BIOLOGIA VIRUSURILOR. BIOLOGIA VIRUSURILOR. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL

VIROZELOR.VIROZELOR. Particularităţile virusurilorParticularităţile virusurilor1.1. Reprezintă structuri acelulare cu potenţial Reprezintă structuri acelulare cu potenţial

infecţiosinfecţios2.2. Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind

paraziţi obligaţi intracelulariparaziţi obligaţi intracelulari3.3. Nu cresc pe medii artificiale, numai pe Nu cresc pe medii artificiale, numai pe

celule viicelule vii4.4. Genomul viral este constituit dintr-un Genomul viral este constituit dintr-un

singur tip de AN (ADN sau ARN)singur tip de AN (ADN sau ARN)5.5. Nu cresc şi nu se divid, ci se reproducNu cresc şi nu se divid, ci se reproduc în în

celule viicelule vii6.6. Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)7.7. Rezistenţă naturală la antibioticeRezistenţă naturală la antibiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILORCLASIFICAREA VIRUSURILOR

După tipul AN (După tipul AN (cu genom ARN/ADN)cu genom ARN/ADN)După dimensiuniDupă dimensiuni (mici – 20-50 nm, (mici – 20-50 nm,

medii – 50-150 nm, mari – peste 150 medii – 50-150 nm, mari – peste 150 nm)nm)

După tipul de simetrie a capsideiDupă tipul de simetrie a capsidei (helicoidală, cubică, mixtă)(helicoidală, cubică, mixtă)

DDupă gazdăupă gazdă (om, animal, insectă, (om, animal, insectă, bacterie)bacterie)

După sensibilitatea în mediul După sensibilitatea în mediul externextern, etc, etc

Virusuri ADNVirusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, PoxviridaeAdenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae

Virusuri ARN+:Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, RetroviridaeRetroviridae

Virusuri ARN-Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, FiloviridaeBunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae

Virusuri ARNd.cVirusuri ARNd.c. : Reoviridae. : Reoviridae

VirionVirion – unitate structurală infecţioasă a virusului – unitate structurală infecţioasă a virusului

ViroidViroid – ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante – ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante

PrionPrion – proteină termostabilă infecţioasă, – proteină termostabilă infecţioasă, cauzează la om boala cauzează la om boala Kuru, Creutzfeldt-JacobKuru, Creutzfeldt-Jacob, , sindromul sindromul Gerstmann-StrausslerGerstmann-Straussler, , scrapiescrapie la oi la oi

COMPOZIŢIA CHIMICĂ ŞI COMPOZIŢIA CHIMICĂ ŞI STRUCTURA VIRIONULUISTRUCTURA VIRIONULUI

Virusurile simple – Virusurile simple – ANAN şi înveliş proteic şi înveliş proteic – – capsidacapsida (nucleocapsidă) (nucleocapsidă)

Virusurile complexe – nucleocapsidă şi Virusurile complexe – nucleocapsidă şi un înveliş extern, lipoglicoproteic un înveliş extern, lipoglicoproteic (supercapsidă, peplos)(supercapsidă, peplos)

AN AN – ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, – ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat.linear, circular sau fragmentat.

ARN monocatenar : ARN monocatenar : ARN+ARN+ (catenă cu (catenă cu sens, ARNm) sau sens, ARNm) sau ARN- ARN- (catenă fără (catenă fără sens)sens)

Funcţia ANFuncţia AN – asigurarea replicării şi expresia – asigurarea replicării şi expresia genomului pentru sinteza proteicăgenomului pentru sinteza proteică

CapsidaCapsida – formată din unităţi proteice, – formată din unităţi proteice, capsomerecapsomere, aranjate simetric., aranjate simetric.

1.1. Simetrie helicoidalăSimetrie helicoidală – capsomerele se – capsomerele se fixează pe catena de AN, formă de bastonaşfixează pe catena de AN, formă de bastonaş

2.2. Simetrie cubicăSimetrie cubică (icosaedrică) – (icosaedrică) – capsomerele se aranjează în jurul AN, capsomerele se aranjează în jurul AN, formând un icosaedru (poliedru regulat cu formând un icosaedru (poliedru regulat cu 20 feţe triungiulare şi 12 vârfuri),20 feţe triungiulare şi 12 vârfuri), eikos eikos=20=20

3.3. Simetrie mixtăSimetrie mixtă (bacteriofagii, (bacteriofagii, poxvirusurile)poxvirusurile)

FuncţiaFuncţia – protecţia AN, rol antigenic, adeziune – protecţia AN, rol antigenic, adeziune

SupercapsidaSupercapsida – structură glucido-lipido- – structură glucido-lipido-proteică, derivată din membrana proteică, derivată din membrana celulei gazdă (lipidele din membrana celulei gazdă (lipidele din membrana celulară, glicoproteinele proprii)celulară, glicoproteinele proprii)

FuncţieFuncţie – protecţie, antigene de – protecţie, antigene de suprafaţă, adeziunesuprafaţă, adeziune

Unele virusuri conţin enzime – polimeraze, Unele virusuri conţin enzime – polimeraze, transcriptaze, etc. transcriptaze, etc.

