Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

1

Biofizika 2. Fizika-Biofizika 2.2013. 02. 25. & 26.Dr. Bugyi Beáta - PTE ÁOK – Biofizikai Intézet

AJÁNLOTT HONLAPOK 1.

http://www.olympusmicro.com/index.html

http://www.microscopyu.com/

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/index.html

MIKROSZKÓPIA - MÉRFÖLDKÖVEK

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/historical.htmlhttp://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/axioobserver/index.html

http://www.nature.com/milestones/milelight/index.html

AJÁNLOTT HONLAPOK 2.

FÁZIS KONTRASZT MIKROSZKÓPIAListeria monocytogenes PtK2 sejtben

forrás Julie Theriot, Dan Portnoy

FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIAEGFP aktint expresszáló B16 melanoma sejt

forrás Klemens Rottner

KÉTFOTON MIKROSZKÓPIAINTRAVITÁLIS MIKROSZKÓPIA élı egérben

véráram a májbanTIRF MIKROSZKÓPIA

aktin filamentumok in vitroforrás Bugyi Beáta

3D KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIAtengeri csillag petesejt, meiozis

forrás Péter Lénárt

FRAPlamellipodium aktin dinamikája EGFP aktin

expresszló B16-F1 sejtekben forrás Lai et al. EMBO Journal 2008

HISZEM, HA LÁTOM

Az emberi szem felbontóképességének (αααα) hullámoptikai határa:

≈ 0.1 mm a tisztánlátás távolságából (25 cm)

! ?

Emlékeztető: I. félév 9. előadás - Látás

�~�

�~0.8’-1.68’�~

�

�~0.8’-1.68’

� a fény hullámhossza: λλλλ� a pupilla átmérıje: d

íííííííííííííííí

emberi szemAbbe elv

BIOLÓGIA KÉPALKOTÓ TECHNIKÁK

MIKROSZKÓPIA

optikai koherencia tomográfia (OCT)

széleslátóterő, evaneszcens mikroszkópia

konfokális mikroszkópia

4Pi, I5M

high resolution structured illumination (hrSIM)

ground state depletion (GSD)

saturated structured illumination (sSIM)

stimulated emission depletion (STED)

egyedi molekula lokalizáció (PALM, STORM)

közeli mezı optikai mikroszkópia (NSOM)

elektron mikroszkópia (EM)

PET, SPECT

MRI, CT, ultrahang

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

2

MIKRO SZKÓPIA (görög)=

MIKRON = kicsi + SZKOPEIN = nézni� az emberi szem számára láthatatlan, apró vizsgálati objektumok

megjelenítése, „láthatóvá tétele”� eszköze: mikroszkóp

MIKROSZKÓPIA - MIKROSZKÓP

A mikroszkópia segítségével láthatóvá tehetjük az élı rendszerek különbözı szervezıdési szintjeit:

szervektıl (cm 10-2m)egyedi molekulákig (nm 10-9m).

7 nagyságrend!!!!

OPTIKAI - FÉNYMIKROSZKÓPIA

NA = 0.04 – 1.45

Képalkotás:� látható fény (λ = 400 – 700 nm)� üvegbıl készült lencsék

„EGYSZERŐ” MIKROSZKÓP – LUPE (1 GYŐJTİLENCSE)

retina

TÁRGY� fókusztávolságon belül

szem

KÉP� nagyított� egyenes állású� látszólagos

GYŐJTİLENCSE

Emlékeztető: Geometriai optika

KÉP 1: objektív� nagyított� valódi� fordított állású

TÁRGY

KÉP 2: okulár� nagyított� egyenes állású� látszólagos

„ÖSSZETETT” MIKROSZKÓP (2 GYŐJTİLENCSE)

OKULÁR - szemlencse

OBJEKTÍV - tárgylencse

MODERN FÉNYMIKROSZKÓP

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/axioobserver/index.html

OBJEKTÍV

OKULÁR (2db)

