1

1 UVOD V BIOKEMIJO

1.1 Pojem biokemije

Biokemija= veda, ki s kemijskimi metodami preučuje življenjske pojave. Preučuje

molekularne spremembe snovi pa tudi energetske pretvorbe in porabo razpoložljive energije;

interdisciplinarna veda.

Dinamična biokemija preučuje substance, ki sestavljajo žive organizme (celice…) in

njihove pretvorbe (glukoza v piruvat); snovne spremembe (izšla iz organske KE)

Bioenergetika spremembe v E, ko se snovi spreminjajo (povezani s fizikalno kemijo)

Molekularna biologija razumevanje bioloških procesov na molekularnem nivoju

1.2 Nastanek in razvoj življenja

Vesolje je nastalo ped 15-20 miljardami let v eksploziji=veliki pok.

Vesolje je iz kvarkov in leptonov.

Delce držijo skupaj 4 sile: gravitacija, elektromagnetizem, močna in šibka jedrska sila.

Proton in nevtron sta težka delca (bariona). Gluoni=nosilci močne jedrske sile in

fotoni=nosilci šibke jedrske sile.

1.3 Principi biokemičnih procesov

Delovanje živih snovi se podreja istim fizikalno kemijskim zakonom kot neživa snov.

Molekulska logika življenja= principi po katerih med seboj interagirajo molekula v živih

organizmih.

Biomolekule so univerzalne za vsa živa bitja. Identiteta živih bitij se ohranja s specifičnim

setom nukleinskih kislin in beljakovin. Vsaka biomolekula v celici ima specifično funkcijo.

Živa bitja ohranjajo svojo zgradbo na račun proste energije iz okolja. Živa bitja delujejo

izotermno in izobarično. Energija za življenje prihaja direktno in indirektno od sončeve

energije. Živa bitja preko okolja izmenjujejo energijo in snov. Energija se v živem svetu

prenaša v obliki kemijskih vezi. Živa bitja so samoregulacijski kemični stroji naravnani tako,

da delujejo najbolj ekonomično.

2 MOLEKULSKI TEMELJI

2.1 Bioelementi

3D struktura molekul je prostorska razporeditev skeleta in funkcionalnih skupin. Tesno je

povezana z njihovim delovanjem in mehanizmom delovanja.

Asimetrične molekule so tiste, ki imajo vse substituente na določenem atomu različne.

Konfiguracija= prostorska razporeditev atomov in atomskih skupin zaradi prisotnosti

dvojnih vezi ali kiralnih centrov; prehod med njimi je mogoč le s prekinitvijo kovalentne vezi.

Stereoizomere= različne izomerne oblike; enantiomera= če sta stereoizomeri zrcalni sliki;

anomeri= 2 optično različni obliki (alfa in beta), razlika samo po konfiguraciji na

anomernem C atomu.

Konformacija= prostorska razporeditve atomov in atomskih skupin, ki se lahko prosto

gibljejo okoli enojnih vezi.

Živi organizmi so sestavljeni pretežno iz C (10%), H (63%), N,O (26%), P, S in Na, K, Cl,

Ca. Ker pa večino telesne teže predstavlja voda, lahko sklepamo, da se je prvo življenje

razvilo v morski vodi.

Zemeljska skorja pa je sestavljena iz bolj kompleksnih spojin teh elementov, npr. H2, CH4,

NH3, H2S ter Fe, Al, Ca, S (28%), O2 (47%)...

Glavni bioelementi (vrste, vloga, izvor):

- OGLJIK: izvor v CO2, je gradnik organskih skeletov

2

- KISIK: del vode, tvori različne funkcionalne skupine, pomemben pri medmolekulskih

povezavah (H-vez, naboj, polarnost...)

- VODIK: del vode, tvori H-vez in ima pomembno vlogo pri strukturi organskih spojin

- DUŠIK: izvor v zraku in nitratih, je pomembna strukturna enota (oblikuje skupine –NH2, H-

vez)

- ŽVEPLO: pomemben pri dihanju

- FOSFOR: ioni pomembni pri tvorbi kosti

Močne vezi:

- kovalentna vez skupni elektronski pari, velika jakost (več sto kJ za 1 mol) in

usmerjenost (pri atomih z enako elektronegativnostjo je vez nepolarna, razlika v

elektronegativnosti pa povzroči polarnost vezi

- ionska vez nastane, ko je razlika v elektronegativnosti dveh atomov prevelika;

ni usmerjena, izredno močna je v kristalih, medtem ko je v raztopinah zaradi

hidratacije šibkejša

- kovinska vez nastane med atomi kovin, ni pomembna za živi svet

Šibke vezi:

- van der Waalsove interakcije poznamo 3 vrste: orientacijske (dipol-dipol),

indukcijske (dipol-induciran dipol) in disperzijske (ind.dipol-ind.dipol); jakost vezi

je majhna (nekaj kJ/mol), pomembne pa so zaradi številčnosti

- vodikove vezi nastane med dvema močno elektronegativnima atomoma (H se

veže na F, O, N), jakost vezi je 10 kJ/mol

- hidrofobne interakcije nastanejo med nepolarnimi molekulami (lipidi)

2.2 Voda

Voda je medij kjer potekajo reakcije v živih sistemih. Je tudi reaktant v bioloških reakcijah.

Struktura vode

V molekuli vode sta dva vezna in dva nevezna elektronska para, ki tvorijo tetraeder (104,5°)

posledica te strukture so interakcije med molekulami, zaradi česar ima voda značilne

lastnosti.

Voda ima visoko tališče (0°C), visoko vrelišče (100°C), veliko izparilno toploto (2260 J/g),

veliko toplotno kapaciteto, veliko viskoznost in neobičajno odvisnost gostote od temperature

(anomalija vode).

Vodikova vez nastane med skupino (donor), v kateri je H kovalentno vezan na močno

elektronegativen atom, in drugo skupino z elektronegativnim atomom (akceptor), ki omogoča

polarizacijo naboja. Tako nastane v številnih biomolekulah (proteinih, nukleinskih kislinah,

sladkorjih,...) in jih stabilizira.

Hidrofobne interakcije nastanejo med nepolarnimi deli molekul v vodnem okolju, ko se le-ti

združijo skupaj in izrinejo vodo ven. Povečan nered molekul vode poveča stabilnost bioloških

makromolekul in entropijo sistema.

Voda je polarno topilo, v katerem se topijo polarne molekule (H-vezi), nepolarne molekule

pa se topijo v nepolarnih topilih.

Biomolekule so lahko:

- polarne (glukoza, glicin, glicerol...) v vodi se raztopijo

- nepolarne (vosek) nastaneta dve fazi (polarna in nepolarna)

- amfipatične (lipidi) s polarnimi glavami se obrnejo proti vodi, nepolarni repi

pa izrinejo vodo in se združijo med seboj (micel)

3

2.3 Raztopine

Raztopine so iz ene same, homogene faze dveh ali več snovi. Topilo= snov, ki je je največ;

ostale snovi so topljenci, ki so lahko trdne snovi, tekočine ali plini. Koncentracija pove

relativno količino topila in topljenca.

Henryev zakon po njem je količina plina, ki se raztopi v vodi odvisna od parcialnega tlaka

nad površino, za raztapljanje sta pomembni še T in površina med plinsko in tekočo fazo.

Absorbcijski koeficient= tista količina plina v l, ki pri standardnih pogojih nasiti 1l tekočine

pri parcialnem tlaku 1atm.

- MOLSKI ULOMEK: X1 = n1 / (n1+n2) in X2 = n2 / (n1+n2); X1 + X2 = 1

n1 ... št.mol topila, n2 ...št.mol topljenca

- MOLARNA KONC. [M]: št.mol topljenca v 1L raztopine

- MOLALNA KONC. [m]: št.mol topljenca v 1kg topila

- PROCENTNA KONC.: utežna p.k. g topljenca na 100g raztopine;

volumska p.k. mL topljenca na 100mL raztopine

Raztopine plinov so ključnega pomena za življenje na Zemlji. Vsak plin je do neke mere

topen v vsaki tekočini, njegova topnost pa je odvisna od temperature, tlaka in stopnje topnosti,

ki je lastnost sistema.

Vodni organizmi se oskrbujejo s kisikom, ki se v vodi raztopi v skladu s Henryjevim

zakonom

Poleg raztapljanja v vodi (Henryjev zakon) se fiziološki plini (O2, N2, CO2) še dodatno

raztapljajo v krvi O2 se veže na hemoglobin, CO2 pa poleg tega tudi reagira z vodo v

H2CO3.

Motnje zaradi spremenjenih zunanjih razmer:

- kisikova toksičnost: v večjih globinah je zaradi zvišanega tlaka kisik v krvi

prisoten v večjih količinah (toksično za centralni živčni sistem)

- kesonska bolezen: pri hitrem dvigu iz večjih globin se dušik iz krvi izloča v obliki

mehurčkov, ki zamašijo kapilare (manj topen)

- dušikova pijanost: pri večjih koncentracijah ima dušik narkotičen učinek

- višinska bolezen: na velikih višinah je parcialni tlak kisika premajhen za normalno

oskrbo organizmov

Težave skušajo reševati s spremenjenimi dihalnimi zmesmi (O2/He), z omejenim bivanjem na

večjih globinah in s skrbno načrtovanim režimom dviganja na površje (ali celo s hiperbarično

komoro).

2.3.1 Koligativne lastnosti raztopin

Koligativne lastnosti- znižanje parnega tlaka topila, zvišanje vrelišča in znižanje zmrzališča,

osmozni tlak. Odvisne so le od števila delcev.

Raoultov zakon znižanje parnega tlaka je porporcionalno molskemu ulomku topljenca.

Difuzija-prehajanje snovi v smeri konc. gradienta( osmozavoda).

Osmozni tlak= tlak, ki ga moramo izvajati nad raztopino, da jo držimo v ravnotežju s čistim

topilom na drugi strani polprepustne membrane, skozi katero lahko prehaja samo topilo in

nekateri topljenci. Toničnost je posledica le tistih delcev v raztopini, ki ne prehajajo skozi

membrano. Je posledica vseh delcev v raztopini. Pomen koligativnih last.: za določanje

aktivnosti. Aktivnostni koeficient je gama=izmerjena KL/izračunana KL (razmerje).

Donnanovo ravnotežje imamo delce, ki lahko prehajajo preko membrane in delce, ki ne

morejo, vsi pa so nabiti. Razporedijo se neenakomerno, glede na elektrostatski privlak.

2.3.2 Kislinsko bazne lastnosti raztopin

Ionizacija vode: 2H2O H3O+ + OH

- (ionizacija je šibka in odvisna od T)

4

Ionski produkt vode: KW= [H3O+] [OH

-] = 1 x 10

-14 mol

2/ l

2 (pri T=25°C)

Disociacijska konstanta podaja razmerje med koncentracijo produktov in koncentracijo

reaktantov:

KD =α2 c / (1-α)

K in n sta konstanti, α in i pa ne, saj sta odvisni od koncentracije z zmanjševanjem konc.se

njuna vrednost povečuje.

pH izrazimo s koncentracijo H3O+: pH = - log10[H3O

+]

pH v čisti vodi je nevtralen, ker je [H3O+] = [OH

-]. Raztopine, pri katerih velja [H3O

+] > [OH

-

] so kisle in tiste s [H3O+] < [OH

-] so bazične. Pri 25°C je pH 7 nevtralno, pH<7 kislo in

pH>7 bazično območje (pH + pOH = pKW = 14).

Zaradi pomembnega vpliva pH na delovanje biomolekul in predvsem na medmolekulske

interakcije (encim-substrat, hormon-receptor...) je pH v bioloških sistemih skrbno uravnavan

(v krvi pH okoli 7˙4, v želodcu pa pH 1)

Kisline so snovi, ki oddajajo protone, baze pa jih sprejemajo. Pri disociaciji kislin in baz

dobimo konjugirane baze in kisline:

HCl + H2O H3O+

+ Cl-

NH3 + H2O NH4+ + OH

-

Henderson-Hasselbachova enačba:

pH = pKa + log [A-] / [AH]

Nevtralizacija je reakcija med kislinami in bazami: HA + BOH B+ + A

- + H2O

kislina + baza = disociirana sol + voda

Pri popolni nevtralizaciji močne kisline z močno bazo je nastala raztopina nevtralna, pri

popolni nevtralizaciji šibke kisline z močno bazo je raztopina nekoliko alkalna, pri popolni

nevtralizaciji šibke baze z močno kislino pa je raztopina nekoliko kisla.

Indikatorji pH so spojine, ki imajo lastnosti šibkih baz ali šibkih kislin. V protonirani ali

neprotonirani obliki imajo različno barvo.