Acţiunea factorilor fizici, chimiciAcţiunea factorilor fizici, chimiciVirusurile sunt foarte sensibile la căldură, Virusurile sunt foarte sensibile la căldură,

desicare, UV. Detergenţii şi solvenţii desicare, UV. Detergenţii şi solvenţii inactivează virusurile cu supercapsidă. inactivează virusurile cu supercapsidă.

Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 CC

REPRODUCEREA VIRUSURILORREPRODUCEREA VIRUSURILOR

I ADSORBŢIA virusului la celula-gazdă I ADSORBŢIA virusului la celula-gazdă prin intermediul receptorilor prin intermediul receptorilor specifici (tropism)specifici (tropism)

II PENETRAREA virusului în celulăII PENETRAREA virusului în celulăa)a) Pinocitoză (viropexis) Pinocitoză (viropexis) b)b) Fuziunea membranelorFuziunea membranelorc)c) TranslocareTranslocared)d) Injectarea AN în citoplasmăInjectarea AN în citoplasmăIII DECAPSIDAREA (enzime celulare)III DECAPSIDAREA (enzime celulare)

IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor şi replicarea AN)IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor şi replicarea AN)

Are loc în citoplasmă (virusuri cu ARN) sau nucleul Are loc în citoplasmă (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN)celulei (virusuri cu ADN)

Biosinteza virusurilor ADNBiosinteza virusurilor ADN

ADNdcADNdc transcrierea ARNm translaţia transcrierea ARNm translaţia (precoce, tardivă), replicarea sinteza (precoce, tardivă), replicarea sinteza proteicăproteică

Biosinteza virusurilor ARN Biosinteza virusurilor ARN

ARN+ARN+ translaţie, replicare sinteza proteică translaţie, replicare sinteza proteică

ARN-ARN- transcriere ARNm translaţie, transcriere ARNm translaţie, replicare sinteza proteică replicare sinteza proteică Retrovirusuri (ARN+)Retrovirusuri (ARN+) transcriere transcriere ADN- ADNdc transcriere ARNm ADN- ADNdc transcriere ARNm replicare, translaţie, sinteza pr. (sau integrare în replicare, translaţie, sinteza pr. (sau integrare în cromosom)cromosom)

RNA VIRUSES THAT DO NOT HAVE A DNA PHASE

Genome

RNA-dependent

RNA polymerase (=transcriptase) in virion

Infectivity of RNA

Initial event in cell

RNA + No Infectious Translation

RNA - YesNon-infectious

Transcription

RNAd.c. YesNon-infectious

Transcription

RETROVIRUSES

Genome

RNA-dependent

RNA polymerase

(=transcriptase) in virion

Infectivity of RNA

Initial event in cell

RNA + Yes Non-infectiousReverse transcription

V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilorV. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilor

Proteinele capsidale participă la formarea Proteinele capsidale participă la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasmă), nucleocapsidei (nucleu,citoplasmă), glicoproteinele sunt inserate în MCP, substituind glicoproteinele sunt inserate în MCP, substituind proteinele celulare. Contribuie la apariţia proteinele celulare. Contribuie la apariţia incluziunilor sau a corpusculilor elementari.incluziunilor sau a corpusculilor elementari.

VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, înmugurire, VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, înmugurire, exocitoză) exocitoză)

Interferenţa viralăInterferenţa virală – fenomen în care, – fenomen în care, consecutiv infecţiei unei celule cu 2 virusuri, consecutiv infecţiei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibată (virus multiplicarea unuia este inhibată (virus interferat / virus interferent)interferat / virus interferent)

CULTIVAREA VIRUSURILORCULTIVAREA VIRUSURILOR

Virusurile sunt cultivate pentru:Virusurile sunt cultivate pentru:- Stabilirea diagnosticului etiologicStabilirea diagnosticului etiologic- Testarea infecţiozităţii virusurilorTestarea infecţiozităţii virusurilor- Testarea preparatelor antiviraleTestarea preparatelor antivirale- Producerea vaccinurilorProducerea vaccinurilorSISTEME DE CULTIVARESISTEME DE CULTIVARE1.1. Culturi de celuleCulturi de celule2.2. Ou embrionat de găinăOu embrionat de găină3.3. Animale de laboratorAnimale de laborator

Animalele de laboratorAnimalele de laborator se utilizează se utilizează limitat (receptivitate selectivă, limitat (receptivitate selectivă, preexistenţa infecţiilor, cost avansat). Se preexistenţa infecţiilor, cost avansat). Se recurge numai când nu există alte recurge numai când nu există alte posibilităţi (VHB, HIV, Coxsackie, etc). posibilităţi (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent – şoriceii albi nou-născuţi, dar pot curent – şoriceii albi nou-născuţi, dar pot fi utilizaţi şobolani, cobai, maimuţe, etc. fi utilizaţi şobolani, cobai, maimuţe, etc.

