BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3

5/17/2018 BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3 - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/biolmol2012-karta-wynikowa-cw3 1/15

Pracownia Biologii Molekularnej Karta Wynikowa Zastosowania Fizyki w Biologii i Medycynie: Biofizyka Molekularna, Projektowanie Molekularne i Bioinformatyka

ĆWICZENIE 3

Zajęcia 4-7

KLONOWANIE PRODUKTU PCR W E. coli NA WEKTORZE

pUC18Grupa ProwadzącyData oddania:

Ilość

punktówImię i nazwisko

1. Etapy klonowania fragmentu DNA na wektorze plazmidowym w E. coli

Celem ćwiczenia było klonowanie cDNA kodującego białko ……………………….. na

wektorze pUC18 w E. coli. Wektor pUC18 o wielkości …………… pz jest wektorem

plazmidowym posiadającym zmodyfikowany replikon naturalnie występującego plazmidu .

…………, gdzie pojedyncza mutacja w replikonie i brak genu rop powoduje, iż plazmidy z

serii pUC są wektorami ………………… kopiowymi. Wektor pUC18 posiada dwa markery

selekcyjne. Pierwszym z nich jest gen bla kodujący.................................................., co nadaje

transformantom oporność na antybiotyk - ………………………………… Drugim markerem

jest fragment genu lacZ (lacZ ’), kodujący N-końcowy fragment enzymu

………………………………………… W obręcie genu lacZ ’ umieszczone jest

……………………………………………………………………………. (MCS), co pozwala

na selekcję transformantów zawierających ………………………………. plazmidy na

podstawie ………………………………. kolonii.

1




Rys 1.1. Mapa wektora pUC18 zaczerpnięta z materiałów firmy Fermentas.

cDNA kodujące białko ……………………., amplifikowane metodą PCR, wprowadzane

zostało do wektora pUC18 w obręb wybranego jednego miejsca restrykcyjnego, którym była

sekwencja rozpoznawana przez enzym restykcyjne …………………. Poszczególne etapy

klonowania były następujące:

Wpisz w punktach etapy klonowania

2




2. Amplifikacja DNA metodą PCR

Technika reakcji łańcuchowej polimerazy PCR opracowana przez

…………………………………., za którą w roku ……………… otrzymał nagrodę

…………………….., pozwala na otrzymanie ………………… dużej liczby kopii określonego

fragmentu DNA. Metoda ta polega na przeprowadzeniu wielu cykli syntezy DNA z

wykorzystaniem ………………………………… polimerazy …………………….. i starterów

……………………………………............................................................................., a każdy

cykl reakcji składa się z trzech następujących etapów:

1. …………………………………………………………………………………………

2. ………………………………………………………………………………………….

3. ………………………………………………………………………………………….

2.1 Projektowanie starterów do reakcji PCR

Projektowane startery do amplifikacji określonego fragmentu DNA powinny w miarę

możliwości spełniać następujące warunki:

Tabela 2.1 Cechy, jakie powinieny posiadać startery stosowane w reakcji PCR.

Parametry OpisDługość

Temperatura

topnienia (T m)

Zawartość GC [%]

Cechy sekwencji

(komplementarność,

unikanie zasad na 3’

końcu, tworzenie

struktur

drugorzędowych)

Stężenie stosowane

w reakcji PCR

3




Do amplifikacji cDNA ………………….. zaprojektowano następującą parę starterów (starter

Forward (For) i strater Reverse (Rev)) wprowadzające dodatkowo na końcach amplifikowanego

fragmentu DNA miejsce restrykcyjne dla ………………………………….

Tabela 2.2 Parametry zastosowanych starterów do amplifikacji cDNA …………………..

metodą ……………… na matrycy ………………………………………..................................

Parametry …….…………For ……………….RevSekwencja

Długość ( N )

Temperaturatopnienia (T m)

% GC

Narysuj, w którym miejscu i do której nici matrycowego DNA przyłaczają się zaprojektowane

startery.

2.2 Przygotowanie mieszaniny reakcynej i profil termiczny reakcji PCR

Matrycą do amplifikacji cDNA ……………………, o wielkości ……….. pz, był wektor ……………………………………… Do reakcji PCR przygotowano trzy próbki, gdzie: próbki

oznaczone literą A, były to …………..………………………… i zawierały ……..

