Biohemija II Praktikum 2011 12

Anela TopčagićLejla Klepo

Ismet Tahirović

BIOHEMIJA IILABORATORIJSKE VJEŽBE

(INTERNA SKRIPTA)

Sarajevo, 2012.

BIOHEMIJA II–laboratorijske vježbe

2

Vježba broj 1

ODREĐIVANJE SADRŽAJA VITAMINA CU UZORKU VOĆNOG SOKA

1. TEORETSKI DIO

Vitamini su spojevi prisutni u hrani životinjskog i biljnog porijekla u malim količinamakoji su neophodni za rast i održavanje organizma.

Iako su po hemijskom sastavu i fiziološkim ulogama u organizmu heterogeni spojevi,vitamini ipak imaju nekoliko zajedničkih osobina.Prema rastvorljivosti u vodi ili uljima dijelimo ih na hidrosolubilne i liposolubilne vitamine.Vitamini topljivi u vodi (hidrosolubilni) su: Vitamini B kompleksa (B1, B2, B3, B5, B6, B9, B12) Vitamin C Vitamin H

Vitamini topljivi u ulju (liposolubilni) su: Vitamin A Vitamin D Vitamin E Vitamin K

Vitamini su uglavnom proizvodi biljaka i nekih mikroorganizama. U organizam seunose u malim količinama – neki i u mikrogramskim količinama. Poslije resorpcije deponujuse u nizu organa, a prije svega u jetri. Zbog toga i mnoge životinjske namirnice-jetra i drugiunutrašnji organi, riblje ulje, mlijeko, jaja itd., služe kao izvor vitamina. U organizmu vitaminiimaju važne fiziološke uloge (Tabela 1).

Mnogi od njih ulaze u sastav koenzima mnogih enzima u organizmu ili su neophodni zaplodnost, razvoj embriona i fetusa, za procese rasta i razvoja, za pravilno sazrijevanjeeritrocita, za pravilan razvoj i strukturu epiderma i epitela.

Nedostatak vitamina u hrani dovodi do određenih poremećaja u organizmu, koji suspecifični za svaki vitamin. Primijećeno je da koža osobito osjetljivo reagira na pomanjkanjerazličitih vitamina.

Hipervitaminoze su poznate kod nekih vitamina topljivih u ulju (A, D). One su gotovouvijek posljedica pogrešnog doziranja pri terapiji vitaminima. U normalnim uvjetima prehranepraktično ne postoje avitaminoze, iako su one uvijek posljedica jednostrane prehrane. Kliničkisu važnije, hipovitaminoze, tj. relativno stanje pomanjkanja vitamina koje još ne dovodi doklasične slike bolesti. Kod nekih vitamina organizam sisavaca može provesti posljednji stupanjsinteze, tj. može prevesti provitamin u sam vitamin. U tim slučajevima (vitamin A) potreba senajvećim dijelom pokriva uzimanjem provitamina. Pokriću normalne potrebe za vitaminimaznatno pridonose bakterije crijeva koje moramo smatrati simbiotima. Npr. potrebu čovjeka zavitaminom K u znatnoj mjeri pokrivaju bakterije.


3

Tabela 1: Pregled i hemijske strukture vitamina

Nazivvitamina Hemijska struktura Hemijski naziv

vitaminaPreporučene

doze Uloga u organizmuBolest usljednedostatkavitamina

B1 Tiamin 1,2 mgDekarboksilacija,

transferaldehidne grupe

Beriberi

B2 Riboflavin 1,3 mg Reakcijeredukcije Ariboflavinoza

B3

Nikotinamid,Nikotinska

kiselina16,0 mg Reakcije

redukcije Pelagra

B5Pantotenska

kiselina 5,0 mg Prenos acilnegrupe Parestezija

B6 Piridoksin 1,3–1,7 mg Prenos aminogrupe

Anemijaperiferne

neuropatije


4

B7 Biotin 30,0 µg Reakcijakarboksilacije Dermatitis

B9Folna

kiselina 400 µg Prenos C1 grupe Megaloblastičnaanemija

B12 Kobaltamin 2,4 µg Intramolekularnapremještanja

Pernicioznaanemija


5

C Askorbinskakiselina 90,0 mg Hidroksilacija Skorbut

A Retinol 900 μg Vid, rast ireprodukcija

Noćno sljepilo,Kseroftalmija

D Kalciferol 5,0 µg–10 µg

Metabolizamkalcija i fosfora Rahitis

E Tokoferol 15,0 mg Lipidniantioksidant Mišićna slabost

K Menakinon 120 µg Zgrušavanje krviUsporeno

zgrušavanjekrvi


6

L-askorbinska kiselina (vitamin C)

Pod vitaminom C podrazumijeva se L-askorbinska kiselina. Vitamin C je ketolakton sašest ugljikovih atoma, pa je po strukturi jako sličan glukozi i topiv je u vodi. To je kristalnispoj, vrlo kiselog karaktera, ima sposobnost reverzibilnog prelaska iz keto u enolni oblik, teigra ulogu oksidaciono-redukcionog sistema. Najbogatiji izvori su šipak, limun, paprika, kao idrugo svježe voće i povrće. Osim biljaka, mogu ga sintetizirati i mnoge životinjske vrste.Ljudski organizam nije u mogućnosti da sintetizira vitamin C, te ga čovjek mora unositihranom .

Rastvori askorbinske kiseline su nestabilni, jer podliježu razgradnji u prisustvuoksidacijskog sredstva, a pogotovo molekulskog kisika. Oksidacijom L-askorbinska kiselinaprelazi u formu L-dehidroaskorbinske kiseline, koja zadržava vitaminska svojstva, a daljnjomoksidacijom i prelaskom u 2,3-diketogulonsku kiselinu gubi se vitaminska aktivnost.Oksidaciju L-askorbinske kiseline potiču i svijetlo, reakcije u baznoj sredini i teški metali (Fe,Cu, Ag). Oksidaciju u biološkom materijalu kataliziraju i razni enzimi. Obzirom daoksidacijom L-askorbinske kiseline nastaju inaktivni spojevi, koji ne posjeduju vitaminskodjelovanje, tokom obrade potrebno je paziti na uslove rada i time smanjiti njenu razgradnju.Kako je L-askorbinska kiselina termolabilna, povišene temperature također pospješujurazgradnju. Kuhanjem namirnica pri visokim temperaturama dolazi do njene razgradnje.

Reaguje kao reducent u mnogim biološkim procesima. Važna je za sintezu kolagena ikarnitina, kao i za sintezu hormona serotonina i adrenalina, te za metabolizam masnih kiselina.

Postoji veliki broj metoda određivanja sadržaja vitamina C. Spektrofluorimetrijskametoda za detekciju vitamina C zasniva se na njegovoj oksidaciji u L-dehidroaskorbinskukiselinu, koja u reakciji sa o-fenilendiaminom (OFDA) u baznoj sredini daje N-heterocikličnispoj sa velikim brojem konjugiranih π-veza, koji može emitovati jaku fluorescenciju. Intenzitetfluorescencije nastalog spoja proporcionalan je koncentraciji i mjeri se pri talasnoj dužiniekscitacije oko 350 nm i emisije oko 430 nm.

Slika 1: Mehanizam fluorescirajuće reakcije određivanja vitamina C


7

2. EKSPERIMENTALNI DIO

Potrebni reagensi:o Askorbinska kiselina (AK) (radna koncentracija): 0,100 g AK otopiti u 100 ml

destilovane vode (1mg/mL) i čuvati u tamnoj reagens boci.o o-fenilendiamin (OFDA): 0,5 g OFDA otopiti u 100 ml 0,1 mol/l HCl i čuvati u tamnoj

reagens boci na 4 °C.o Pufer NH3-NH4Cl (pH 9,4): 13,5 g NH4Cl i 15,75 ml amonijaka otopiti u 100 ml

destilovane vode. Zatim se doda rastvor 0,1 mol/l NaOH, da bi se dobio optimalan pHotopine (provjeriti pH metrom)

Upotrebom radne koncentracije, pripremiti u odmjernim sudovima od 10 ml standardneotopine AK slijedećih koncentracija: 0,5; 1; 5; 10; 30; 50 i 70 μg/ml.

Izvagati 1g uzorka voća ili povrća i macerirati sa 9 ml destilovane vode, a potom gacentrifugirati pri 15 000obr/min, 15 minuta. Od dobijenih supernatanata pripremiti deset putarazblaženiji uzorak. U slučaju uzorka voćnog soka, uzorak samo centrifugirati prema istimuslovima i razblažiti na isti način kao uzorak voća ili povrća.

Ovako pripremljeni rastvori AK i uzoraka se koriste za mjerenje. Rastvori se miješaju poslijedećem redoslijedu: 1 ml AK, 1,0 ml 0,5% OFDA, 1,5 ml pufera NH3-NH4Cl. Rastvor sedopuni do 10 ml s destilovanom vodom, dobro izmiješa i ostavi da stoji 5 minuta prijemjerenja. Intenzitet fluorescencije se mjeri u kvarcnoj kiveti od 1 cm pri talasnoj dužiniekscitacije od 330 nm i talasnoj dužini emisije od 430 nm.

Izračunati koncentraciju AK u uzorku i rezultat izraziti kao mg/100 ml uzorka ili kao mg/100 guzorka.

3. ZADACI I VJEŽBE

-Odgovorite na slijedeća pitanja:

1. Koji od navedenih vitamina, kao strukturne elemente, sadrži izoprenske fragmente:a) vitamin Eb) vitamin Ac) nikotinska kiselinad) vitamin K

2. Koji od navedenih vitamina je derivat sterola:a) vitamin B12b) vitamin Dc) vitamin Ad) vitamin B2


8

3. Kakva je hemijska struktura askorbinske kiseline:a) derivat sterolab) derivat izoaloksazinac) amid piridin-3-karbonske kiselined) lakton dienilgulonske kiseline (2-keto-L (-)-gulonkiseli-γ-lakton)

4. Spojite vitamine sa ponuđenim odgovorimaA. Nikotinamid a. Sadrži prsten tiazolaB. Tiamin b. U organizmu životinja sintetizira se iz triptofanaC. Pantotenska kiselina c. Učestvuje kao koenzim u reakcijama transaminacije i

dekarboksilacije aminokiselinaD. Piridoksalfosfat d. Ulazi u sastav koenzima A

5. Vitamini A i D se mogu uzeti odmah, u jednoj dozi, u takvoj količini da je dovoljna zaodržavanje njihove normalne koncentracije u toku nekoliko sedmica. Vitamine B grupeneophodno je uzimati znatno duže i češće. Zašto?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

6. Ako je dnevna potreba za vitaminom C 75 mg, koliko mg ili g ispitivanog uzorka jepotrebno uzeti da bi se zadovoljila dnevna potreba za vitaminom C?


9

4. REZULTATI

Koncentracijastandarda

Intenzitetfluorescencije

Određivanje koncentracije vitamina C u uzorku

OVJERA VJEŽBE:


10

Vježba broj 2

KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UKUPNIH LIPIDA I TRIGLICERIDA USERUMU ILI PLAZMI

1. TEORETSKI DIO

Ukupni serumski (plazma) lipidi su sastavljeni od triglicerida, fosfolipida, holesterola,estera holesterola, neesterificiranih masnih kiselina, glikolipida (cerebrozida), acetilfosfatida(plazmalogena), fosfatidnih kiselina, viših alkohola, karotinoida, steroidnih hormona, tevitamina A, D, E. Po svojoj važnosti, naročito je bitno u uzorcima odrediti koncentracijetriglicerida i ukupnog holesterola.

Holesterol je najprisutniji sterol u organizmu, koji po svom hemijskom sastavu sadržiugljikov skelet ciklopentanoperhidrofenantrena.