Regulile de lucru cu animalele de laborator Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infecţiile bacteriene. identice cu cele din infecţiile bacteriene.

Oul embrionat de găinăOul embrionat de găină (5-13 zile) (5-13 zile) reprezintă un mediu de celule reprezintă un mediu de celule nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril nediferenţiate, cu multiplicare activă, steril şi lipsit de mijloace de apărare şi lipsit de mijloace de apărare antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea antiinfecţioasă. Se utilizează în prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)unor vaccinuri virale (ex.: gripal)

- Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la - Iniţial se verifică viabilitatea embrionului la ovoscop în camera obscură. ovoscop în camera obscură.

- Prelevatul se inoculează steril cu seringa în Prelevatul se inoculează steril cu seringa în cavitatea amniotică sau alantoideană, sau cavitatea amniotică sau alantoideană, sau pe membrana chorioalantoideană (utilizând pe membrana chorioalantoideană (utilizând metoda deschisă sau închisă). metoda deschisă sau închisă).

- Orificiul se parafinează şi se incubează la Orificiul se parafinează şi se incubează la 35-37 C timp de 48-72 ore 35-37 C timp de 48-72 ore

Culturile de celuleCulturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celulele provenite din ţesuturi adulte sau embrionare, Celulele provenite din ţesuturi adulte sau embrionare,

normale sau tumorale, plasate într-un mediu adecvat normale sau tumorale, plasate într-un mediu adecvat (nutrienţi, pH, t) rămân viabile şi se multiplică. Pentru (nutrienţi, pH, t) rămân viabile şi se multiplică. Pentru cultivarea virusurilor se utilizează culturile în monostrat cultivarea virusurilor se utilizează culturile în monostrat celular.celular.

Tipurile de culturi de celuleTipurile de culturi de celule:: Culturi primareCulturi primare (primar tripsinizate). Sunt obţinute din (primar tripsinizate). Sunt obţinute din

ţesuturi adulte sau embrionare de origine animală sau ţesuturi adulte sau embrionare de origine animală sau umană. Suportă 4-6 pasaje (subcultivări)umană. Suportă 4-6 pasaje (subcultivări)

Culturi diploideCulturi diploide. Obţinute din ţesut embrionar (MRS5, . Obţinute din ţesut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaţii fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaţii

Linii continui de celuleLinii continui de celule. Obţinute din ţesut tumoral. . Obţinute din ţesut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.Pot fi subcultivate nelimitat.

HeLaHeLa – carcinom de col uterin – carcinom de col uterinKBKB – tumoare a rinofaringelui – tumoare a rinofaringeluiHep-2Hep-2 – tumoare canceroasă a laringelui – tumoare canceroasă a laringelui

Obţinera culturilor de celule primar Obţinera culturilor de celule primar tripsinizatetripsinizate::

- Prelevarea ţesutului (ex.: rinichi de maimuţă)Prelevarea ţesutului (ex.: rinichi de maimuţă)- Fragmentarea şi spălarea cu sol fiziologicăFragmentarea şi spălarea cu sol fiziologică- Dezagregarea tisulară cu enzime proteoliticeDezagregarea tisulară cu enzime proteolitice- Separarea celulelor prin centrifugareSepararea celulelor prin centrifugare- Dozarea suspensiei 10Dozarea suspensiei 1055 – 10 – 106 6 celule/ml celule/ml - Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi Întroducerea celulelor în mediu nutritiv şi

repartizarea în recipiente sterilerepartizarea în recipiente sterile- Incubarea până la formarea monostratului celular Incubarea până la formarea monostratului celular

(inhibiţie de contact)(inhibiţie de contact)- Monostratul poate fi infectat cu virus sau Monostratul poate fi infectat cu virus sau

serveşte drept sursă de celule pentru o nouă serveşte drept sursă de celule pentru o nouă cultivare (pasaj)cultivare (pasaj)

Mediile de culturăMediile de cultură pentru culturi de celule pentru culturi de celule conţin AA, Vit, factori de creştere, săruri conţin AA, Vit, factori de creştere, săruri minerale (minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbuminăde lactalbumină, etc), roşu fenol pentru , etc), roşu fenol pentru monitorizarea pH (virează în galben în monitorizarea pH (virează în galben în mediu acid)mediu acid)

1.1. Mediile de creştereMediile de creştere sunt îmbogăţite cu ser sunt îmbogăţite cu ser sangvin (uman, animal) – pentru cultivarea sangvin (uman, animal) – pentru cultivarea CCCC

2.2. Mediile de întreţinereMediile de întreţinere se utilizează pentru se utilizează pentru menţinerea monostratului în procesul menţinerea monostratului în procesul reproducerii virale. Nu conţin ser. reproducerii virale. Nu conţin ser.

CC reprezintă sistemul virus-gazdă predilect în CC reprezintă sistemul virus-gazdă predilect în virologia clinică şi cercetare.virologia clinică şi cercetare.

