ca de glucosa marcada a estas moléculas.

M E T O D O L O G 1 A . -

Se usaron 4 ratas en Diestro, a las Cuales se les extrajo

el Citero, el cual se limpió de tejidos anexos. El endome-

trio se extrajo mediante raspado de los cuernos uterinos

longitudinalmente, y se homoqeneiz6 en un amortiguador de

TRIS-HCL o.lM ph 7.5, conteniendo MgCl 5mM a 4OC. Una

allcuota de este homoqeneizado correspondiente a 1 mg de

proteína se incubó en un medio de 1 ml conteniendo:

TRIS-HCL, ph 7.5... 0.1 M

MqC12 .... 5 mM

14C Glucosa .... 0.1 pCi Glucosa .... 0.5 mg

Posteriormente se incubó a 37OC con agitación moderada y - al tiempo deseado se adicion6 1 m l de ácido Tricoioro Acé-

tic0 (TCA) a l 10% frlo. La separaci6n de proteínas, llpidos

y poliisoprenoles qlicosilados se realizó según l a técnica

de Waechter y col, 1973 (13); la cual básicamente consiste

en lo siguiente: por las caracterlsticas de solubilidad, - 10s poliisoprenoles -fosfo-mono glicosilados se extraen con

la mezcla de cloroformo/metanol 2:l

los poliisoprenoles-difosfppoligliglicosilados son solubles - en la mezcla de cloroformo/metanoi H20 10/1(4/3 ( C /M/H~O ) ,

siendo las glicoprote€nas insolubles en estos sistemas de

solvent.es.

(C/M), mientras que -

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P r e c i p i t a d o

l a v a d o L .,sees (,'.:. I 0.5ml.

P r e c i p i t a d o

Suspens ión

ExtracciÓr. con 2C volúmenes de f ; ro C e n t r i f u g á c i ó n

P r e c i p i t a d o

Secado a l v a c í o E x t r a c c i ó n con 2 m l

C e n t r i f u g a c i ó n C/M /n20

P r e c i p i t a d o

P o t é i c o

.

Sob r enadan t e

Sobrenadante

Sobrenadante : E x t r a c t o C / M

Sobrenadante : E x t r a c t o C/M /H20

1 % 1' r

La radioactividad se cuantificó en un contador de cente-

lleo líquido. Como control se us6 un homogeneizado prc-

vianente calentado en baño marfa a ebullición.

, I.

, I...

..

Con el propósito de caracterizar en cierta medida a los

compuestos que incorporaron la marca radioactiva en l a s

fracciones obtenidas, se aplicó el mismo criterio de ca-

racterización de los derivados del Dolicol expresado por

el grupo de Leloir (14) : es decir (c.p.f.), labilidad an -

te la hidrólisis ácida y alcalina ass como las caracterfs -

ticac de solubilidad en varios sistemas de solventes.

R E S U L T A D O S

A.- CONDICIONES PARA LA CUANTIFICACION DE LAS ENZIMATICAS .

ACTIVIDADES

El efecto de la concentración del sustrato y -1 pH en la

actividad de 4 -Manosidasa en el endometrio de la rata no

embarazada se muestra en las gráficas 2 y 3 . La gráfica - 2 muestra una cinética de tipo Michaelis-Menten en la -

cual no se ensayó la actividad a concentraciones superio-

res a i2 WI del sustrato debido a la poca solubilidad del

p-nitrofenol-4 - D-manopiranósido en el medio de incubación

En cuanto al efecto del pH, la figura 3 muestra una activi-

aad máxima a pH = 4 . 5 .

El curso de las reacciones se muestran en ].as gráficas 4-7

En estos ensayos se usaron ratas embarazadas, determindndo-

se l a s activirades en zonas de implante e intersitios de - implantaci6n, tanto en el estroma como en el epitelio ute-

rinoc-; .

En términos generales se puede apreciar una linealidad con

respecto al tiempo de incubación hasta los 90 minutos de - incuhación.

