BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Ekstraksi dan Fraksinasi

Maserasi merupakan metode ekstraksi yang sering digunakan dalam

mengekstrak jaringan tumbuhan. Pada dasarnya metode ini dengan cara merendam

sampel menggunakan pelarut organik seperti metanol, etanol dengan sekali-sekali

dilakukan pengocokkan dalam suhu ruang. Umumnya perendaman dilakukan 24 jam

dan selanjutnya pelarut diganti dengan pelarut baru. Proses maserasi sangat

menguntungkan dalam isolasi senyawa bahan alam karena mudah dilakukan.

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel rimpang

jeringau. Sebelum maserasi dilakukan, rimpang jeringau dibersihkan dari kotoran-

kotoran seperti lumpur dan dirajang kecil-kecil. Sampel dibersihkan agar tidak

mengandung banyak senyawa -senyaw a atau kotoran pengganggu. Proses perajangan

sampel jeringau dilakukan untuk memperluas permukaan sentuh sampel, karena luas

permukaan mempengaruhi proses maserasi. Semakin kecil ukuran partikel sampel

maka luas permukaan semakin besar. Rajangan sampel rimpang jeringau diangin -

anginkan sampai kering tanpa sinar matahari. Hal ini dilakukan karena sinar matahari

dapat merusak senyawa-senyawa aktif yang terkandung di dalam sampel. Proses

pengeringan berguna untuk mengurangi kadar air dalam sampel, karena air dapat

mempengaruhi proses penarikan zat aktif dalam sampel. Rajangan sampel rimpang

jeringau diperkecil ukuran partikelnya sehingga menjadi serbuk. Sampel rimpang

jeringau sebanyak 500 gram dimaserasi menggunakan pelarut metanol dalam suhu

kamar terlindung dari cahaya. Pelarut metanol digunakan dalam maserasi karena

bersifat universal yang dapat mengikat semua komponen kimia yang terdapat dalam

tumbuhan bahan alam baik yang bersifat non polar, semi polar, dan polar. Metanol

adala cairan penyari yang masuk k e dalam sel melewati dinding sel serbuk rimpang

jeringau. Selama proses perendaman sampel, akan terjadi proses pemecahan dinding

dan membran sel akibat perbedaan tekanan di dalam dan di luar sel. Sehingga

metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma akan terlarut dalam pelarut organik

dan senyawa akan terekstraksi sempurna (Lenny, 2006). Sehingga senyawa zat aktif

dapat terekstrak keluar bersama cairan penyari. Maserasi dilakukan selama 3 × 24

jam, dimana setiap 24 jam ekstrak metanol disaring dan dimaserasi kembali dengan

pelarut metanol yang baru. Ekstrak metanol rimpang jeringau yang diperoleh,

diuapkan dengan menggunakan penguap putar vakum (rotary vacuum evaporator)

pada suhu 30-40 oC sampai terbentuk ekstrak kental metanol. Tujuan dari evaporasi

yaitu untuk menguapkan pelarut yaitu metanol, sehingga yang tersisa hanya senyawa

aktif atau ekstrak kental metanol. Ekstrak kental metanol yang dihasilkan dari

maserasi yaitu 38,11 gram berwarna merah kehitaman.

Ekstrak kental metanol sebanyak 10 gram disuspensi menggunakan air dan

metanol dengan perbandingan 2:1, dimana volume air 100 mL dan volume metanol

50 mL. Hasil suspensi ini dipartisi menggunakan corong pisah dengan pelarut n-

heksan yang bersifat non polar dengan volume 100 mL. Sehingga terbentuk dua

lapisan, lapisan atas merupakan fraksi n-heksan yang berwarna kuning dan lapisan

bawah merupakan fraksi air yang berwarna kecoklatan. Hal ini terjadi karena massa

jenis n-heksan 0.4 g/mL yang lebih kecil dari massa jenis air yaitu 1 g/mL.

Pemisahan tersebut memberikan hasil yang tidak maksimal karena masih terdapat

sedikit fraksi n-heksan yang tercampur pada fraksi air. Untuk mengoptimalkan

pemisahan, maka dilakukan ekstraksi kembali dengan menggunakan partisi. Partisi

dilakukan sebanyak 4 kali, setiap partisi ditambahkan n-heksan sebanyak 100 mL.