Struktura holesterola

Porijeklo holesterola u organizmu je dvojako, većina ćelija sintetizira holesterol, a drugi njegovizvor je hrana kojom se unosi. Oko 2/3 holesterola nastaje sintezom u organizmu (kod odrasleosobe oko 800-900 mg/dan), a svega 1/3 se unosi hranom (oko 150-300 mg/dan). Djeci jepotrebna proporcionalno veća količina, što se opravdava njegovom značajnom ulogom kaostrukturnog elementa svih ćelijskih i unutarćelijskih membrana. Najveći dio holesterola nastajeu jetri, a do njegove sinteze može doći i u sluzokoži crijeva i nadbubrežnim žlijezdama. Odatlese putem krvotoka transportuje do ćelija organizma. Pošto je nerastvorljiv u vodi, u krvi seholesterol transportuje tako što se veže za proteine gradeći lipoproteine. Postoji više vrsta ovihlipoproteina i dijele se prema gustoći na: VLDL (Very Low Density Lipoproteins), lipoproteini vrlo male gustoće LDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini male gustoće HDL (Low Density Lipoproteins), lipoproteini velike gustoće

Lipoproteini sa dosta lipida imaju nižu gustoću.U krvi holesterol je prisutan u slobodnom i esterificiranom obliku vezan sa jednom

molekulom masne kiseline. Esterifikacija holesterola odigrava se u plazmi pod djelovanjemenzima lecitin-holesterol-acetiltransferaze (LHAT), koji se nalazi u krvnoj plazmi. U plazmi jepribližno 75 % ukupnog holesterola esterificirano najčešće nezasićenim masnim kiselinama,(od toga 55 % linolnom kiselinom). Eliminacija holesterola iz organizma se vrši preko žuči


11

(konverzijom u holne kiseline), perutanjem kože, mala količina se gubi urinom, dok žene kojedoje gube nešto holesterola preko mlijeka.

Holesterol je neophodan za normalno funkcioniranje svake ćelije, kao bitan strukturnielement. Specifične uloge holesterola su: Sinteza žučnih kiselina u hepatocitima Sinteza steroidnih hormona u kori nadbubrežnih i polnih žlijezda Transport liposolubilnih vitamina (A, D, E i K)

Štetno djelovanje holesterola se ispoljava kada je u krvi prisutan u znatno većimkoličinama. Povećanje LDL-a, a time i holesterola u krvnoj plazmi dovodi do povišenog ulaskaestera holesterola u ćelije krvnih sudova, gdje dolazi do taloženja estera holesterola, što možeda dovede do začepljenja krvnih sudova, smanjenja njihove prirodne elastičnosti, a u kasnijimstadijima, formiranja tromba i infarkta miokarda.

Prilikom uklanjanja holesterola iz organizma slobodni holesterol dospijeva u žuč ukojoj je nerastvorljiv. On se u žuči inkorporira u micele koje čine lecitin i žučne soli. Ovemicele imaju ograničen kapacitet rastvaranja holesterola. Kod ljudi sa kamenom u žučnoj kesidolazi do formiranja abnormalne žuči, koja postaje prezasićena holesterolom. Pod djelovanjemrazličitih faktora dolazi do viška taloženja holesterola u vidu kristala. Ako se kristali ne izlučeu crijevo, narastaju i formiraju kamenje.

Metode određivanja holesterola su spektrofotometrijske, enzimske i hromatografske.Najčešće se primjenjuje Liberman-Burchard-ova metoda određivanja, gdje holesterol ubezvodnoj sredini sa anhidridom acetatne kiseline i koncentriranom sulfatnom kiselinom dajenezasićene visokomolekularne ugljikovodike, plavozelene boje, tzv. halokrome. Intenzitetnastale boje direktno je srazmjeran koncentraciji holesterola i mjeri se fotometrijski. Acetatnakiselina i anhidrid acetatne kiseline služe kao rastvarači i dehidratacijska sredstva, jer sereakcija odvija u bezvodnom mediju, a sulfatna kiselina dehidrira i ujedno oksidira holesterol.

Trigliceridi su esteri glicerola i masnih kiselina. Glavni su sastojak životinjskih i biljnihmasti i ulja. Masti nas opskrbljuju velikom količinom energije. Nalazimo ih u masnom tkivu iu masnim kapljicama ostalih ćelija. Zbog toga su masti i ulja vrlo važna skupina spojeva uljudskoj prehrani. One su rezerva energije neophodne svakom živom organizmu za njegovrazvoj i održavanje. Vrlo su široko rasprostranjene u prirodi, koliko u životinjskom, toliko i ubiljnom svijetu. Masti osim biološkog, imaju i veliko tehničko značenje. One služe kaosirovina za proizvodnju sapuna, margarina, raznih maziva, lakova i boja. Maslac i margarin suvrlo česti izvori masti u prehrani. U probavi hrane, mast se razgrađuje tek u tankom crijevu.Žuč, koja dolazi iz žučnog mjehura u duodenum (prvi dio tankog crijeva), zajedno s hranomputuje kroz tanko crijevo i razgrađuje mast na njene komponente: glicerol i masnu kiselinu.Masna kiselina se dalje probavlja, a glicerol se metabolizira u jetri.

U analitici ukupnih lipida opisane su gravimetrijske i turbidimetrijske metode,računske, te kolorimetrijske metode.

Ukupni lipidi plazme (seruma) se određuju spektrofotometrijski, reakcijom savanilinom i fosfornom kiselinom. Predpostavka je da pri dodavanju koncentrirane sulfatnekiseline serumu uz zagrijavanje, svi lipidi koji u svojoj strukturi posjeduju dvostruke veze dajuketone ili ketole. Ovi potom reagiraju sa vanilinom u fosfornoj kiselini uz nastajanje ružičastocrvene boje, čiji intenzitet apsorpcije se mjeri između 510-550 nm.


12

Prema hipotezi Knighta i saradnika, reakcija se odvija u tri stepena:

1. Nezasićena masna kiselina reagira sa H2SO4 stvarajući karbonium jon:

2..Vanilin reagira sa H3PO4 stvarajući aromatski ester:

3. Karbonijum jon reagira s aktiviranom karbonilnom grupom fosfovanilina stvarajućinabijeni ružičasto obojeni kompleks, koji se stabilizira rezonancijom i maksimalnoapsorbira kod 525 nm:

Trigliceridi se određuju po hemijskom ili enzimskom principu određivanja glicerola. Samoodređivanje triglicerida se sastoji od ekstrakcije, potom odvajanja fosfolipida i drugihhromogena, te saponifikacije, odnosno ekstrakcije, nakon čega slijedi direktno određivanjeglicerola. Faza ekstrakcije se izvodi u rastvaračima poput metanola, etanola, izopropanola ilihloroforma. Svi ovi rastvarači dovode do denaturacije lipoproteina, dakle disocijacije vezanihtriglicerida. Interferirajuće supstance se mogu ukloniti na dva načina i to korištenjemadsorbensa poput zeolita, salicilne kiseline ili aktivnog magnezij-silikata ili pak korištenjemnonana ili heksana. Glavne interferirajuće supstance koje se mogu ukloniti na ovaj način sufosfolipidi i glukoza zajedno sa nekim hromogenima i ponekad sa slobodnim glicerolom.Druga faza u sklopu ovih postupaka uključuje hidrolizu triglicerida na glicerol i masne kiselinei obično se izvodi sa etanolnim rastvorom kalij-hidroksida pri visokim temperaturama


13

(saponifikacija). U trećoj fazi dolazi do oksidacije glicerola u formaldehid, koji se prevodi ureakciji sa acetilacetonom u obojeni spoj.

Određivanje triglicerida se može prikazati hemijskim reakcijama u tri stepena:

Prvi stepen:

CH2

CH

CH2

O

O

O

C

C

C

O

O

O

R

R

R

+ K OH

CH2

CH

CH2

OH

OH

OH

+ RCOOK3 3

Drugi stepen:

CH2

CH

CH2

OH

OH

OH

+ NaJO4 C

O

H H + NaJO3 + H2O3

Treći stepen:

C

O

H H + CH3 C

O

CH2 C CH3

O

2 + NH4+

NH

CCH3

O

CH3CH3

CH3

O

formaldehid acetilaceton3,5-diacetil -1,4 -dihidroksitoluen


14


2.1. ODREĐIVANJE UKUPNIH LIPIDA

Potrebni reagensi:- Sulfatna kiselina, koncentrirana- o-fosfatna kiselina, p.a.- Vanilin 0,008 M vanilina (C8H8O3, Mr 152,15) otopi se u 100 ml redestilirane vode- Fosfovanilinski reagens: fosfatna kiselina 11,9 M i vanilin 0,008 M, 1 dio fosfatne

kiseline pomiješa se s 1 dijelom (1:1) otopine vanilina. Reagens je stabilan u tamnojboci na sobnoj temperaturi 2 sedmice

- Standard maslinova ulja, 1 g maslinova ulja/100 ml etanola.

Otopine su stabilne jednu godinu na sobnoj temperaturi, ako su zatvorene. Otopine trebačuvati u tamnim bocama.

U epruvete s brušenim staklenim čepom otpipetira se:_________________________________________________

Proba Standard_________________________________________________Serum 50 μl -Standard lipida - 50 μlH2SO4 2,0 ml 2,0 ml

Sulfatna kiselina dodaje se tako da se pokupe svi tragovi seruma na zidovima epruvete na dno.Epruvete se stave 10 minuta u ključalo vodeno kupatilo i ohlade u hladnoj vodi.

U nove epruvete se otpipetira: Smjesa analize: 100 μl - - Smjesa standarda lipida: - 100 μl - Fosfovanilinski reagens: 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml

Miješati i ostaviti da stoji 30 min. a nakon toga se mjeri apsorpcija (A) probe i standarda lipidaprema slijepoj probi kod 530 nm u kiveti od 1 cm.

Odrediti sadržaj ukupnih lipida u uzorku seruma, a rezultat izraziti kao g/l.Referentne vrijednosti ukupnih lipida: 4 do 8 g/l.

2.1. ODREĐIVANJE TRIGLICERIDA

Potrebni reagensi:- n-heptan;- izopropanol;- sulfatna kiselina, 0,04 mol/L;- acetatna kiselina, 1 mol/L;- kalij-hidroksid 6,25 mol/L;


15

- rastvor metaperjodata: rastvoriti 3 g natrij-metaperjodata i 25 mL glacijalne acetatnekiseline u destiliranoj vodi i dopuniti vodom do 500 mL;

- amonij-acetat, 2 mol/L;- rastvor acetilacetona: rastvoriti 0,75 mL acetilacetona i 2,5 mL izopropanola i dopuniti

do 100 mL 2,0 mol/l rastvorom amonij-acetata. Rastvor čuvan u tamnoj boci stabilan jemjesec dana na +4 °C;

- standard: maslinovo ulje.

Pipetirati u epruvete sa brušenim zatvaračima prema priloženoj tabeli:

1. EkstrakcijaSlijepa proba Standard Uzorak

Destilirana voda 0,5 mLStandard 0,5 mLSerum 0,5 mL

n-heptan 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mLIzopropanol 3,5 mL 3,5 mL 3,5 mL

Sulfatna kiselina 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mLMiješati na vorteksu oko 30 s i sačekati da se odvoje slojevi.