Ind H (barva 1) + H2O H3O+ + Ind

- (barva 2)

pH = pKa + log [Ind-]/[Ind H] 1. [Ind

-] = [Ind H] pH = pKa (preskok barve)

2. [Ind-] = 10 [Ind H] pH = pKa +1 (barva 2)

3. [Ind-] = [Ind H] / 10 pH = pKa -1 (barva 1)

- bikarbonatni pufer (HCO3-/H2CO3) v izvenceličnih tekočinah (kri) ECP

- fosfatni pufer (HPO42-

/H2PO4-) v citoplazmi ICP

3 BIOENERGETIKA

3.1 Termodinamske osnove

Sistem= del celote, ki ga obravnavo (popišemo ga s T,p, V, količino snovi, pri konstantnih

vrednostih teh spremenljivk je sistem v določenem stanju.); Okolje= vse izven sistema.

Sistemi so lahko izolirani, zaprti in odprti.

Entalpija (H): sprememba entalpije (∆H) je toplota, ki jo zaprt izotermalni (T=konst) sistem

sprejme (∆H>0, endotermen proces) ali odda (∆H<0, eksotermen proces), če se pri

spremembi stanja sistema opravi le delo, povezano s spremembo volumna:

∆H=∆E + p ∆V (∆H=∆Q, če ni volumskega dela); enota za entalpijo je J/mol. V praksi je to

sežigna toplota oz. kalorična vrednost hrane.

Hessov zakon: sprememba entalpije v neki reakciji je odvisna le od začetnega in končnega

stanja ne glede na št.vmesnih stopenj.

∆H0

rkc = ∑∆H0

t produkti - ∑∆H0

t reaktanti

Pri prehodih sistema iz enega stanja v drugo gre za spremembe makroskopskih količin, za

katere ni potrebno poznati podrobne zgradbe sistema in da so te količine posledica dogajanj v

5

svetu atomov in molekul. Pri tem je obravnava statistična, ugotovitve pa veljajo za celoten

sistem in ne le za posamezne elemente. Energijo merimo glede na količino snovi: J/mol,

kcal/mol. Notranja E sistema je sestavljena iz E kinetičnih stanj atomov (translacije, rotacije

in vibracije) ter energije vezi med atomi.

1. zakon termodinamike= celotna E sistema je konstantna. Biološki sistemi so odprti

sistemi, ki delujejo pri konstantnem pritisku in T in so sestavljeni tudi iz okolice. ∆E = Q +

W (sprememba energije je enaka vsoti dovedene toplote in dovedenega dela).

2. zakon termodinamike uvaja entropijo kot kriterij, s katerim lahko ovrednotimo verjetnost

s katero bo nek proces potekal v določeno smer. Entropija je merilo za spontanost reakcije in

neurejenost sistema; matematično je pri idealnih reverzibilnih procesih definirana kot dS=

dQrev/T. Enota je J/molK. Entropija narašča s povečevanjem nereda ali z naraščanjem

temperature. Če je sistem sposoben absorbirati vso dovedeno toploto (izoliran) je proces

popolnoma reverzibilen, sicer ne(odprt). Za reverzibilnost odprtega sistema je potrebno

dovajati energijo-v bioloških sistemih entropija vedno le narašča oz pada na račun okolice;

okolica pa je del sistema. Toplota ireverzibilno prehaja v eno smer in se pri tem enakomerno

porazdeljuje, kar povzroča neurejenost. Stabilni sistemi so neurejeni sistemi. Gibbsova

prosta entalpija (G)= funkcija stanja sistema. Eksergonskost= spontan proces,

endergonskost= nespontan proces. EKSERGONSKA RKC (∆G0<0) v ravnotežju je več

produktov kot reaktantov; ENDERGONSKA RKC (∆G0>0) ravnotežje pomaknjeno v

smer reaktantov. Smer reakcije je odvisna od predznaka, torej od G. proste entalpije. Vse 3

termodinamske funkcije so aditivne, velja Hessov zakon. 3. zakon termodinamike pove, da

je urejenost idealnega kristala pri absolutni ničli popolna in je zato takrat entropija 0.

Spontan potek procesa biološke sisteme obravnavamo kot zaprte + upoštevamo okolico. V

takem sistemu se entalpija vedno manjša, entropija pa veča, saj toplota neprestano uhaja v

okolico. Tako sta izpolnjena oba pogoja za spontanost. Standardno stanje: T=25°C (298 K),

p=101,3kPa, c(reakt.in prod.)=1mol/L Kemijski potencial je delež proste entalpije sistema,

ki odpade le na eno komponento.

Kemijski potencial= parcialna molarna količina in je zato odvisna od koncentracijske

komponente. μA=μ°A + RTln[A]. Prosta entalpija sistema je vsota kemijskih potencialov

vseh komponent, tudi če te niso v standardnem stanju. ∆G=∆G°+RTln[C][D]/[A][B]. Vsota

kemijskih potencialov vseh komponent v ravnotežju je enaka nič. ∆G je mera, kako daleč od

ravnotežja se nahaja sistem; izpeljava zveze med standardno prosto entalpijo in ravnotežno

konstanto: ∆G° = - RTlnK. Vsota kemijskih potencialnov difuzibilnih ionov na obeh straneh

membrane mora biti enaka (D. ravnotežje). V ravnotežju je hitrost reakcije v desno enaka

hitrosti reakcije v levo in takrat se vzpostavijo stalne koncentracije reaktantov in produktov.

Za sklopitev reakcij je potreben skupni intermediat.

Sklopljene reakcije, pomen za vzdrževanje življenja

A + B ↔ C + D ∆G10 > 0 ENDERGONSKA RKC

C ↔ X + Y ∆G20 < 0 EKSERGONSKA RKC

Velja: |∆G20| > |∆G1

0|

-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------

A + B ↔ D + X + Y ∆G30 < 0

EKSERGONSKA RKC (∆G0<0) v ravnotežju je več produktov kot reaktantov

ENDERGONSKA RKC (∆G0>0) ravnotežje pomaknjeno v smer reaktantov

V organizmih potekajo tako eksergonske kot endergonske reakcije. Da nastane dovolj

produktov, se morajo reakcije med seboj sklapljati. Pogoji za uspešno sklopitev so: obe

reakciji morata teči v istem prostoru, imata skupni intermediat (C) in skupna sprememba

proste entalpije mora biti negativna (∆G30 < 0).

6

Reakcije v živih organizmih so organizirane v metaboličnih poteh, kar pomeni, da so med

seboj sklopljene.

3.2 Kemijska kinetika

Hitrost reakcije je sprememba koncentracije reaktanta ali produkta v časovni enoti v=∆[P]/

∆t oz -∆[S]/ ∆t. Hitrost pretvorbe A in B v C in D je podana z enačbo v+1 = k+1 [A]n1

[B]n2

, ki

odraža št.trkov med A in B, odvisna pa je od njunih aktivnosti, reda reakcij in hitrostne

konstante (k+1), ki je odraz deleža uspešnih trkov. Red reakcije je parameter, ki pove kako je

hitrost odvisna od koncentracije. Delni red reakcije je eksponent koncentracije reaktanta od

katere je odvisna hitrost reakcije. Celokupni red reakcije je vsota eksponentov koncentracij

reaktantov oz. produktov v reakciji.

Red reakcije; določanje reda reakcije

Red reakcije pove, kako posamezen reaktant vpliva na hitrost reakcije:

- red 0: v = k [A]0 sprememba koncentracije ne vpliva na hitrost rkc, [A] pa s

časom pada: [A] = [A]0 - kt

- red 1: v = k [A]1 hitrost je linearno odvisna od konc.reaktanta, [A] pada

eksponentno s časom: [A] = [A]0 e-kt

(t1/2 = ln2 / k)

- red 2: v = k [A]2 odvisnost je kvadratna, 1/ [A] = 1 / [A]0 + kt (t1/2 = 1/ k[A]0)

Red reakcije se da določiti eksperimentalno, če so reakcijske enačbe poenostavljene. V

nasprotnem primeru je mehanizem rkc v skladu z enačbo rkc (elementarne rkc), delni redi za

posamezen reaktant so enaki koeficientom pred tem reaktantom: aA + bB cC + dD; velja:

v+1 = k+1[A]a[B]

b

Hitrostna konstanta: k = RT/Nh e-∆G/RT

N...Avogadrovo število

h...Planckova konstanta

∆G0...aktivacijska energija (večja je ∆G

0,

počasnejša je reakcija v desno)

Celotni red reakcije je lahko 0,1 ali 2, pa tudi ulomek, redko je večji od 2. Ni nujno, da je red

reakcije v zvezi s stehiometričnimi koeficienti v reakcijski enačbi, je pri preprostih reakcijah.

Red reakcije je mogoče določiti z enačbo: logv=logk+nlog[A]. Hitrostna konstanta odseva

intrinzične lastnosti posamezne reakcije pod določenimi pogoji. Pri preučevanju reakcij je

koristno poznati red, ker lahko iz njega sklepamo na mehanizem, še posebej, če upoštevamo

osnovne kemijske principe in skupaj z nekinetičnimi podatki o reakciji. Mehanizem reakcije

je natančno poznavanje vseh stopenj, reaktantov, intermediatov in produktov, pa tudi hitrost

vseh pretvorb in to na molekulskem nivoju. Pri kompleksnem reakcijskem mehanizmu odloča

o hitrosti najpočasnejša stopnja. Hitrost ene stopnje je enostavna funkcija le koncentraciji

reaktantov v tej stopnji in da je taka delna reakcija elementaren proces. Molekularnost

reakcije je vsota molekul, ki sodelujejo v elementarni reakciji. Primer monomolekularne

reakcije je razpad molekule. Najpogostejše so bimolekularne reakcije, verjetnost

trimmolekularne reakcije je le 1/1000 bimolekularne. Reakcije največkrat potekajo

zaporedno: nov reaktant reagira s produktom predhodne bimolekularne reakcije itn.

Tri teorije o hitrosti kemičnih reakcij? Arrheniusova teorija= molekule morajo trčiti, do

reakcije pride le pri trkih aktivnih molekul; pri višji T je več molekul v aktivnem stanju.

Arrheniusov diagram: lnk=lnA-E/RT. Po teoriji trkov je hitrost porporcionalana številu trkov

in koncentracijam reaktantov. Uspešni trki pa so le tisti, pri katerih trčijo molekule z dovolj

veliko energijo, ki je proporcionalana e-E/RT

. Obe teoriji je potrebno popraviti za sterični faktor

P<1. Po teoriji o aktiviranih kompleksih se molekule približajo, prvotne vezi zrahljajo,

nove pa se le delno vzpostavijo. To je aktiviran kompleks, ki je energijsko stabilno stanje:

lahko razpade na reaktante ali produkte. Energija za nastanek aktiviranega kompleksa pride

od E molekul pri trku, je proporcionalna – enačba

7

Najpomembnejši dejavniki, ki vplivajo na hitrost reakcije, so:

- koncentracija reaktantov: povečana koncentracija reaktantov povzroči več uspešnih trkov in

s tem večjo hitrost reakcije

- pH: lahko vpliva posredno (zaradi spremembe ionske moči ali pri kataliziranih reakcijah

zaradi vpliva na katalizator) ali neposredno (če je reaktant proton (H+), saj ∆pH pomeni

spremembo koncentracije reaktanta)

- ionska moč (μ): se kaže samo pri nabitih reaktantih če so enako nabiti, so trki olajšani in

reakcija lahko poteče hitreje in obratno

- temperatura: dvig T poveča kinetično energijo reaktantov in s tem hitrost reakcije

- prisotnost katalizatorjev: katalizator zmanjša Ea in s tem pospeši njeno hitrost.

4 TEMELJNE BIOMOLEKULE

Osnovni gradniki žive snovi so monosaharidi, aminokisline, dušikove baze in različne

maščobne molekule. Ti gradniki se zaradi ekonomičnosti uporabljajo v različne namene.

Biomolekulam določajo lastnosti njihove funkcionalne skupine. 3D struktura, tj. konfiguracija

in konformacija, biomolekulam omogoča povezovanje, prepoznavanje in funkcioniranje.

4.1 SLADKORJI

4.1.1 Monosaharidi

So polihidroksi ketoze in aldoze. Pri ciklizaciji fizioloških ketoz nastajajo največkrat peterni

obroči, furanoze, pri ciklizaciji aldoz pa šesterni obroči, piranoze. Novo nastalo hidroksilno

skupino pri ciklizaciji imenujemo anomerna, sladkorji s prosto anomerno hidroksilno

skupino imajo redukcijske lastnosti. Dva različna položaja anomerne hidroksilne skupine sta

vzrok za pojav dveh novih stereoizomer, ki sta zelo pomembni pri polimerizaciji.