Por 10s resultados presentados en las gráficas 4-7 y en las

tablas I y 11, se puede señalar que las actividades espe -

.-

i i 1 : i.

i

...

1 .

...

. .

...

..

cfficas de4-glucosidasa y 4 -manosidasa son mayores en

cl tejido estromal que en el epitelio uterinos. Por otro

lado, en ambos tejidos se encontraron dichas actividades

cnzimáticas incrementadas en los intersitios de implanta

ci6n a l compararse con las zonas de implante, siendo es-

ta diferencia ectadfsticamente significativa (tablas I y

11).

Dado que la técnica de visualizacibn y separaci6n de las

zonas de implante en el útero se basa en la tincidn se - lectiva de estas zonas con azul de tripdn, encontrándose

este colorante presente por extrabasación sanguínea en

estas zonas, se estudi6 SI el azul de trip& tendría al-

gfin efecto en la actividad de las enzimas estudiadas que

explicarfa las diferencias antes señaladas. Para ello se

at-terminaron las actividades enzimáticac adicionando al

medio de incubacibn una cantidad similar de azul de tri-

pSn (determinada espectrofotométricamente) a la encontra -

da en el tejido teñido. El resultado para manosidasa se

muestra en la gráfica 8 , no encontrándose efecto alguno

en la actividad de esta enzima. El resultado para

glucosidasa fue igual.

. .

_.._

._

. .

, ....

..

..

.

..

.._ .

..

.._,

._

I-

...

- ._ I-

-

40 SO Lo nmoles de /O 20 PNP

GRAFICA I Curva de calibración para p-Nitro fenol (PNP) en regulador de carbonatos 0.5 M, pH 10.5 Las lecturas de D.O. se hicieron en un espec tofotómetro a 400nm

-

.

- .

5m

400

303

200

I O 0

'4 PNP-a-D-Ma :nopira moca

GRAFICA 2.- Efecto de la concentracibn del sustrato en la actividad de a-Manosidasa en el epitelio uterino ae la rata (Diestro)

c .

r

r-

/o0 .-

80 -

60 -

40 -

20 .-

-- % de la _. actividad

máxima ...

,...

. ..

-.

I .

. ,-

...

--

.-

. ..

..

. ..

.I

/o0

80

60

40

20

3 9 5 6 7 8 PH

GRAFICA 3.- Efecto del pH en la actividad de a-manocidasa en endometrio de la rata en diestro. Ectroma (- ) y Epitelio

1.

40

20

GRAFICA 4.- Efecto del tiempo de incubaci6n en la actividad de a-Glucosidasa en epitelio uterino c?e rata en el 5' día de embara - 2 0 SI (.o+) Y IS1 (e).

GRAFICA 5.- Efecto del tiempo de incubación en la actividad de a-Glucosidasa en el est- ma uterino en el 5O día de embarazo.

SI (- ) IS1 (-6-0- 1

L

r-

u O &4 a

m @ +. O E $2

G

200

100

500

400

300

zoo

10 o

- minutos

GRAFICA 6.- Efecto del tiempo de incubación en la actividad de a-Manosidasa en epitelio uterino en el 5 O dla de embarazo.

SI (- 1. IS1 (- ) .

90 minutos

GRAFICA 7.- Efecto del tiempo de inhbación en la actividad de a-Manosidasa en el estroma uterino en el 5' día de em- barazo SI(- ) , IsI(* )

.. r

"-

I .

..

. .

,-

I-

. ..

,.-

..++ - k'RAC¿'iOi\i

- p a s t i l l a ae e p i t e l i o X = j 7

P a s t i l l , a de estrouia a=ss s'.;

s=10 Soorenadante de e p i t e l i o i=13

s=3 SoureniAaante de e s t r o m X=17

s=4

-

IS1

t x=75

iz=141+ s- 5

s=12 X=16 s=2

s-2

-

x=20

Act i v idad expresada en n iuoleu Ue PNP liDerados/mg de proteina/h, U. pii de ?.5

obtenida por centr i fU&ción u 16 OOOg/33 win

D i f e renc ia lil cowp.+mmst' con <p<O.Ol)

++

+

" ,.