Hal ini dilakukan agar zat yang bersifat non polar benar-benar terdistribusi ke pelarut

non polar (n-heksan). Partisi ini menghasilkan fraksi n-heksan dan fraksi air. Fraksi

n-heksan dievaporasi menggunakan evaporator pada suhu 30-40 oC, suhu rendah

digunakan untuk menjaga agar senyawa aktif tidak mengalami kerusakan. fraksi n-

heksan menghasilkan ekstrak kental sebanyak 3,49 g. Fraksi air yang tersisa dipartisi

kembali dengan pelarut etilasetat yang bersifat semi polar dengan perbandingan 1:2,

dimana volume air 150 mL dan etilasetat 300 mL. Sehingga terbentuk dua lapisan,

lapisan atas merupakan fraksi etil asetat dan lapisan bawah merupakan fraksi air.

Fraksi etil asetat berada pada lapisan atas karena memiliki massa jenis 0.66 g/mL

yang lebih kecil massanya dari fraksi air yaitu 1 g/mL. Partisi dilakukan sebanyak 3

kali, setiap partisi ditambahkan etilasetat sebanyak 300 mL. Hal ini dilakukan agar

senyawa aktif yang bersifat semi polar terdistribusi kepelarut semi polar. Sehingga

menghasilkan fraksi etilasetat dan fraksi air. Hasil partisi dari masing-masing fraksi

dievaporasi pada suhu 30-40 oC sehingga diperoleh ekstrak kental fraksi etilasetat

sebanyak 0,85 gram dan ekstrak kental fraksi air sebanyak 3,12 gram. Hasil randemen

dapat dilihat pada Tabel 6 berikut.

Tabel 6. Hasil Rendemen Fraksi n-Heksan, Etil asetat, dan Air Ekstrak Metanol

Rimpang Jeringau

Berat ekstrak

metanol (g) Fraksi

Berat Wadah Fraksi

kental (g)

Rendemen

(%) Kosong (g) + fraksi (g)

10 g

n-Heksan 10,41 g 13,90 g 3,49 g 34,9 %

Etil asetat 9,8 g 10,65 g 0,85 g 8,5 %

Air 9,5 g 11,62 g 3,12 g 31,2 %

Hasil rendemen berdasarkan urutan tingkatannya berturut-turut yaitu fraksi n-

heksan, air, dan etilsetat. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa yang terkandung pada

ekstrak kental metanol lebih besar senyawa non polar yaitu dengan rendemen 34,9 %,

karena dalam rimpang jeringau kandungan minyak atsiri sangat besar. Rendemen

fraksi air juga cukup banyak yaitu 31,2 %, karena pada rimpang jeringau selain

mengandung minyak atsiri juga mengandung senyawa -senyawa polar seperti

flavonoid dan lain-lain. Untuk fraksi etil asetat menghasilkan rendemen yang sangat

sedikit yaitu 8,5 %, kemungkinan besar senyawa semi polar yang terkandung dalam

rimpang jeringau sangat sedikit.

4.2 Uji Fitokimia

Ekstrak kental metanol, n-heksan, etilasetat dan air dilakukan uji fitokimia

membe rikan hasil uji positif mengandung flavonoid, terpenoid. Steroid dan saponin

hanya pada ekstrak kental metanol. Ini dibuktikan dengan adanya perubahan warna

untuk uji flavonoid, terpenoid terjadi perubahan warna merah bata, dan steroid

terbentuk warna hijau kebiruan. Pada uji alkaloid tidak terbentuk endapan, dan pada

uji saponin tidak terbentuk busa/buih pada fraksi selain ekstrak kental metanol.