KONDENZOR

FÉNYFORRÁS

KÉPDETEKTOR:KAMERA

KÉPDETEKTOR:SZEM

VÁZ

TÁRGYminta

SZŐRİKTÜKRÖK

12

OBJEKTÍV (tárgylencse, 1db)� a tárgyhoz közelebb esı lencserendszer� nagyítás

OKULÁR (szemlencse, 2db)� a megfigyelıhöz közelebb esı lencserendszer� nagyítás

KONDENZOR� a fényforrás fényének összegyőjtésére és a tárgyra

fókuszálására szolgáló lencserendszer� egyenletes megvilágítás

MODERN FÉNYMIKROSZKÓP – LEGFONTOSABB OPTIKAI ELEMEK

OBJEKTÍV

OKULÁRKONDENZOR

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

3

ÁTESİFÉNY - TRANSZMISSZIÓS

FÉNYFORRÁS

KÉPDETEKTOR

TÁRGY

MEGVILÁGÍTÁS - transzmissziós

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/axioobserver/index.html http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/axioobserver/index.html

EPI

KÉPDETEKTOR

TÁRGY

FÉNYFORRÁS

MEGVILÁGÍTÁS - epi

MIKROSZKÓPVÁZ – upright / inverted KÉPALKOTÁS: TÁRGY → KÉP

TÁRGY-PONT

KÉP-”PONT”PIXEL

INTENZITÁS TÉRKÉP

SZEM

↑

FOTON

↓

DIGITÁLIS JEL

http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/digitalimagebasics.htmlhttp://www.olympusmicro.com/primer/java/digitalimaging/processing/spatialresolution/index.html

A KÉPALKOTÁS LEGFİBB KÖVETELMÉNYEI

1. NAGYÍTÁS� elég nagy legyen

2. FELBONTÁS� minden érdekes részlet láthatóvá váljon� milyen kicsi dolgokat láthatunk?

3. KONTRASZT� minden érdekes részlet jól elkülönüljön a környezetétıl

1. NAGYÍTÁS

OBJEKTÍV: Nobjektív ≈ 2.5 – 150xOKULÁR: Nokulár ≈ 10 – 25x

MIKROSZKÓP NAGYÍTÁSA: Nmikroszkóp ≈ 50x – 1200x

NAGYÍTÁS: N � �é��é����

��������

�����

�������

���������ó! ��"#$�%í' ∗ ���)*á����������ó! ��"#$�%í' ∗ ���)*á�

v

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

4

2. FELBONTÁS

FELBONTÓKÉPESSÉG: d� az a legkisebb távolság, amelyre lévı két tárgypont képe még

megkülönböztethetı egymástól a képen

… nem olyan egyszerő, mint amilyennek tőnik �

az 1D-s pont képe nem pont, hanem egy 3D-s mintázat

FELBONTÓKÉPESSÉG – DIFFRAKCIÓ (ELHAJLÁS)

TÁRGY

képINTERFERENCIA

kondenzor

fényrekesz

elhajlási irány

optikai rácsfényáteresztı képesség periódikusan változik

objektív

KÉP

-2 -1 0 +1 +2

KONSTRUKTÍVerısítés - világos

DESTRUKTÍVkioltás - sötét

ELHAJLÁSDIFFRAKCIÓ

tárgyOPTIKAI RÁCS

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/imageformation.html

Emlékeztető: I. félév 18. előadás – EM hullámok tulajdonságai: diffrakció, interferencia

FELBONTÓKÉPESSÉG – AIRY MINTÁZAT

AIRY MINTÁZAT: egyetlen tárgypont elhajlási képe� egyetlen tárgypontról képpont helyett koncentrikus körök formájában megjelenı erısítési és

kioltási helyek sorozata alakul ki � elhajlási kép

erısítés kioltás

0 Airy korong

12

3

TÁRGY1D

KÉP3D

George Biddel Airy (1801-1892)

AIRY MINTÁZAT

POINT SPREAD FUNCTION

FELBONTÓKÉPESSÉG – AIRY MINTÁZAT

felbontottnem felbontottAz egyik maximuma éppen a másik elsıminimumába esik.

d

http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasresolution.htmlhttp://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/image.htm

maximum

1. minimum

OBJEKTÍV – NUMERIKUS APERTÚRA

NA = 0.04 – 1.7

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.html

APERTÚRA SZÖG (α)� az objektív által összegyőjtött fénysugarak félkúpszöge

NUMERIKUS APERTÚRA (NA)� az optikai lencserendszerek fénygyőjtı képességének egység nélküli mérıszáma� az objektív mekkora szögben (α) képes begyőjteni az egy tárgypontból érkezı sugarakat

�+ , ∗ -.,��+ , ∗ -.,�

� objektív apertúra szöge: αααα� a minta és az objektív közötti közeg törésmutatója: n

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.htmlhttp://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasna.html

