Bioteknologi Farmasi Penanggung jawab: Dr Amarila Malik Departemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia FAR 40541 2 SKS Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. SASARAN PEMBELAJARAN: Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi, keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme, teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika, pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi, dan penerapan bioteknologi dalam upaya pemeliharaan kesehatan masyarakat. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PUSTAKA : Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006 Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press. Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E. Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK) Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland, MA, USA J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, USA Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Pokok-pokok Bahasan Pendahuluan Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam bidang farmasi, Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi, Teknologi bioproses Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi: fermentasi dan kinetikanya, proses hilir Materi genetik Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan Terapi gen pada manusia, Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang farmasi, Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Pendahuluan - Bioteknologi Farmasi Dampak bioteknologi terhadap bidang farmasi Rekayasa genetika-rekombinasi DNA kloning gen Aplikasi teknik molekular Produk komersial dari mikroorganisma Terapi Gen Overview Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. BIOTEKNOLOGI FARMASI Definisi: Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi Dampak terhadap : obat-obatan diagnostik vaksin BIOTEKNOLOGI: - Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang penting dan Bermanfaat : protein dan enzim -Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing tertentu, juga senyawa kimia lainnya, spt. Vitamin Diperlukan molecular basic knowledge TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER ORGANISME REKOMBINAN Human insulin (1978): produk farmasi pertama hasil rekayasa genetika Sepotong DNA penyandi hormon insulin manusia Transfer ke mikroorganisme : E. coli Kontrol ekspresi Human insulin di E. coli Gene cloning Teknik : Rekayasa Genetika Genetically modified/genetically engineered 1994: 21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA 150 produk dalam taraf clinical trial Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Dampak Bioteknologi terhadap Farmasi TUGAS: Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi. Diskusikan per kelompok Cari protein-protein yang diproduksi secara teknologi DNA rekombinan Terhadap profesi farmasis: isu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial) Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DAMPAK BIOTEKNOLOGI TERHADAP BIDANG FARMASI I. Obat obatan berupa protein dan peptide stabilitas, formulasi, penyimpanan, efek samping berbeda dengan obat obat yang berupa molekul, kecil Contoh : suhu refrigerator ; tidak boleh terkocok II. Pilihan produk biotek ( protein & peptida). Pertimbangan sistem ekspresi Sistem ekspresi berbeda, maka produk sedikit berbeda Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. III. Obat obat kelas baru yang beredar di pasaran Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat diatasi . Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) ; Hep B-vaccine (Engerix BR Smith Kline Beecham) IV. Agents diagnostik model baru Contoh : ELISA monoclonal antibody (Enzyme Linked immunosorbant Assay) reaksi warna probe untuk Plasmodium falciparum, berupa potongan DNA spesifik Profesi FARMASIS Isu isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical ) Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat obat dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. R A K A Y A S A G E N E T I K A Definisi Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor, sehingga memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang / diperbanyak di dalam sel inang yang baru. KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan memperbanyak molekul yang baru. Kloning gen rekayasa genetika, teknologi DNA rekombinan Contoh : domba Dolly Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. RAKAYASA GENETIKA Material genetik : adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan dari tetua ke turunannya, yaitu asam nukleat DNA : deoksi ribonucleic acid RNA : ribonucleic acid Vektor Kloning : adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke inang tertentu. Gen : adalah sekuens DNA yang menyandikan protein. