1
Domena głowy Trzon Badanie funkcji białka OmpR w regulacji transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej ekspresji genu kodującego adhezynę YadA Yersinia enterocolitica Marta Nieckarz 1 , Joanna Wachowicz 1 , Adrianna Raczkowska 1 , Janusz Dębski 2 , Michał Dadlez 2,3 , Katarzyna Brzostek 1 1 Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa 2 Instytut Biochemii i Biofizyki, PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa 3 Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa Wstęp YadA jest wielofunkcyjnym białkiem błony zewnętrznej Y. enterocolitica, bakterii chorobotwórczej dla ludzi i zwierząt. YadA kodowane w plazmidzie wirulencji pYV pełni funkcję adhezyny, a także warunkuje oporność komórek na bakteriobójcze działanie surowicy ludzkiej [1]. Ekspresja genu yadA indukowana jest w temperaturze 37 °C, co wynika ze zmiany topologii DNA w tych warunkach, a także aktywności pozytywnego regulatora transkrypcji VirF oraz YmoA [2]. Wyniki badań wrażliwości komórek na cytolityczne działanie układu dopełniacza sugerują udział OmpR, regulatora transkrypcji szlaku sygnałowego EnvZ/OmpR w regulacji ekspresji genu yadA [3]. System EnvZ/OmpR Y. enterocolitica kontroluje także ekspresję sRNA OmrA. Materiały i metody Różnicową analizę proteomiczną białek błonowych szczepu dzikiego Y. enterocolitica O:9 (Ye9) i mutanta ΔompR (AR4) wykonano metodą „shotgun”, z zastosowaniem tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS; [I]). Badania oddziaływania OmpR z sekwencją promotorową yadA przeprowadzano analizując tempo migracji kompleksów nukleoproteinowych (techniką EMSA; [II]). Rolę białka OmpR w regulacji transkrypcji yadA określano analizując aktywność promotora yadA w fuzji transkrypcyjnej z genem reporterowym lacZ w szczepie mutanta AR4 (MN4) i w eksperymencie komplementacji dziką kopią genu ompR wprowadzoną in trans w plazmidzie pOmpB [III]. Potranskrypcyjną regulację ekspresji yadA analizowano badając (cytometrem przepływowym) poziom ekspresji fuzji translacyjnej yadA’-‘gfp w plazmidzie pFX-yadA, w szczepie Ye9 i w mutancie AR4. Komplementację mutacji ΔompR przeprowadzono z zastosowaniem plazmidu pBR2 [IV]. Analizę poziomu syntezy białka YadA przeprowadzono techniką Western Blot [V]. . Cel pracy Celem prezentowanych badań było poznanie roli białka OmpR w regulacji ekspresji genu kodującego adhezynę YadA u Y. enterocolitica. Wniosek OmpR, czynnik transkrypcyjny dwuskładnikowego systemu transdukcji sygnału EnvZ/OmpR jest pozytywnym regulatorem ekspresji genu kodującego YadA - główną adhezynę patogenu. Literatura [1] Mikula, M. K., Kolodziejczyk, R., Goldman, A. (2013) Yarsinia infection tools – characterization of structure and function of adhesins. Front Cell Infect Microbiol 2:169. doi: 10.3389/fcimb.2012.00169. [2] Lambert de Rouvroit, C., Sluiters, C., Cornelis, G. R. (1992) Role of the transcriptional activator, VirF, and temperature in the expression of the pYV plasmid genes of Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 6(3):395-409. [3] Skorek, K., Raczkowska, A., Dudek, B., Miętka, K., Guz-Regner, K., Pawlak, A., Klausa, E., Bugla-Płoskońska, G., Brzostek, K. (2013) Regulatory protein OmpR influences the serum resistance of Yersinia enterocolitica O:9 by modifying the structure of the outer membrane. PLoS One 8(11):e79525. I. Różnicowa analiza proteomiczna metodą „shotgun” szczepu Ye9 i AR4. II. Analiza tempa migracji kompleksów białka OmpR z sekwencją promotorową yadA. Ye9/AR4 26° C pH 7 86 mM NaCl Ye9/AR4 37° C pH 7 86 mM NaCl Ye9/AR4 26° C pH 5 86 mM NaCl Ye9/AR4 37° C pH 5 86 mM NaCl Ye9/AR4 26° C pH 7 300 mM NaCl Ye9/AR4 37° C pH 7 300 mM NaCl Wynik I. Poziom syntezy białka YadA jest większy w mutancie AR4, w stosunku do szczepu Ye9, we wszystkich wariantach doświadczalnych. Wynik II. Białko OmpR specyficznie wiąże się do sekwencji promotora genu yadA. III. Badanie aktywności promotora yadA w fuzji transkrypcyjnej z genem lacZ w szczepie mutanta AR4 (MN4). Wynik III. Poziom aktywności β-galaktozydazy jest wyższy w szczepie AR4 z fuzją yadA::lacZ (MN4) w stosunku do wariantu z komplementacją dziką kopią genu ompR. 1 2 3 4 V. Poziom syntezy białka YadA oznaczony metodą Western Blot. Wynik V. Poziom syntezy YadA w szczepie AR4 jest wyższy niż w szczepie dzikim Ye9. 1. Szczep Ye9 37°C; 2. Ye9 26°C; 3. AR4 37°C; 4. AR4/pOmpB 37°C IV. Poziom syntezy białka fuzyjnego YadA-GFP w szczepie dzikim Ye9 i w mutancie AR4. Wynik IV. W mutancie AR4 obserwuje się większy, niż w szczepie dzikim Ye9, poziom syntezy białka fuzyjnego YadA- GFP. Wyniki