Emlékeztető: Geometriai optika

IMMERZIÓS KÖZEG törésmutató: n

levegı 1.0002

olaj 1.5

glicerin 1.4695

víz 1.3333

OBJEKTÍV – NUMERIKUS APERTÚRA

,/,1 sin56��-é-.7

sin5�ö�é-.7,/,1

sin56��-é-.7

sin5�ö�é-.7

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

5

FELBONTÓKÉPESSÉG – ABBE ELV – DIFFRAKCIÓS LIMITErnst Abbe (1840-1905)

� megvilágítás hullámhossza: λλλλ� objektív numerikus apertúrája: NA (NA = n*sinαααα)

XY irányban – a minta síkjában Z irányban – optikai tengely mentén

Annál jobb a mikroszkóp felbontása, minél kisebb d, azaz:

9:,; 1

2∗

=

�+9:,;

1

2∗

=

�+9� 2 ∗

=

5�+7/9� 2 ∗

=

5�+7/

� megvilágítás hullámhossza: λλλλ ↓� apertúra szög: αααα ↑ � a minta és az objektív közötti közeg törésmutatója: n ↑

Fénymikroszkóp felbontása: dx,y ~ 200 nm és dz ~ 1000 nmFénymikroszkóp felbontása: dx,y ~ 200 nm és dz ~ 1000 nm

NUMERIKUS APERTÚRA - FELBONTÓKÉPESSÉG

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/basics/numericalapertureimageresolution/index.html

3. KONTRASZT

NA = 0.04 – 1.45

KONTRASZT� a tárgynak a leképezés szerinti inhomogenitását erısítjük fel (azt a tulajdonságát használjuk

ki, ami megkülönbözteti a környezetétıl)

például:

OPTIKAI INHOMOGENITÁS miatt� fényelnyelés� törésmutató

� alak� szín

a tárgyon áthaladó FÉNYSUGARAK SAJÁTSÁGAI MEGVÁLTOZHATNAK� irány

� sebesség� fázis

� polarizáltság� hullámhossz…

technikák: fázis-kontraszt-, differenciál-interferencia kontraszt- (DIC), Hoffman-modulációskontraszt-, sötétlátóterő-, polarizált fény-, fluoreszcencia- mikroszkópia

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/contrast.html

FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA

fényeslátóterő

fázis-kontraszt

emberi glia agysejtek egyrétegő kultúrában

1953. Frits Zernike Fizikai Nobel-Díj

� törésmutatóbeli eltérések � fázisbeli különbségek � intenzitásbeli különbségek

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/contrast.html

, >?

>,

>?

>

n↑ c↓

aktin hálózat modell rendszerbenforrás Bugyi Beáta

FÁZIS-KONTRASZT MIKROSZKÓPIA

Listeria monocytogenes PtK2 sejtbenforrás Julie Theriot, Dan Portnoy

sejtmozgásforrás Vic Small

SZTEREOMIKROSZKÓPIA – 3D KÉP

két mikroszkóptubus 14o

2 objektív + 2 okulár

NE KEVERJÜK ÖSSZE ABINOKULÁRRAL!!!

TÁRGY↓két 2D kép (bal - jobb)↓egy 3D KÉP

alkalmazás:

mikrosebészet

14o

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

6

FLUORESZCENCIA MIKROSZKÓPIA

Emlékeztető: II. félév 2. előadás – Fluoreszcencia spektroszkópia

Képalkotás:� a mintának a megvilágító fény által kiváltott fluoreszcencia emissziója� üvegbıl készült lencsék� nem invazív

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/print/basics/fluorescence-print.html

1904. August Köhler: UV mikroszkóp1911. Oskar Heimstadt: fluoreszcencia mikroszkóp

BELSİ (INTRINSIC) FLUOROFÓR: korlátozott� klorofilKÜLSİ (EXTRINSIC) FLUOROFÓR: széles spektrális lehetıségek� szintetikus festékek� kvantum gyöngy� fehérje

� GFP (zöld fluoreszcens fehérje) és változatai� 2008. Kémiai Nobel-díj: Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Tsien

� antitest� 1942. immunofluoreszcencia

� direkt (target-antitest*fluorofór)� Indirekt (target-elısdleges antitest-másodlagos antitest*fluorofór)

FLUOROFÓROK

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/superresolution/palm/introduction.html

FOTOSZABÁLYOZHATÓ FLUOROFÓROK: speciális alkalmazások

FLUOROFÓROK

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/print/superresolution/palm/practicalaspects-print.html