………………………….., próbka B była próbką ………………………………, która nie

zwierała …………………………….. Próbki przygotowano według następującego schematu:

5’

5’

3’

3’

cDNA……..matryca

4




Komponenty Stężeniewyjściowe

Ilość/Stężeniekońcowe w

próbce

PróbkaA1

PróbkaA2

PróbkaB

Starter For …… µM …… µM …… …… ……

Starter Rev …… µM …… µM …… …… ……

dNTPs …… mM …… mM …… …… ……Matryca …… ng/µl …… ng …… …… ……

H2O 14 µl 14 µl 16 µl

Mix:Bufor 10x DreamTag

Polimeraza DreamTag

10x

5 U/µl

1x

1,5 U

25 µl 25 µl 25 µl

Objętość końcowa 50 l 50 l 50 lMIX na 3 reakcje IlośćBufor 10x DreamTag …..

Polimeraza Dream Tag 1,05 µl

H2O …..Objętość końcowa 3,5 x 25 l

Do reakcji PCR użyto termostabilną polimerazę DNA ……………………….. firmy

Fermentas, której średnia szybkość syntezy wynosi ……………..kb/min, oraz posiada ona

następujące aktywności egzonukleazy ………………………………………………………….

Amplifikację DNA metodą PCR przeprowadzono według następującego profilu termicznego:

Segment Ilość cykli Temperatura Czas1 …. ….. …..

2

…..

…. ….

…. ….

…. ….

3 1 …. ….

4 1 …. ∞

2.3 Analiza produktów reakcji PCR na żelu agarozowym

Po zakończonej reakcji PCR produkt PCR z próbek …………….., oczyszczono od pozostałych

komponentów reakcji stosując zestaw ……………………………………………

……………………………….. firmy Qiagen. Oczyszczony produkt PCR jak i próbki

……………….. analizowano w ………% żelu ………………………………………

5




Wstaw zdjęcie żelu wraz z opisem

Analiza elektroforetyczna próbek po reakcji PCR pokazała ………………………………..

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

3. Trawienie produktu PCR i wektora pUC18 wybranym enzymem restrykcyjnym

W przeprowadzanym eksperymencie klonowania, otrzymany produkt PCR wprowadzano do

wektora pUC18 z użyciem tylko ………………………………………………………………..

6




Mieszaninę reakcyjną trawienia produktu PCR enzymem restrykcyjnym ………………………

przygotowano według następującego schematu:

Komponenty Stężenie końcowe PróbkaBufor do reakcji …… 10x 1x …..

Produkt PCR ……………… ..... µ g …..H2O ….

Enzym …………. …… U ….

Objętość końcowa 40 l

Hydrolizę DNA prowadzono w temperaturze ……..oC przez około ……………. h. Produkt

oczyszczono po reakcji za pomocą zestawu „Qiaquick Gel Extraction Purification Kit ” firmy

QIAGEN. DNA eluowano ze złoża krzemionkowego ………… µl ………..

Mieszaninę reakcyjną trawienia wektora pUC18 enzymem restrykcyjnym

……………………… przygotowano według następującego schematu:

Komponenty Stężenie końcowe PróbkaBufor do reakcji …… 10x 1x …

Wektor pUC18 ..... µ g ….

H2O ….

Enzym …………. ….. U ….


Hydrolizę wektora prowadzono w temperaturze ……..oC przez około ……………. h.

Następnie w celu …………………………………………………………………. dodano

………..U ………………………….. FastAP i inkubowano przez ………….w ………….. oC.

Produkt oczyszczono po reakcji za pomocą zestawu „Qiaquick Gel Extraction Purification Kit ”

firmy QIAGEN. Zlinearyzowany wektor eluowano ze złoża krzemionkowego ………… µl

…………

Następnie przeprowadzono analizę elektroforetyczną strawionych i oczyszczonych próbek

wektora i produktu PCR. Analizę przeprowadzono w …………………………….....................

…………………………………………………………………………………………………..


7




(skomentuj wyniki)

…………………………………………………………………………....................................

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

4. Ligacja wektora ze wstawkąLigacja fragmentów DNA polega na tworzeniu wiązań fosfodiestrowych

………………………………………………… sąsiadujących nukleotydów. Najczęściej

stosowanym enzymem do ligacji fragmentu wstawki i wektora jest ………………………….

8




Mieszaninę ligacyjną wektora pUC18 i wstawki, które posiadają lepkie końce w wyniku

trawienia enzymem restrykcyjnym …………………………………….., przygotowano według

następującego schematu:


Ilość/Stężeniekońcowe w próbce

Próbka A

Trawiony produkt PCR ….. ng/µl ……. ng …..

Liniowy wektor pUC18 ….. ng/µl …… ng ……

H2O …..