Inocularea CCInocularea CC - Se aleg tuburi cu monostrat bine Se aleg tuburi cu monostrat bine

formatformat- Se înlătură mediul de creştere, se Se înlătură mediul de creştere, se

spală cu sol. Hanks spală cu sol. Hanks - Se inoculează 0,1 – 0,2 ml de prelevatSe inoculează 0,1 – 0,2 ml de prelevat- Peste 30-60 min în tuburi se toarnă Peste 30-60 min în tuburi se toarnă

câte câte

1 ml mediu de întreţinere1 ml mediu de întreţinere- Se întroduc în termostat la t adecvată Se întroduc în termostat la t adecvată

3-4 zile 3-4 zile

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROAL VIROZZELORELOR

IndicaţiiIndicaţii: : - Boli cu măsuri terapeutice sau profilactice Boli cu măsuri terapeutice sau profilactice

speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)- Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri

epidemice (meningite, gastro-enterite, epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc)pneumonii, etc)

- Supravegherea epidemiologicăSupravegherea epidemiologicăPrelevatePrelevate: LCR, sânge, exsudate, secreţii : LCR, sânge, exsudate, secreţii

nazale, rino-faringiene, mase fecale, urină, nazale, rino-faringiene, mase fecale, urină, vezicule şi ulceraţii cutaneo-mucoase, vezicule şi ulceraţii cutaneo-mucoase, bioptate, etc.bioptate, etc.

EficacitateaEficacitatea diagnosticului este diagnosticului este condiţionată de:condiţionată de:

1.1. Alegerea corectă a prelevatelor, Alegerea corectă a prelevatelor, calitatea lor şi transportarea în calitatea lor şi transportarea în laboratorlaborator

2.2. Examinarea precoce (la debutul bolii)Examinarea precoce (la debutul bolii)

3.3. Transportarea rapidă a probelor sau Transportarea rapidă a probelor sau utilizarea mediului de transport utilizarea mediului de transport

4.4. Respectarea regulilor de autoprotecţie Respectarea regulilor de autoprotecţie şi de protecţie a anturajului la şi de protecţie a anturajului la recoltare, transportare şi examinarea recoltare, transportare şi examinarea probelorprobelor

METODELE DE DIAGNOSTIC AL METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELORVIROZELOR

METODE DIRECTEMETODE DIRECTE- Examenul virusoscopicExamenul virusoscopic (evidenţierea (evidenţierea

directă a virionului sau a componentelor lui în directă a virionului sau a componentelor lui în prelevate)prelevate)

- Examenul virusologicExamenul virusologic (izolarea şi (izolarea şi identificarea virusului)identificarea virusului)

- Detectarea Ag virale în prelevatDetectarea Ag virale în prelevat- Identificarea genomului viralIdentificarea genomului viral (hibridizarea (hibridizarea

AN, amplificarea genică – PCR)AN, amplificarea genică – PCR)METODE INDIRECTEMETODE INDIRECTE- - SerodiagnosticulSerodiagnosticul (creşterea de cel puţin 4 (creşterea de cel puţin 4

ori a titrului Ac în dinamică)ori a titrului Ac în dinamică)

EXAMENUL VIRUSOSCOPICEXAMENUL VIRUSOSCOPIC

1.1. Microscopia opticăMicroscopia optică – depistarea în – depistarea în prelevat a incluziunilor virale specifice prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri în variolă, Babeş-(corpusculii Guarnieri în variolă, Babeş-Negri în rabie) sau nespecifice, Negri în rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepară citoplasmatice sau nucleare. Se prepară frotiuri sau frotiuri-amprente colorate frotiuri sau frotiuri-amprente colorate RRomanovschiomanovschi-G-Giemsaiemsa sau cu fluorocrom sau cu fluorocrom

2.2. Microscopia electronicăMicroscopia electronică3.3. IImunoelectronomicroscopia munoelectronomicroscopia – mai – mai

sensibilă, mai specifică. Se examinează sensibilă, mai specifică. Se examinează complexele imune virus – Accomplexele imune virus – Ac

4.4. Imunofluorescenţa Imunofluorescenţa (directă şi indirectă) (directă şi indirectă) – utilizată în diagnosticul rapid al virozelor – utilizată în diagnosticul rapid al virozelor

EXAMENUL VIRUSOLOGICEXAMENUL VIRUSOLOGIC

Prelucrarea prealabilă a prelevatelor:Prelucrarea prealabilă a prelevatelor:- Omogenizarea (după necesitate) Omogenizarea (după necesitate) - Înlăturarea elementelor celulare, inclusiv Înlăturarea elementelor celulare, inclusiv

bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)- Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea

creşterii bacteriilor şi fungilor creşterii bacteriilor şi fungilor contaminanţi (penicilină - 500 UA/ml, contaminanţi (penicilină - 500 UA/ml, streptomicină – streptomicină –

- 500 UA/ml, nistatină - 20 UA/ml)500 UA/ml, nistatină - 20 UA/ml)

Etapele diagnosticului virusologicEtapele diagnosticului virusologic1.1. Izolarea virusuluiIzolarea virusului2.2. Evidenţierea (indicarea) reproducerii Evidenţierea (indicarea) reproducerii

viralevirale3.3. Identificarea virusuluiIdentificarea virusuluiIzolarea virusuluiIzolarea virusului se realizează prin se realizează prin

inocularea cu material de examinat a inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de animalelor de laborator, embrionilor de găină sau a culturilor de celule. găină sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se Alegerea sistemului de cultivare se efectuează în funcţie de particularităţile efectuează în funcţie de particularităţile biologice ale agentului etiologic probabil biologice ale agentului etiologic probabil şi posibilităţile laboratorului.şi posibilităţile laboratorului.