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. - Menerobos barier alamiah suatu spesies Insulin manusia diproduksi oleh E. coli E. coli sebagai pabrik biologis -Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif potongan potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi gen penyebab penyakit keturunan Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS, 02/0897) sel sumsum tulang belakang diekrtraksi, dimanipulasi dengan sel sel normal, diintroduksi kembali melalui pembuluh darah. ASPEK KLONING Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya mengisolasi dan menskrining, tapi juga dapat mengkonstruksi organisme, dalam hal ini galur galur yang produktif. Mikroorganisme Tanaman BIOREAKTOR Hewan ASPEK KLONING Dua dasar penerapan kloning gen 1. Isolasi dan studi gen gen tertentu Diperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi dan mekanisme regulasi gen 2. Peningkatan produksi oleh suatu gen spesifik Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TEKNIK TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN Metode isolasi DNA Metode memotong dan menyambung molekul molekul asam nukleat Metode transformasi pada sel host/ inang ; sebagai dasar : Escherichia coli ( E. coli ) why ? Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetika digunakan E. coli sebagai organisme inang : Paling banyak dipelajari Paling lengkap informasi material genetiknya : - sudah lengkap peta genomnya. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DEFINISI Isolasi DNA mengekstraksi molekul DNA dari sel Memotong DNA ( digestion ) memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi Menyambung DNA ( Ligation ) Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase Transformasi Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang DEFINISI Isolasi DNA mengekstraksi molekul DNA dari sel Memotong DNA ( digestion ) memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi Menyambung DNA ( Ligation ) Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase Transformasi Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. ISOLASI DNA 1.Penghancuran dinding sel : - mekanik - enzimatis 2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat - Triton X 100 3. Membersihkan debris sel - sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ; atau proteinase-K 4. Presipitasi - + alkohol sentrifugasi gradien CsCl ; elektro- - + alcohol + NH4 asetat ISOLASI DNA 1.Penghancuran dinding sel : - mekanik - enzimatis 2. Lisis sel : - S D S : sodium dodesil sulfat - Triton X 100 3. Membersihkan debris sel - sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol, CHCl3 kemudian disentrifugasi ; atau proteinase-K 4. Presipitasi - + alkohol sentrifugasi gradien CsCl ; elektro- - + alcohol + NH4 asetat Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom 1. Beda struktur tersier : DNA plasmid : supercoiled Covalently Closed Circular ( CCC ) DNA kromosom/genom : linier 2. Sifat denaturasi - dengan alkali, pemanasan - DNA plasmid lebih mudah renaturasi 3. Ultrasentrifugasi : CsCl gradien DNA plasmid berada di bawah 4. Mobilitas di elektroforesis gel agarose DNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom) DNA Supercoiled (plasmid) Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom 1. Beda struktur tersier : DNA plasmid : supercoiled Covalently Closed Circular ( CCC ) DNA kromosom/genom : linier 2. Sifat denaturasi - dengan alkali, pemanasan - DNA plasmid lebih mudah renaturasi 3. Ultrasentrifugasi : CsCl gradien DNA plasmid berada di bawah 4. Mobilitas di elektroforesis gel agarose DNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom) DNA Supercoiled (plasmid) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Agarose gel electrophoresis DNA size lamda lamda plasmid plasmid +RE +RE Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA Elektroforesis - DNA diwarnai dengan Etidium bromida - dilarikan pada gel agarose dari kutub () ke (+) - dapat diketahui adanya degradasi Degradasi : Ik. Fosfodiester putus Penyimpanan : > - 200C - DNAse tidak aktif - mencegah degradasi oleh DNAse > TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. METODE METODE ISOLASI PLASMID skala besar : sentrifugasi gradien CsCl skala kecil ~ mini prep, midiprep sentrifugasi gradien alkalin lisis metode ammonium asetat metode partikel gelas ( glass milk ) metode partikel magnetic ( magnetic beads ) kromatografi ( exclusion chromatography) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. VEKTOR KLONING PLASMID bereplikasi diri ( self replicating ) utas ganda : d s molekul DNA sirkulator di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal copy number ( Jumlah kopi per sel ): high copy number 10 100 kopi / sel low copy number 1 4 kopi / sel medium copy number diantaranya Ukuran : 1 s/d 500 kb VEKTOR KLONING PLASMID bereplikasi diri ( self replicating ) utas ganda : d s molekul DNA sirkulator di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal copy number ( Jumlah kopi per sel ): high copy number 10 100 kopi / sel low copy number 1 4 kopi / sel medium copy number diantaranya Ukuran : 1 s/d 500 kb Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. VEKTOR KLONING Spektrum inang : broad hostrange dapat bereplikasi pada sejumlah spesies bakteri narrow hostrange hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning : Ukuran kecil Mempunyai situs situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ), tempat insert disisipkan / diklon. Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert. Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered Contoh : pBR 322, pUC 19 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PLASMID -Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda. - Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang Eukariotik ( beberapa ) - Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB 2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit PLASMID -Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda. - Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang Eukariotik ( beberapa ) - Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB 2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. STABILITAS PLASMID kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri tidak tergantung kromosom ada gen ORI : untuk replikasi mandiri - Plasmid rekayasa Untuk teknologi DNA rekombinan STABILITAS PLASMID kondisi optimum, stabil medium tumbuh - Mandiri tidak tergantung kromosom ada gen ORI : untuk replikasi mandiri - Plasmid rekayasa Untuk teknologi DNA rekombinan Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA Telah diketahui ada 3,139 enzyme Restriction Enzymes = enzim restriksi PEMOTONGAN DNA (digesti ) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Enzyme Site Recognition = situs pengenalan enzim restriksi Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site) Enzim mengenali 4- atau 6- pasangan basa , dengan sekuens palindromik (eg GAATTC) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. 5 versus 3 overhang Enzyme cuts 5 GAATTC 3 3 G 5 5 G 3 3 CTTAAG 5 5 G 3 3 CTTAA 5 5 AATTC 3 3 G 5 Generates 5 overhang Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Common Restriction Enzymes EcoRI Escherichia coli 5 overhang PstI Providencia stuartii 3 overhang 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 5 CTGCAG 3 3 CACGTC 5 Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. The DNA Digestion Restriction Buffer provides optimal conditions NaCl provides the correct ionic strength Tris-HCl provides the proper pH Mg2+ is an enzyme co-factor Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DNA Digestion Temperature Why incubate at 37C? Body temperature is optimal for these and most other enzymes What happens if temperature is too hot or cool? G Too hot = enzyme may be denatured, killed J Too cool= enzyme activity lowered, requiring longer digestion time Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Agarose Electrophoresis Arus listrik yang membawa DNA bermuatan negatif ke elektroda muatan (warna merah)positif melalui suatu gel agaros Gel agarose memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di dibandingkan fragmen besar Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PENYAMBUNGAN DNA ( Ligasi ) - Penyambungan gugus 3OH dan DNA insert. ( Gb. ) - Ligasi lebih mudah pada ujung ujung sticky ( dengan ER sama / isoschizomer / isocaudomer). - Reaksi Ligasi DNA vektor 3 1 : 2 ( s/d 1: 10 ) DNA insert 6 Buter T4 DNA ligase 5x 4 T4 DNA ligase 1 dH2O ( destilata bebas ion ) 6 Total 20 Inkubasi : 40 150 C semalam ( 18 24 jam ) - Ujung blunt end : dapat diligasi, walaupun didigesti dengan ER berbeda. Pada reaksi Ligasi, selalu sertakan pula control control : k. Transformasi : vector utuh k. ligasi : vector linier / terpotong + enz ligase Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Pengambilan DNA rekombinan oleh E.coli dengan cara mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah kompeten. TRANSFORMASI GFP Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. E.coli sebagai sel inang : > sudah dimodifikasi genetik, antara lain : > Rec A- : tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi contoh : E.coli DH5, E.coli HB101 TRANSFORMASI Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Electroporation Electrical shock yang menyebabkan membran menjadi permeabel terhadap DNA Calcium Chloride/Heat Shock Chemically-competent cells mengambil DNA setelah heat shock E.coli dibuat kompeten dengan cara kimia: -Peningkatan suhu dan CaCl2 heat shock pada 370 C 420 C, dalam larutan CaCl2 - Setelah ditransformasi, disebar pada medium seleksi TRANSFORMASI Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Electroporation Electric shock Membuat pori-pori kecil pada membran sel Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. SELEKSI E.coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap E.coli yang tidak membawa rekombinan Macam seleksi : ( 4 ) 1.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan ) perlu teknik cawan replika (replica plating) 2. seleksi warna koloni : X gal , memanfaatkan gen lacZ yang menghasilkan enz. galactosidase. Enzim tsb mengubah substrat X- gal menjadi -gal biru 3.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E. coli DHS ( inang ) 4. Analisa hibridisasi : - dot blot; colony hybridization Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. REPLICA PLATING Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh) = Transforman AMPR Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh Kain Beludru AMP LATE BLOCK PRESS Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. AMP LATE BLOCK REPLICA PLATING Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh Kain Beludru AMP LATE BLOCK PRESS AMP LATE BLOCK TET PLATE BLOCK Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TETRES NONRECOMBINANTS TET PLATE GROW Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan Ambil REKOMBINAN dari TETSENS AMPRES dari cawan AMP TETRES NONRECOMBINANTS AMP LATE TET PLATE REPLICA PLATING Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINAN Dilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER). Vertifikasi : Memastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor, menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double digest), berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di elektroforesis gel agarose. Pemetaan : Manfaat ER dalam biologi molekuler. Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs situs Enzim restriksi. Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ): pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER. Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOT Perlu teknik khusus Prokariot tidak dapat melakukan intron splicing DNA eukariot besar karena mengandung banyak intron Ekspresi akan kacau oleh prokariot Oleh karena itu : -menggunakan MRNA mature - Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dari RNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yang mensintesis utas kedua DNA dari template DNA Sehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) : yang utuh & parsial Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULER SEKTOR : Medicinal : -Human Therapeutic -Human Diagnostic Non medical : -Agriculture -Specialities -Non-medical Diagnostic Contoh : INDIGO pewarna jeans Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. INDIGO -diekstraksi dari tanaman -batubara -rekombinan DNA Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans Genencor International : green route to blue dye Indol diubah menjadi cis indole 2,3 dehydrodiol dengan gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. DIAGNOSTIK MOLEKULER Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus virus spesifik, bakteri, fungi dll, juga molekul molekul kecil. Untuk kepentingan pencegahan, control, pengobatan dari penyakit penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadap organisme pathogen penyebab penyakit ditumbuhkan/dikultur amati sifat sifat fisiologis KENDALA : lama mahal ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan sulit mendeteksi organisme penyebab penyakit Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Untuk mengatasi kendala kendala tersebut maka dikembangkan prosedur prosedur diagnostik molekular: 1. Metode immunologi detection Co : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E. coli ( Enzyme linked immunosorbent assay ) 2. Metode deteksi DNA yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA Prinsip hibridisasi asam. Nukleat Essei ini : cepat reliable spesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens nukleotida target Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBA HUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS - jumlah sangat terbatas - produksinya mahal -biological mode of action belum dikarakterisasi jelas + 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telah diklon, dan telah melalui berbagai uji selama bertahuntahun sebelum tersedia secara komersial. (Tabel 7.1) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Pharmaceutical biotechnology Diabetes Insulin Haemophilia Factor VIII Stroke Tissue plasminogen activator Growth failure Human growth hormone Anaemia Erythropoietin Viral infection Interferon Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical Isolasi cDNA Engineering (Rekayasa) Optimizing Gene Expression Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Isolasi cDNA Strategi I: Isolasi protein target Determinasi sekuens asam amino Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi Sintesis oligonukleotida Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari pustaka genom atau pustaka cDNA Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatu jaringan khusus Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA ; tidak perlu dari protein. mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target. Contoh : Insulin disintesis hanya dijaringan khusus di pancreas yaitu di pulau Langerhans. Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut 70 % menyandikan insulin. MRNA (mature) Reverse transcribed cDNA Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Engineering -sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda -jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan biaya -namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional protein heterogous masih tetap?? Strategi untuk mendesain protein protein, dengan cara mengatur kombinasi domain domain fungsional suatu protein, atau dengan cara mutagenesisis terarah, agar dapat mempelajari mode of action suatu protein. Optimizing Gene Expression Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Harus dipilih berdasarkan kriteria : -memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature authentic protein, selain -mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi -mudah dipurifikasi Contoh : human interleukin 3 Produksi paling baik di Bacillus licheniformis meskipun produksi banyak di E. coli, tapi menghasilkan protein interleukin-3 yang salah. Optimizing Gene Expression Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit. C) D-glucose D-Sorbitol L-sorbose 2 KLG (2-keto-L-gluconic acid) L- ascorbic Acid Satu tahap fermentasi mikroba sejumlah