STANDARD

FOTOAKTIVÁLHATÓ

FOTOKAPCSOLHATÓ

MIKROSZKÓPVÁZ – EPIFLUORESZCENS ELRENDEZÉS

MINTA

FÉNYFORRÁS

GERJESZTÉSI SZŐRİ

EMISSZIÓS SZŐRİ

DIKROIKUS TÜKÖR

DETEKTOR

OKULÁR

OBJEKTÍV

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_microscope

FÉNYFORRÁS

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/index.html

� xenon lámpa

� higanygız lámpa

� fém halogenid

� lézer

� LED

HULLÁMHOSSZTARTOMÁNY ADOTT HULLÁMHOSSZ

Emlékeztető: I. félév 23. előadás - Lézer

SZŐRİK, TÜKRÖK

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/print/basics/fluorescence-print.html

TRAN

SZM

ITTA

NC

IA (%

)

HULLÁMHOSSZ (nm)

ALULÁTENGEDİ FELÜLÁTENGEDİSÁV DIKROIKUS SZŐRİ/TÜKÖR

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

7

SZŐRİKOCKA

emissziós szőrı

gerjesztési szőrı

dikroikus tükörSZŐRİ KOCKA

GERJESZTÉS EMISSZIÓ

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/anatomy/fluoromicroanatomy.html

DETEKTOROK - PMT (photomultiplier tube): FOTOELEKTRON SOKSZOROZÓ

http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/pmtintro.html

fotoelektromos hatásfoton � elektron

foton

fotokatóddinódalánc – fém elektród

anódvákuumcsı

Emlékeztető: I. félév 19. előadás – Fényelektromos hatás

fókuszálóelektróda

e-

másodlagos emisszió

- +

elektromos jel

1921. Albert Einstein Fizikai Nobel-díj

DETEKTOROK - CCD (charge-coupled device): TÖLTÉS-CSATOLT ESZKÖZ

http://learn.hamamatsu.com/articles/ccdanatomy.htmlhttp://learn.hamamatsu.com/articles/fullframe.htmlhttp://www.microscopyu.com/articles/digitalimaging/ccdintro.htmlhttp://hu.wikipedia.org/wiki/F%C3%A1jl:CCD_charge_transfer_animation.gif

2009. Boyle és Smith megosztott Fizikai Nobel-díj

foton

e-

egymáshoz csatolt kondenzátorok

fotoelektromos hatásfoton � elektron

elektromos jel

Biofizika 2. Fizika-Biofizika 2.2013. 03. 04. & 05.Dr. Bugyi Beáta - PTE ÁOK – Biofizikai Intézet

íííííííííííííííí

emberi szemABBE ELV

BIOLÓGIA KÉPALKOTÓ TECHNIKÁK

MIKROSZKÓPIA

optikai koherencia tomográfia (OCT)

széleslátóterő, evaneszcens mikroszkópia

konfokális mikroszkópia

4Pi, I5M

high resolution structured illumination (hrSIM)

ground state depletion (GSD)

saturated structured illumination (sSIM)

stimulated emission depletion (STED)

egyedi molekula lokalizáció (PALM, STORM)

közeli mezı optikai mikroszkópia (NSOM)

elektron mikroszkópia (EM)

PET, SPECT

MRI, CT, ultrahang

KÖVETELMÉNYEK

� térbeli felbontás növelése („apró” objektumok láthatóvá tétele)� idıbeli felbontás növelése (gyors folyamatok megfigyelése)� behatolóképesség növelése („deep tissue imaging”, szövetek vizsgálata)� non-invazív (károsítás nélkül, „intravital imaging” – élı rendszerekben történı

vizsgálatok)� egyszerre több komponens vizsgálata

KÖVETELMÉNYEK

� térbeli felbontás növelése („apró” objektumok láthatóvá tétele)� idıbeli felbontás növelése (gyors folyamatok megfigyelése)� behatolóképesség növelése („deep tissue imaging”, szövetek vizsgálata)� non-invazív (károsítás nélkül, „intravital imaging” – élı rendszerekben történı

vizsgálatok)� egyszerre több komponens vizsgálata

MODERN MIKROSZKÓPIAI MÓDSZEREK

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

8

HÁTTÉRFLUORESZCENCIA

� KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA� MULTIFOTON MIKROSZKÓPIA� EVANESZCENS MEZİ MIKROSZKÓPIA

A fénymikroszkóp felbontása: Abbe elv, diffrakciós limitA fénymikroszkóp felbontása: Abbe elv, diffrakciós limit