Badanie funkcji białka OmpR w regulacji transkrypcyjnej i …zms.biol.uw.edu.pl/pliki/316/Plakat_Wektory_Patogeny... · Wynik I. Poziom syntezy białka YadA jest większy w mutancie

  • Upload
    others

  • View
    2

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Badanie funkcji białka OmpR w regulacji transkrypcyjnej i …zms.biol.uw.edu.pl/pliki/316/Plakat_Wektory_Patogeny... · Wynik I. Poziom syntezy białka YadA jest większy w mutancie

Domena głowy

Trzon

Domena kotwicząca

Badanie funkcji białka OmpR w regulacji transkrypcyjnej i potranskrypcyjnej ekspresji genu kodującego adhezynę YadA

Yersinia enterocolitica

Marta Nieckarz1, Joanna Wachowicz1, Adrianna Raczkowska1, Janusz Dębski2, Michał Dadlez2,3, Katarzyna Brzostek1

1Instytut Mikrobiologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Miecznikowa 1, 02-096 Warszawa2Instytut Biochemii i Biofizyki, PAN, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa3Instytut Genetyki i Biotechnologii, Wydział Biologii, Uniwersytet Warszawski, ul. Pawińskiego 5a, 02-106 Warszawa

WstępYadA jest wielofunkcyjnym białkiem błony zewnętrznej Y. enterocolitica, bakterii chorobotwórczej dla ludzi i zwierząt. YadAkodowane w plazmidzie wirulencji pYV pełni funkcję adhezyny, a także warunkuje oporność komórek na bakteriobójczedziałanie surowicy ludzkiej [1]. Ekspresja genu yadA indukowana jest w temperaturze 37 °C, co wynika ze zmiany topologiiDNA w tych warunkach, a także aktywności pozytywnego regulatora transkrypcji VirF oraz YmoA [2]. Wyniki badańwrażliwości komórek na cytolityczne działanie układu dopełniacza sugerują udział OmpR, regulatora transkrypcji szlakusygnałowego EnvZ/OmpR w regulacji ekspresji genu yadA [3]. System EnvZ/OmpR Y. enterocolitica kontroluje takżeekspresję sRNA OmrA.