V raztopini je le okoli 5% monosaharida v aciklični obliki, vse 3 oblike so v ravnotežju. Kisli

monosaharidi so sestavine gliko-proteinov vezivnega tkiva pri višjih organizmih, v zobeh,

kosteh in koži. Monosaharidi se v celicah uporabljajo kot energetski viri (glukoza), gradniki

oligo in polisaharidov (derivati, kisli derivati) in kot gradniki nukleozidov (riboza in

deoksiriboza).

4.1.2 Oligosaharidi

Delitev na: disaharidi, polimeri z do 10 enotami, homo in heteroglikani.

Pri trehaloznem tipu disaharida nastane 1-1 glikozidna vez, pri tem tipu vezave se izgubijo

redukcijske sposobnosti in mutarotacija. Pri maltoznem tipu disaharida nastane 1-x glikozidna

vez, pri takšni vezavi se ohranijo redukcijske sposobnosti disaharida in mutarotacija.

CELOBIOZA = ß-glukoza + ß-glukoza (1,4´-ß vez)

TREHALOZA = α-glukoza + α-glukoza (1,1´-α vez)

- najdemo jo pri insektih

- zaloga energije v krvi

MALTOZA = α-glukoza + ß-glukoza (1,4´-α vez)

- razgradni produkt škroba in glikogena

SAHAROZA = α-glukoza + ß-fruktoza (1,2´-α,ß´vez)

- ni prostih reducirajočih koncev (trehalozni tip)

- pesni sladkor

LAKTOZA = ß-galaktoza + ß-glukoza (1,4´-ß vez)

- mlečni sladkor

Oligosaharidi so sestavine glikoproteinov in glikolipidov. Oligosaharidi opravljajo različne

funkcije: sodelujejo pri beljakovinskem zvijanju (negativno nabiti, kot je sialična kislina),

8

ščitijo beljakovine pred agensi (pH, toploto, hidrolitičnimi encimi), sodelujejo pri

povezovanju z drugimi strukturami (receptorjem dajejo veliko specifičnost).

Strukturan osnova antigenov pri krvnih skupinah je pentasaharid, na katerega sta lahko

dodatno vezana še eden ali dva monosaharida. Pri dedovanju krvnih skupin gre za specifično

dedovanje zapisa za transferaze, ki katalizirajo pripenjanje enega ali obeh monosaharidov na

pentasaharid. Raznolikost možnih povezav med saharidnimi gradniki privede do velikega

števila strukturnih kombinacij antigenov. Zaradi enoličnih funkcionalnih skupin ne sodelujejo

z enimi pri njihovem katalitskem delovanj (nanaša na oligosaharide).

Biokemične funkcije oligosaharidnih sestavin, vezanih na delujoče beljakovine: antigenska

(ločevanje lastnega od tujega), signalna (za izločanje, za označevanje starosti), zaščitna (pri

G- bakterijah, ki nimajo kompleksne celične stene).

4.2 LIPIDI

Lipidi so biomolekule katerih skupna lastnost je netopnost v vodi. Po strukturi in funkciji so

zelo različni. Razdelimo jih (po funkciji): rezervni (masti in olja), strukturni

(glicerofosfolipidi, sfingolipidi in steroli), tisti s specifičnimi funkcijami (steroidni hormoni,

inozitolni derivati, eikozanoidi, lipidotopni vitamini, kinoni in doliholi).

4.2.1 Rezervni lipidi

Osnovne maščobne kisline imajo sodo št.C-atomov, lahko so:

- nasičene (ni dvojnih vezi, pri sobni T so v trdnem stanju masti)

- PALMITINSKA KSL (16 C-atomov)

- STEARINSKA KSL (18 C-atomov)

- nenasičene (pri sobni T so v tekočem stanju olje; več dvojnih vezi nižja TT + večja

fluidnost; dvojne vezi so v konfiguraciji cis )

- OLEINSKA KSL (18: 1∆9)

- LINOLNA KSL (18: 2∆9,12

)

- LINOLENSKA KSL (18: 3∆9,12,15

)

- ARAHIDONSKA KSL (20: 4∆5,8,11,14

)

Velika stopnja reduciranosti lipidnih molekul je izvor koristne rezervne E. Acil-gliceroli so

estri glicerola in ene do treh višjih MK. Masti in olja so zaloga energiji in izolacijska plast. S

kuhanjem v alkalnem mediju se acilgliceroli umilijo.(!)

Pri MO je na eno od hidroksilnih skupin glicerola lahko estrsko vezan višji alkohol, ki

povzroči rezistentnost proti lipazam.

Voski so estri višjih MK in višjih alkoholov, njihova vloga je zaloga E (plankton), zaščita

pred omočitvijo (perje vodnih ptic), izhlapevanjem (tropske rastline) ali pa so gradbeni

material (vosato satovje žuželk, vosati kiti).

4.2.2 Strukturni lipidi

Glicerofosfolipidi so strukturni lipidi, ki so sestavljeni iz glicerola, 2h višjih MK, fosforne

kisline in alkohola. Osnovni predstavnik sfingolipidov je ceramid, t.j. z amidno vezjo

povezan amino-alkohol sfingozin in višja MK. Na ceramid je lahko vezan fosfoholin

(sfingomielin), galaktoza ali klukoza (cerebrozid) ali pa kompleksni (kisli) oligosaharidi

(gangliozid). Pentasaharid, ki determinira krvne skupine je vezan na ceramid.

4.2.3 Steroidi

Holesterol je prekurzor drugih steroidov s specifičnimi funkcijami. Prokarionti nimajo

sterolov, imajo jih glive, rastline in živali.

9

4.2.4 Lipidi s posebno biološko vlogo

STEROIDE sestavljajo 4 kondenzirani hidrofobni obroči in substituenti. Glede na št.C-

atomov lahko steroide različno poimenujemo, pomemben pa je tudi položaj substituentov (α,

ß) in povezava med obročema A in B:

- trans-5α H atom (steroli, steroidni hormoni)

- cis-5ß H atom (žolčne kisline)

Steroidni hormoni so derivati holesterola; osnovni skelet je podoben, le substituenti so

različni. Ločimo:

- KORTIKOSTEROIDE (hormoni nadledvične žleze): glukokortikoidi, mineralokortikoidi;

Funkcija: vpliv na metabolizem OH in proteinov, zmanjšujejo imunski odziv ter vnetne in

alergijske reakcije; vpliv na krvni tlak, zadrževanje vode v ledvicah.

- SPOLNE HORMONE:

- androgeni: testosteron (glavni moški hormon, nastaja v testisih)

androstendion

Struktura: O na C3, OH na C17, dvojna vez na C4

Funkcija: uravnavajo razvoj moških sek.spolnih znakov, anabolno delovanje

- estrogeni: estradiol (glavni ženski hormon, nastaja v jajčnikih)

estron

Struktura: OH na C3, C17 ter aromatski A obroč

Funkcija: uravnavajo razvoj ženskih sek.spolnih znakov

- progestageni: progesteron (vsebujejo ga kontracepcijske tablete)

Struktura: O na C3, COCH3 na C17, dvojna vez na C4

Fosfatidilinozitol in njegovi derivati so intracelularni obveščevalci (fosfatidilinozitol-4,5-

bifosfat). Intracelularni obveščevalci so zasidrani na notranji strani membrane in se pod

vplivom zunanjih signalov sprostijo v celico in opravijo signalno nalogo. Fosfatidilinozitol in

njegovi derivati delujejo na sproščanje kalcija (inozitol-1,4,5-trifosfat) in aktivacijo

proteinskih kinaz C (diacilglicerol).

Eikozanoide izločajo tkiva za lokalno signilizacijo, s tem da jih proizvajajo iz arahidonske

kisline, ki je vskladiščena v membranskih fosfolipidih. 3 vrste eikozanoidov: prostaglandini,

tromboksani in leukortieni.

Glavni fiziološki učinki tkivnih hormonov so krčenje gladke muskulature, vpliv na

termoregulacijo, bolečino, vnetje, strjevanje krvi, aktivni transport in na regulacijo krvnega

pritiska.

Vsi lipidotopni vitamini so izoprenoidi. Hormon D pospešuje absorbcijo kalcija v črevesju

(poveča sintezo prenašalcev za kalcij) in spodbuja osteoklaste pri sproščanju kalcija iz kosti.

Vitamin E (tokoferol): najdemo ga v rastlinskih oljih in semenih. Njegova glavna vloga je

zaščita plazmaleme in subcelične membrane. S svojim aromatskim obročem uniči proste

radikale in tako prepreči oksidacijo membrane (deluje kot antioksidant). Učinkovit je pri

velikih koncentracijah kisika, zato ga najdemo v membranah eritrocitov, dihal.

Vitamin K-vloga pri post-translacijski modifikaciji trombina in fotosintezi.

Ubikinon je iz 10 izoprenskih enot in kot lipidotopen prenašalec redukcijskih ekvivalentov

(vodikovih atomov) sodeluje v dihalni verigi v živalskih celicah. Plastokinon je iz 4

izoprenskih enot in kot lipidotopen prenašalec redukcijskih ekvivalentov (vodikovih atomov)

sodeluje pri fotosintezi v rastlinskih celicah. Doliholi so polimeri 9-22 izoprenskih enot, s

svojo hidroksilno skupino sodelujejo kot aktivatorji mono- in oligosaharidnih enot pri

njihovem prenosu na proteine. Poleg energijskega prispevka (tvorba vezi) pri nastanku

glikoproteinov doliholi pomagajo pri prepoznavanju (entropijsko) pravih beljakovin.

10

4.3 AMINOKSILINE

Pomen karboksilne in amino sk.

Značilne reakcije AK, ki potekajo na funkcionalne skupine:

- pomembne za COOH skupino: nastanek peptidne vezi, amidacija karboksilne

kisline (CONH2), dekarboksidacija (izguba COOH skupine, nastane biogeni amin)

- pomembne za NH2 strukturo: peptidna vez, ninhidrinska reakcija

- funkcionalne skupine v R: ksantoproteinska reakcija (poteka na R fenilalanin in

tirozin – dušikova kislina nitrira obroč, rumena barva dokaže prisotnost

aromatskega obroča).

AK glede na radikale razdelimo na hidrofobne, hidrofilne, aromatske, nabite ter male in

velike. V celicah najdemo kakšnih 300 AK, atipične: hidroksiprolin, hidroksilizin, citrulin,

srkozin, homocistein, homoserin, DOPA, D-aminokisline, β-alanin. Nekatere AK so tudi

toksične (kanavalin, β-cianoalanin).

4.3.1 Kislinsko bazne lastnosti AK

Izoelektrična točka AK je pH, pri katerem ne potuje v električnem polju. Določimo jo s

pomočjo izolektričnega fokusiranja. Izoionska točka AK je pH, pri katerem AK v vodi nima

neto naboja. Določimo jo tako, da AK raztopimo v vodi in s pH-metrom izmerimo pH

vrednost. Specifične reakcije na funkcionalne skupine v AK: ninhidrinska- osnovni

kvalitativni test za dokazovanje AK, ksantoproteinska-za aromatske AK, biuretska-

specifična reakcija na peptidno vez.

4.3.2 Peptidi

So aminokislinski polimeri z do 50 enotami, v vodni raztopini nimajo stalne 3D strukture.

Nastanejo z razgradnjo beljakovin, ali kot samostojne aktivne substance. Povezava med 2ma

AK v peptidih je lahko peptidna vez (amino in karboksi konec) ali splošna amidna vez (nap. 2

karboksilna konca). Pomembni peptidi- glutation, aspartam. Obstajajo zelo učinkoviti peptidi

s posebnimi funkcijami, kot so bradikinin, vasopresin in oksitocin, tireotropni hormon (TSH),

garamicin, substanca P, mastoparan, enkefalin, amanitin, aktinomicin D. Atipične vezi

pomen za odpornost proti proteazam.

4.3.3 Biogeni amini

So derivati AK, nastanejo z dekarboksilacijo, včasih pa še z dodatnimi modifikacijami. Imajo

hormonski ali nevrotransmitorski učinek. Seotonin (5-hidroksi-triptamin) je derivat triptofana

in krči žile. Histamin derivat histidina, širi žile in se sprošča pri alergijskih reakcijah.

Dopamin, adrenalin (epinefrin) in noradrenalin (norepinefrin) so derivati fenilalanina oz

tirozina in so centralni in periferni nevrotransmitorji, slednja 2 tudi hormona. Tiroksin in

trijodtrionin sta ščitnična hormona, ki nastaneta iz tirozina, pod posebnimi pogoji v ščitnici.