.. ...

.I

L

..

. ..

-r: \. tJ

zi k

O] iu ri O 3

d

20 itiinutos Jo

GRAFICA 8.- Efecto de la presencia de A z u l de Tripdn a una

concentraci6n de 50rg/ml en el m, -dio de incuba -

cidn (-) en l a actividad de a-Manosidasa -- pH 5.5 en el endometrio de la rata. Sin Azul - de Tripdn (-0-0-1.

1 .- a

..

.-

11. INCORPORACION DE I4C GLUCOSA A GLICOPROTEINAS Y GLICOLIP' DOS EN EL ENDOMETRIO DE LA RATA.

Las cinéticas de la incorporación de glucosa marcada en las

tres fracciones estudiadas se muestra en las gráficas I y 11.

Como podemos observar, los resultados indican que dicha in - corpor,aci6n tiene un carácter enzimático, ya que cuando se - us6 homogeneizado inactivado (gráfica II), l a incorporacidn

fue mu:y poca y con un comportamiento diferente al mostrado en

la gráfica 11.

Por otro lado, la CfhetiCa de la incorporaci6n en l o s tres - mostrados en la gráfica I es similar a la reportada por - - Waechter y col (13) para oviducto de gallina, la cual corres-

ponderiia a la vía biosintética expresada en el esquemax; ya

que por otro lado, se acepta que las condiciones de extracción

usadas,, las fracciones C/M y C/M/HP corresponden a l o s deri-

vados Dolicil-fosfo-sacdrido y Dolicol-difocfo-oligosacáridos,

respectivamente (14) . Finalmente, en cuanto a las características de hidrdlisis, se

puede apreciar en las tablas que los glicolfpidos presentaron,

por un lado, labilidad en solucion ácida diluída en condicio -

I

I 1

nes moderadas de temperatura y tiempos cortos; mientras que -- !

fueron relativamente estables a la hidrblisis alcalina modera- .. . ~

I da. Estos últimos resultados apoyan la estructura de poliiso - prenoles glicosilados con la unidad alfa-isopreno saturada (14) - Aunque es necesaria una mejo'r caracterizaci6n de estos glicolf-,*

pidos, por los resultados obtenidos es muy probable que se tra

~

i i

te de derivados glicosilados del Dolicol, por lo cual la técni- > I

Ca empleada puede aplicarse para los fines mencionados en 6:: 06 jetivo.

GRliFICA I

. -

I .

10 20 30 40 50

Minutos

L..

--

Incorporacidn de (14C) Glucosa a g l i o o l i p i d o s y prote ínas

(Endometrio de r a t a en d i e s t r o )

Ex t rac to do cloroformo/metanol 2 : l p-) Extrac to de olorof,rmo/metanol/H20 10!10:3

Mater ia l inso lub le (prote ína ) (-rt) (-k )

r

-..

GRAFICA I1

...

c

,-

/O 20 30

m i nut os

40

IncorporeciÓn de ( l 4 C ) Glucosa a é. - ~ . o l i p i

50

s y p r c ;inas (Endometrio de rata e n d i e s t r o i n a o t i v a d o por e b u l l i o i ó n

durante lijmin. )

E x t r a c t o de cloroformo/metanol 2 :1 (+o-)

E x t r a c t o de cloroforrno/rnetanol/H20 10:lO '3 (+-o-)

M a t e r i a l i n s o l u b l e ( p r o t e í n a ) (tr)

!

r

1 '

,-

.-

.-

. ._

r-

1 ..

,--

ESUJEMA

G l c

Hexosas I

D o l - P - A z ú c a r e s + D o l -P2-(G1cNA,)2

I GL I COPROTEINA 1

I

. .

. .

....

.,..

, .

. .

I,.

, ..

.. .

1

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L

,-

I-

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L,

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L.-

.-.

.-.