A FELBONTÓKÉPESSÉG JAVÍTÁSA

gerjesztés

emisszió

µm

VIZSGÁLT SÍK

AIRY MINTÁZAT

� STIMULÁTL EMISSZIÓ (STED)� EGYEDI MOLEKULA LOKALIZÁCIÓ

(PALM, STORM)

Z Y

X

dx,y ~ 200 nm dz ~ 1000 nm

1961. Marvin Minsky1987. elsı konfokális mikroszkóp

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA – ALAPELVEK

SZÉLESLÁTÓTERŐ MIKROSZKÓPIA

egy sík van fókuszban

mégis az összes sík hozzájárul a

képhez

mintafókuszsík

fókuszpontból

fókuszponton kívüli

detektor

fókuszponton kívüli

objektív

APERTÚRA

APERTÚRA

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA

egy sík van fókuszban

↓ APERTÚRA (rés)térbeli szőrés

egy sík járul hozzá a képhez

az apertúra „kiszőri a többit”

mintafókuszsík

detektor

objektív

KONJUGÁLT SÍKKONJUGÁLT FOKALITÁS

apertúra mérete: 1 Airy egységAiry egység:Airy korong átmérıje

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA – ALAPELVEK

HAGYOMÁNYOS KONFOKÁLIS

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA

felbontás hagyományos konfokális

XY, nm 200 180

Z, nm 1000 500 !!

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/opticalsectioning/confocalwidefield/index.html

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA – OPTIKAI SZELETELÉS

minta „felszeletelése”optikai szeletek

TÁRGY↓sok 2D képösszefőzése↓3D KÉP

pollenautofluoreszcenciahttp://www.olympusmicro.com/primer/techniques/confocal/confocalintro.html

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

9

KONFOKÁLIS MIKROSZKÓPIA – 4D: 3D + idı

tengeri csillag petesejtmeioziskromoszómákaktinmikrotubulusok

TIRFM - ALAPELVEK

Emlékeztető: Optika, Refraktometria gyakorlat

TELJES BELSİ VISSZAVERİDÉS - EVANESZCENS MEZİ

@5A7 @?exp5EA

97@5A7 @?exp5E

A

97

exponenciális lecsengés

FGHIJIGKL

MN

MO

MO PMN

Q RSS

T~NSSMU

V

W5V7

WSW V WS

X

TIRFM

hagyományos

,/,1 sin56��-é-.7

sin5�ö�é-.7,/,1

sin56��-é-.7

sin5�ö�é-.7

felbontás hagyományos TIRFM

XY, nm 200 200

Z, nm 1000 100 !!

TIRFM

HAGYOMÁNYOS TIRFM

B16/F1 melanoma sejt

Aktin filamentumok

„EGY-FOTON” MIKROSZKÓPIA� gerjesztés: 1 db foton� abszorpció: t = 10-15 s� E = Egerjesztett – Ealap

→ a foton hullámhossza: λλλλ

„KÉT-FOTON” MIKROSZKÓPIA� gerjesztés: 2 db foton� E = Egerjesztett – Ealap

→ a fotonok hullámhossza: 2*λλλλ

Feltétele:� két foton „egyidejő” abszorpciója (t = 10-18 s)� kis valószínőség

� nagy fotonsőrőség� lézernyaláb fókuszálása� mode-locked lézer (*106 fotonsőrőség)

Y Z>

=

TÖBB-FOTON MIKROSZKÓPIA - ALAPELVEK

Emlékeztető: I. félév 23. előadás – Lézer, II. félév . 2 előadás Fluoreszcencia – nemlineáris jelenségek

http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/multiphoton/multiphotonintro.html

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

10

Elınyei:� Z irányú felbontás növelése� „deep-tissue” imaging: képalkotás mélyebb rétegekben is

� konfokális: ≈ 100 µm� két-foton ≈ 1000 µm

� kevésbé károsítja a mintát (alacsony fototoxicitás)� képalkotás élı szövetekben, élı állatokban

KÉT-FOTON MIKROSZKÓPIA - ALAPELVEK

makorfágok migárciója tumor sejtekben (élı egérben)nukleusz (Hoechst)