4.4 PURINSKE IN PIRIMIDINSKE BAZE

So bazične hidrofobne molekule, ki sestavljajo nukleotide in nukleinske kisline. Obstajajo

tudi atipične baze, kot so 5-bromouracil, 2-aminopurin, pseudo-uracil itd. So šibke baze,ker se

dušik v heterociklih lahko protonira. Konjugirane dvojne vezi v obročih povzročajo planarnost

molekul, absorbcijo UV svetlobe (pri 260nm) in hipokromni efekt, kadar tvorijo ||-||

interakcije. Pojav tavtomerije pH je odvisen in zelo pomemben za interakcije baz s

sladkorjem. Dušikove baze v celicah niso proste. Baze se z N-glikozdino vezjo povežejo z

ribozo ali dezoksiribozo v nukleozide oz. dezoksinukleozide. Tudi nukleozidi v celicah niso

prosti. Ester nukleozida in fosforne kisline se imenuje nukleotid. Na nukleotidu so lahko do

11

3 fosforne kisline, 2. in 3. sta vezani anhidridno. Nukleotidi sestavljajo RNA in DNA. Druge

funkcije nukleotidov: prenašalci E (ATP, GTP, UTP, CTP), sestavine koencimov (NAD+,

FAD) in sekundarni obveščevalci (cAMP, cGMP).

4.5 HORMONI

So molekule, ki se sintetizirajo v žlezah z notranjim izločanjem ter delujejo na celice tarče.

Celice tarče so tiste celice, ki imajo receptorje za hormone. Strukturna razdelitev

hormonov: peptidni (tropni hormoni, nap ADTH, insulin, glukagon, vazopresin itd.), derivati

AK (adrenalini itd.), steroidni hormoni, hormonom podobne snovi (eikozanoidi). Hormone

delimo tudi na vodotopne in lipidotopne. Vodotopni hormoni imajo membranske receptorje,

nadaljevanje prenosa poteka kaskadno. Pri tem se lahko uporabijo G-proteini (insulin),

adenlatna ciklaza in proteinske fosforilaze ali inozitol-bifosfat (vazopresin). Lipidotopni

hormoni imajo plazemske beljakovinske prenašalce, citosolne receptorje in se skupaj z njimi

v jedru povežejo s specifičnimi zaporedji v DNA molekuli. Temu sledi represija ali depresija

gena (nap. povečana sinteza kalcijevih prenašalcev).

Adenilatna in guanilatna ciklaza katalizirata intramolekularno esterifikacijo, ko iz ATP,

GTP nastane cAMP, cGMP in PPi.

Fosfodiesteraza hidrolizira 3` estersko vez v cikličnih nukleotidih in s tem dezaktivira

kaskadno reakcijo. Struktura, funkcija steroidnih hormonovglej lipide.

Glukokortikosteroidi in mineralokortikosteroidi imajo 21 C- atomov. Ženski spolni

hormoni (estrogeni: estron, estradiol in estriol) 18 C-atomov. Moški spolni hormoni

(androgeni: androsteron in testosteron) imajo 19 C-atomov. Progesteron ima 21 C-atomov.

Hormonska hiearhija: sprostitveni hormoni iz hipotalamusa povzročijo sproščanje tropnih

hormonov iz hipofize, ti pa izločanje končnih hormonov iz ostalih endokrinih žlez. Nekateri

hormoni se lahko izločajo zaradi živčnih impulzov (adrenalin iz nadledvičen žleze).

Hormone izločajo tudi žuželke (ekdisoni), rastline (auksini, citokinini, giberilinska in

abcisinska kislina). MO ne izločajo hormonov, pač pa rastne faktorje.

4.6 VITAMINI

So male organske molekule, ki jih organizmi potrebujejo v zelo majhnih količinah, a brez njih

ne morejo živeti. MO in rastline izdelujejo vitamine, ki za njih to niso. Vitamine delimo na

vodotopne in lipidotopne. Vodotopni vitamini: niacin, tiamin, riboflavin, lipoična kislina,

CoA, biotin, folijska kislina, vitamin B12 in vitamin C. Lipidotopni vitamini: D, E, K, A .

Glej tudi lipide s posebnimi funkcijami.

5 BIOLOŠKE MAKROMOLEKULE

Med njih prištevamo polisaharide, nukleinske kisline in beljakovine. Sestavljene so iz

velikega števila gradnikov. Biološke makromolekule so v celicah rezerva E, strukturne in

informacijske molekule ali pa zelo pomembne funkcionalne molekule.

5.1. POLISAHARIDI

So polimeri velikega števila monosaharidnih enot z molekulsko maso milijon in več.

Polisaharidi (glikani) so lahko iz identičnih enot (homoglikani) ali iz različnih enot

(heteroglikani). Po funkciji ločimo rezervne polisaharide (α-1- >x vez) in strukturne

polisaharide (β-1- >x vez). Glikogen in škrob sta razvejana (α-1- > 6 vez) homoglikana (iz

glukoznih enot), glikogen bolj kot škrob. Razvejanost omogoča hitrejše sproščanje

12

monosaharidnih enot. Princip cepljenja-fosforoliza na nereducirajočem koncu. Bakterije

poleg glikogena skladiščijo tudi polihidroksi butirat (ni sladkor), dekstran (α-1- > 6 vez v

verigi), mutan (α – 1- > 3 vez v verigi). Celuloza je vlaknasti glukozni polimer z β – 1 - > 4

vezjo v verigi in vodikovimi vezmi med verigami. Hitin je oporno tkivo živali (členarjev), je

kemični homoglikan iz N-acetil-glukozamina, njegova 3D struktura je podobna celulozni.

Vretenčarji ne morejo razgrajevati glikozidne vezi v strukturnih polisaharidih, ker nimajo

encima celulaze; take encime imajo MO in nevretenčarji. Nekateri MO živijo v simbiozi z

višjimi živalmi, ki se zato hranijo s celulozo (prežvekovalci, temiti). Heteroglikani:

glukozaminoglikani hialuronska kislina, hondoitin sulfat, keratan sulfat. Glukozaminoglikani

so sestavine ekstracelularnega matriksa z veliko viskoznostjo (mazivo v sklepih).

Heteroglikan iz N-acetil-glukozamina in N-acetil-muraminske kisline je sestavina

bakterijske celične stene.

5.2 NUKLEINSKE KISLINE

So polimeri nukleotidov, in sicer 2h tipov: dezoksiribonukleinska kislina in 3 vrste

ribonukleinskih kislin: ribosomalna, informacijska in prenašalna. Dva nukleotida med seboj

povezuje fosfodiesterska vez. Podaljševanje verige poteka na 3` koncu. Pri tem se

hidrolizirata 2 fosfatni vezi, saj se prihajajoči nukleozid trifosfat pirofosfatazno razcepi

(anhidridna vez se pretrga) in hkrati esterificira (nastane energijsko nižja estrska vez). DNA

molekule so temeljne informacijske molekule v živem svetu, ki iz roda v rod ohranjajo

identičnost vrst. DNA je dvojna, komplementarna in antiparalelna desna vijačnica, pri kateri

so baze v notranjosti, sladkorji in fosfati pa na površini. 3D strukturo molekule DNA

omogočajo vodikove vezi med ustreznimi pari baz sosednjih verig, hidrofobne interakcije

med sosednjimi bazami iste verige in površinski elktrostatski odboji disociiranih fosfatnih

skupin. Ve, da je zato DNA molekula rigidna, v raztopini zelo viskozna molekula. Pri

vzdrževanju nativne konformacije DNA molekule sodelujejo tudi molekule vode, dehidracija

povzroči drugačno konformacijo (B,A,Z). Komplementarni sta vedno purinska baza v eni

verigi in pirimidinska baza v sosednji verigi, to je sterično pa tudi strukturno pogojeno.

Komplementarni so vedno A-T in G-C. Zaporedje nukleotidov v eni verigi je lahko poljubno,

a je po principu komplementarnosti potem zaporedje v nasprotni verigi avtomatično določeno.

Zaradi načela komplementarnosti DNA se molekule podvojujejo semi-konzervativno. To

pomeni, da se dvojna vijačnica razpre in ob vsaki verigi se zgradi nova. Vsaka hčerinska

celica ima zato polovico molekule od starševske, druga polovica pa je nova. Molekule DNA

lahko tvorijo tudi drugačne, manj stabilne, 3D strukture, pri katerih sodelujejo spremenjene

baze, nenavadne baze ali pa se nenavadno parijo. DNA molekule v celicah se kompaktno

pakirajo s pomočjo različnih beljakovin. (Glej supemolekulske strukture). Tališče molekule

DNA je T pri kateri se absorbnost njene raztopine pri 260nm poviša na polovico max

(hiperkromni efekt). Odvisna je od G-C parov. RNA so enoverižne molekule, ki se prostorsko

zvijajo v najstabilnejše konformacije. Pri tem lahko sodelujejo beljakovine ali pa tudi ne.

rRNA molekule sestavljajo ogrodje ribosomov in sicer večino njihove mase (60%). NA to

ogrodje se vežejo beljakovinske molekule, enojna verižna rRNA pa tvori predele dvojne

vijačnice, ločene z zankami. mRNA je enoverižni prepis DNA, ki nosi direkten zapis za

zaporedje AK v beljakovinski molekuli. Prepisovalna stopnja je zato, da je molekula DNA

čim krajši čas izpostavljena. mRNA molekule so v celicah zaščitene z beljakovinami ali pa

vezane v ribosomih (polisomih). Nezaščitene pa se hitro razgrajujejo. tRNA ima 3D strukturo

v obliki črke L in zato več zank, s katerimi tvori interakcije, ki ji omogočajo opravljanje

izredno pomembne prevajalne funkcije. V zankah molekul tRNA so atipične baze

(dihidrouridin, pseudouridin) zato, da na teh ,mestih ne pride do parjenja. Vloga zank: zgornji

del ACC- gor se veže AK, antikodonski pecelj/zanka komplementarna mRNA kodonu, D

13

zanka-aminoacil RNA sintetaza jo prepozna, L zanka-pripne se na ribosom. AK se veže v

aktivirani obliki (ak-AMP) na 3` OH konec specifične tRNA. tRNA je adapterska molekula,

ki prinaša na ribosom ustrezno AK ob pravem času. Prevajanje pomeni odraz zaporedja

nukleotidov v zaporedje AK v beljakovini. tRNa molekule z lastnim zaporedjem 3h

nukleotidov spoznavajo zaporedje 3h nukleotidov na mRNA molekuli in to s pomočjo okolja

v ribosomu. Princip prepoznavanja tripleta baz imenujemo genetski kod, ki je univerzalen za

živi svet. Obstaja 61 različnih tRNA molekul z različnimi tripleti za 20 različnih AK. To

izvira iz števila kombinacij, ki so možne z menjavanjem 4 različnih nukleotidov v kodonu 3h

zaporednih (64). Za preostale 3 kodone ni tRNA molekul; to so STOP kodoni. Večje število

kodonov kot AK pomeni degeneracijo. Le ta se kaže v pomenu posameznih nikleotidov v

tripletu, ki pada od prvega do tretjega. Poleg specifične tRNA obstajajo specifični encimi, ki

katalizirajo povezavo določene AK na določeno tRNA. Polimerizacija AK poteka na

ribosomu, med prosto AK skupino prihajajoče AK s prenosom obstoječe polipeptidne verige

iz estrske vezi na 3` mestu prvega adenozina. Na ribosomu so hkrati vezane 3 tRNA

molekule: tista, ki nosi novo AK, druga z obstoječo polipeptidno verigo in odhajajoča brez

vsega. Ribosom ima GTPazno aktivnost, ki mu omogoča spremembo konformacije za pomik

po mRNA.