INDICAREA VIRUSULUIINDICAREA VIRUSULUI

În culturi de celuleÎn culturi de celule1. 1. ECP ECP – modificări degenerative şi – modificări degenerative şi

distrugere celularădistrugere celulară,, rezultat al rezultat al multiplicării virale (rotunjire sau multiplicării virale (rotunjire sau retracţie celulară, citoliză, apariţia retracţie celulară, citoliză, apariţia vacuolelor sau granulelor în vacuolelor sau granulelor în citoplasmă, picnoza nucleului, fuziunea citoplasmă, picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etcmembranelor, etc)). ECP poate fi studia. ECP poate fi studiatt la microscopul optic pe celule la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozină, Giemsa, fluorocrom. eozină, Giemsa, fluorocrom.

2. 2. Incluziuni viraleIncluziuni virale

Reprezintă acumulări paracristaline de virioni Reprezintă acumulări paracristaline de virioni sau de componente virale în aria de replicare sau de componente virale în aria de replicare şi asamblare a virusurilor (citoplasmă, şi asamblare a virusurilor (citoplasmă, nucleu). Coloraţia Giemsa, hem-eozină, nucleu). Coloraţia Giemsa, hem-eozină, fluorocrom. Localizarea, forma şi afinitatea fluorocrom. Localizarea, forma şi afinitatea tinctorială (bazofile, acidofile) sunt tinctorială (bazofile, acidofile) sunt particularităţi diagnostice pentru unele viroze.particularităţi diagnostice pentru unele viroze.

3. 3. InterferenţaInterferenţa

Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determină Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determină fenomenul de interferenţă. Pentru detectarea fenomenul de interferenţă. Pentru detectarea V.rubeolei se infectează CC cu virus V.rubeolei se infectează CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicării acestui virus citopatogen. Lipsa multiplicării acestui virus confirmă prezenţa V.rubeolei. confirmă prezenţa V.rubeolei.

4. 4. Hemadsorbţia (RHAd)Hemadsorbţia (RHAd) – pentru virusuri cu – pentru virusuri cu HAHA

Unele virusuri posedă în componenţa Unele virusuri posedă în componenţa capsidei, în special supercapsidei, capsidei, în special supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaţa glicoproteine care pot adera la suprafaţa hematiilor – HA.hematiilor – HA.

În timpul eliberării din celulă prin înmugurire a În timpul eliberării din celulă prin înmugurire a acestor virusuri, HA lor se află deja înserate acestor virusuri, HA lor se află deja înserate în MCP la nivelul mugurelui. Dacă la aceasta în MCP la nivelul mugurelui. Dacă la aceasta etapă în recipientul cu monostrat celular se etapă în recipientul cu monostrat celular se adaugă suspensie de hematii şi se menţine adaugă suspensie de hematii şi se menţine 15-20 min la t caracteristică fiecărui virus, la 15-20 min la t caracteristică fiecărui virus, la microscop pot fi urmărite hematiile fixate la microscop pot fi urmărite hematiile fixate la suprafaţa celulelor infectate (RHAd).suprafaţa celulelor infectate (RHAd).

5. 5. Hemaglutinarea (RHA)Hemaglutinarea (RHA)Pentru virusurile Pentru virusurile cu HA cu HA acumulate în mediul de acumulate în mediul de

întreţinere. În acest caz mediul de întreţinere întreţinere. În acest caz mediul de întreţinere aglutinează eritrocitele unor specii de aglutinează eritrocitele unor specii de mamifere sau păsări.mamifere sau păsări.

6. 6. Formarea plajelorFormarea plajelor Reprezintă focare de celule alterate în Reprezintă focare de celule alterate în

monostratul celular acoperit cu agar. monostratul celular acoperit cu agar. Numărarea plajelor permite cuantificarea Numărarea plajelor permite cuantificarea virusului infectant.virusului infectant.