2. Saponifikacija i oksidacijaNa 0,4 mL heptanskog sloja (gornji sloj) dodati 2 mL izopropanola i kap KOH. Dobropromiješati i inkubirati na 70 °C u trajanju od 10 min. Nakon toga dodati 0,2 mL reagensaNaJO4 i 1 mL reagensa acetilacetata. Dobijeni rastvor dobro promiješati i inkubirati na 70 °C utrajanju od 10 min. Nakon toga, smjesu ohladiti na sobnu temperaturu. Dobijenom rastvorumjeriti apsorbansu na 425 nm. Boja je stabilna oko sat vremena. Standardne rastvore čijekoncentracije idu do 2 g/L tretirati na isti način. Na osnovu dobijenih vrijednosti apsorbansi zastandard triglicerida, konstruirati kalibracionu krivu i pomoću jednačine pravca odrediti sadržajtriglicerida. Sadržaj triglicerida izraziti kao mmol/L.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Oslobađanje masnih kiselina u toku posta ide iz kog organa:a) Jetreb) Masnog tkivac) Epitela tankog crijevad) Limfe

2. Koji se proces naziva saponifikacija masti:a) Enzimska hidrolizab) Alkalna hidrolizac) Hidrogenizacijad) Reakcija sa olovo-acetatome) Emulzifikacija masti


16

3. Kakvom pretvaranju podliježe glicerol koji nastaje u prvoj etapi pri razgradnjitriacilglicerola:

a) Redukcijib) Oksidacijic) Metiliranjud) Fosforiliranjue) Aciliranju

4. Koji od navedenih lipoproteina se karakterizira kao „loši“ holesterol:a) LDLb) HDLc) Hilomikronid) IDL

5. Koji se od vitamina ponašaju kao lipidi:a) vitamin Cb) vitamin Kc) vitamin Ad) vitamin Ee) vitamin D

6. Koji sastojci ćelije sadrže fosfolipide:a) mijelinski omotač nervnih ćelija velikog mozgab) hijeloplazmac) kompleks membrana

7. Objasniti ulogu sulfatne kiseline u reakciji određivanja ukupnih lipida?____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4. REZULTATI

- Određivanje koncentracije ukupnih lipida

Uzorak Apsorpcija (A)


17

- Određivanje koncentracija triglicerida

Uzorak Apsorpcija (A)

OVJERA VJEŽBE


18

Vježba broj 3

RAZDVAJANJE PROTEINA GEL ELEKTROFOREZOM

(RAZDVAJANJE I IDENTIFKACIJA PROTEINA U UZORCIMA GOVEĐEG SERUMANA AGAROZNOM GELU UZ PRIMJENU ISTOSMJERNE ELEKTRIČNE STRUJE)

1. TEORETSKI DIO

Elektroforeza po svojoj definiciji, je tehnika kojom se razdvajaju naelektrisane čestice poddjelovanjem homogenog električnog polja. Tom prilikom otopljena čestica efektivnog naboja qputuje u viskoznom puferu pod djelovanjem električnog polja prema jednoj od elektroda, uovisnosti od prirode njenog naboja. Ovo je jedna od važnijih tehnika u separaciji biološkihmolekula, jer obično ne uzrokuje promjene na nivou strukture molekula koje se separiraju, aosim toga osjetljiva je na male promjene u naboju i masi makromolekula.Kretanje molekula u električnom polju predstavlja funkciju naboja q i koeficijenta trenja f.Brzina koju ostvaruje jedan molekul sa nabojem u električnom polju je funkcija jačine polja Etako da imamo odnos:

v=f

Eq

v - brzina kretanja molekule (m/s)E - jačina električnog polja (V/m)q - naboj molekulef - koeficijent trenja (Vs/m2)

Pri tome je razdvajanje čestica u električnom polju ovisno i o vremenu.Kao analitička metoda, elektroforeza je jednostavna, brza i vrlo osjetljiva. U kombinaciji sdrugim tehnikama molekularne biologije, postala je jedna od najčešće primjenjivanih metoda.

Postoje dva tipa elektroforeze: slobodna i zonska.Kod slobodne elektroforeze naelektrisani joni se slobodno kreću kroz rastvor sve dok postojidjelovanje električnog polja. Ovdje se radi o jednom dinamičkom sistemu koji direktnamjerenja može da vrši samo kod onih čestica koje svojom različitom brzinom putovanjastvaraju mjesta različite gustoće. Za ovu potrebu koristi se U-cijev koja u donjem dijelu sadržiuzorak i krajeve koji su napunjeni elektrolitom kako bi se održavale oštre granice premauzorku. Kretanje uzorka se mjeri pomoću pomjeranja granica u funkciji vremena. Na ovajnačin dolazi do optičke pojave (tzv. šlira), do prelamanja svjetlosti na granici dvije različitekoncentracije i one se registruju posredstvom mjerenja indeksa prelamanja svjetlosti. Ovatehnika uglavnom se koristi u analizama fizičkih karakteristika molekula.Mnogo pogodnija tehnika je tzv. zonska elektroforeza. Naelektrisane čestice se kod ove tehnikekreću kroz interni potporni medij koji može biti filter papir, celuloza-acetat, skrobni gel, agargel, poliakrilamid gel... Prednost ove tehnike je i u tome da se razdvojene supstance u željenompoložaju mogu stabilizirati, osušiti i hemijski fiksirati. Potporni medij pri tome ima ulogu daspriječi sve poremećaje vezane za kretanje uzoraka, a osim toga predstavlja u izvjesnom smislui molekulsko sito ili pak stabilizirajući medij za pH gradijent. Napon koji se koristi kodrazdvajanja će ovisiti od tipa uzorka i vrste potpornog medija. Tako npr. visoki naponi se


19

koriste za papirne potporne medije uslijed velikog otpora samog papira. Visoki napon setakođer koristi za izbjegavanje problema koji bi nastali difuzijom i doveli tako do širenjamolekula. Sa velikim naponima stvaraju se i veće jačine struje, dolazi do stvaranja toplote štozahtijeva hlađenje sistema. Dodatni problem u nekim efektivnim potpornim medijima jefenomen elektroendoosmoze u kojem pufer sam pokazuje elektroforetski učinak i time maskirapokretljivost molekule koja se prati. Ova pojava se može kao takva pripisati efektima kretanjapufera koji se javljaju uslijed negativno nabijenog potpornog medija i dovode to toga da pufer,kada se izloži električnom polju se kreće prema katodi. Proteini su negativno nabijeni i krećuse prema anodi. Drugim riječima, kada dolazi do ove pojave dolazi do njihovog kretanjasuprotno kretanju pufera. Brzina kretanja pufera se mijenja sa korištenjem različitih potpornihmedija. U izvjesnom smislu efekat elektroendoosmoze se pokazao korisnim, jer pomaže kodrazdvajanja gama globulina od ostalih proteina. Ova frakcija proteina ima negativan naboj, alise radi o molekulama velike molekulske mase tako da naboj koji oni posjeduju nije dovoljan daanulira efekat kretanja pufera.Dostupan je širok raspon opreme za elektroforezu, ali u osnovi postoji zajednički bazni dizajn.Dobro dizajnirana komora treba da spriječi bilo koji stepen isparavanja sa potpornih medija, daima učinkovit sistem hlađenja kada se koriste gelovi ili tehnike visokog napona pri čemu jepotrebno posebno voditi računa o sigurnosnim prekidačima.

Tipovi elektroforeze su:

ELEKTROFOREZA NA FILTER PAPIRU ELEKTROFOREZA NA CELULOZAACETATU ELEKTROFOREZA NA TANKOM SLOJU KAPILARNA ELEKTROFOREZA GEL ELEKTROFOREZA

Idealan potporni medij za elektroforezu je hemijski inertan, sa njima se lahko rukuje i usvakom trenu je moguće kontrolirati poroznost. Iako se papir smatra pravim nosačem kodseparacije aminokiselina, malih peptida, ovaj medij neosporno pokazuje velike nedostatke, jerse u ovom slučaju poroznost ne može kontrolirati. Supstance sa velikim molekulskim masamapoput proteina i nukleinskih kiselina se ne separiraju dobro na papiru, jer celulozna vlaknapokazuju veliki otpor prema kretanju. Gelovi sa varirajućom poroznošću su idealni kodseparacije visokomolekularnih supstanci jer dozvoljavaju lagano kretanje makromolekula uzistovremeno spriječavanje konvekcije i uz minimalnu difuziju. Tri tipa gela se koriste u ovusvrhu: skrobni gel, poliakrilamid gel i agaroza. Aparati mogu biti za cilindrične gelove i za gelploče (gdje broj rupica za uzorke se utvrđuje na osnovu broja zuba na plastičnom češlju koji sekoristi).Najpoznatiji gelovi koji se koriste u elektroforezi su:

AGAROZNI ŠKROBNI POLIAKRILAMIDNI


20

AGAROZA KAO GEL

Agarozni gelovi se stvaraju tako što se suha agaroza otopi u vodenom puferu, potom zagrijedok se ne dobije bistri rastvor, a zatim ohladi na sobnoj temperaturi. Agaroza je prirodnilinearni polisaharid građen od galaktoze i 3,6-anhidrogalaktoze. Dobija se iz agara.Visokoporozni gel koji se dobija na ovaj način je pogodan za elektroforezu i za nekeimunološke tehnike. Agaroza se obično koristi pri koncentracijama između 1% i 3%. Agaroznigel se odlikuje relativno velikom veličinom para nakon njegovog hlađenja. Ove pore sustabilizirane vodikovim vezama. Veličina pore se kontrolira početnom koncentracijom agaroze.Velike pore se stvaraju pri korištenju niskih koncentracija agaroze, a manje veličine se stvarajuprilikom korištenja velikih koncentracija agaroze. Velike pore i gelovi niskih koncentracijaagaroze omogućavaju separiranje vrlo velikih molekula poput DNK, lipoproteina,imunoglobulina i enzimatskih kompleksa. Agaroza predstavlja definitivno metod izbora kodpripreme DNK lanca za sekvencioniranje. Fragmente DNK je pri tome moguće ekstrahiratidirektno sa niskotopive agaroze (62 oC-65 oC) nakon zagrijavanja na 65 oC. Ovaj tip gela vrlose često koristi za imunoelektroforezu gdje se separiraju veliki kompleksi antigen-antitijelo, atakođer se koristi i kod izoelektričnog fokusiranja. Dobra strana ovih gelova je da su oni fizičkijači od niskoprocentnih poliakrilamid gelova.

SDS-PAGE KONTINUIRANA ELEKTROFOREZA (WEBER-OSBORN POSTUPAK)

Ovo je tehnika kod koje se deterdžent natrijumdodecilsulfat (SDS) dodaje na sistem.Uglavnom se koristi u istraživačke svrhe za karakterizaciju proteina u toku izolacije. Proteinivelikih molekulskih masa, proteinski kompleksi ili pak nukleinske kiseline se vrlo čestorazdvajaju u prisustvu agensa koji djeluju na razbijanje nativne strukture. Natrijumdodecilsulfat (SDS) je deterdžent koji pokazuje polarne i nepolarne karakteristike. SDS sevezuje za najveći broj proteina tako da su njegovi nepolarni hidrofobni dijelovi pohranjeni unepolarni region proteina, a negativno nabijeni sulfatni izložen prema rastvaraču. VezivanjeSDS-a ima dvojake efekte. Prvi su vezani za interferenciju sa nativnim hidrofobnim i jonskimvezama što dovodi do disocijacije najvećeg broja oligomernih proteina u njihove monomere ido razaranja njihove sekundarne strukture. Ukoliko su polipeptidni lanci povezani disulfidnimvezama, potrebno je dodatno uzorke zagrijati u prisustvu disulfid reducirajućih agenasa(betamerkaptoetanola ili 1,4-ditiotreitola). Da bi se to postiglo, potrebno je da protein disocirana manje podjedinice. Ovaj drugi efekat se pojavljuje kada proteini postanu zasićeni sanegativno nabijenim molekulama SDS-a. Tada elektroforetska separacija ovisi isključivo odmolekulske mase, tako monomeri malih molekulskih masa putuju znatno brže jer je koeficijenttrenja manji. Elektroforeza koja se izvodi pod ovim uvjetima može da se koristi za utvrđivanjemolekulske mase proteina.Weber i Osborn su pokazali da se molekulske mase najvećeg broja proteina mogu utvrditiputem mjerenja pokretljivosti na poliakrilamidnom gelu koji sadrži SDS. Standardi proteinapoznatih molekulskih masa se analiziraju elektroforetski i njihova pokretljivost se mjeri inanosi na graf papir i izražava u obliku logaritma molekulske mase. Ovaj grafikon daje jednupravu liniju. Pokretljivost nepoznatog uzorka se može odrediti pod identičnim uslovima, amolekulska masa se može dobiti na osnovu grafika pokretljivosti standarda u odnosu nanjihove odgovarajuće logaritme molekulskih masa. Molekulske mase utvrđene metodomelektroforeze pod disocirajućim uslovima zadovoljavaju tačnost u rasponu od 5-10 %.


21

SDS-PAGE primjena


Potrebni reagensi:- Goveđi serum- Standard - albumin goveđeg seruma (BSA)- Agaroza- glicin- tris (hidroksimetil)-aminometan- natrijum-dodecilsulfat (SDS)- 2-merkaptoetanol- glicerol- brom-fenol plavo

Za analizu uzoraka koristiće se jednodimenzionalna agarozna gel elektroforeza.

Detekcija se vrši pomoću indikatora brom-fenol plavog, komazi briljantno plavog (coomassiebrilliant blue) ili bojenjem sa srebrom.