5.3 BELJAKOVINE

5.3.1 Splošne lastnosti

Beljakovine so najpomembnejše funkcijske molekule. Razvrstitev po biološki vlogi:

- ENCIMI (proteinski katalizatorji za procese v celici):

- znotrajcelični: DNA polimeraza, glikogenska fosforilaza, alkoh. dehidrogenaza

- zunajcelični (po sintezi v celici gredo ven): amilaza

- TRANSPORTNI PROTEINI (v krvi vežejo molekule ali ione in jih prenašajo po telesu):

- plazemski: hemoglobin

- membranski (omogočajo prehod snovi skozi membrano)

- intracelularni (prenašajo molekule v celici od organela do organela)

- HRANILNI ali SKLADIŠČNI PROTEINI (celica jih kopiči in nato lahko izrablja):

ovalbumin, azin, foritin

- KONTRAKTILNI, MUTILNI PROTEINI (omogočajo spremembo oblike celice (krčenje) in

gibanje po okolic): aktin, miozin, mikrotubuli

- STRUKTURNI PROTEINI: kolagen (hrustanec), elastin, keratin (več vrst; nohti, lasje,...),

ß-fibrin (svila)

- OBRAMBNI PROTEINI: imunoglobulini oz. protitelesa (ustvarjajo jih limfociti),

fibrinogen, trombin (strjevanje krvi), strupi

- REGULATORNI PROTEINI

- hormoni: inzulin, rastni hormon

- G-proteini (prenos signala)

- DNA-vezavni proteini

Beljakovine so polimeri z več kot 50 AK. Peptidi imajo praviloma manj kot 50 AK ostankov

in v raztopini nimajo stalne 3D strukture. Beljakovine so iz ene ali več polipeptidnih verig,

molekulska masa je lahko od 5000 preko milijon. Iz znanega št. AK lahko ocenimo

molekulsko maso in obratno. Povprečna molekulska masa AK, ki nastopajo v beljakovinah

je 128 in ne 138, ker nekatere (velike) AK nastopajo bolj po redko. Pri oceni molekulske

mase beljakovin je potrebno odšteti molekulsko maso vode, torej molekulska masa

beljakovine je 110x število ostankov. AK ostanki so zato, ker je pri polimerizaciji izstopila

voda. Nekatere beljakovine za delovanje potrebujejo eno ali več malih organskih skupin, ki

jim pravimo prostetične skupine.

14

Za preučevanje beljakovin je te potrebno najprej očistiti. Po homogenizaiji tkiva dobimo

izvleček, ki ga najprej centrifugiramo, nato precipitiramo in končno kromatografiramo.

Beljakovine lahko ločujemo po topnosti, velikosti in naboju. Ločitvene metode:

centrifugiranje, kromatografija, elektroforeza. Molekulsko maso beljakovine lahko ocenimo

s pomočjo ultracentrifugiranja, SDS elektroforeze ali po določitvi celotnega amino

kislinskega zaporedja.

Specifično rekacijo antige-protitelo uporabljajmo za lokalizacijo in kvantifikacijo beljakovin

(konfokalna mikroskopija, kolokalizacija). Tuje molekule v imunsko odzivnih organizmih

sprožijo odziv, to je nastanek specifičnih protiteles. Epitop je področje na površini tuje

molekule, ki je komplementarno površini protitelesa, na eni beljakoviniski molekuli je lahko

več epitopov. Proti vsakemu epitopu se naredi posebna vrsta protiteles, ki jim pravimo

monoklonska protitelesa; zmes hkrati nastalih protiteles proti več epitopom imenujemo

polikolnska protitelesa. Na protitelesa lahko vežemo označevalce (markerje) ali pa jih

vežemo na kromatografske kolone.

5.3.2 Struktura beljakovin

Beljakovine se med seboj razlikujejo po številu in zaporedju aminokislinskih ostankov.

Specifično aminokislinsko zaporedje v vodnem mediju se zvije v enolično 3D strukturo, ki

določa vlogo in funkcijo vsake posamezne beljakovine. Funkcije beljakovine se preučuje pri

osebkih, ki imajo okvarjene ali polimorfne beljakovine. Beljakovine s podobnim zaporedjem

v splošnem opravljajo iste funkcije, tiste z zelo različnim pa navadno ne. Obstajajo izjeme-

alkoholna DH. Polimorfizem je posledica spremenjenega zaporedja AK v populaciji, ki pa ne

privede do bolezni; 20-30% beljakovin pri ljudeh je polimorfnih. Zaporedje v funkcijsko

pomembnih predelih je precej ohranjeno, drugje je bolj variabilno. Napovedovanje funkcije

iz aminokislinskega zaporedja je zelo težko, a dostikrat možno. Seveda je vmesna stopnja

napovedovanje 3D strukture, katere poznavanje bistveno olajša napovedovanje funkcije.

4 stopnje beljakovinske strukture: primarna struktura= AK zaporedje in položaj

disulfidnih vezi; sekundarna struktura= lokalna prostorska ureditev AK v polipeptidni verigi,

ki jo predvsem vzdržujejo H vezi med atomi peptidnih vezi; terciarna struktura= prostorska

ureditev elementov sekundarne strukture, ki jo predvsem vzdržujejo interakcije med

stranskimi verigami AK; kvartarna struktura= prostorska ureditev beljakovinskih podenot

(samo nekatere beljakovine imajo to).

5.3.3 Primarna struktura beljakovin

Predstavlja jo kovalentna zgradba, t.j. zaporedje aminokislin povezanih s peptidno vezjo in

položaj disulfidnih mostičev. Amidna vez v beljakovinah je peptidna vez, ki ima značaj

dvojne vezi, v kateri so 4 atomi (C,O,N,H) koplanarni. Kovalentna peptidna vez se

nespecifično cepi z močno kislo raztopino, redkeje močno alkalno; specifično pa s cianogen-

bromidom (ob metioninu) ali encimsko (tripsin, papain…). Torzijski kot iz atomov v

peptidni vezi (omega kot) je praktično 180°; to pomeni da je vez trans. Peptidna vez je zelo

redko tudi cis, nap. pri prolinu. Kota fi in psi sta kota med C-alfa in C ter N in C-alfa, v

okviru sterične prostosti sta poljubna (Ramachandranov diagram). AK zaporedje pri

beljakovinah se določa v 3h stopnjah: določitev AK sestave, označitev in določitev n-

terminalnega ostanka in določitev celotnega zaporedja z Edmanovo degradacijo. Postopek

Edmanove degradacije temelji na označitvi n-terminalne AK s fenil-isotiocianatom, ki

istočasno povzroči destabilizacijo pripadajoče peptidne vezi, ki se zato cepi že v blago kislem

mediju. ED je mogoče izvajati z avtomatskim sekvenatorjem, a le na fragmentih do 50 oz.

največ do 200 AK ostankov. Peptidno verigo je treba pred sekveniranjem razrezati na manjše

polipeptide s kemičnimi ali encimskimi metodami. Določa se zaporedje fragmentov, s

prekrivanjem razrešujemo pravilno zaporedje fragmentov. Po encimskem ali neencimskem

15

cepljenju elektroforetsko ločimo fragmente in tako dobimo prstni odtis (nap. triptinski

fingerprint). S pomočjo različnih fingerprintov elektroforetsko pod reducirajočimi in

nereducirajočimi razmerami razrešujemo položaj disulfidnih mostičkov. Danes se zaporedje

AK določa predvsem iz zaporedja nukleotidov v genu ali z izolacijo in določitvijo mRNA. V

genu so lahko tudi introni, zrela beljakovina je drugačna od prekurzorja, nekaterih inf. Ni v

nukleinskih kislinah (S-S mostiči). AK zaporedje nakazuje 3D strukturo, funkcijo, celično

lokalizacijo in evolucijo in sicer s primerjanjem znanih zaporedij. Med beljakovinami, ki

imajo vsaj 25 do 30% identičnih AK lahko pričakujemo strukturno in funkcijsko povezavo.

To so homologne beljakovine. Podobnost lahko zajema celotno zaporedje ali pa le določene

predele, ki jim pravimo domene. Domene so za funkcijo pomembni predeli, ki so lahko enaki

tudi pri zelo različnih beljakovinah (signalni, akceptorji prostetičnih skupin).

5.3.4 Sekundarna struktura beljakovin

Osnovni 4 tipi sekundarne strukture: α-heliks, β-struktura (nagubani list), β-obrat (zavoj) in

neurejena struktura. Na osnovi sekundarne strukture beljakovine delimo v fibrilarne,

sestavljene iz ene same vrste in globularne iz različnih vrst. α-heliks je posledica nastanka H

vezi med atomi iz peptidnih vezi 1. in 4. AK v zaporedju. V alfa heliksu se skelet polipeptidne

verige vijačasto zvije okrog vzdolžne osi, radikali pa štrlijo navzven. Vse AK v α-heliksu

morajo imeti isto absolutno konfiguracijo (L- ali D-). 5 faktorjev, ki vplivajo na nastanek

helične strukture: radikala ne smeta imeti enakega naboja, pomembna je velikost molekule (če

so velike se ne bodo zvijale), če je veliko + ali – nabojev skupaj se odbijajo, AK R veliko

stransko verigo se tudi motijo., ujemanje z naravnim dipolom heliksa. β-struktura paralelnih

in antiparalelnih cik-cak polipeptidnih verig, ki so med seboj povezane z vodikovimi vezmi,

je prav tako med atomi, ki tvorijo peptidne vezi. Antiparalelne beta strukture so stabilnejše,

ker so vodikove vezi ravne in zato močnejše. Več vzporednih beta struktur tvori naguban list,

več nagubanih listov pa se lahko naloži v plast, drug na drugega. β-obrat največkrat nastopa

na koncu beta strukture, ko se polipeptidna veriga v globularnih beljakovinah obrne za 180°.

Sestvljajo ga 4 AK, kjer nastanejo vodikove vezi med 1. in 4. , 2. in 3. pa sta na površini. V

beta obratu pogosto najdemo prolin in to celo v cis konfiguraciji, pa tudi glicin, ki je majhen.

Obstajajo predeli verige, v globularnih beljakovinah, ki so identični pri vseh molekulah iste

vrste, a jih ne moremo uvrstiti v prejšnje 3; pravimo jim neurejena struktura. Α-heliks in β-

struktura sta izredno obstojni zaradi minimalnih steričnih odbojev in najugodnejših položajev

vodikovih vezi. Ramachandranov diagram kaže vrednosti fi in psi kotov AK ostankov v

beljakovinski molekuli; ve, da se 90% kotov nahaja v dveh področjih.

5.3.5 Fibrilarne beljakovine

Keratin, kolagen, fibroin, elastin. Gradnik keratina je dimer desnih alfa heliksov (Cys-Cys),

ki sta levosučno navita drug okrog drugega (coiled coil), je sestavina las, peres, nohtov,

krempljev, rogov, želvjih oklepov, kože. Tropokolagen je iz 3h levih heličnih vijačnic, ki so

ovite v desni smeri; vsebujejo Gly-X-Pro motiv, vmes do hidroksilirane AK in sestavljajo

kite, hrustančevino, želatino. Elastinski heliks je iz dolgih verig Gly, ki jih ločujejo kratki

odseki Lys-Ala; predeli, kjer je Lys se kovalentno modificirajo v lysinornorleucin in

desmosin, ki se na teh mestih elastično razteguje in krči. Svila je iz fibroina, ki je sestavljen iz

plasti nagubanih listov, v katerih si sledijo Gly in Ala ostanki; plasti se pravilno zložijo in

dajejo svili mehko konsistenco.

5.3.6 Terciarna struktura beljakovin

Terciarna oz 3D struktura beljakovin je prostorska razporeditev vseh atomov v beljakovini

oz. elementov sekundarne strukture v globularnih beljakovinah. 3D struktura se razrešuje s

pomočjo NMR spektroskopije ali s kristalografijo z Roentgenskimi žarki. Globularne

16

beljakovine so sestavljene iz različnih vrst sekundarne strukture. Za 3D strukturo so izredno

pomembni Cys-Cys mostiči, predvsem pri majhnih molekulah (strupi). Vse vrste šibkih

interakcij, predvsem med AK radikali, sodelujejo pri nastanku in vzdrževanju terciarne

strukture. Zunanje šibke interakcije so tiste med atomi v beljakovini in vodo, notranje pa

tiste, ki so le med atomi v beljakovini. Večja svoboda gibanja molekul vode vpliva na

prednostno nastajanje notranjih šibkih interakcij in s tem prispeva k stabilnosti nativne

beljakovinske molekule. AK ostanki v globularni beljakovini se pakirajo z veliko gostoto,

zato je v notranjosti le malo ujetih vodnih molekul. Predeli v notranjosti beljakovine, ki niso

komplementarno povezani močno destabilizirajo molekulo, ne glede na vrsto šibkih

interakcij. Samosestavljanje višjih beljakovinskih struktur imenujemo beljakovinsko zvijanje

(protein folding). 2 ključna principa, ki vodita v zvijanje: maksimilizacija notranjih

vodikovih vezi in zakopavanje hidrofobnih predelov v notranjost. Zvijanje poteka preko

vmesnih stopenj, ki zajemajo lokalno nastajanje področji sekundarnih struktur. Proces

zvijanja poteka hierarhično na 2 načina : sekundarne strukture med seboj interagirajo ali pa

pride najprej do hidrofobnega kolapsa. Oba načina se prepletata, pri različnih beljakovinah

prevladuje eden ali drugi, odvisno od primarne strukture. Osnovni vzorci, okoli katerih se

dokonča zvijanje nativne beljakovine: sodček, sedlasta beta struktura, beta-alfa-beta zanka,

povesmo 4ih heliksov, sendvič iz beta struktur. Pri zvijanju dostikrat pomagajo posebne

beljakovine, ki preprečujejo nastajanje nezaželjenih interakcij in imajo včasih tudi ATPazno

aktivnost; polipeptide chain biding proteins, heat shock proteins, beljakovine za pospeševanje

nastajanja disulfidnih mostičev, beljakovine za izomerizacijo prolinov iz cis v trans. Za

pravilno beljakovinsko zvijanje so nekatere AK pomembnejše(invariantne) kot druge

(variabilne).Glej homologne beljakovine.