Tabel 7. Hasil Uji Fitokimia Berbagai Fraksi

Fraksi Uji

Fitokimia Pereaksi

Perubahan dengan pereaksi Hasil

Uji

Ekstrak

Metanol

Flavonoid

Alkaloid

Steroid

Saponin

Terpenoid

Mg -HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Liebarman

Bauchar

Aquades

panas

Liebarman

Bauchar

Orange tua-Orange muda

Orange tua-merah

Orange tua-Coklat kehitaman

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Hijau kebiruan

Terbentuk busa

Terbentuk warna merah bata

+

+

+

-

-

-

+

+

+

n-

heksan

Flavonoid

Alkaloid

Steroid

Saponin

Terpenoid

Mg -HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Lieberman

Bauchar

Aquades

panas

Lieberman

Kuning muda -Kuning tua

Kuning muda -Merah

Kuning muda -Coklat kehitaman

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk hijau kebiruan

Tidak ada busa

Terbentuk warna merah bata

+

+

+

-

-

-

-

-

+

Tabel 8. Hasil Uji Fitokimia dari Berbagai Fraksi

Fraksi Uji

fitokimia Pereaksi

Perubahan dengan pereaksi Hasil

Uji

Etil

asetat

Flavonoid

Alkaloid

Steroid

Saponin

Terpenoid

Mg -HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Lieberman

Bauchar

Aquadest

panas

Liebarman

Bauchar

Orange kecoklatan-Merah

Orange kecoklatan-Orange

Orange kecoklatan-Coklat

kehitaman

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk tendapan

Tidak terbentuk hijau kebiruan

Terbentuk busa

Terbentuk warna merah bata

+

+

+

-

-

-

-

-

+

Air

Flavonoid

Alkaloid

Steroid

Saponin

Terpenoid

Mg -HCl

H2SO4

NaOH

Mayer

Wagner

Hager

Liebarman

Bauchar

Aquades panas

Liebarman

Bauchar

Merah bata-Orange muda

Merah bata-Kuning muda

Merah bata-Kuning kecoklatan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk hijau kebiruan

Tidak terbentuk busa

Terbentuk warna merah bata

+

+

+

-

-

-

-

+

+

Berdasarkan hasil ini ekstrak metanol, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan

fraksi air mengandung senyawa -senyawa metabolit sekunder yaitu flavonoid,

terpenoid, saponin, steroid dan alkaloid.

1. Uji Flavonoid

Ekstrak metanol, fraksi air, fraksi n-heksan, dan fraksi etil asetat memberikan

hasil positif mengandung flavonoid, yang dibuktikan oleh perubahan warna pada

flavonoid dengan pereaksi Mg -HCl, NaOH, dan H 2SO4. Hal ini didukung oleh hasil

penelitian Muthuraman dan Singh (2012) pada ekstrak metanol mengandung

flavonoid dengan level yang tinggi (+++). Perubahan warna terjadi karena pada

ekstrak metanol terjadi reaksi antara flavonoid dengan pereaksi. Salah satu contoh

senyawa flavonoid yang bereaksi dengan HCl akan terbentuk garam flavilium yang

ditandai dengan perubahan warna merah bata. Setiap perubahan warna yang terjadi

berdasarkan jenis senyawa flavonoid yang bereaksi dengan pereaksi.

HCl

O

OH

OH

OH

OH

O

Cl-

G aram F lavilium (M erah Tua)

CH3CH2OH

H2

O

O

OH

F lavano l

M g

O

OH

OH

Gamb ar 8 . Struktur reaksi flavonoid dengan pereaksi HCl

N aOH

O

O

KrisinAseto feno n (Kuning )

OH

HO HO OH

CO2H

OH

A

B

AB

C

O

H3C+

Gambar 9. Reaksi flavonoid dengan pereaksi NaOH

2. Uji Alkaloid

Berdasarkan hasil uji fitokimia pada tabel 7 dan 8 ekstrak metanol, fraksi n-

heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air memberikan hasil negatif pada senyawa

alkaloid. Hal ini terjadi kemungkinan dalam sampel tidak mengandung senyawa

alkaloid yang dibuktikan dengan tidak terbentuknya endapan pada sampel. Hal ini

diperkuat oleh penelitian Muthuraman dan Singh (2012) bahwa kandungan alkaloid

memberikan level yang cukup (++). Dengan perbedaan lokasi tumbuh tanaman dapat

mempengaruhi kandungan senyawa aktif dalam tanaman itu sendiri. Berikut Gambar

10 struktur reaksi antara alkaloid dengan pereaksi apabila terbentuk endapan.

Pereaksi Mayer

+

4KI Hg Cl4 K2Hg I4 2KCl

Kalium alkalo ida endapan

N

+ +

NK+

K2Hg I4 K+ [ Hg I4]+

Kalium tetraio do m erkurat (II)

Gambar 10. Reaksi alkaloid dengan Pereaksi Mayer

Pereaksi Wagner

KI

+ I-I3

-

Co kelat

+

Kalium alkalo ida endapan

N NK+

++ I2 I3-

I2

Gambar 11. Reaksi Alkaloid dengan Pereaksi Wagner

3. Uji Steroid, Saponin, dan Terpenoid

Pada uji steroid dan terpenoid yang memberikan hasil positif hanya pada ekstrak

metanol yang ditandai dengan terbentuknya warna hijau kebiruan dan warna merah

bata pada penambahan pereaksi dietil eter, asam asetat glacial dan penambahan 1

tetes H2SO4. Pada fraksi air, fraksi n-heksan dan fraksi atil asetat memberikan hasil

negatif mengandung steroid. Hal ini didukung oleh penelitian Muthuraman dan Singh

(2012) bahwa pada ekstrak metanol jeringau mengandung senyawa steroid yang

sangat sedikit (+). Sedangkan pada terpenoid semua fraksi serta ekstrak metanol

rimpang jeringau memebrikan hasil positif terpenoid. Senyawa triterpenoid/steroid

akan mengalami dehidrasi dengan penambahan asam kuat dan membentuk garam

yang memberikan sejumlah reaksi warna (Mukhlish, 2010). Adapun reaksi perkiraan

uji terpenoid/steroid pada gambar 12 berikut ini.