KÉT-FOTON MIKROSZKÓPIA – INTRAVITÁLIS MIKROSZKÓPIA (IVM)

véráram a májban (élı egérben) Dextran (TexasRed)Hepatociták (endogén fluoreszcencia)

http://www.nidcr.nih.gov/Research/NIDCRLaboratories/OralPharyngeal/I

endocitózis (élı egér májában)Dextran – 70 kDa (Texas Red)Dextran - 500 kDa (FITC)Texas Red-Dextran internalizációja a nyálmirigyek sztrómális sejtei által

2000. Stefan Hell

gerjesztés�

gerjesztett állapot - fluoreszcencia

nem lineáris le-gerjesztés�

alapállapot - nonfluoreszcens

maradék fluoreszcencia

FLUORESZCENCIA EMISSZIÓ STIMULÁLT GYENGÍTÉSE

STED - ALAPELVEK

Emlékeztető: I. félév 23. előadás – Lézer

objektívgerjesztı lézer

gyengítı lézerSTED lézer

gerjesztés gyengítés

dikroikustükrök

fázislemez

minta

red shift

STED - ALAPELVEK

Aktin filamentumokfelbontás hagyományos STED

XY, nm 200 20 !!!!

Z, nm 1000 50 !!!!

HAGYOMÁNYOS STED

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/superresolution/stedfundamentals/index.html

STED

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

11

2006.

PALM - ALAPELVEK

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/print/superresolution/palm/practicalaspects-print.htmlhttp://www.nature.com/nmeth/journal/v6/n2/fig_tab/nmeth0209-124_F1.html

„fotoativálható fluorofór

Emlékeztető: II. félév 5. előadás –Fluoreszcencia mikroszkópia – fotoaktiválható fluorofórok

PALM

felbontás hagyományos PALM

XY, nm 200 10-20 nm !!!

Z, nm 1000 10-20 nm !!!

FRAP – „PHOTOBLEACHING”: fotohalványodás

FOTOHALVÁNYODÁS, KIFEHÉREDÉS� a fluorofór irreverzibilis fotokémiai destrukciója� a gerjesztı fény tönkreteszi a fluoreszcens molekulát

HÁTRÁNY:� anti-photobleaching oldat (pl. glükóz oxidáz – kataláz – merkaptoetanol) � expoziciós idı csökkentése � pulzusszerő gerjesztés � alacsonyabb intenzitású gerjesztı fény � ellenállóbb fluorofór

ELİNY:� háttér eliminálása� autoquenching� FRAP, FLIP

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_loss_in_photobleachinghttp://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/fluorescence/photobleaching/

FRAP – ALAPELVEK

idı (t)

kioltás

visszatérés

mobilis

immobilis50%

INTENZÍV LÉZERIMPULZUSfluoreszcencia kioltás

elıtte utána

fluoreszcens molekulák nem-fluoreszcens molekulák fluoreszcens molekuláknem-fluoreszcens molekulák

DIFFÚZIÓ

idı (t)

visszatérés

mobilis

immobilis50%

fluor

eszc

enci

a in

tenz

itás

Biofizika 2 Fizika-Biofizika 2 2013.

12

FRAP

idı (t)

kioltás

visszatérés

mobilis

immobilis50%

Fluo

resz

cenc

ia in

tenz

itás

B16-F1 sejt EGFP-aktin

LAMELLIPODIUM DINAMIKÁJA

Lai és mtsai EMBO Journal 2008

FRAP

kioltás

visszatérés

mobilis

immobilis50%

idı

fluoreszcencia kioltás

fluoreszcencia visszatérése

ELEKTRONMIKROSZKÓPIA (EM)

OPTIKAI - FÉNY EM

képalkotásfénynyaláb

üveg lencsékelektronnyalábelektromágnes

hullámhossz, nm 400 – 600 0.004 – 0.006

felbontás, nm 200 0.2

nagyítás 1000 x 1000 - 100000 x

1986. Ernst Ruska Nobel-díj

NA = 0.04 – 1.45

ELEKTRONMIKROSZKÓPIA (EM)TRASZMISSZIÓS ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (TEM)� áteresztett e-

PÁSZTÁZÓ ELEKTRON MIKROSZKÓPIA (SEM)� visszafelé szórt e-

� rendszámbeli különbségek, nehézatomok� másodlagos e-

� felület topográfiája� Auger e-

� karakterisztikus rtg sugárzás spektruma� felület kémiai összetétele

TEMSEM