Mioglobin: - relativno majhen O2 vezavni protein (M = 16700g/mol)

- vsebuje polipeptidno verigo iz 153 AK (na položaju 93 je proksimalen His),

ki veže Hem skupino (monomer). Hidrofobne AK so v notranjosti, hidrofilne pa na površina

in omogočajo topnost v vodi

- terciarno strukturo vzdržujejo hidrofobne interakcije

- nahaja se v mišičnih celicah, ki hranijo in prenašajo kisik za

mitohondrijske procese (vodni sesalci ga imajo veliko, zato lahko zdržijo

pod vodo dolgo časa).

Nativna konformacija je termodinamsko najstabilnejša konformacija beljakovine v

fizioloških pogojih. Med biološkim delovanjem mnogih beljakovin pride do manjših

konformacijskih sprememb, predvsem pod vplivom različnih ligandov (oksi-dezoksi-

homoglobin, prehodno stanje encima).

5.3.7 Denaturacija beljakovin

Denaturacija je proces, pri katerem pride do porušenja vseh višjih struktur, razen primarne,

denaturirana beljakovina zavzame popolnoma naključno strukturo. Dentaurirana beljakovina

izgubi biološko funkcijo. Denaturacija je večstopenjski proces. Poteka lahko preko

reverzibilnih stopenj in se konča ireverzibilno. Lahko pa je tudi reverzibilna, odvisno od AK

sestave. Pomembni denaturacijski agensi so: temperatura, pH, organska topila (alkohol,

aceton), nekateri topljenci (urea) in detergenti.

5.3.8 Lastnosti beljakovin v raztopini

Izoionska točka= pH, pri katerem ni preveč naboja, pH, ki ga ta beljakovina vsili raztopini;

Izoelektrična točka= pH, pri katerem beljakovina ne potuje v el. polju, ker je nenabita.

Razlika (z AK): beljakovine nenabite ne potujejo v vodi, potrebni so številni organski pufri, ki

dodajo ione, ti vplivajo na disociacijo beljakovin in te pKa-je si lahko malo spremenijo v

drugi raztopini. Napoved obeh točk: prešteješ disociabilne AK v beljakovini, ene v eni obliki,

17

druge v drugi, prešteješ naboje in oceniš disociacijskokonstanto te točke. Večina belj. to izoel.

točko pod 7 (nabite v celici). Beljakovine se nahajajo in preočujejo v pufrih, kjer ima vsaka

svojo karekteristično izoelektrično točko (IT). IT beljakovin so pretežno v kislem območju,

redkeje v bazičnem (histoni). Beljakovine z nasprotnimi IT se privlačijo, agregirajo in so tako

obstojnejše (insulin-protamin). Zaradi električne nevtralnosti se beljakovinske molekule pri

IT oborijo-precipitirajo; so slabo topne. Precipitacija se uporablja za ločevanje beljakovin:

najprej spremenimo ionsko moč, nato pa se približujemo IT in s tem izločimo željeno

beljakovino. Raztopina beljakovin deluje pufrsko, optimalno pri pH-ju, ki je blizu pK

najpogostejše disociabilne skupine (pri fiziološkem pH je to histidin, če je pristoen-

hemoglobin). Raztopina beljakovin povzroča osmotski pristisk. Isoosmoznost=raztopini

imata enak osmotski tlak; Hipo in hiperosmoznost hipo= nižja konc., hiper = višja

koncentracija. (koligativne lastnosti)

5.3.9 Kvartarna struktura beljakovin

Nekatere beljakovine so iz več ločenih polipeptidnih verig, podenot, ki so lahko identične ali

pa različne, so oligomerne. Razporeditev podenot, protomerov, v 3D kompleksu v oligomeru

predstvlja kvartarno strukturo. Pretežno šibke interakcije stabilizirajo oligomerno sestavo

beljakovin, redkeje pa tudi kovalentne, predvsem disulfidni mostiči. Namen oligomerizacije

je lahko zelo različen: uravnavanje (proteinske kinaze), učinkovito medsebvojno delovanje v

fizični bližini (maščobno sintezni kompleks), le strukturna vloga (aktin). Oligomerna sestava

beljakovine največkrat prideve do zelo velikih sprememb v biološki akitvnosti beljakovin

(glej o alosteriji). Za preučevanje kvartarne strukture se uporabljata NMR spektroskopija

in kristalografija z Roentgenskimi žarki, tudi elektronska mikroskopija.

Hemoglobin: - oligomerni O2 vezavni protein (M = 64500g/mol)

- vsebuje 4 polipeptidne verige in 4 Hem prostetične skupine

- proteinski del (globin) je sestavljen iz dveh α-verig (141 AK-ostankov

vsaka) in dveh ß-verig (146 AK-ostankov vsaka)

- molekula Hgb je sferična (diameter 5,5nm)

- vsak Hem je pripet na en polipeptid

5.4 SUPERMOLEKULSKE STRUKTURE

Zvite polipeptidne verige se lahko povežejo z ostalimi nebeljakovinskimi makromolekulami

in tvorijo biološke strukture, ki še niso celice, niti organeli.

5.4.1 Biološke membrane

Sestava: lipidni dvosloj (fosfolipidi in sfingolipidi), integralne-periferne beljakovine (40-

75%), glikolipidi, glikoproteini. FI-KE lastnosti membran: lateralna difuzija molekul, flip-

flop, hidrofobnost-hidrofilnost beljakovin (transmembranski heliksi, porblem izolačcije z

detergenti), male hidrofobne organske molekule (ubikinon in plastikinon).

(s) Funkcija membranskih beljakovin: prenašalci (prenos snovi preko membrane-kanali,

prenašalne beljakovine…), encimi, promotorji reorganizacije membran (prenašalne belj.?) pri

endo-,ekso- in pinocitozi (tekoči delci). Asimetričnost (oglj,h. in beljakovine pripete na lipide)

in tekoči značaj.

5.4.2 Lipoproteini

So prenašalci netopnih maščob po telesnih tekočinah do celic. Sestavljeni so iz

beljakovinskega, apoproteinskega dela (2-40%) in različnih vrst maščob, ambifilnih na

površini (fosfolipidi, holesterolni estri) in hidrofobnih v notranjosti (holesterol,

triacilgliceroli). Lipoproteine ločujemo po vsebnosti beljakovinskega in maščobnega dela v

HDL, LDL, VLDL in hilomikrone. Tisti, ki vsebujejo več beljakovin imajo večjo gostoto

18

(HDL). Beljakovinski del lipoproteina je pomemben za vezavo na zunanjecelične receptorje,

po vezavi na receptor se iz lipoproteina odcepljajo (odstranjujejo) različni lipidi, odvisno od

prisotnosti encimov, tj. trenutnih potreb celice.

5.4.3 Celične stene

Večina celic ima na zunanji strani membrane trdne ovojnice, celične stene. Bakterije in

modrozelene alge imajo 2 vrsti celičnih sten, glede barvanja jih razdelimo na po G+ in po G-

Sestava stene po G+ bakterij je dvoplastna: znotraj je peptidoglikan murein, zunaj pa

teihojska kislina. Teihojska kislina je iz poli-fosfo-glicerola ali poli-fosfo-ribitola; na proste

hidroksilne skupine so vezani različni sladkorji ali AK, ki reagirajo z Gramovim barvilom.

Murein je zamrežena polisaharidna struktura in NAcGlc in NAcMur, ki se s tetra- in

pentapeptidi prečno povezuje. Pentapeptidi v mureinu vsebujejo D-aminokisline, ki

preprečujejo peptidazam razgrajevanje celične stene. Penicilin inhibira encime, ki sodelujejo

pri zamreženju mureina pri G+ bakterijah (streptokoki). Stena G- bakterij je najmanj 2x

debelejša (10-15nm) od stene G+ bakterij, sestavljena je iz najmanj 5ih plasti: proteinska,

mureinska (5-15%),proteinska, lipopolisaharidna (do50%), lipoproteinska. Ni teihojske

kisline. Okoli celične stene je še sluznata lipopolisaharidna kapsula, ki dodatno ščiti celico,

hkrati pa vsebuje mnoge antigene.

Celična stena rastlin je iz trdnega, pravilno organiziranega polisaharidnega materiala,

prepojenega z različnimi solmi (Ca-karbonat, Ca-okslat-cipresa); okoli je še pluta in vosek

(palme).

Pri živalskih celicah je ekstracelularni matriks (medceličnina) v kateri je skoraj vedno

kolagen.

Celična stena je na posameznih mestih pritrjena skozi membrano na citoskelet.

5.4.4 Kromosomi

DNA molekule so zelo dolge in se morajo zato v jedru kompaktno zviti, pri tem pa ne

poškodovati. Organizacija evkariontskega kromosoma se najbolje vidi v metafazi. Kisla

DNA je povezana z bazičnimi beljakovinami, histoni, ki jih je 5 vrst ( H1, H2A, H2B, H3 in

H4) in nastopajo v parih. Histoni so evolucijsko zelo ohranjene beljakovine. 8 molekul tvori

osnovo, okoli katere se 1,8x navije dvojna vijačnica, se pri tem nekoliko zrahlja (področje A-

T parov) in se pri tem cca 7x gosteje zoži. To so nukleosomi. Nukleosomi se organizirajo v

30 mikronska vlakna in sicer s pomočjo histona H1, tako, da se kompaktnost zlaganja poveča

še za 100x. Ta vlakna se zvijejo v zanke, 6 zank se navije okoli nuklearnega ogrodja v rozete.

Med beljakovinami v ogrodju sta histon H1 in topoizomeraza 2, ki zmanjša ovitost dvojne

vijačnice. Tudi rozete se nalagajo, tako da se kompaktnost še poveča. Bakterijski kromosom

se nahaja v področju nukleoida, skupaj z vrsto histonom podobnih beljakovin, ki tvorijo

ogrodje, a mnogo bolj dinamično kot pri evkariontih (zaradi hitre delitve). Bakterijski

kromosom se na več mestih pripenja na notranji sloj celične membrane.

5.4.5 Ribosomi

Ribosomi so mehanično kemični stroji, ki zagotavljajo vernost prevajanja (translacije)

mRNA v beljakovine. Sestavljeni so iz rRNA, ki tvori ogrodje in večjega števila

ribosomalnih beljakovin (65:35);mali (bakterijski, mitohondrijski, plastidni) 70S in veliki

(evkariontski) 80S, oboji so iz male in velike podenote. V razrešeni 3D strukturi se vidi

natančen položaj vezane mRNA in do 3 tRNA molekul. Le na ribosomu se lahko tRNA

ustrezno poveže z mRNA, in to le z enim od 3h možnih okvirjev (frame) branja. Na novo

prevedeno AK se prenese obstoječa polipeptidna veriga, pri čemer se sprosti prazna tRNA:

Energijske zahteve sinteze na ribosomih: 2x ATP za aktivacijo AK pri vezavi na tRNA s

19

pomočjo specifične amino-acil tRNA sintetaze in hidroliza 1x GTP za konformacijsko

spremembo ribosoma, potrebno za premik mRNA (plezanje).

5.4.6 Virusi

So znotrajcelični paraziti, ki niso sposobni samostojnega razmnoževanja. Podobno kot

ribosomi so iz nukleinske kisline in globularnega beljakovinskega plašča (kapsida).