Mix zawierający:Bufor do reakcjiLigazę DNA T4

10x

5 U/µl

1x

3 U

10 µl


Reakcję prowadzono w temperaturze ……………., przez ………….h. Nastepnie produktyligacji odczyszczono za pomocą zestawu „Qiaquick Gel Extraction Purification Kit ” firmy

QIAGEN. DNA eluowano ze złoża krzemionkowego ………… µl …………

Jako kontrolę przeprowadzono również recyrkulizację wektora pUC18 zlinearyzowanego

poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym …………………………..

W wyniku ligacji cDNA ……………. z wektorem pUC18 w klonowaniu na …………….

miejsce restrykcyjne mogą powstać następujące produkty:………………………………….....…………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………………….

…………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………..

5. Transformacja bakterii – szczep E. coli XL1-Blue

Stosując wektor pUC18 do klonowania, selekcja transformantów odbywa się poprzez

zastosowanie podłoża zawierającego ampicylinę, zaś selekcja transformantów zawierających

zrekombinowany plazmid, od tych, co posiadają pusty wektor, odbywa się za pomocą tzw. α-

komplementacji.

Opisz zasady selekcji metodą blue-white screnning

9




Elektrokompententne komórki bakteryjne E. coli szczep XL1-Blue transformowany był

mieszaniną ligacyjną metodą ……………………………… Do ………… µl. rozmrożonych na

lodzie komórek kompetentnych XL1-Blue dodano ……………. µl oczyszczonej mieszaniny

ligacyjnej. Mieszaninę przeniesiono do kuwet do elektroporacji i poddano działaniu impulsu

pola elektrycznego o parametrach: ……………………………………………………………..

Następnie dodano…………………………, przeniesiono komórki do 1,5 ml probówki i

inkubowano ……………………………… Następnie komórki wysiano na następujące

podłoża selekcyjne w następujących rozcieńczeniach:

1……………………………………

2…………………………………….

3……………………………………..

4……………………………………

6. Analiza rekombinowanych klonów pod względem obecności i orientacji wstawkiDo analizy obecności i orientacji wstawki zastosowano PCR kolonijny z następującymi parami

starterów:

1……………………………….

2……………………………….

3………………………………

10




Zastosowanie takich kombinacji starterów pozwala na analizę obecności oraz orientacji

wstawki w wektorze, gdyż…………………………………………………………………........

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

Analizę przeprowadzono w sposób następujący:

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

A mieszaniny reakcyjne przygotowano w następujący sposób:


Ilość/Stężeniekońcowe w próbce

PróbkaA1

PróbkaA2

PróbkaA3

PróbkaB

Starter For dlawstawki

……….µM …… µM

Starter Rev dlawstawki

……… µM …… µM

M13For ………..µM ….. µM

dNTPs …….. mM ….. mMkoloniaKolonia-lizaddH2OMix zawierający:

Bufor Tag

Dream (10x)Pol Tag

Dream

10x

5 U/µl

1x

1,0 U10 µl 10 µl 10 µl 10 µl

Objętość końcowa 30 l 30 l 30 l 30 l

Reakcję PCR przeprowadzono według następującego profilu termicznego:

Segment Ilość cykli Temperatura Czas1 …. ….. …..

2

…..

…. ….

…. ….

…. ….

11




3 1 …. ….

4 1 …. ∞

Otrzymane produkty PCR analizowano …………………………………………………


W analizowanych klonach stwierdzono ………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………………………..

7. Izolacja DNA plazmidowego z komórek bakteryjnych

DNA plazmidowe izolowano z komórek bakteryjnych metodą lizy alkalicznej z zastosowaniem

zestawu do izolacji „QIAprep Spin Miniprep Kit ” firmy Qiagen.

12




Opisz metodę izolacji

Otrzymane DNA analizowano na …………….. żelu agarozowym.


13




Ocena jakości preparatu poprzez rozdział elektroforetyczny DNA w żelu agarozowym pokazała

………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………...

Ilość DNA oznaczono przez pomiar absorpcji w 260 nm

Parametry Badana próbkaIlość DNA ( X µl) dodana do 10 mM Tris-HCl

pH 8.0 V tot= 1ml

A260nm

A280nm

Stosunek A260nm/ A280nm

Stężenie wyjściowe plazmidu (ng/µl)

14




Stężenie DNA w otrzymanym preparacie wyniosło …………………………ng/µl. Całkowita

otrzymana ilość DNA wyniosła …………………… µg. Czystość preparatu oceniono na

podstawie ……………………………………, który wynosi ……………………, co świadczy

…………………………………………………………………………………………………...

PODSUMOWANIE:

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................................................................

..........................................................................................................

15

Documents

BiolMol2012 Karta Wynikowa Cw3