.-

.-.

r_

L

r

r .i

. .

t ------.---- I C/N

/:2 100Clprn)

HCL 0.1N, 3Ooc, 1 5 win

r----------- I

t----------

I

Vna alícuota de cada extrbcto conteniendo las dpm6 in- dicadas, se tratd con H C 1 (arriba) Ó NaOH (abajo). Des puéa de cada incubación, se realizaron dos extracciones Con NaCi 0.15 M y la radioúctiviaad en las dos fases fue determinada.

-

< -

, .

CARACTERISTICAS CSOMPTOGRAFICA (c.c.f. )

DE LOS GLICOLIPIDOS MARCADOS

VALORES DE Rf

SISTE'lfiS DE SOLVENTES

EXTn7PCTG A B C /-- I I

I .

D Z S C U S I O N

..

: .^ I.

L

Por los resultados cbtenidos e s ev idente que en l a s zonas

adyacentes a los s i t i o s de implantación en e l útero de l a

r a ta en e l 5 O d í a de embarazo, l a s act iv idades e spec í f i cas

de o[ -Manosidasa y 4-Glucosidasa son mayores (aproximadg

mente l . 5 - 2 veces mayor) que en los s i t i o s de implante.

A l parecer e s t a d i f e r e n c i a no se debe a una disminución de

l a s act iv idades enzimáticas en l o s s i t i o s de implante, ya

que en e l c i c l o e s t r a l de l a r a ta no embarazada (datos no

presentados), los v a l o r e s de e s tas act iv idades enzimdticas

son s imi lares a los encontrados en e l s i t i o de implantation

en e l !so d í a de embarazo. Según esto, l a s d i f e r enc ias encon

tradas ent re e l intcrs i t io y e l s i t i o de implantación esta-

r í an dadas por un incremento e n l a ac t i v i dad de es tas dos - enzimais en los i n t e r s i t i o s de implantación.

-

Desde hace tiempo sf ha estab lec ido l a ex i s t enc ia de por l o

menos tres isoenz i ras tanto parae-manosidasa en e l hígado

de rata (10) como para d-glucosidasa en Gtero de ra ta (11)

Aunque e l papel f i s io lóg ico de cada una de e l l a s no está

b ien establecido, a l parecer l a s isoenzimas de o r i g en l iso-

somal (con pH óptimo de 4 . 5 ) e s t á asociada a procesos h id ro - l í t icos en lisosoma; las de o r i g en microsomal (con pH óptimo

de 5.511 con procesos de b i o s í n t e s i s de g l i coprote ínas , y l a s

de oricjen c i t o só l iCo (con pH dptimo de 6.5) con ac t i v i dad

h i d r o l l t i c a no bien caracter izada en e l citosol.

por lo anteriormente mencionado, es difícil establecer un

significado fisiológico a los resultados aqui presentados,

ya que las actividades enzimdticas medidas no diferencian

a cada una de las isoenzimas. Sin embargo, como se muestra

en la qráfica 3, la máxima actividad específica de monosi-

dasa se encontr6 al pH de 4 . 5 , lo cual nos indicaría una - actividad mayor de la isoenzima de origen lisosomal. Por - otro lado, los resultados presentados en la tabla 11, mues -

tran que las diferencias de las actividades de 4-qlucosida - sa entre el sitio de implantación y las zonas adyacentes

son mayores cuando se midi6 la actividad en las pastillas de

una centrifugación a 16,000 g/30 min. (fracción con lisoso-

mas y mitocondrias), mientras que no se encontró diferencia

significativa cuando se midi6 la actividad en los sobrena - dantes (fracciones citosólica y microsomal).

Aunque es necesario establecer si los resultados encontrados

se deben a la variaci6n de alguna de las isoenzimas glucosi-

dasa y manosidasa, lo anteriormente señalado parece indicar

que son las isoenzimas de origen lisosomal cuya actividad

específica se encuentra incrementada en las zonas adyacentes

al sitio de implantacibn. De comprobarse ésto, quedaría por

establecer el significado de los resultados encontrados en

este trabajo, y si estas enzimas están involucradas en el - proceso de implantacion en l a rata. .

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I .

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,-

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v-

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