Nukleinska kislina v virusih je lahko DNA ali RNA. V zapisu RNA virusov je gen za

reverzno transkriptazo, enicm, ki prepisuje RNA v DNA. Ta encim se uporablja pri

genetskem manipuliranju. Celotna virusna struktura je podrejena zaščiti nukleinske kisline

(informacije), njenemu vstopu v gostiteljsko celico in podreditvi biosinteznega stroja za lastno

reprodukcijo in izražanje. Virusne sestavine- bakteriofag T4 in tobakov mozaik. (s) Kapsida,

beljakovinski repek, znotraj kapside nukleinska kislina, na koncu repka kaveljčki za pripetje

na celico. Virusna DNA se vključi v genom celice in se nato replicira skupaj s celičnim

dednim materialom. Virusna RNA se najprej prepiše v DNA (reverzna transkriptaza), ki se

nato vključi v genom gostiteljice. Sedaj se prepisuje v mRNA-je, ki kodirajo virusne

beljakovine in v celoti kot rRNA. Oboje se sestavi v nove viruse. Pomembni so RNA virusi-

onkovirusi, ki povzročajo rakavost.

6 ENCIMI

So katalizatorji kemičnih reakcij v bioloških sistemih. Katalizatorji pospešujejo reakcije,

lahko v njih sodelujejo, se spremenijo, a izstopajo nespremenjeni, se ne porabljajo in delujejo

v zelo majhnih količinah.

Fiziološke koncentracije encimov so najmanj tisočkrat, ponavadi pa celo več kot milijonkrat

nižje od koncentracij spojin, ki se z njihovo pomočjo pretvarjajo. Delovanje encimov

opazujemo tako, da zasledujemo njihovo aktivnost, to je sposobnost pretvarjanja kemičnih

spojin. Substrat je snov, ki se na encimu pretvarja v produkt; modulatorji pa so substance,

ki spremenijo encimsko aktivnost.

Površina na encimu, kjer poteka reakcija, je aktivno mesto, v primerjavi s celim encimom je

to navadno majhno področje, mnogokrat zakopano v notranjosti. Za katalitsko delovanje pa

je odgovoren aktivni center, ki je formiran na določenih delih peptidne verige (aktivna

površina, aktivni center, aktivno mesto, aktivni lijak, aktivni žleb.) Narava delovanja

omogoča encimom daleč najboljšo katalitsko sposobnost med katalizatorji.

Tri edinstvene lastnosti encimov:

-so izredno specifični za svoje substrate

-specifični za tip reakcij

-delujejo v zelo milih pogojih temperature in pH

Praktično vse reakcije v živem svetu potekajo v prisotnosti ustreznih encimov.

Sodelujejo v organiziranih zaporedjih, kjer se pospešuje množica reakcij. Taka zaporedja

imenujemo metabolične poti. Nekateri izmed encimov so sposobni odgovorit na različne

metabolične signale tako, da spremenijo svojo katalitsko sposobnost. Metabolične poti so s

pomočjo regulacijskih encimov izvirno natančno koordinirane, kar daje celicam po delovanju

nujno harmonijo, da se vzdržujejo v stanju življenja, da rastejo in se razmnožujejo.

Praktični pomen encimov:

-genetske bolezni (bolezni kopičenja)

-bolezni pri diagnostiki (jetrne, sečne bolezni)

-biotehnologija (spremenjena hrana)

-v vsakdanjem življenju (biopralni praški)

20

Louis Pasteur je okoli leta 1850 ugotovil, da poteka pretvorba sladkorja v alkohol pri

kvasovkah zaradi prisotnosti fermentov.

Eduard Buchner je leta 1897 dodal, da so tudi neživi izvlečki kvasovk sposobni fermentirati.

James Sumner je leta 1926 izoliral in kristaliziral ureazo (prvi kristalizirani encim), encim, ki

razgrajuje sečnino in s tem dokazal beljakovinski značaj.

J.S.B. Haldane je leta 1930 izdal knjigo Encimi, ki je podala bistvo razumevanja katalitskih

procesov v prisotnosti encimov.

Encimi so beljakovine, a tudi RNA molekule lahko imajo katalitske sposobnosti=ribocimi.

Zaradi beljakovinske sestave je aktivnost encimov neposredno odvisna od njihove nativne

konformacije; z denaturacijo ali pa razgradnjo na AK se vedno izgubi. Molska masa

encimov je od približno 12 000 do preko milijon, funkcionalni encimi so lahko mono- ali pa

oligomeri. Nekateri encimi ta delovanje uporabljajo le funkcionalne skupine v

aminokislinskih radikalih, ki jih sestavljajo, nekateri pa potrebujejo še dodatne kemične

skupine, ki jim pravimo kar kofaktorji. Kofaktorji so lahko anorganski ioni (Fe, Mg, Zn,…)

ali pa male organske molekule (molekulska masa okoli 1000). t. je koencimi in prostetične

skupine. Kofaktorji med katalitskim procesom »posodijo« encimom funkcionalno skupino, ki

je encimi-beljakovine nimajo.

Koencimi so organski kofaktorji, ki se selijo iz ene vrste encima, kjer se pretvorijo na drugo

vrsto, kjer se regenerirajo (NADH).

Prostetične skupine so organski kofaktorji, ki se dodajo pri sintezi encima in se sprostijo

šele, ko se encim denaturira in razgradi. Torej se pretvarjajo in regenerirajo na isti molekuli

(hem na citokromih, na hemoglobinu, P450).

Izhodiščne snovi za večino organskih kofaktorjev pri višjih organizmih so vodotopni

vitamini.

6.1 KOFAKTORJI

So vitamini zato, ker so bistveni za življenje, a le v minimalnih količinah. So učinkovine, ki

jih moramo dobiti s hrano, izdelujejo jih bakterije, nekatere rastline in celo višji organizmi (za

njih to niso vitamini). Vodotopni vitamini so iz skupine B in C. Med B vitamine spadajo:

niacin, riboflavin, tiamin, piridoksin, koencim A, lipoična kislina, biotin, cianokobalomin,

folijska kislina, železo-žveplovi centri. Večina vitaminov se mora pred vezavo na apo-encim

ustrezno aktivirati, zato pravimo, da delujejo le v aktivirani obliki. Predhodna aktivacija

poteka z drugimi encimi. Kofaktorske molekule so navadno velike v primerjavi s skupino, ki

sodelujejo v encimski reakciji. Vzrok za to je zahteva po izredno natančni orientaciji skupine

na aktivnem mestu.

Piridinske dehidrogenaze so stereospecifične, glede na prenos vodikovega atoma na obroč.

NAD se uporablja v katabolnih, NADPH pa v anabolnih reakcijah; piridin nukleotid

transhidrogenaza je encim, ki prenese redukcijska ekvivalenta iz NADH na NADP in

obratno. Redukcijski ekvivalenti so delci, ki reducirajo akceptorje; to so: elektroni (hem v

citokromih), hidridni ioni (NAD(P)H, proton in 2 elektrona) in vodikovi atomi (FMN, FAD

(falvin adenin dinukleotid), proton in elektron). Redukcijski ekvivalenti se navadno prenašajo

v parih.

6.2 RAZVRŠČANJE in POIMENOVANJE ENCIMOV

Že dolgo poznani enimi imajo večinoma trivialna imena (tripsin, pepsin..). Leta 1961 je

mednarodna komisija dala pravila za nomenklaturo in razdelitev encimov. Po tej razdelitvi

razlikujemo 6 glavnih razredov (EC), ki encime razvrščajo po reakcijah, ki jih katalizirajo:

oksido-reduktaze, transferaze, hidrolaze, liaze, izomeraze in ligaze.

21

Vsak encim ima svojo številko, ki je iz 4ih delov: razred, podrazred, akceptorska

funkcionalna skupina in akceptorska molekula (EC 2.7.1.1). Sistematično ime encima je iz

naštetih substratov, tipa reakcije in pripone –aza (ATP: glukoza fosfotrasfer-aza, 2.7.1.1).

Zgodovinsko imajo nekateri trivialna imena (glukokinaza), ki so lahko zelo nenavadna, iz njih

tudi ponavadi ne moremo razbrati funkcije (tripsin), lahko pa imajo celo več imen (ptialin ali

maltaza).

6.3 DELOVANJE ENCIMOV

Encimi nudijo ugodno okolje, da lahko določene reakcije sploh potekajo, potek je izredno

pospešen. Reakcije tečejo po termodinamskih zakonih.

Pod biološkimi pogoji je večina celičnih molekul tako stabilnih, da bi brez učinkovite katalize

vse ostalo nespremenjeno. Encim nudi specifično zelo ugodno okolje, v katerem je potek

reakcij izredno pospešen. Kljub velikosti encimske molekule, reakcija poteka le v majhnem

področju. Mehanizem encimske reakcije je zelo zapleten, kompleksen in mnogostopenjski,

v principu pa lahko delovanje strnemo v dveh stopnjah.

V prvi stopnji poteče prepoznavanje substrata, ki se veže na encim zelo specifično, saj se

substratu zelo podobne molekule vežejo na encim mnogo slabše.

V drugi stopnji se substrat pretvori v produkt. PAZI- substrat se pretvori v produkt tudi brez

encima, encim reakcijo le pospeši! S pospeševanjem reakcije encim ne spremeni

ravnotežnega razmerja med substratom in produktom.

Močno eksergonske (spontano teče od reaktantov do produktov) in endergonske (spontano

teče od produktov do reaktantov) reakcije so lahko hitre ali počasne, to ne vpliva na hitrost, s

katero se bo vzpostavilo ravnotežje.

Energija, ki se imenuje aktivacijska barijera, odloča kako hitro bo v neki reakciji doseženo

ravnotežje. Barijera predstavlja E, ki je potrebna, da se reaktivne skupine med seboj pravilno

orientirajo, pri čemer je potrebno premagati morebitne odbojne sile; temu sledi preurejanje

vezi. Vsaki substratni molekuli se mora med pretvorbo v produkt dvigniti energijsko stanje do

višine barijere; najvišja točka se imenuje prehodno stanje (transition state). To stanje je

najbolj labilno stanje, traja le en vibracijski cikel (0,1 pikosekunde). Verjetnost, da se pretvori

nazaj v substrat ali naprej v produkt je enaka. Bariero imenujemo aktivacijska prosta entalpija

∆G, je obratno in logaritmsko proporcionalna hitrosti. Encim ima sposobnost, da zniža

bariero in to brez spremembe temperature in pritiska; to velja identično za obe smeri reakcije.

6.4 KATALITIČNA MOČ ENCIMOV

Katalitična moč encimov je faktor za katerega encimi pospešijo reakcijo (običajno med 7 in

14 velikostnih redov). Veliko znižanje aktivacijske proste entalpije v prisotnosti encima

nastane zaradi 2h vzrokov.

Specifične reakcije med substratom in funkcionalnimi skupinami vodijo reakcijo po drugi

poti, taki, ki ima nižje aktivacijske energije. E za znižanje barijer se v splošnem dobi iz

nastanka multiplih šibkih interakcij med substratom in encimom, ki specifično stabilizirajo ES

kompleks, to je vezalna energija. Ta je ključni izvor E, ki ga encimi uporabijo za znižanje

barijere.

Hipoteza E. Fischerja (1895): E in S morata biti komplementarna, da se sploh lahko

povežeta primerjava interakcije med E in S s ključem in ključavnico. Kristalografski

podatki so popolnoma potrdili to hipotezo, tako je komplementarnost resnično

najpomembnejši pogoj za specifičnost in destabilizacijo med katalizo. Vezi pri interakciji

substrata in encima so natančno tiste, ki vzdržujejo konformacijo encima: hidrofobne,

vodikove vezi, Van der Waalsove vezi. Popolna prilagoditev substrata in encima zelo ugodno

22

vpliva na pravilno orientacijo, ne more pa razložiti njune destabilizacije, ki privede do

preurejanja vezi.

Haldane, Pauling in Koshland so zato Fischerjevo tezo dopolnilipopolna

komplementarnost med substratom in encimom se doseže le v prehodnem stanju.

Del vezalne E pri interakciji med substratom in encimom se porabi, da se kompleks privede v

prehodno stanje; pri tem se substrat močneje destabilizira, saj se lahko tudi pretvori, encim pa

le malo (vsiljena prilagoditev).

Vsota neugodne aktivacijske entalpije v encimski reakciji in ugodne vezalne E je absolutno

nižja od aktivacijske entalpije nekatalizirane reakcije. Večja razlika pomeni večjo katalitično

moč encima. V encimski reakciji nastopa veliko atomov, reakcije v splošnem potekajo v več

stopnjah.

Celokupna hitrost encimsko katalizirane je odvisna od najpočasnejše stopnje. S spremembo

pogojev (pH, T) v neki reakciji se lahko zamenja najpočasnejša stopnja, kar s pridom

uporabljajo pri preučevanju mehanizma reakcije.