Intenzitet trake je veličina za relativno određivanje količinskih dijelova neke komponente. Naosnovu protoka referentnih proteina sa poznatom masom, mogu se odrediti molekulske maserazličitih proteina u uzorku i isti mogu biti identificirani. U slijedećoj tablici navedene surelativne molekulske mase različitih proteina određene na poliakrilamidnom gelu:

Protein Mr

Pređenaudaljenost

(mm)Transferin 78 000 6,0Albumin goveđeg seruma 66 000 12,5Ovalbumin (albumin jajeta) 45 000 32,0Gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza 36 000 38,0


22

Protein Mr

Pređenaudaljenost

(mm)Karboanhidraza 29 000 50,0Tripsinogen 24 000 54,0Tripsin inhibitor soje 20 100 61,0-laktoglobulin 18 400* 69,0Mioglobin 17 800 69,0Lizozim 14 300 79,0Citohrom c 12 400 86,5

* -laktoglobulin ima Mr od 36 800 jer je dimer od dvije identične subjedinice sa Mr od 18 400. Podreducirajućim uvjetima pufera za uzorak disulfidne veze podjedinica su reducirane (pocijepane) tako da se na geluvide monomerni lanci.

1. Priprema potrebnih puferaa) Elektroforetski pufer

Postoji više pogodnih elektroforetskih pufera za analizu proteina, ali je najčešće u upotrebiTRIS-Glicin pufer koji se priprema na slijedeći način:Pripremiti po 1 litar 0,192 mol/dm3 glicina i 0,025 mol/dm3 tris (hidroksimetil)-aminometana.Miješanjem tih komponenata dostići pH vrijednost 8,3.

b) Pufer za tretman uzorka400 l elektroforetskog pufera + 100 l 2-merkaptoetanola + 100 l 2 % SDS-a uelektroforetskom puferu.

c) Pufer za aplikaciju uzorka300 l elektroforetskog pufera + 700 l 87 %-og glicerola + nekoliko kristalića brom-fenolplavog ili komazi briljant plavog.

2. Priprema uzorka ili standardaU kivetu za centrifugu odmjeriti 200 l uzorka ili standarda (pripremljenog tako da se 0,01 galbumina goveđeg seruma otopi sa 1 ml elektroforetskog pufera), dodati 200 l pufera zatretman uzorka, promiješati na vorteks miješalici i držati na ključalom vodenom kupatilu 5minuta.

3. Eksperimentalna proceduraa) Pripremiti 1% rastvor agaroze ukupnog volumena 150 mL (agarozu otopiti u

elektroforetskom puferu).b) Miješati na magnetnoj miješalici uz grijanje dok se agaroza ne otopi.c) Nakon otapanja, ostaviti otopinu na sobnoj temperaturi da se hladi uz miješanje na

drugoj magnetnoj miješalici. Dok je otopina još vrela popuniti s njom šupljine izmeđuivica staklene ploče i okvira koristeći Pasterovu pipetu. Kada se ruka može zadržati natikvici sa otopinom, tada dodati 0,1 g SDS-a, promiješati staklenim štapićem da seotopi i sipati otopinu gela na staklenu ploču.

d) Odmah uroniti češalj u otopinu blizu jednog od krajeva ploče. Češalj podesiti tako dadonji dijelovi njegovih zubaca ne dodiruju površinu ploče (debljina gela na timmjestima treba da je 0,5 – 1,0 mm.


23

e) Nakon što prođe 30 – 45 minuta pažljivo ukloniti češalj i okvir, te staviti ploču s gelomu elektroforetsku jedinicu.

f) U udubljenja koja su napravili zupci češlja aplicirati uzorke koji su pripremljeni naodgovarajući način (na ravnoj plastičnoj podlozi ili parafinskom filmu pomiješati 1,5 lpufera za aplikaciju uzorka sa 6 l uzorka ili standarda).

g) U elektroforetske komore sipati elektroforetski pufer da dodiruje ivice gela.h) Pokriti sistem sa poklopcem i priključiti kablove sa elektrodama koje su spojene sa

ispravljačem.i) Uključiti ispravljač uz podešavanje odgovarajućeg napona (u početku dok uzorci ne

uđu u gel napon može biti oko 50-60 V, a kasnije 80-100 V).

NAPOMENAPrije rada upoznati se sa načinom rukovanja hemikalijama koje se koriste. Podaci o štetnostikemikalija, kao i načinu pružanja prve pomoći nalaze se u laboratoriju (konsultovati asistenta ilaboranta)! Ovdje su navedene neke informacije za supstance povećanog rizika:

- 2-MerkaptoetanolŠtetan ukoliko se proguta ili udiše. Toksičan u kontaktu sa kožom. Uzrokuje upaljenje.Toksičan za vodene organizme, može uzrokovati dugotrajne štetne efekte u vodenoj sredini!Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice i rad obavljati u digestoru!

- Natrijum-dodecilsulfatŠtetan ukoliko se proguta ili udiše. Iritira kožu, oči i respiratorni trakt. Može uzrokovatialergiju kože ili respiratornu reakciju (kašalj i sl.). Zapaljiv u čvrstom stanju!Pri radu sa ovom supstancom obavezno koristiti rukavice!

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Kakav je pravac kretanja peptida (ostaje na startu, kreće se ka anodi ili katodi) uprocesu eletroforeze pri pH 2; 3,5; 6,5; 10:

a) Lys-gly-ala-glub) Glu-gly-ala-gluc) Gly-gly-ala-lys


24

2. Smjesa glicina, glutaminske kiseline, lizina, arginina i serina razdvaja se metodomelektroforeze na papiru pri pH 6,0. Navedite koja su se jedinjenja kretala ka anodi, +(A), katodi, - (K), a koja su ostala na startu C.

A:B:

C:

3. Navedite pravac kretanja peptida lyz-gly-ala-gly u procesu elektroforeze na papiru pripH 1,9; 3,0; 6,5; 10,0.

4. Navesti u koje svrhe se može koristiti elektroforetska metoda?_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5. Koju ulogu u pripremi uzorka za elektroforezu imaju 2-merkaptoetanol i natrijum-dodecilsulfat?

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________


25

4. REZULTATI

OVJERA VJEŽBE


26

Vježba broj 4

KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE UKUPNIH PROTEINA BIURETMETODOM

1. TEORETSKI DIO

Proteini predstavljaju kompleksne polimere koji se sintetiziraju na nivou svih živih bića.Međusobno se razlikuju po svojim funkcijama, veličini, obliku molekule te strukturi,rastvorljivosti, sastavu, eletroforetskoj pokretljivosti. U odnosu na ulogu koju imaju uorganizmu, u principu se mogu podjeliti na proteine katalizatore (enzime), potom regulatorneproteine (receptori, hormoni, represori, inhibitori), transportne proteine, strukutrne proteine,proteine odbrane (imunoglobulini i komplement), onkofetalne i placentalne proteine i proeteinečija funkcija još nije poznata. Najstariji pristup određivanja ukupnih proteina jeste utvrđivanjekoncentracije azota proteinskog porijekla. Poznati postupak koji se koristi kod određivanjaovog tipa je Khjeldahl-ov postupak. Ovom metodom se utvrđuje koncentracija ukupnog azotau biološkom materijalu. Princip je da se supstance koje sadrže azot pretvore u amonijum jonposredstvom oksidacije u sistemu za razaranje koji sadrži koncentrovanu sulfatnu kiselinu kaokatalizator i so koja ima funkciju da podigne tačku ključanja smjese. Amonijum jon se najboljeanalizira pretvorbom u amonijak sa dodatkom alkalija. Nakon destilacije upari se u rastvorborne kiseline i amonijak potom titrira sa standardnim rastvorom hlorovodonične kiseline.Korekcija za neproteinski azot se ostvari korištenjem seruma koji ne sadrži proteine. Metodaodređivanja po Khjeldahlu odlikuje visokom tačnošću i preciznošću, činjenica je da traje dugo ida je dosta komplikovana sa aspekta izvođenja rutinske analize serumskih proteina čak i uslučajevima kada se amonijak određuje enzimatskim analizama. Postoji također i nesigurnostoko tačnosti faktora konverzije azota u proteine. Historijski se još uvijek koristi faktor 6,25iako se zna da je vrijednost istog relativno niska. Ova metoda se još uvijek koristi kaostandardna metoda sa kojom se upoređuju sve druge metode.Jedna od najčešće korištenih metoda za utvrđivanje koncentracije serumskih proteina jezasnovana na principu Biuret reakcije. U ovoj reakciji bakarni jon reagira sa peptidnim vezamaproteina u osnovnom rastvoru gradeći ljubičasto obojene komplekse koji pokazuju apsorpcionimaksimum na 540 nm. Biuretska reakcija predstavlja vrlo pogodnu metodu i odlikuje sedobrom preciznošću (pozitivna bojena reakcija dobija se i pri razblaženju 1:104). Količina bojekoju daje Biuret reagens u vrlo bliskom je odnosu sa polipeptidnim dijelom različitihserumskih proteina što je direktna prednost nad Lowry-evom metodom. Reakcija koristi jedanvrlo stabilan reagens i uslijed toga našla svoju široku primjenu u automatizaciji. Nedostatak ješto pozitivnu reakciju mogu dati i neke supstance koje ne poseduju peptidnu vezu u molekuli,kao što su histidin, asparagin ili oksamid.Kingsley je 1942. godine koristio prvi reagens koji nije bio veoma stabilan. Prvi stabilan Biuretreagens opisao je Weichselbaum koji je dodao kalij natrij tartarat kao stabilizator i kalij jodidda bi spreiječio autoredukciju alkalnog bakar tartarata i separaciju bakar oksida. Ovaj metod sezasniva na interakciji Cu2+ jona sa atomima nitrogena i oksigena u peptidnoj vezi proteina ualkalnoj otopini, pri čemu nastaje ljubičasto obojeni kompleks čija apsorpcija se mjeri na 545nm.


27

Pored ove metode, najčešće korištene metode za kvantitativno određivanje proteina su:

1. Bredford-ova metoda: zasniva se na mjerenju apsorpcije kompleksa proteina saBredfordovim reagensom pri 595 nm. Bredfordov reagens je Coomassie briljantno plavo G ufosfatnoj kiselini i metanolu. Linearno područje koncentracija proteina: 0,1-1,4 mg/ml.Ukoliko u uzorku ima tragova deterdženata prikladnija je BCA metoda koja će biti opisana.

2. Lowry-jeva metoda: zasniva se na redukciji fosfomolibden-volfram mješovitogkiselog kromogena u fenolskom Folin-Ciocalteu reagensu od strane proteina, što rezultira uapsorpcionom maksimumu pri 750 nm. Nedostatak je što se na rezultat može negativnoodraziti prisustvo ostalih reducirajućih supstanci i što reagens reagira samo sa proteinima kojisadrže tirozin.

3. Metoda sa bicinkoninskom kiselinom (BCA metod) zasniva se na redukciji kupri(Cu2+) jona do kupro (Cu+) jona proteinom. Bicinkoninska kiselina se koristi za detekciju Cu+.Ova metoda ima nekoliko interferirajućih supstanci čiji efekat može biti u izvjesnoj mjeriumanjen razrijeđivanjem ispitivane otopine proteina.

4. Fluorimetrijski metod zasniva se na derivatizaciji proteina sa o-ftalaldehidom(OPA), koji reagira sa primarnim aminima proteina (N-terminalne aminokiseline i -NH2 grupalizina). Osjetljivost se može povećati prethodnom hidrolizom proteinskog uzorka.

5. Metoda mjerenja refraktivnog indeksa zasniva se na mjerenju prelamanja ulaznesvjetlosti na smjesu uzorka, ali za serum, to će u principu odražavati masu prisutnih proteina.Obzirom da serum sadrži i znatnu količinu ostalih tvari, refraktometar se mora specifičnokalibrirati sa serumom poznate koncentracije proteina.

Vrlo važni koraci na nivou standardizacije prilikom određivanja ukupnih serumskih proteina supoduzeti osamdesetih godina prošlog stoljeća. U tom periodu univerzalno se prihvatilokorištenje goveđeg serumskog albumina kao referentnog materijala koji će se koristiti zaodređivanje ukupne koncentracije proteina u spektrofotometrijskim metodama poput biuretskei Lowry-eve metode. On se preporučuje kod svih određivanja koja za princip imaju biuretskureakciju.