tahap tahap kimia Dari penelitian penelitian biokimia mengenai lintasan lintasan metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan kemungkinan untuk mensintesis 2 - KLG Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Acetobacter Gluconobacter D. glucose 2,5 diketo- D- glukonic acid (2,5 DKG) Erwinia melalui beberapa lintas metabolisme Corynebacterium 2,5-DKG reduktase Brevibacterium 2,5 DKG 2 KLG Arthrobacter 1 lintas metabolisme Gen penyandi enzim 2.5 DKG reduktase dari Corynebacterium di klon di Erwinia Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIK Produksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasi lama lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurang Pertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotik menurun Vitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisi miskin O2 Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yang berfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O2 dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel. Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. TERAPI GEN Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal, atau mungkin juga lebih kompleks, yaitu terhadap sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi. TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler manusia menentukan kecacatan pada level gen, dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan simtom penyakit genetik yang spesifik Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PENDEKATAN Protein yang terlibat Isolasi dan karakterisasi Sekuensing asam amino Investigasi sekuen penyandi Buat pelacak spesifik Isolasi gen target dari pustaka genom Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Dasar pemikiran terapi gen: Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia telah berhasil diklon, maka sangat berbuna untuk memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Ex vivo gene therapy Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien) Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi secara genetik (remedial cell) Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasien Gen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yang seudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normal menjadi sel kanker. Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga gen remedial masuk Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. In vivo gene therapy Menggunakan adenovirus : ds DNA low pathogenicity in human Gen remedial Konstruksi pada vektor virus di bawah promotor khusus yang spesifik menginfeksi sel khusus (sel target) Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Antisense therapy Dirancang untuk pencegahan; - penurunan ekspresi gen tertentu, - bekerja pada tahap translasi (mRNA) Ada 2 cara: A.Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas) B.Menggunakan gen antisense yang diklon Antisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidak ditranskripsikan, merupakan utas pasangan dari utas yang ditranskripsikan (utas sense). Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. A. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas): DNA ------ A G C T G A T ---------- -------T C G A C T A ---------- transcription antisense mRNA oligonukleotida A G C U G A U T C G A C T A Base pairing A G C U G A U T C G A C T A No translation Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. B. Menggunakan gen antisense yang diklon DNA ------ A G C T G A T ---------- -------T G C G A C T A------- -------T C G A C T A ---------- -------A C G C T G A T------- transcription mRNA A G C U G A U U C G A C U A Base pairing A G C U G A U T C G A C T A No translation mRNA sense mRNA antisense Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. PROSEDUR PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER I. DNA sequencing techniques 1. prosedur Dideoxynucleotide : - Maxam Gilbert : chemical based - Sanger : enzymatic based 2. Penggunaan Bacteriophage M13 Untuk memperoleh ss.DNA Target DNA + 500 bp < 2000 bp : harus dipotong potong menjadi beberapa fragmen overlap dengan ER Primer Walking : Uk. DNA > 5000 BP Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. II. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) - Amplifikasi molekul DNA - Esensial : 1. Dua buah primer sintesis oligonukleotida (masing masing ~ 20 nt ) 2. sekuens target pada sampel DNA 3. DNA polymerase yang thermostabil mencapai suhu 950 C atau lebih 4. Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) : dATP, dCTP, dGTP, dTTP PROSEDUR PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. II. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) Tahap tahap : -denaturasi : - suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA - enzim Taq DNA polymerase - primer -renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C primer berikatan dengan template DNA -sintesis : - suhu dinaikkan sampai 750C, suhu optimum untuk fungsi katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk mensintesis DNA. Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekul DNA dalam jumlah besar. PROSEDUR PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER Generated by Foxit PDF Creator Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.