7. 7. Proba culoriiProba culorii- - Metabolismul cMetabolismul celulelularar neafectatneafectat – virajul culorii – virajul culorii

mediului din roşu în galben (pH acid)mediului din roşu în galben (pH acid)- Metabolismul celular inhibat – culoarea - Metabolismul celular inhibat – culoarea

mediului nu se modifică mediului nu se modifică

Indicarea virusului în oul Indicarea virusului în oul embrionat de găinăembrionat de găină

Ouăle se răcesc 18 ore la +4 grade C Ouăle se răcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricţie maximă, apoi pentru o vazoconstricţie maximă, apoi aseptic se taie coaja, se recolteazăaseptic se taie coaja, se recoltează lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA şi embrionul se întroduc în cutii Petri şi embrionul se întroduc în cutii Petri sterile. Se observă:sterile. Se observă:

1.1. Moartea embrionuluiMoartea embrionului2.2. Apariţia modificărilor (hemoragii, Apariţia modificărilor (hemoragii,

pustule) pe MCApustule) pe MCA3.3. Acumularea de HA în lichideAcumularea de HA în lichide

Indicarea virusului pe animale de Indicarea virusului pe animale de laboratorlaborator

1.1. Boala manifestă a animalului, decesBoala manifestă a animalului, deces

2.2. Urmărirea virusului în organele-ţintă:Urmărirea virusului în organele-ţintă:- HemaglutinareHemaglutinare- Infecţiozitatea omogenatelorInfecţiozitatea omogenatelor- Examene histopatologice (leziuni Examene histopatologice (leziuni

inflamatorii, degenerare, incluzii inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babeş-Negri în virale specifice: corp. Babeş-Negri în neuronii infectaţi cu V.rabic, etc)neuronii infectaţi cu V.rabic, etc)

Identificarea virusurilorIdentificarea virusurilor

Determinarea Determinarea genului, genului, specieispeciei şi serotipului şi serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. de virus prin stabilirea structurii antigenice.

Se efectuează cu ajutorul serurilor Se efectuează cu ajutorul serurilor imune imune specifice antivirale în diferite reacţii specifice antivirale în diferite reacţii serologice:serologice:

- RNRN- RIHA/RIHAdRIHA/RIHAd- RFCRFC- RIFRIF- RIE (ELISA)RIE (ELISA) - ARI, etcARI, etc

DETECTAREA AG VIRALE ÎN DETECTAREA AG VIRALE ÎN PRELEVATEPRELEVATE

AvantajeAvantaje: simplitatea şi rapiditatea : simplitatea şi rapiditatea examenului, nu necesită menţinerea examenului, nu necesită menţinerea infecţiozităţii virusuluiinfecţiozităţii virusului

DezavantajeDezavantaje: sensibilitate direct : sensibilitate direct proporţională cu cantitatea virusului din proporţională cu cantitatea virusului din prelevatprelevat

Se utilizează Ac policlonali de origine Se utilizează Ac policlonali de origine umană (seruri imune) sau Ac monoclonali umană (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murină)(de origine murină)

Reacţii: Reacţii: RHAI, RLA, RIF, RIE, Western-RHAI, RLA, RIF, RIE, Western-blot, ARIblot, ARI, etc., etc.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRALIDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea în evidenţă a AN virali din (punerea în evidenţă a AN virali din

prelevate în cursul infecţiilor virale prelevate în cursul infecţiilor virale acute sau cronice şi monitorizarea acute sau cronice şi monitorizarea tratamentului).tratamentului).

Pot fi examinate toate ţesuturile şi Pot fi examinate toate ţesuturile şi lichidele biologice.lichidele biologice.

Hibridizarea acizilor nucleici fără Hibridizarea acizilor nucleici fără amplificareamplificare

Hibridizarea după amplificare (PCR Hibridizarea după amplificare (PCR şi variantele ei)şi variantele ei)

DIAGNOSTICUL SEROLOGICDIAGNOSTICUL SEROLOGIC

EsenţaEsenţa: depistarea Ac sintetizaţi de : depistarea Ac sintetizaţi de gazdă în răspuns la o infecţie virală.gazdă în răspuns la o infecţie virală.

După o După o primo-infecţieprimo-infecţie are loc inducerea are loc inducerea formării Ac, iar după o formării Ac, iar după o reinfecţiereinfecţie sau sau reactivare titrul Ac creşte în dinamică. reactivare titrul Ac creşte în dinamică.

În serodiagnosticul virozelor este În serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina obligator de a examina 2 probe de ser2 probe de ser de la bolnav : prima prelevată la de la bolnav : prima prelevată la debutul bolii, al doilea prelevat peste 15 debutul bolii, al doilea prelevat peste 15 zile. zile.

Ac sunt depistaţi în ser, uneori în LCR, Ac sunt depistaţi în ser, uneori în LCR, exsudate, lichid articular, etc. exsudate, lichid articular, etc.

Pentru depistarea Ac se utilizează Ag virale de Pentru depistarea Ac se utilizează Ag virale de referinţă (suspensie virală inactivată, proteine referinţă (suspensie virală inactivată, proteine virale native sau recombinante, oligopeptide virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice).sintetice).

Tehnici utilizate: Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA),ARI, AIE (ELISA), etc. etc.

Semnificaţie diagnosticăSemnificaţie diagnostică prezintă prezintă trecerea trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitivtitrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecţie) sau (seroconversie, primo-infecţie) sau creşterea creşterea titrului Ac de cel puţin 4 orititrului Ac de cel puţin 4 ori în cursul în cursul infecţiei. Ambele seruri vor fi testate în infecţiei. Ambele seruri vor fi testate în aceeaşi zi, prin tehnici identice şi în acelaşi aceeaşi zi, prin tehnici identice şi în acelaşi laborator. laborator.