Potrebni reagensi:- 200,00 g 0, 9% vodene otopine NaCl- 100,00 g 6% vodene otopine NaOH- 200,00 mL Biuret reagensa koji se priprema na slijedeći način: 3,46 g bakar (II)-sulfata

otopiti u 10,00 ml vruće vode i ostaviti da se ohladi (otopina A). Otopiti 34,6 gnatrijumcitratdihidrata i 20,0 g natrijumkarbonata u 80,0 ml vruće vode i ohladiti (otopina B).Pomiješati otopine A i B i razrijediti sa vodom do 200,0 ml. Ovakav Biuret reagens stabilanje pri sobnoj temperaturi 6 mjeseci. Ukoliko se pojavi zamućenje ili talog ne koristiti takavreagens.

- 0,2% NaOH u 50% etanolu (za uzorke pšenice, raži, ječma, zobi)


28

Priprema slijepe probe:

Na 1 ml otopine NaOH dodati 1 ml Biuret reagensa i sadržaj protresti. Na to dodati 0,4 mlotopine NaCl i promiješati.

Priprema i upotreba standardne otopine proteina:

Odvagati 0,0500 g albumina goveđeg seruma (BSA) (liofilizirani prah, nabavljen od Sigma) iotopiti u 5,00 ml 0,9 % NaCl. Dobijenu otopinu izraziti u mg/mL, označiti je kao osnovnuotopinu, te od nje prirediti po 10,00 mL slijedećih radnih otopina: 7.5, 5.0, 2.5, 1.0 i 0.5 mg/ml.

Izmjeriti apsorbansu svih otopina (uključujući i osnovnu) pri 545 nm koristeći se slijedećimpostupkom:

U čiste i označene epruvete (pripremiti istovremeno za standarde, uzorke i slijepu probu) sipatipo 1 ml otopine NaOH, dodati u svaku 1 ml Biuret reagensa i sadržaj protresti. Na to dodati 0,4ml otopine standarda (ili uzorka) zatvoriti i promiješati. Nakon 15 minuta sadržaj istresti ukivetu, obrisati kivetu i mjeriti apsorbansu. Konstruirati kalibracionu krivu A = f (c), nanosećina apscisu konačne koncentracije standardnih otopina.

Priprema i rad sa uzorkom proteina

UZORAK 1: Odvagati približno 2 g sirovog bjelanca (sa preciznošću na četiri decimalne cifre)u prethodno odvaganoj čistoj i suhoj čašici. Pomoću 0,9 % otopine NaCl prebacitikvantitativno sadržaj bjelanca u odmjerni sud od 50 ml. Izmjeriti apsorbansu takopripremljenog uzorka pri istim uvjetima korištenim za rad sa standardnom otopinom BSA.Pomoću jednačine pravca dobijene iz kalibracione krive izračunati koncentraciju ukupnihproteina u uzorku bjelanca izrazivši konačan rezultat kao mg proteina/g svježeg bjelanca.

UZORAK 2: Odmjeriti ispitivanog uzorka po 1-1,5 g materijala koji je prethodno usitnjem iliizmljeven u staviti u odgovarajuće posebne porculanske avane. Probama dodati 2 g kvarcnogpijeska i dodati po 3 mL NaOH u alkoholu, a zatim pažljivo rastrljavati uzorak u trajanju od triminute kako bi se razorile ćelije i ekstrahovali proteini. Posle isteka 3 minute dodati u avan još12 mL rastvarača i ponovo homogenizirati u trajanju od dvije minute. Tako dobijenu smjesukvantitativno prebaciti u odmjerni sud od 50 mL; avan 2-4 puta isprati sa po 5 mL rastvarača iprenijeti u odmjerni sud. Odmjerni sud dopuniti sa rastvaračem do mjerne crte, dobropromućkati i ostaviti sa stoji 1 sat. Sadržaj profiltrirati u suhu erlenmajericu od 50 mL. 10 mLtakvog filtrata staviti u kivete za centrifugiranje i dodati po 1 mL 6% NaOH i po 1 mL Biuretreagensa. Smjesu u epruvetama dobro promućkati i centrifugirati u trajanju pd 5 minuta. Akorastvor nije proziran, onda je potrebno da se eksperiment ponovi uz dodavanje po 2 mL baze ireagensa. Poslije centrifugiranja, rastvor mora biti bistar (proziran).


29

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Prikazati mehanizam Biuret reakcije na primjeru uree?

4. REZULTATI

Standard A

Uzorak A1 A2 A3 Asr St dev


30

- Napomena: Priložiti grafik

OVJERA VJEŽBE:


31

Vježba br. 5

ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE ALBUMINA I GLOBULINA

1. TEORETSKI DIO

Prečišćavanje proteina je osnovni korak u izučavanju njihovih fizičkih i bioloških svojstava ijedan je od najčešćih postupaka u praktičnoj biohemiji. Za postizanje prečišćavanja proteinmora biti oslobođen od svog biološkog matriksa i selektivno odvojen od ostalih proteinaodgovarajućim postupkom frakcioniranja. Predmeti izučavanja na prečišćenim proteinimaodređuju prihvatljivost granica čistoće koju je potrebno dostići. Tako, ispitivanja aktivnosti nezahtijevaju 100% čist preparat, dok osnovna strukturna izučavanja zahtijevaju. Suprotno,ispitivanja aktivnosti zahtijevaju očuvanje funkcije i stoga smanjenje denaturacije i proteolize,dok strukturna ispitivanja se mogu izvesti na denaturiranom proteinu. Količina prečišćenogproteina potrebna za izučavanje objektivno utiče na izbor metoda prečišćavanja. Neke tehnikeimaju visok kapacitet i mogu raditi sa velikim volumenima i koncentracijama proteina, dokdruge imaju ograničen kapacitet.Proteini se razlikuju u njihovoj osjetljivosti na denaturaciju tokom procesa ekstrakcije iprečišćavanja, posebno u njihovoj osjetljivosti na povišene temperature (iznad 40 C), naprisutnost deterdženata, teških metala i na ekstremne pH vrijednosti. Ove razlike često suiskorištene u strategiji prečišćavanja pojedinih proteina i tehnika zasnovanih na njihovomzajedničkom svojstvu u ranim fazama procesa prečišćavanja. Topivost prirodnih proteinauvjetovana je pH vrijednošću (topivost postaje minimalna u izoelektričnoj tački), dodatkomsoli kao što su amonijumsulfat i prisutnošću organskih otapala, kao što su aceton i butanol, priniskim temperaturama. Male razlike u ovakvim svojstvima enzima također su iskorištene upostupcima frakcioniranja i prečišćavanja. Spojevi koji sadrže tiolnu grupu kao što sumerkaptoetanol i glutation (redukovani oblik) često se dodaju enzimskim preparatima daspriječe oksidaciju sulfhidrilnih grupa, koja se može desiti odmah nakon razaranja stanice iprethodne denaturacije.Tokom odvijanja prečišćavanja proteina često se prave razrijeđene otopine proteina. Nažalost,razrijeđene otopine proteina, posebno prečišćenih proteina, često su nestabilne ili zbogdisocijacije subjedinica ili adsorpcije proteina na površini posude. Problemi adsorpcije mogubiti smanjeni upotrebom silikoniziranih posuda uz dodatak malih koncentracija deterdženatakao što su Triton X-100 ili Tween 20. Problemi disocijacije mogu često biti prevaziđenidodatkom glicerola (10% do 40% (v/v)), glukoze ili saharoze ili povremeno albumina goveđegseruma (bovine serum albumin, BSA). Čuvanje uzoraka pri 0-4 C je također korisno. Dužečuvanje može biti omogućeno upotrebom visokih koncentracija amonijsulfata (to objašnjavazašto su trgovački preparati enzima često spremljeni u otopini amonijsulfata).

Prečišćene proteine moguće je frakcionirati na različite načine:1. Frakcioniranje denaturacijom koristi razlike u toplotnoj osjetljivosti proteina. Kada

je poznata temperatura denaturiranja, moguće je ukloniti više termolabilnihkontaminirajućih proteina grijanjem smjese do temperature koja je 5-10 C niža od ovekritične temperature u trajanju od 15-30 minuta. Denaturirani, neželjeni protein sepotom ukloni centrifugiranjem. Prisustvo supstrata, produkta ili inhibitora enzima čestostabilizira enzim i omogućava da se može primijeniti čak i viša temperatura toplotne


32

denaturacije. Na sličan način, proteini se razlikuju u lakoći denaturiranja priekstremnim pH vrijednostima ( 3 ili 10 ). Kompletan proteinski ekstrakt se dovedena pH ne manji od jedne pH jedinice od pH unutar kojeg se ispitivani protein taloži.Osjetljiviji proteini će se istaložiti i ukloniti centrifugiranjem.

2. Frakcioniranje solima izvodi se postepenim dodavanjem odgovarajuće soli. U praksiamonijsulfat je najčešće korišten jer je dobro topiv u vodi, može se dobiti u visokomstepenu čistoće, jeftin je i nema štetnog uticaja na strukturu proteina. Nakon svakogdodatka soli mora se osigurati potpuno otapanje soli i nastajanje homogenog otapala.Istaloženi protein se odcentrifugira, otopi u svježem puferu i ispita u odnosu na ukupniprotein i proteinsku aktivnost. Sve faze se izvode pri 0-10 C radi smanjenjadenaturacije. Dati protein se normalno isoli u okviru uskog područja koncentracijeamonijsulfata. To je posljedica činjenice da protein-protein udruživanje za dati proteinnaglo postaje dominantno nad protein-voda i protein-so interakcijama. To je zbog togašto dodatak soli uklanja sloj molekula vode koji okružuje hidrofobne grupe na površiniproteina, što omogućava hidrofobnim grupama da uzrokuju udruživanje proteina i stogataloženje.

3. Frakcioniranje organskim otapalom zasniva se na razlikama u topivosti proteina uvodenim otopima organskih otapala kao što su etanol, aceton i butanol. Organskootapalo snižava dielektričnu konstantu medija putem povećanja privlačnosti izmeđunabijenih molekula proteina i smanjenja njihove interakcije sa vodom. Topivostproteina se stoga smanjuje. Frakcioniranje organskim otapalom u biti je suprotnoprocesu obuhvaćenim frakcioniranjem solima. Kod prvog procesa, hidrofobne grupeproteina su znatno zaštićene molekulama organskog otapala, a jonske grupe postajudominantne, dok kod drugog procesa hidrofobne grupe su jako izložene.

4. Frakcioniranje organskim polimerom slično je frakcioniranju organskim otapalom umehanizmu djelovanja, ali zahtijeva niže koncentracije za izazivanje taloženja proteina.Najčešće korišteni polimer je polietilenglikol (PEG) sa relativnom molekulskommasom u području 6 000 - 20 000.

5. Izoelektrično frakcioniranje (frakcioniranje taloženjem u izoelektričnoj tački)zasnovano je na tome da proteini imaju minimalnu topivost u izoelektričnoj tački. Priovom pH postoji jednak broj pozitivnih i negativnih naboja proteinske molekule iintermolekulska odbijanja su minimalna, a intermolekulska privlačenja maksimalna, štorezultira u nastajanju netopivih agregata. Osnovno što se može iskoristiti je iliuklanjanje neželjenog proteina, podešavanjem pH ekstrakta proteina tako da se izazovetaloženje ovih proteina, ali ne i ispitivanog proteina, ili uklanjanje ispitivanog proteina,podešavanjem pH ekstrakta na pHi tog proteina.

Centrifugiranje je moćna i opće primjenjiva metoda za razdvajanje i analizu stanica, organelai bioloških makromolekula. Čestica koja se kreće kružno sa poluprečnikom r, ugaonombrzinom , izložena je centrifugalnom polju koje iznosi 2r.

Brzina taloženja tj. brzina sedimentacije čestice ovisi o nekoliko činioca:o masi čestice – teže čestice brže se talože od onih lakših;o obliku čestice – koeficijent trenja kompaktne čestice manji je nego u slučaju izdužene

čestice iste mase, što znači da će se kompaktnije čestice brže taložiti od izduženih;o gustoći čestice – gušće čestice se kreću mnogo brže od onih manje gustoće;


33

o gustoći otopine u kojoj se čestica nalazi.

Krvna plazma je svijetlo-žuta tečnost, a najveći dio nje čini voda (oko 90%) u kojoj suotopljene različite organske i anorganske tvari, oko 7% proteina, 1% raznih anorganskih soli i0,1% glukoze. Među organskim tvarima najvažnije su proteini plazme. U 1 litri plazme ima ihoko 73 grama.