CH3COOH)2O

HO H3COC

-CH3COOH

H3COC

-H2O

H2SO4 pekat

H3COC

SO2H

asam 3-aseto -5-ko lestero l sulfo nat (Hijau)

Ko lestero l

Gambar 12. Reaksi Steroid dan Terpenoid dengan Pereaksi

4. Uji Saponin

Pada uji saponin menurut Rusdi (1990) timbulnya busa pada uji Forth

menunjukkan adanya glikosida yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam

air yang terhidrolisis menjadi glukosa dan senyawa lainnya. Berikut struktur reaksi

saponin dengan air. untuk uji saponin yang memberikan hasil positif hanya pada

ekstrak metanol dan ketiga fraksi memberikan hasil negatif. Hal ini didukung oleh

penelitian Muthuraman dan Singh (2012) bahwa kandungan senyawa flavonoid

berada pada level yang setara dengan flavonoid (+++). Namun untuk ketiga fraksi

yang diuji kemungkinan dipengaruhi oleh proses partisi yang tidak sempurna.

1-Arabino p irio sil-3asetil o leno lat

CO

O

OH

OH

CH2OH O

OH

Ag liko n

O

OH

OH

CH2OH

OHCO2H

H2O

G luko sa

+

Gambar 13 . Reaksi saponin dalam air

4.3 Pemisahan dan Pemurnian

Ekstrak kental metanol dari hasil uji fitokimia, dianalisis dengan

menggunakan kromatografi lapis tipis yang bertujuan untuk melihat ada berapa

senyawa yang terkandung di dalam sampel melalui bercak noda. Bercak noda yang

didapatkan dari kromatografi lapis tipis memberikan bercak noda tailing dengan

perbandingan eluen yang divariasikan. Hal ini terjadi karena sampel masih

mengandung banyak senyawa yang sangat sulit untuk dianalisis menggunakan KLT.

Sehingga segera dilakukan pemisahan dengan menggunakan kromatografi kolom

agar terjadi pemisahan yang sesuai dan dapat dianalisis menggunakan KLT.

Pada pemisahan kromatografi kolom, Pengisian fasa diam ke dalam kolom

dilakukan dengan cara basah. Fasa diam (silika gel) diubah menjadi bubur silika

(slurry) dengan pelarut yang digunakan dalam fasa gerak (n-heksan). Pelarut n-

heksan dimasukan kedalam kolom dengan batas tertentu dan slurry dialirkan melalui

dinding kolom secara perlahan menggunakan pipet tetes dengan kran terbuka. Hal ini

dilakukan agar silika dapat mengisi tempat dan padat secara teratur, tidak mengalami

pematahan dan berongga dalam kolom. Jika letak silika dalam kolom berongga dan

mengalami pematahan maka pemisahan tidak akan terjadi dengan sempurna. Pelarut

n-heksan dialirkankan secara terus menerus minimal 2 jam dan maksimalnya semakin

lama maka semakin padat silikanya.

Ekstrak kental metanol sebanyak 10 g dilarutkan dengan metanol dan

kemudian dicampurkan dengan fase diam silika gel GF 60 sampai benar-benar kering.

Sampel dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom yang berisi fase diam (silika

gel), selanjutnya fasa gerak n-heksan dialirkan secara perlahan ke dalam kolom

dengan keadaan kran terbuka sampai terbentuk pita. Jika fasa gerak yang menetes

sudah tidak berwarna, maka divariasikan perbandingan eluen yang sesuai.

Variasi eluen yang digunakan berturut-turut yaitu fasa gerak n-

heksan:etilasetat (9,5:0,5), (9:1), (8,5:1,5), (8:2), (7,5:2,5), (7:3), (6,5:3,5), (6:4),

(5,5:4,5), (5:5), (4,5:5,5), (4:6), (3,5:6,5), (3:7), (2,5:7,5), (2:8), (1,5:8,5), (1:9),

(0,5:9,5), perbandingan ini digunakan juga pada variasi eluen selanjutnya

etilasetat:metanol sampai terjadi pemisahan dan Eluet ditampung pada botol vial.