Materiały i metodyRóżnicową analizę proteomiczną białek błonowych szczepu dzikiego Y.enterocolitica O:9 (Ye9) i mutanta ΔompR (AR4) wykonano metodą „shotgun”, zzastosowaniem tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS; [I]). Badaniaoddziaływania OmpR z sekwencją promotorową yadA przeprowadzanoanalizując tempo migracji kompleksów nukleoproteinowych (techniką EMSA;[II]). Rolę białka OmpR w regulacji transkrypcji yadA określano analizującaktywność promotora yadA w fuzji transkrypcyjnej z genem reporterowym lacZw szczepie mutanta AR4 (MN4) i w eksperymencie komplementacji dziką kopiągenu ompR wprowadzoną in trans w plazmidzie pOmpB [III]. Potranskrypcyjnąregulację ekspresji yadA analizowano badając (cytometrem przepływowym)poziom ekspresji fuzji translacyjnej yadA’-‘gfp w plazmidzie pFX-yadA, wszczepie Ye9 i w mutancie AR4. Komplementację mutacji ΔompRprzeprowadzono z zastosowaniem plazmidu pBR2 [IV]. Analizę poziomusyntezy białka YadA przeprowadzono techniką Western Blot [V]..

Cel pracy Celem prezentowanych badań było poznanie roli białka OmpR w regulacji ekspresji genu kodującego adhezynę YadA u Y. enterocolitica.

WniosekOmpR, czynnik transkrypcyjny dwuskładnikowego systemutransdukcji sygnału EnvZ/OmpR jest pozytywnym regulatoremekspresji genu kodującego YadA - główną adhezynę patogenu.

OmpR pełni rolę pozytywnego regulatora ekspresji genu kodującego adhezynę YadA. .

Literatura[1] Mikula, M. K., Kolodziejczyk, R., Goldman, A. (2013) Yarsinia infection tools – characterization of structure and function of adhesins. Front Cell Infect Microbiol 2:169. doi: 10.3389/fcimb.2012.00169.[2] Lambert de Rouvroit, C., Sluiters, C., Cornelis, G. R. (1992) Role of the transcriptional activator, VirF, and temperature in the expression of the pYV plasmid genes of Yersinia enterocolitica. Mol Microbiol. 6(3):395-409.[3] Skorek, K., Raczkowska, A., Dudek, B., Miętka, K., Guz-Regner, K., Pawlak, A., Klausa, E., Bugla-Płoskońska, G., Brzostek, K. (2013) Regulatory protein OmpR influences the serum resistance of Yersinia enterocolitica O:9 by modifying the structure of the outer membrane. PLoS One 8(11):e79525.

I. Różnicowa analiza proteomiczna metodą „shotgun” szczepu Ye9 i AR4.

II. Analiza tempa migracji kompleksów białka OmpR z sekwencją promotorową yadA.

Ye9/AR426° CpH 7

86 mM NaCl

Ye9/AR437° CpH 7

86 mM NaCl

Ye9/AR426° CpH 5

86 mM NaCl

Ye9/AR437° CpH 5

86 mM NaCl

Ye9/AR426° CpH 7300

mM NaCl

Ye9/AR437° CpH 7300

mM NaCl

↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

Wynik I. Poziom syntezy białka YadA jest większy w mutancie AR4, w stosunku do szczepu Ye9, we wszystkich wariantach doświadczalnych.

Wynik II. Białko OmpRspecyficznie wiąże się do sekwencji promotora genu yadA.

III. Badanie aktywności promotora yadA w fuzji transkrypcyjnej z genem lacZ w szczepie mutanta AR4 (MN4).

Wynik III. Poziom aktywności β-galaktozydazy jest wyższy w szczepie AR4 z fuzją yadA::lacZ(MN4) w stosunku do wariantu z komplementacją dziką kopią genu ompR.

1 2 3 4

V. Poziom syntezy białka YadA oznaczony metodą Western Blot.

Wynik V. Poziom syntezy YadA w szczepie AR4 jest wyższy niż w szczepie dzikim Ye9.1. Szczep Ye9 37°C; 2. Ye9 26°C; 3. AR4 37°C; 4. AR4/pOmpB 37°C

IV. Poziom syntezy białka fuzyjnego YadA-GFP w szczepie dzikim Ye9 i w mutancie AR4.

Wynik IV. W mutancie AR4 obserwuje się większy, niż w szczepie dzikim Ye9, poziom syntezy białka fuzyjnego YadA-GFP.

Wyniki