Te proteine možemo svrstati u 3 velike grupe:

- Albumini – 45 g/l – to su proteini plazme s najmanjom molekulskom masom, te su vrloprikladni za održavanje osmotskog tlaka. Osmotski tlak je vrlo važan, jer održava protutežuhidrostatskom tlaku krvi koji stvara srce. Albumini se sintetiziraju u jetri i odatle se otpuštaju ukrv. Sudjeluju u prijenosu raznih hormona, različitih jona, aminokiselina, masnih kiselina,lijekova itd.- Globulini – 25 g/l – važni su nositelji odbrane organizma u obliku različitih antitijela. Dijelese na alfa, beta i gama globuline. Uloga alfa i beta globulina je slična ulozi albumina, a gamaglobulini su zapravo imunoglobulini (Ig), a to su molekule koje obavljaju zaštitne funkcije.- Fibrinogeni – 3 g/l – vrlo važni proteini u procesu zgrušavanja krvi, te osiguravajuzaustavljanje krvarenja. Fibrinogeni pomoću trombocita stvaraju «mrežu» u kojoj se ondaulove eritrociti i nastaje ugrušak (tromb). Krv bez fibrinogena je defibrinirana krv.


Potrebni reagensi:- 0, 9 % vodena otopina NaCl- 2, 0 % otopina trihloracetatne kiseline u 0,9 %-om NaCl- Biuret reagens- 6,0 % vodena otopina NaOH

U uzorku goveđeg seruma izmjeriti koncentraciju ukupnih proteina koristeći se Biuret testom(100 l goveđeg seruma razrijediti sa 900 l 0,9 % -ne otopine NaCl, a za daljnju proceduruvidjeti vježbu „Kvantitativno određivanje ukupnih proteina Biuret metodom“). Podatakzabilježiti u radni dnevnik i preračunati na sadržaj proteina izražen u mg/100 ml seruma.Nakon toga u dvije ependorf epruvete (centrifugalne kivete) odmjeriti po 100 l uzorkagoveđeg seruma i na to dodati po 900 l 2,0 % otopine trihloracetatne kiseline. Propisnozatvoriti kivete, okrenuti ih nekoliko puta da se sadržaj izmiješa i ostaviti ih 10 minuta da seizvrši taloženje. Za to vrijeme podesiti centrifugu na 3 500 o/min i centrifugiranjem u trajanju 5minuta oboriti globuline na dno kiveta. U supernatantima odrediti sadržaj albumina Biurettestom. Iz razlike koncentracija ukupnih proteina i albumina izračunati koncentraciju globulina.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Glavne osobine albumina (A), globulina (B) i prolamina (C) su:a) Nerastvorljivi u vodi, rastvorljivi u 70-80% alkoholub) Dobro rastvorljivi u vodic) Nerastvorljivi u vodi i u rastvorima soli umjerene koncentracije


34

4. REZULTATI

Standard A

Uzorak A1 A2 A3 Asr St dev

- Napomena: Priložiti grafik

OVJERA VJEŽBE:


35

Vježba broj 6ENZIMI

1. TEORETSKI DIO

Enzimi su globularni proteini tercijarne ili kvarterne strukture, koji na površini imaju većinupolarnih aminokiselinskih ostataka, dok su nepolarni ostaci okrenuti prema unutrašnjostimolekule. Ovako organizirane proteinske molekule nazvane enzimi imaju visoku katalitičkumoć i specifičnost za pojedine hemijske reakcije i supstrate u živim organizmima. Katalitičkamoć enzima se manifestira njegovom sposobnošću da smanjuje energiju aktivacije potrebnu zaodvijanje hemijskih reakcija. Enzimi ubrzavaju reakcije i vrlo često kataliziraju samo jednuhemijsku reakciju ili skup vrlo srodnih reakcija, a specifičnost za supstrat je najčešće potpuna.

U trenutku katalitičke promjene supstrat je s enzimom povezan uglavnom slabimnekovalentnim vezama (vodikove, hidrofobne ili Van der Waalsove veze), što omogućava brzuizmjenu molekula supstrata na enzimu. Ta izmjena se događa u jednom dijelu enzimanazvanom aktivno mjesto. Aktivno mjesto predstavlja mali broj aminokiselina smještenih uunutrašnjosti u hidrofobnom dijelu proteinske molekule, čije prostorno uređenje odgovaramolekuli supstrata. Taj prostor u hidrofobnoj unutrašnjosti je odgovoran za njegovu katalitičkumoć.Internacionalnom konvencijom enzim se svrstava u jednu od šest vrsta na osnovu hemijskereakcije koju katalizira. Svaka vrsta se dijeli prema prirodi hemijske grupe, koenzima i drugihgrupa uključenih u reakciju. Saglasno pravilima Evropske komisije (EC), svaki enzim može seoznačiti jedinstvenim kodom od četiri broja i nedvosmislenim sistematskim imenomzasnovanim prema kataliziranoj reakciji.


36

Šest vrsta enzima su: Oksidoreduktaze, koje prenose atome hidrogena, oksigena ili elektrone od jednog

substrata na drugi; Transferaze, koje prenose hemijske grupe između substrata; Hidrolaze, koje kataliziraju hidrolitičke reakcije; Liaze, koje razlažu substrate reakcijama različitim od hidrolize; Izomeraze, koje pretvaraju izomere jedan u drugi intermolekularnim premještanjem; Ligaze (sintetaze), koje kataliziraju nastajanje kovalentne veze, uz cijepanje

odgovarajućeg nukleotid-trifosfata.

Jedinica za enzimsku aktivnostJedna enzimska jedinica definira se kao količina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 °C,1 bar), razloži 1 μmol supstrata za jednu minutu. Specifična aktivnost enzima može se izrazitikao broj enzimskih jedinica po miligramu proteina.Nova internacionalna jedinica (IU) određena od strane EC je katal (kat). Definira se kaokoličina enzima koja pri optimalnim uvjetima (25 °C, 1 bar) razloži 1 mol supstrata za jednusekundu. Iz praktičnih razloga u upotrebi su manje jedinice kao mikrokatal (μkat), pikokatal(pkat), nanokatal (nkat) itd.

Amilaza spada u grupu hidrolaza (karbohidraze), jer kataliziraju hidrolizu oligo- i polisaharida.Hidroliza se vrši razlaganjem glikozidnih veza između monosaharida, koji izgrađuju oligo- ipolisaharide. α-amilaza se nalazi u svim organima čovjeka i drugih sisara (ubikvitaran enzim),a najveća aktivnost je u pljuvački (gdje se naziva ptijalin) i u pankreasnom soku (gdje se nazivadijastaza). Specifična je za α1-4 glikozidnu vezu u polisaharidima (škrob i glikogen). Pošto nemože da cijepa α1-6 glikozidnu vezu, razlaže se oko 80% molekule škroba tj. potpunohidrolizira amilozu i amilopektin. Krajnji produkti koji nastaju hidrolizom škroba ovimenzimom su maltoza i granični dekstrini koji nastaju na mjestima grananja u amilopektinu, tj.gdje se nalazi α1-6 glikozidna veza. Zato se α-amilaza još naziva i endoamilaza (unutrašnja) ilidekstrinogena amilaza. Za razliku od α-amilaze, β-amilaza je biljnog porijekla. Specifična je,također, za α1-4 glikozidnu vezu, ali djeluje na krajevima polisaharidnih lanaca. Zato imanaziv-egzoamilaza (spoljašnja) i krajni produkti njenog djelovanja su molekule maltoze.

Pepsin je također enzim iz grupe hidrolaza (III grupa enzima) iz grupe peptidhidrolaza. To jeproteolitički enzim koji cijepa peptidne veze u denaturiranim proteinima u želucu. Kada seproteini u želucu denaturiraju hloridnom kiselinom iz želučanog soka, dobiju naziv acidalbumini (acid proteini). Pepsin prvenstveno cijepa peptidne veze između aromatskih idikarboksilnih aminokiselina tako da nastaju, kao produkti, duži ili kraći peptidni lanci. Kraćilanci se nazivaju peptoni, a duži albumoze. Smjesa peptona i albumoza se koristi kao podlogaza bakterije. Pepsin luče glavne ćelije želučane sluznice u obliku proenzima-pepsinogena kojije neaktivan što se tiče proteolize. Pepsinogen se pri pH ispod 3 reverzibilno aktivirapromjenom konformacije, a zatim autokatalizom odcjepljuje dva peptida sa N-terminalnogkraja, prelazeći ireverzibilno u pepsin.

Schardingerov enzim katalizira oskidaciju aldehida i otuda se naziva aldehid-dehidrogenazaSchardingera (aldehid: O2-oksidoreduktaza 1.2.3.1.). Pored toga, ovaj enzim ubrzava


37

oksidaciju hipoksantina i ksantina u mokraćnu kiselinu. Zahvaljujući drugoj reakciji kojukatalizira, dobio je naziv ksantin-oksidaza (ksantin: O2-oksido-reduktaza-1.2.3.2). Dugo semislilo da su to dva odvojena enzima.Sviježe mlijeko sadrži dosta Schardingerovog enzima. Jetra čovjeka također je bogata ovimezimom. Schardingerov enzim oksidira podjednako efikasno i aromatske i alifatske aldehide.Da bi se ostvarila oksidacija (putem oduzimanja hidrogena) in vitro, potrebno je reakcionojsmjesi dodati supstancu-akceptor hidrogena. U tu svrhu može da posluži metilensko plavo, jerono prima hidrogen do oksidiranog supstrata i odmah se obezboji-prelazi u leuko formu. Akoduže stoji, metilensko plavo može ponovo da se oboji, jer lahko predaje hidrogen oksigenu izzraka. In vivo, hidrogen oduzet od supstrata predaje se direktno oksigenu, ili preko NAD-a, akoje hipoksantin supstrat oksidacije. Schardingerov enzim spada u aerobne dehidrogenaze u obaslučaja: i kada djeluje na aldehide i kada djeluje na purine. Ako upotrebljavamo mlijeko kaoizvor enzima, neophodno je da bude svježe. Temperatura ključanja brzo razara enzim.


Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvačke)

Skupiti 2-3 ml pljuvačke, profiltrirati je, podijeliti na dva dijela. Jedan dio proključati naplameniku ili rešou. U šest epruveta pripremiti smjese prema datoj tabeli:

Epruveta I II IIIŠkrob 2-3 ml 2-3 ml 2-3 ml

Neprokuhanapljuvačka

Nekolikokapi

Prokuhanapljuvačka

Nekolikokapi

Lugolov reagens 2-3 kapi 2-3 kapi 2-3 kapi

Sve epruvete staviti u vodeno kupatilo na 37 ºC na inkubiranje od 30 minuta. Nakon togvremena izvaditi epruvete i zaključiti šta se desilo u epruvetama.

Izvesti Fehling-ovu reakciju na sadržaje u drugoj i trećoj epruveti. U svaku dodati po 1-2 mlpripremljenog Fehlingovog reagensa i zagrijavati do ključanja. Zaključiti šta se desilo u ovimepruvetama.

Praćenje aktivnosti pepsina

U tri epruvete odmjeriti po 1,0 ml 1 % otopine pepsina u 0,5 % otopini HCl. U četvrtu epruvetuodmjeriti 1,0 ml iste otopine pepsina, ali prethodno prokuhanog na 70 - 100 °C (u tu svrhu začitavu grupu studenata odmjeriti manju čašu 10 ml otopine pepsine i prokuhati).Treba pripremiti kuhano bjelance kokošijeg jajeta isjeckano na kockice koje će poslužiti kaosupstrat. Uzeti četiri epruvete i dodati u njih:


38

Epruveta Bjelance Pepsin Prokuhani pepsin 0,2% HCl 1% Na2CO3I 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mLII 2-3 kockice 5 mLIII 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mLIV 2-3 kockice 2-3 kapi 5 mL

Sve četiri epruvete staviti u vodeno kupatilo, na 37 °C i inkubirati 30 minuta. Pripremiti novečetiri epruvete i nakon inkubacije sadržaje epruveta dekantirati u nove pripremljene epruvete.U izdvojene filtrate dodati 1-2 ml Biuret reagensa. Uočiti gdje se desila Biuret reakcija.

Dokazivanje prisustva dehidrogenaze Schardingera u mlijeku

U tri epruvete staviti po 1 ml svježeg mlijeka. U jednu, dodati 1 kap 0,02% rastvorametilenskog plavog i 1 kap 0,4% rastvora aldehida, a u drugoj samo metilenskog plavog.