RELAŢII VIRUS-CELULA GAZDĂRELAŢII VIRUS-CELULA GAZDĂ Infecţie virală productivă, citocidăInfecţie virală productivă, citocidăVirusul este infecţios iar celula permisivă. La Virusul este infecţios iar celula permisivă. La

nivelul ma/o corespunde infecţiilor acute, nivelul ma/o corespunde infecţiilor acute, aparente sau inaparente (gripă, rujeolă)aparente sau inaparente (gripă, rujeolă)

Infecţii virale persistenteInfecţii virale persistente Celulele infectate supravieţuiesc cu producerea Celulele infectate supravieţuiesc cu producerea

permanentă sau intermitentă a virusului.permanentă sau intermitentă a virusului.1. 1. Infecţii abortive Infecţii abortive cu virioni defectivi – cu virioni defectivi –

infecţia nu se exprimă, are loc transformarea infecţia nu se exprimă, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin ţintă celulelor prin proteine virale. Ele devin ţintă pentru efectorii imunităţii (macrofage, T-pentru efectorii imunităţii (macrofage, T-limfocite) în cursul unor infecţii cronice (PESS limfocite) în cursul unor infecţii cronice (PESS post-rujeolică)post-rujeolică)

2. 2. Infecţii integrateInfecţii integrate (virusuri ADN sau copii (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor)ADN ale Retrovirusurilor)

- Transformarea malignă a celulei gazdă Transformarea malignă a celulei gazdă - Manifestarea infecţiei după o perioadă de Manifestarea infecţiei după o perioadă de

incubaţie îndelungată cu expresia integrală a incubaţie îndelungată cu expresia integrală a genomului viral (HIV-SIDA) – genomului viral (HIV-SIDA) – infecţii lenteinfecţii lente

- Reactivări ocazionale, repetate ale infecţiei cu Reactivări ocazionale, repetate ale infecţiei cu exprimarea integrală a informaţiei genetice exprimarea integrală a informaţiei genetice virale (infecţia herpetică) – virale (infecţia herpetică) – infecţii latenteinfecţii latente

- Infecţii croniceInfecţii cronice – perioade de remisie şi – perioade de remisie şi acutizare, virusul este prezent permanent, acutizare, virusul este prezent permanent, chiar în absenţa simptomelor (hepatita virală chiar în absenţa simptomelor (hepatita virală B)B)

TERAPIA ANTIVIRALĂTERAPIA ANTIVIRALĂDificultăţiDificultăţi::- Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fără Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fără

afectarea celulei!)afectarea celulei!)- Apariţia mutantelor rezistenteApariţia mutantelor rezistente- Activitate asupra virusului în fază de Activitate asupra virusului în fază de

multiplicare multiplicare - Costul avansat al tratamentuluiCostul avansat al tratamentuluiPrimele preparate antivirale – anticanceroase.Primele preparate antivirale – anticanceroase.Preparatele antivirale contemporane:Preparatele antivirale contemporane:- Nu manifestă activitate virucidă, doar inhibă - Nu manifestă activitate virucidă, doar inhibă

reproducerea viralăreproducerea virală- Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

Adeziunea virusului la celulăAdeziunea virusului la celulăMecanismul – blocarea receptorilor celulari (HIV-Mecanismul – blocarea receptorilor celulari (HIV-

oligopeptidul T, care reproduce oligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4gp120; CD4 solubili)solubili)

Dificultăţi: afinitate redusă, degradare rapidăDificultăţi: afinitate redusă, degradare rapidă Fuziunea, penetrareaFuziunea, penetrareaReprezintă peptide sintetice (Reprezintă peptide sintetice (pentafuzida-T20, pentafuzida-T20,

T1249T1249) blochează fuziunea virusului HIV cu ) blochează fuziunea virusului HIV cu membrana celulară (dificultate – injecţii s/c membrana celulară (dificultate – injecţii s/c zilnice)zilnice)

DecapsidareaDecapsidareaAmantadina, rimantadinaAmantadina, rimantadina inhibă decapsidarea inhibă decapsidarea

virusului gripal Avirusului gripal AUtilizare limitată – dezvoltarea rezistenţeiUtilizare limitată – dezvoltarea rezistenţei

ReplicareaReplicareaMecanismul – blochează activitatea enzimelor virale Mecanismul – blochează activitatea enzimelor virale

de reproducere (transcriptaze, polimeraze, de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze)replicaze)

Avantaj – nu influenţează componentele celulei-Avantaj – nu influenţează componentele celulei-gazdăgazdă

1.1. Analogi nucleozidiciAnalogi nucleozidiciSe disting de nucleozidele naturale prin modificarea Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea

componentului glucidic sau a bazei purinice sau componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blochează elongarea catenei de ADN pirimidinice. Blochează elongarea catenei de ADN în curs de formare. în curs de formare.