Sproščena vezana E lahko pri nastanku 1 same H-vezi zniža barijero tako, da poteka reakcija

tudi 1000x hitreje (enačbaglej KE kintetika). Specifičnost je posledica komplementarnosti,

destabilizacija je posledica komplementarnosti v prehodnem stanju. Specifičnost encima je

odvisna od njegove fiziološke vloge; proteaze so lahko izredno specifične (faktorji strjevanja

krvi) ali pa zelo nespecifični (pepsin).

Dogodki, ki se morajo zgoditi med katalitičnim procesom na encimu: zamrznitev rotacijskih

intranslacijskih stopenj prostosti gibanja, dehidracija substrata in aktivne površine,

destabilizacija elektronskega oblaka in konformacije, predvsem substratne molekule, včasih

celo nastanek kovalentnega intermediata. Le zamrznitev gibanja lahko prideve do 100

miljonkratne pospešitve reakcije; za tako pospešitev nekatalizirane reakcije bi se morala

koncentracija substrata povečati za isti faktor, na nemogočo koncentracijo.

Dogodki med katalizo entropijski efekt (približanje in orientiranje) ter entalpijski efekt

(destabilizacija).

6.5 MEHANIZEM ENCIMSKE KATALIZE

Za encime, ki so brez kofaktorskih molekul sta kemično pomembni kovalentna in

kislinsko-bazna kataliza. Pri kovalentni katalizi nastane kovalentni intermediat med

encimom in substratom, ob njegovem nastanku se odcepi del substrata (leaving group).

Največkrat so kovalentni intermediati estri med alkoholno skupino na encimu in kislinskim

delom substrata; pri procesu gre za nukleofilno substitucijo. Nekatere skupine hidrolaz

katalizirajo reakcije po mehanizmu kovalentne katalize. Kovalentni intermediat nastane, ker

je encim v prvi stopnji boljši nukleofil in v drugi boljša »leaving group« kot naravni substrat.

Zato reakcija poteče veliko hitreje. Jodid je boljši nukleofil od vode in boljša LG od bromida

in zato je dvostopenjska katalizirana reakcija hitrejša od enostopenjske nekatalizirane (glej

rate limiting step). Hitrost reakcije je lahko odvisna od prisotnosti hidronijevih (H30+) ali

hidroksilnih ionov (OH-), ali drugih donorjev oz. akceptorjev protonov. Prvo je specifična,

drugo pa splošna kislinsko-bazna kataliza. Encimska kataliza je navadno homogena

kataliza, kar pomeni, da nastopajo reaktanti in katalizatorji v istem agregatnem stanju.

Iz natančnega poznavanja visoko organiziranega aktivnega centra encima je mogoče

prepoznati kakšen je dejanski mehanizem katalize.

Encimi, ki ne uporabljajo kofaktorskih molekul imajo v aktivnem centru kisle in bazične

skupine na fiksnih mestih, orientiranih natančno proti tistim delom substrata, ki se bodo

pretvarjali. Pri zelo učinkovitih encimih pride do kooperacije kislih in bazičnih skupin, ki tako

»dogovorjeno« predajajo in sprejemajo protone na in od substrata (push-pull concerted

catalysis). S pomočjo encima multisubstratne reakcije potekajo zaporedno, saj se v vsaki

23

stopnji lahko najdeta 2 molekuli, kar izredno poveča verjetnost trka in s tem hitrost. Encimi

so iz kiralnih gradnikov, zato so tudi sami kiralni; to je vzrok, da so sposobni ločevati

kiralne substrate. Ogstonov principi prepoznavanja komplementernosti med encimom in

substratom na osnovi 3h točk encim se lahko le na 1 način veže če so komplementarnosti

na 3h mestih ( a ne popolne, da se ne poveže za vedno), popolna je le v vzbujenem stanju.

Specifično lahko deluje če uma prilagoditev E na S več mestih.

6.6 ENCIMSKA KINETIKA

Encimska kinetika se ukvarja s preučevanjem hitrosti encimskega delovanja in sprememb

tega delovanja, kot odgovor na spremembe posameznih parametrov v okolju. Kinetično

preučevanje encimov je preučevanje delovanja v razmerah, ki so najbolj podobne

fiziološkim. Hitrost encimske reakcije se definira kot povečanje koncentracije produkta ali

zmanjšanje koncentracije substrata v časovni enoti (KE kinetika). Hitrost se je v poteku

reakcije lahko spreminjala zaradi porabe substrata, kopičenja produkta, kar povzroči

potekanje reakcije v obratni smeri ali pa zaradi propadanja encima. Zasledovanje naraščanja

koncentracije produkta ali padanje koncentracije popišemo s krivuljo časovnega poteka, ki

ji s tujko pravimo progress curve. Hitrost reakcije je v vsakem trenutku tangenta na

krivuljo časovnega poteka, torej je odvod. Tangenta na krivuljo časovnega poteka

predstavlja reakcije skozi točko v času nič na začetno hitrost. Na začetno hitrost ne vpliva

produkt, ker ga še ni; koncentracija substrata je kar dodana koncentracija, običajno take

meritve izvajamo v razmerah, ko je koncentracija substrata mnogo večja (1000 in večkrat) od

koncentracije (?) encima. Michaelis-Mentov mehanizem encimske reakcije. Ugotovitev

obstoja kompleksa med encimom in substratom (ES) izvira iz kinetičnih raziskav in dejstva,

da se z naraščanjem koncentracije substrata hitrost reakcije zaradi nasičenja encima povečuje

le do neke maksimalne vrednosti. MM enačba je matematična enačba preslikane hiperbole

(y=1/x). Hiperbolična odvisnost hitrosti od koncentracije substrata pomeni, da se red reakcije

v odvisnosti od koncentracije substrata spreminja od ena proti nič. Pod pogoji merjenja

začetnih hitrosti je red reakcije v odvisnosti od koncentracije encima ena, torej, da pri

dvakratni večji koncentraciji encima teče reakcija 2x hitreje. Hitrost reakcije pri koncentraciji

substrata, ki je številčno enaka vrednosti M. konstante Km je polovica maksimalne Vmax/2.

6.6.1 Določanje parametrov hitrostne enačbe

Michaelis-Mentovo enačbo hiperbole je mogoče linearizirati tako, da za obe strani enačbe

uporabimo obratne (recipročne) izraze (Lineweaver-Burkov diagram). Za določitev obeh

parametrov MM enačbe je zelo primerna linearizacija po Lineweaver-Burku, a so možni tudi

drugi načini linearizacije. S pomočjo nelinearne regresije se lahko določita oba parametra

direktno s prilagajanjem MM enačbe za izmerjene hitrosti pri različnih koncentracijah

substrata a le s pomočjo programa v računalniku. Matematično modeliranje imenujemo

kompleksen analitičen postopek, ki pripelje do matematične formulacije poljubne encimske

reakcije, torej do enačbe, ki ustreza izmerjenim hitrostnim podatkom pod poljubnimi pogoji.

Matematično lahko modeliramo tudi celotne metabolične poti.

6.6.2 Splošni vplivi na hitrost encimske reakcije

Običajno ima diagram v vs. pH optimum, le ta je lahko različno širok, diagram pa ima lahko

tudi plateau in sicer pri nizkem ali visokem pH. Popolna izguba aktivnosti se pojavi pri zelo

nizkem ali zelo visokem pH zaradi denaturacije encimske molekule, ko prostoni asocirajo ali

disocirajo iz bazičnih ali kislih skupin in s tem vplivajo na vodikove in elektrostatske

interakcije. Širina optimuma v digramu v vs. pH je odvisna od funkcionalnih skupin v

aktivnem centru: če so disociabilne je ozek, če pa so hidrofobne je širši.

24

V splošnem encimske reakcije tečejo hitreje pri višji T zaradi hitrejšega gibanja molekul, a

se pri določeni T encim denaturira in s tem izgubi aktivnost (običajno nad 35°C). Naraščanje

aktivnosti s T poteka po Arrheniusovi enačbi: k= Ae-Ea/RT

. S poskusi s katerimi določimo

hitrost encimske reakcije pri različnih T in s pomočjo linearizirane Arrheniusove enačbe

(lnk=lnA-Ea/RT) lahko narišemo diagram, iz katerega določimo aktivacijsko energijo (Ea)

oziroma aktivacijsko entalpijo (∆H#). Aktivacijska entalpija se v proučevanem

temperaturnem intervalu (običajno med 5 in 35°C) le minimalno spreminja; to nam omogoča

določiti aktivacijsko entropijo s pomočjo enačbe ∆G#=∆H# - T∆S#. Temperaturni

koeficient Q10 pove kolikokrat hitreje poteka encimska reakcija, če T dvignemo za 10 stopinj.

T koeficienti encimskih reakcij so okoli 2; pri nekaterih procesih lahko potekajo z velikimi

koeficienti (1000 pri denaturaciji beljakovin) ali pa so reakcije neodvisne od T (renaturacija

poteka enako pri 20 ali 30°C). Povečana ionska moč pospeši tiste reakcije, kjer nastajajo

raznoznačni naboji; ionska moč ne vpliva na hitrost reakcije s hidrofobnimi intermediati.

6.6.3 Encimski inhibitorji

Snovi, ki pospešujejo delovanje encimov so aktivatorji, tiste, ki zavirajo pa inhibitorji.

Skupna imena so efektorji, modulatorji, modifikatorji ali kar ligandi.

Inhibitorji so lahko reverzibilni ali ireverzibilin in lahko delujejo trenutno ali pa počasi.

Ireverzibilni inhibitorji se vežejo na encime s šibkimi interakcijami (vodikove, hidrofobne,

Van der Waalsove in elektrostatske), a so lahko včasih zaradi mnogih interakcij tako trdno

vezani, da encim zapustijo šele pri denaturaciji (analogi prehodnega stanja).

Ločimo med reverzibilnimi in ireverzibilnimi inhibitorji z dializnim poskusom; lahko tudi s

kromatografijo (gelska filtracija), z razredčitvijo (Oswaldov zakon redčenja).

Inhibicija s kovinskimi ioni je pogosto vezava atomov težkih kovin na sulfidrilne skupine, kar

privede do denaturacije. Helatorji so snovi, ki iz medija odstranijo (vežejo v komplekse)

različne kovinske ione. Nekateri kovinski ioni so kofaktroji (Mg 2+ in ATP-aze); reakcije ne

tečejo, če na vodo delujemo s helatorji.

6.7 ALOSTERIJA

Alosterija je pojav, pri katerem poteka kontrola katalitske funkcije pri t.i. regulatornih

encimih z efektorji, ki se vežejo na encimsko molekulo na mesto, ki je bolj ali manj daleč od

aktivnega mesta. Vezavno mesto alosteričnega efektroja je običajno celo na drugi podenoti

encima. Alosterični encimi so običajno zgrajeni iz podenot (oligomerna sestava).

Pri sistemih, ki so sposobni vplivati sami nase opazimo kooperativne pojave. O

kooperativnih encimih govorimo takrat, ko substrat ali efektor povzroči v encimski molekuli

take konformacijske spremembe, da le te vplivajo na aktivno(-na) mesto(-ta) tako, da se

spremeni njihova katalitična sposobnost. Pozitivna kooperativnost izboljša katalitično

sposobnost, negativna jo poslabša. Homotropična kooperativnost je pojav, ko substrat

vpliva na lastno pretvorbo. Heterotropična kooperativnost je takrat kadar sta substrat in

efektor različni molekuli. Koopertivnost obstaja tudi pri beljakovinah, ki niso encimi

(hemoglobin). Kooperativni encimi so takšni, kjer se kaže delovanje v spremembi vezave

substrata (KM, K sistemi) ali takšni, kjer se spremeni hitrost pretvorbe (kcat), V sistemi, ker je

V= kcat*E0). Kooperativne beljakovine ligande le vežejo in ne pretvarjajo, zato je vpliv le na

afiniteto. Kinetično je razlika med MM encimi in alosteričnimi encimi je v tem, da se na

alosterične encime veže sočasno več ligandov (substratnih molekul ali substrat in efektor),

kar povzroči sigmoidno odvisnost encimske aktivnosti od koncentracije liganda. Ena od

glavnih karakteristik alosteričnih encimov je sigmoidna kinetika.

25

Pojem pseudokooperativnosti je rezerviran za kinetično obnašanje encimov, ki nimajo

oligomerne sestave, a vseeno kažejo odstopanja od hiperbolične (Michaelis-Mentove)

kinetike.

Eksponent v hitrostni enačbi alsoteričnega encima je Hill-ov koeficient, ki govori o vrsti in

stopnji kooperativnosti; n<1 pomeni negativno kooperativnost, n>1 pozitivno, n=1 pa

hiperbolično odvisnost hitrosti od koncentracije substrata.