Epruveta Mlijeko Prokuhano mlijeko Metilensko plavo 0,4% aldehidI 1 ml 1 kap 1 kapII 1 ml 1 kapIII 1 ml

Sadržaj epruveta promiješati i staviti u vodeno kupatilo na 70 °C. Kroz nekoliko minuta sadržajprve epruvete izgubi boju.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koji enzim pokazuje apsolutnu specifičnost prema supstratu:a) Himotripsinb) Papainc) Ureazad) Arginazae) Lizozom

2. Koji od proteolitičkih enzima pokazuje esteraznu aktivnost:a) Tripsinb) Karboksipeptidazac) Aminopeptidazad) Himotripsine) Pepsin

3. Na kojoj temperaturi se enzimi denaturiraju:a) 0 °Cb) 80-100 °Cc) 20-30 °Cd) 30-40 °C

4. Koja je temperatura optimalna za djelovanje većine enzima:a) 50-60 °C


39

b) 15-20 °Cc) 80-100 °Cd) 35-40 °C

5. Koji optimum pH ima enzim pepsin:a) 1,5-2,5b) 4-5c) 6-7d) 8-9e) 10-11

6. Kinetika enzima je riješena preko Michael-Mentenove konstante. Napisati jednačinu iprikazati je grafički?


40

4. REZULTATI

Dokazivanje aktivnosti i termolabilnosti ptijalina (α-amilaze iz pljuvačke)

Broj epruvete

Rezultat

Fehling-ova proba

Komentar

Praćenje aktivnosti pepsina

Broj epruvete

Biuret proba

Komentar


41

Dokazivanje prisustva dehidrogenaze Schardingera u mlijeku

Broj epruvete

Rezultat

Komentar

OVJERA VJEŽBE:


42

Vježba broj 7

ODREĐIVANJE AKTIVNOSTI α-AMILAZE PO WOHLGEMUTH-U

1. TEORETSKI DIO

Postoji niz metoda za određivanje aktivnosti amilaze. Prema njihovom principu mogu sepodijeliti na slijedeće grupe:o Viskozimetrijske metode (zasnivaju se na smanjenju viskoznosti rastvora škroba zbog

hidrolitičkog djelovanja amilaze);o Saharogene metode, zasnivaju se na određivanju reduktivnih spojeva koji nastaju

hidrolizom škroba. Ove metode nisu precizne;o Hromogene metode, koriste se u proteklih 20-tak godina, a zasnivaju se na djelovanju

amilaze na škrob ili amilozu ili amilopektin koji su kovalentno vezani (eterski iliesterski) za neku boju koja je derivat trijazina, koja se oslobađa pri hidrolizi škroba(amiloze ili amilopektina) , centrifugiranjem odvaja i mjeri fotometrijski;

o Nefelometrijske metode, zasnivaju se na smanjenju zamućenosti reakcione smjeseškroba i ispitivanog materijala (urin, plazma, pljuvačka) nakon hidrolize škroba;

o Spektrofotometrijske i fluorimetrijske enzimske metode u kojima se pratioksidoredukcija nikotinamidadenin dinukleotida (NAD-a);

o Fotometrijske metode sa sintetskim supstratima čiji se razgradni produkti mogu mjeritifotometrijski, kontinuirano. Takvi su supstrati razni: p-nitrofenilni i Cl-p-nitrofenilnimaltozidi (u obliku testova). To su najnovije i dosta precizne metode. Zamjenjujuklasične metode zbog toga, što hidrolizom škroba pod djelovanjem amilaze nastajuprodukti koji nisu tačno definirani u datom momentu (amilo-, eritro-, ahromodekstrini);

o Amiloklasične metode-zasnivaju se na svojstvu škroba ili amiloze da sa jodom dajuplavi produkt (amilopektin sa jodom daje ljubičastu boju). Djelovanjem amilaze naškrob nastaju prvo amilodekstrini (sa jodom daju plavoljubičastu boju), zatimeritrodekstrini (sa jodom daju crvenu boju), ahromodekstrini (ahrodekstrini) sa jodomse ne boje

U grupu amiloklasičnih metoda ubraja se i metoda određivanja amilaze po Wohlgemuth-u.Prva metoda za određivanje aktivnosti amilaze koja se zasniva na tome koje razrijeđenjeuzorka još razgrađuje škrob, pa se dodatkom joda (Lugolovog rastvora) ne javlja plava boja.Metodu je uveo Wohlgemuth kao prvu metodu određivanja enzima u dijagnostičke svrhe.Najveću dijagnostičku vrijednost metoda je pokazala kod oboljenja pankreasa i parotitisa. Takoα-amilaza iz pljuvačke (ptijalin) ima povećanu aktivnost u pljuvačci, serumu i urinu kodakutnog parotitisa (zaušnjaka) ili kod čira (ulcusa) na želucu. Amilaza iz pankreasa (dijastaza)ima povećanu aktivnost u serumu i urinu kod akutne nekroze pankreasa u početnom stadiju,akutnog pankreatitisa. Značajno povišenje aktivnosti dijastaze u urinu javlja se kod upalažučne kese, uremije, perforacije čira na želucu, postoperativnih stanja.


43


U stalak se pripremi 10 čistih epruveta i u svakoj odpipetira po 1 ml fiziološkog rastvora(0,90% NaCl). U posebnu, čistu epruvetu se sakuplja profiltrirana pljuvačka bez dodatka voderadi lakšeg i bržeg filtriranja. Sakupi se nešto više od 1 ml, a potom odpipetira 1 ml i stavi uprvu epruvetu.Sadržaj epruvete se dobro promiješa i na taj način se dobije dva puta razblažena pljuvačka.Nakon toga se odpipetira 1 ml tako razblažene pljuvačke i stavi u drugu epruvetu. Sadržaj i oveepruvete se dobro promiješa i dobije četiri puta razblažena pljuvačka. Postupak se ponavlja svedo desete epruvete iz koje se 1 ml pljuvačke izbaci. Potrebno je prilikom ovog razblaživanjapipetu kojom se pipetira i prebacuje sadržaj jedne epruvete u drugu, nakon svakog prebacivanjasadržaja isprati vodom. Kada se naprave razblaženja pljuvačke, u svaku epruvetu se odpipetirapo 1 ml 0,1% koloidnog rastvora škroba. Sadržaji u svakoj epruveti se promiješaju, sve se vratiu stalak i termostatira na sobnoj temperaturi. Poslije 15 minuta termostatiranja u svakuepruvetu (od desete do prve) se doda po jedna kap Lugolovog reagensa. U epruvetama ukojima je škrob hidroliziran nema plave boje, a u kojima nije hidroliziran pojavljuje se plavaboja. Između obojenih i neobojenih sadržaja u epruveta javlja se jedan koji sa Lugolovimrastvorom daje crvenu boju. Boja potiče od razgradnih produkata škroba-eritrodekstrina sajodom iz Lugolovog reagensa. U toj epruveti razblažena pljuvačka sadrži jednu enzimskujedinicu α-amilaze, po Wohlgemuth-u.

Jedna enzimska jedinica α-amilaze po Wohlgemuth-u je ona aktivnost ovog enzima pri kojoj sena temperaturi od 38 C hidrolizira 1 mg škroba za 30 minuta, odnosno 0,00055 mg škroba zajednu sekundu. Najmanje razblaženje uzorka u kome se za 30 minuta na temperaturi od 38 Chidrolizira jedan mg škroba do produkata koji sa Lugolovim rastvorom ne daju plavu boju(eritrodekstrini-daju crvenu boju) sadrži jednu jedinicu α-amilaze po Wohlgemuth-u (1 WJ).

Pretvaranje IU u katale:1 kat = 1 mol/s = 60 mol/min = 60x106 μmol/min = 6x107 IU1 IU = 1 μmol/min = 1/60 μmol/s = 1/60 μkat = 16,67 nkat

Ukoliko se kao supstrat na koji djeluje amilaza koristi škrob koji ima molekulsku masu 55000,onda 1 WJ α-amilaze iznosi 0,01 nkat.

3. ZADACI I VJEŽBE

1. Koji pH optimum ima enzim amilaza:a) 1,5-2b) 7-7,5c) 8-9d) 3,5-4e) 4,5-5

2. Za koje enzime su Mg2+ aktivatori:a) Fosforilazeb) Amilaze


44

c) Heksokinazed) Kreatinkinazee) Karboksipeptidaze

3. Za koje enzime su joni Zn2+ aktivatori:a) Karboksipeptidazub) Karboanhidrazuc) Glutamatdehidrogenazud) Laktatdehidrogenazue) Aminooksidazu

4. Koji je jon neophodan za djelovanje kinaza (fosfotransferaza) koje kataliziraju građenjeO-fosfatnih estera:a) Mg2+

b) Co2+

c) Ca2+

d) Na+

e) K+

7. Kod kojih enzima u aktivnom centru su dokazane aminokiseline glutamat i aspartat:a) Piruvatdehidrogenazeb) Lizozomuc) Pepsinud) Ureazie) Karboksipeptidazi

8. Koji enzimi pripadaju grupi „serinskih“ enzima:a) Pepsinb) α-himotripsinc) tripsind) acetilholinesterazae) lizozom

9. Dokazati da 1 WJ iznosi 0,01 nkat?


45

4. REZULTATI

Izračunati aktivnost uzorka pljuvačke i prikazati u WJ, kat i IU.

Brojepruvete

Razblaženjepljuvačke

WJ

OVJERA VJEŽBE:


46

Vježba broj 8

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREĐIVANJE SADRŽAJA UKUPNIHFENOLA U UZORKU PČELINJEG MEDA

1. TEORETSKI DIO

Postoji više načina da se odredi ukupna količina fenolskih spojeva, uz napomenu da nijedna odovih tehnika ne detektuje sve fenolske spojeve. Jedna od najčešće korištenih metoda zaodređivanje ukupnog sadržaja fenola je stara oko 100 godina i u početku je razvijena zaistraživanje metabolizma proteina kod ljudi. Folin i Denis (1912) su koristili kolorimetrijskimetod detekcije tirozina prilikom hidrolize proteina. Aktivni reagens je žut i sastavljen je odkompleksnih polimernih jona formiranih od fosfomolibdenove i fosfovolframove kiseline. Činise da ovaj rastvor sadrži integrirane polimerne serije i da imaju formu tetraedra okruženu saoktaedarskim molibden oksikiselinskim jedinicama u kojoj volfram može lahko supstituiratimolibden. Ovaj reagens oksidira fenolate i heteropolarna kiselina biva reducirana iz stanja +6 usmjesu stanja +6 i +5 uz nastanak plavog molibden-volframovog kompleksa. Metod jemodificiran od strane Folin-a i Ciocalteu-a (1927). Modifikacija uključuje dodatak litijuma ufosfovolframat / fosfomolibdat reagens na kraju procesa kuhanja. Dodatak litijuma spriječavaprecipitiranje i smetnje prilikom kvantifikacije u odnosu na intenzitet boje. Intenzitet bojemože biti korišten za kvantitativnu analizu na osnovu vrijednosti apsorbanse. Koncentracijafenola se izražava kao ekvivalenti galne, odnosno hlorogenske kiseline koje se koriste kaostandardi.Od ranije je evidentan uticaj fenolskih komponenti na ljudsko zdravlje. Najvjerovatnijenajstarija medicinska primjena fenolskih komponenti je upotreba fenola kao antiseptika. Zbognegativnog uticaja koji ima na tkiva, posebno nastajanje rana pri velikim koncentracijama, nijeviše u upotrebi. Do danas su se zadržale u upotrebi 0,5% otopina fenola protiv bakterijaStaphylococcus aureus i 1,5% otopina kao oralni anestetik. Druga česta upotreba fenolskihkomponenti je kao zaštita od UV zračenja. Prisustvo aromatskog prstena doprinosi efektivnojapsorpciji UV zračenja (između 280-315 nm) i na taj način štiti od opekotina. Najčešći sastojakkrema za sunčanje je p-aminobenzojeva kiselina (nije fenolski spoj). Ovaj sastojak se koristiodo 1970-ih kada je otkriveno da izaziva osip i akne. Alternative aktivne komponente susalicilati, kao što je oktilsalicilat, cimetati kao što je oktilmetilcimetat (nerastvoran u vodi ikoristi se za kreme nerastvorne u vodi), benzofenon, oksibenzon, antraanilati kao što jementilantranilat. Imaju ulogu pri stresnim situacijama u okolini, što uključuje zaštitu odvisokih nivoa vidljive i UV svjetlosti, odbrana od patogena i opšta zaštita od oksidativnogstresa, ozona. Također, utiču na ljudsko zdravlje uz moguće djelovanje kao antioksidanti,antikancerogeni i karvoprotektivni agens. Fenoli u biljkama nalaze slijedeće uloge: zaštita odštetnog UV zračenja, odbrana od biljojeda, odbrana od patogena, zaštita od fitoinhibije i zaštitaod reaktivnih kisikovih čestica (ROS-reactive oxygen species).