- Antiherpetice (Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridinidoxuridin))

- Anti-HIV (Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudinstavudin, lamivudin, etc), etc)

- Anti-HBV (Anti-HBV (entecavir, LdT, LdCentecavir, LdT, LdC – fază de cercetare) – fază de cercetare)

2. 2. Analogi nucleotidiciAnalogi nucleotidici - CidofovirCidofovir-CMV, HSV -CMV, HSV - adefoviradefovir- HIV, HBV, HSV, CMV - HIV, HBV, HSV, CMV - tenofovirtenofovir – HIV, HBV – HIV, HBV

3. 3. Analog al pirofosfatuluiAnalog al pirofosfatului - FoscarnetFoscarnet – HSV, CMV (HIV, HBV -?) – HSV, CMV (HIV, HBV -?)

4. 4. Inhibitori nenucleozidici ai RT Inhibitori nenucleozidici ai RT HIVHIV ( (nevirapin, delavirin, efavirenznevirapin, delavirin, efavirenz))

Blocarea activităţii polimerazelor virale Blocarea activităţii polimerazelor virale se realizează prin:se realizează prin:

1.1. Competiţie cu substratul natural al Competiţie cu substratul natural al enzimeienzimei

2.2. Îngrămădirea sterică a centrului Îngrămădirea sterică a centrului activ al enzimei activ al enzimei

3.3. Incorporarea în catena de ADN în Incorporarea în catena de ADN în curs de sintezăcurs de sinteză

4.4. Blocarea procesului de elongare a Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe de a fixa un alt nucleozid pe analogul său artificialanalogul său artificial

Asamblarea, eliberareaAsamblarea, eliberarea- Inhibitori ai proteazei HIVInhibitori ai proteazei HIV

((sanquinavir, ritonavir, indinavir, sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinaviramprenavir, lopinavir, , nelfinavirnelfinavir, , etc) – toxicitate, rezistenţăetc) – toxicitate, rezistenţă

- Inhibitori ai neuraminidazeiInhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (virusurilor gripale (zanamivir, zanamivir, oseltamiviroseltamivir). Activă contra gripei ). Activă contra gripei A şi B (efect preventiv, curativ, A şi B (efect preventiv, curativ, rezistenţă rară)rezistenţă rară)

INTERFERONII (IFN)INTERFERONII (IFN) IFN – ansamblu de proteine capabile IFN – ansamblu de proteine capabile

să confere celulelor o stare de să confere celulelor o stare de rezistenţă la o infecţie virală.rezistenţă la o infecţie virală.

IFN tip 1IFN tip 1 (clasic, (clasic, antiviralantiviral):):1.1. IFN-alfa (leucocitar)IFN-alfa (leucocitar)2.2. IFN-beta (fibroblastic) IFN-beta (fibroblastic) Inductori: virusuri, LPS, ARN bicatenarInductori: virusuri, LPS, ARN bicatenarIFN-gama, tip 2IFN-gama, tip 2, , imunimun, produs de LT , produs de LT

activate, NK. Manifestă activitate activate, NK. Manifestă activitate imunomodulatoareimunomodulatoare

- IFN acţionează asupra ciclului de replicare virală prin IFN acţionează asupra ciclului de replicare virală prin intermediul celulei: interacţiunea IFN-alfa cu intermediul celulei: interacţiunea IFN-alfa cu receptorul său induce sau stimulează expresia unor receptorul său induce sau stimulează expresia unor gene celulare, rezultând o activitate antivirală gene celulare, rezultând o activitate antivirală (blocarea translaţiei ARNm viral, degradarea ARNm (blocarea translaţiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibilă şi blocarea asamblării şi viral). Este posibilă şi blocarea asamblării şi înmuguririi virusului (HIV)înmuguririi virusului (HIV)

- IFN măresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN măresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gama şi a celor de clasa II IFN-gama şi a celor de clasa II

- IFN măresc activitatea intrinsecă şi extrinsecă a IFN măresc activitatea intrinsecă şi extrinsecă a macrofagelor şi manifestă activitate antiproliferativămacrofagelor şi manifestă activitate antiproliferativă

- IFN-gama activează celulele NK IFN-gama activează celulele NK

Utilizarea terapeuticăUtilizarea terapeutică a IFN–hepatite B şi C cronice, a IFN–hepatite B şi C cronice, infecţii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemiiinfecţii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemii

Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.etapa de testare in vitro.

TERAPIA CELULARĂ (CMV, EBV)TERAPIA CELULARĂ (CMV, EBV)Fondată pe administrarea CTL Fondată pe administrarea CTL

(limfocite Tc) autologe.(limfocite Tc) autologe.- Prelevarea sângelui de la bolnavPrelevarea sângelui de la bolnav- Izolarea CTL specificeIzolarea CTL specifice- Clonarea şi proliferarea CTL in vitroClonarea şi proliferarea CTL in vitro- Reinjectarea la pacient Reinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea VIITOR: fototerapia, imunizarea

intracelulară (introducerea unei gene intracelulară (introducerea unei gene ce codifică un anticorp antiviral)ce codifică un anticorp antiviral)