Potrebni reagensi:- Uzorci za analizu-Pčelinji med- Standard-galna kiselina, 98 %,


47

- Folin-Ciocalteu's reagens- Natrij-karbonat

Za analizu će biti korištena metoda po Singleton-Rossiju.

a) Priprema standardne otopine galne kiselineU čistoj i suhoj čašici odvagati 0,0250 g galne kiseline, dodati 200 l 95% etanola, laganoprotresti rukom da se supstanca otopi, te dodavanjem destilirane vode špric balonomkvantitativno prenijeti sadržaj (ispirati čašicu destiliranom vodom) u odmjerni sud od 50 ml.Postojanost ove otopine je 2 dana na 4 C. Odgovarajuća razrijeđenja ove standardne otopinekoriste se za pripremu kalibracionog pravca (npr. pripremiti po 10,00 ml 200, 150, 100, 50 i 10mg/l galne kiseline).

b) Priprema uzorkaU čistoj i suhoj čašici odvagati na analitičkoj vagi oko 1 g uzorka meda, zapisati tačnu masuodvage, dodati na uzorak 10 ml destilirane vode i miješati staklenim štapićem do otapanja.Otopinu sa uzorkom prenijeti kvantitativno u odmjerni sud od 25 ml uz ispiranje čaše sa još 10ml (u porcijama po 5-6 ml) destilirane vode. Nakon što se i taj dio prenese u odmjerni sud,otopina se protrese i dopuni do oznake od 25,00 ml pomoću špric balona. Ukoliko se primijetečvrsti ostaci u otopini, kompletan sadržaj profiltrirati preko običnog filtar papira u čistu čašu ilidrugi odmjerni sud. Nakon toga, određeni volumen uzorka razrijediti u omjeru 1 : 10 (npr. na1,00 ml uzorka dodati 9,00 ml destilirane vode).

c) Eksperimentalna proceduraNa 2,00 ml otopine uzorka ili standarda (razrijeđenih na gore opisani način) doda se 10,00 mlFolin-Ciocalteu reagensa razrijeđenog u omjeru 1:10 i promiješa. Ova smjesa se ostavi daodstoji oko 10 minuta. Zatim se doda 8,0 ml 7,5 %-og Na2CO3. Nakon 30 minuta stajanja nasobnoj temperaturi očita se apsorbansa pri 743 nm.Priprema slijepe probe obavlja se na isti način, s tom razlikom što se umjesto uzorka ilistandarda uzima 2,00 ml destilirane vode!

3. REZULTATI

Uzorak γ(mg/L) Apsorbansa (A)


48

- Koncentracija nepoznatog uzorka

- Uz izvještaj priložiti i grafik kalibracione krive

OVJERA VJEŽBE


49

Vježba broj 9

SPEKTROFLUORIMETRIJSKO ODREĐIVANJEANTIOKSIDATIVNOG KAPACITETA U UZORKU PČELINJEG MEDA

1. TEORETSKI DIO

Fluorimetrija je analitička metoda određivanja supstanci zasnovana na fluorescenciji.Fluorescencija predstavlja proces koji se dešava u vrlo kratkom vremenskom periodu (< 10-8 s)kada elektroni vraćajući se sa najnižeg pobuđenog energetskog nivoa u osnovno energetskostanje emitiraju pri tome energiju u vidu svjetlosti (fotona). Mnoge organske molekuleapsorbiraju u UV ili pak vidljivom valnom području, ali ne fluoresciraju. Ipak, većina od onihkoje fluoresciraju, od biološke su važnosti.

Slika 1: Dijagram energijskih razina koji pokazuje neke od energijskih promjena što se događaju pri (a)apsorpciji, (b) relaksaciji bez pojave zračenja i (c) fluorescenciji molekulskih vrsta.

Na slici 1c prikazuje se relaksacijski proces – fluorescencija. Treba uočiti da se prifluorescenciji molekule pojavljuju vrpce zračenja, jer se elektronski pobuđene molekule mogurelaksirati u bilo koje od nekoliko vibracijskih nivoa u osnovnom elektronskom stanju.Molekulske fluorescencijske vrpce, kao i molekulske apsorpcijske vrpce, sastavljene su odmnoštva blizu smještenih, često teško razlučljivih linija. Fluorescencija se, prema tome,definira kao zračenje emitovano pri prelasku molekule sa najnižeg vibracionog nivoaekscitiranog singlet stanja u osnovno stanje.Supstance koje fluoresciraju treba da sadrže fluoroforne grupe kojima je uslovljenafluorescencija. Uvođenje nekog supstituenta u jedinjenje može da pojača ili oslabi intenzitetfluorescencije. Supstituenti koji pojačavaju intenzitet fluorescencije nazivaju se auksofluori, aoni koji slabe intenzitet diminofluori. Auksofluori su supstituenti koji se kad se uvedupovećavaju delokalizaciju π elektrona. Obično se uvode ovi supstituenti sa orto i para


50

direkcionim grupama kao što su fluoro, amino, alkilamino, dialkilamino, hidroksi, metoksigrupe itd. Primjena fluorescencije je ograničena na spojeve koji posjeduju sistem dvostrukihveza. Najintenzivnije i najprimjenljivije fluoresciraju spojevi koji imaju aromatske prstenove,dok je vrlo mali broj alifatskih i aromatskih jedinjenja sa karbonilnom grupom koja mogu dafluoresciraju.Razni faktori mogu uticati na intenzitet fluorescencije, a to su: koncentracija uzorka kojifluorescira, prisustvo drugih supstanci koje fluoresciraju ili ne fluoresciraju, prisustvosupstanci koje izazivaju gašenje fluorescencije, uticaj koncentracije vodikovih jona (pH), uticajtemperature, uticaj rastvarača, uticaj razgradnje uzorka.

Postoje dvije vrste instrumenata koje se koriste za ovu metodu: fluorimetri i spektrofluorimetri.Razlika između ova dva instrumenta je neznatna, fluorimetar ima filtere, a spektrofluorimetarima prizme (monohromator) za selekciju valnih dužina pri pobuđivanju uzorka i prizme zaselekciju valne dužine prilikom registriranja emisije fluorescencije. Izvor i detektor se ujednostavnijim instrumentima mogu smjestiti puno bliže uzorku, čime se postiže većaosjetljivost.

Više biomolekula ima unutrašnju fluorescenciju koja se može ponekad koristiti bez potrebevezivanja kemijske grupe. Ponekad se ova unutrašnja fluorescencija mijenja ako se molekulanađe u specifičnoj sredini, tako da se distribucija ili vezivanje molekule može mjeriti.Bilirubin, npr., visoko je fluorescentan ako se veže na specifično mjesto albumina seruma.Cink-protoporfirin, nastao umjesto hemoglobina (ako željezo nije raspoloživo ili ako jeprisutno olovo) razvijanjem eritrocita, ima široku fluorescenciju i može se koristiti za detekcijuovih problema.


Potrebni reagensi:- Uzorak za analizu-Pčelinji med- Standardi-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilkroman-2-karboksilna kiselina (troloks),- fluorescein- hidrogenperoksid, 33-35 %,- bakar(II)-sulfat-pentahidrat, p.a.

Za analizu će biti korištena metoda oksigen radikal apsorpcijskog kapaciteta (ORAC). Ovametoda može kvantitativno mjeriti ukupni AC biološkog uzorka kao npr. ljudskog iživotinjskog seruma, tkiva, poljoprivrednih i prehrambenih proizvoda, sastojaka hrane,farmaceutskih proizvoda itd. Metoda mjeri efektivnost različitih prirodnih antioksidanataprisutnih u uzorku, u spriječavanju gubitka intenziteta fluorescencije fluoresceina (FL) ilifluorescentnog marker proteina -pikoeritrina (beta-PE) tokom njihovog izlaganja djelovanjuFR.


51

Struktura fluoresceina

Rezultati ORAC metodom postižu se dovodeći reakciju do kraja i integrirajući površinu ispodkinetičke krive relativno prema reakciji slijepe probe koja ne sadrži dodane antioksidante.Površina između krive uzorka i krive slijepe probe srazmjerna je koncentraciji svihantioksidanata prisutnih u uzorku. Svaka reakcija se kalibrira upotrebom standarda troloksa(Trolox), koji je sintetski vodotopivi vitamin E analog.

Grafički prikaz izračunavanja ORAC vrijednosti

Podaci se proslijeđuju elektronski od Perkin-Elmer luminiscentnog spektrometra LS 55 naračunarski sistem opremljen softverskim programom FL WinLab i analiziraju programomMicrosoft Excel 2000 primjenjujući jednačine (1) i (2) za površinu ispod fluorescentneopadajuće krive:

..../, / PSSPSUgmolTE SSSSkORAC (1)gdje je :

ORAC - oksigen radikal apsorpcijski kapacitet izražen u troloks ekvivalentima (TE, mol/g)

k - faktor razrijeđenja otopine;US - površina ispod fluorescentne opadajuće krive za uzorak


52

..PSS - površina ispod fluorescentne opadajuće krive za slijepu probu

SS - površina ispod fluorescentne opadajuće krive za standardPovršina integrala ispod fluorescentne opadajuće krive za uzorak, standard ili slijepu probuizračunava se po obrascu za izračunavanje površine trapeza na slijedeći način:

iiii ffttffttffttS 1112120101 ...21 ( 2 )

gdje je:S - površina integrala ispod fluorescentne opadajuće krive za uzorak, standard ili slijepu probut - vrijeme inkubacijef - relativni intenzitet fluorescencije

a) Priprema uzorkaU čistoj i suhoj čašici odvagati na analitičkoj vagi oko 1 g uzorka meda (zapisati tačnu masuodvage), dodati na uzorak 10 ml destilirane vode i miješati staklenim štapićem do otapanja.Otopinu sa uzorkom prenijeti kvantitativno u odmjerni sud od 25 ml uz ispiranje čašice sa još10 ml destilirane vode (u porcijama). Nakon što se i taj dio prenese u odmjerni sud, otopina seprotrese i dopuni do oznake od 25,00 ml pomoću špric balona. Od tako pripremljenog uzorkauzeti 100 l, razrijediti ih sa 900 l destilirane vode i nakon miješanja na vorteksu koristiti zaanalizu.

b) Priprema standarda, fluoresceina i generatora hidroksilnih radikalaPripremiti slijedeće otopine: 4,00 ml 1 mM otopine troloksa (na odvagu troloksa dodati 100 l etanola, a zatim 3,90

ml destilirane vode); zatim razrijeđivanjem u vodi pripremiti 1,00 ml 20 M otopinetroloksa;

10,00 ml 0,64 M otopine fluoresceina (FL); 1,00 ml 2,2 M H2O2; 10,00 ml 72 mM CuSO4 u destiliranoj vodi.

c) Eksperimentalna proceduraU kivetu za mjerenje dodati 50,00 l 0,64 M otopine FL, 100 l 20 M otopine troloksa iliuzorka meda (razrijeđenog na odgovarajući način), 1750 l destilirane vode, 50 l 7,2 mMotopine Cu2+, postaviti kivetu u aparat za mjerenje, a odmah zatim 50 l 2,2 M otopine H2O2 ipromiješati sadržaj. Nakon toga mjeriti intenzitet fluorescencije svakih 5 minuta do krajareakcije (sve dok relativni int. fluorescen, ne padne na nulu).

Slijepa proba:50,00 l 0,64 M otopine FL, 1850 l destilirane vode i nakon termostatiranja 50 l 7,2 mMotopine Cu2+ + 50 l 2,2 M otopine H2O2).


53

3. REZULTATI

OVJERA VJEŽBE

Slijepaproba

Standard

Površina

ORAC

Documents

Biohemija II Praktikum 2011 12