Hasil pemisahan kromatografi kolom diperoleh fraksi sebanyak 135 fraksi.

Keseluruhan hasil fraksi dianalisis dengan KLT, dan bercak nodanya dilihat dengan

menggunakan lampu UV. Pola noda dari 135 fraksi ini dapat dilihat pada Gambar 14.

Gambar 14. Profil KLT hasil pemisahan kromatografi kolom pertama Menggunakan

adsorben silika gel GF 254, fase gerak etil asetat:metanol (8,5:1,5)

Semua fraksi hasil pemisahan dianalisis dengan kromatografi lapis tipis untuk

melihat pola noda. Fraksi dengan pola noda yang sama dan harga Rf-nya yang sama

digabung. Dari 135 fraksi diperoleh 5 fraksi, terdiri dari fraksi A1 yaitu gabungan

fraksi 30-40, fraksi A2 yaitu gabungan fraksi 50 -75, fraksi A3 yaitu gabungan fraksi

79 -84, fraksi A 4 yaitu gabungan fraksi 87 -98 dan fraksi A 5 yaitu gabungan fraksi 100-

105 dengan berat masing-masing fraksi secara berturut-turut yaitu 1,23 g, 1,68 g, 0,35

gr, 1,96 g, dan 1,31 g. Fraksi ini dianalisis menggunakan KLT untuk melihat pola

noda dari 5 kelompok fraksi ini. Dari 5 fraksi yang diperoleh, fraksi A4 yang

dipisahkan lagi dengan menggunakan kromatografi kolom untuk mendapatkan isolat

murni. Fraksi ini diambil karena memberikan hasil kromatografi lapis tipis yang

memberikan bercak noda ganda (2 noda) dan masih memiliki berat yang banyak dari

5 fraksi. Hasil KLT 5 Fraksi dapat dilihat pada Gambar 15 dibawah ini.

Gambar 15. Profil KLT hasil pemisahan kromatografi kolom dari penggabungan

fraksi menggunakan adsorben silika gel GF 254, fase gerak etil

asetat:metanol (8,5:1,5)

Hasil kromatografi kolom dari A4 diperoleh 59 fraksi, kemudian fraksi ini

dikromatog rafi lapis tipis dengan menghitung harga Rf. Fraksi yang memberikan

bercak noda tunggal yaitu fraksi 32-40. Namun fraksi 38 -40 yang diambil karena

memiliki nilai Rf yang lebih kecil dibandingkan dengan R f fraksi 32-37. Berat

masing -masing adalah 0,46, 0,15 g, dan 1,21 g. Pola noda dari fraksi ini dapat dilihat

pada Gambar 16.

Gambar 16. Profil KLT hasil pemisahan kromatografi kolom kedua menggunakan

adsorben silika gel GF254, fase gerak etil asetat:metanol (7:3)

4.4 Uji Kemurnian

Isolat yang diduga murni yaitu isolat pada fraksi 38-40. Sebelum diuji

kemurniannya dengan menggunakan spektrofotometer UV -VIS dan IR, fraksi ini

diuji kemurniannya secara kromatografi lapis tipis dua dimensi dengan menggunakan

eluen bergradien yang cocok dengan beberapa perbandingan, yaitu etilasetat:metanol

(7:3), kloroform:metanol (6:4). Pelarut yang digunakan hanya pelarut semi polar dan

polar, karena diduga senyawa yang terkandung di dalamnya adalah senyawa sangat

polar. Ketika diuji menggunakan eluen n-heksan:etilasetat dengan berbagai macam

variasi perbandingan, noda yang ditotolkan tidak terelusi sama sekali. Hal ini terjadi

kemungkinan senyawa aktif yang terkandung di dalam sampel adalah senyawa polar.

Hasil KLT dua dimensi untuk membuktikan isolat ini merupakan isolat murni. Hasil

KLT dua dimensi dapat di lihat pada Gambar 17.

R1

R2

Gambar 17. Profil KLT dua dimensi hasil pemisahan kromatografi kolom dari

penggabungan fraksi menggunakan adsorben silika gel GF 254

Keterangan:

(R1) : Etil asetat:metanol (7:3)

(R2) : Kloroform:metanol (6:4)

Menurut Harbone (1996) dalam Reniza (2003) bahwa hasil KLT dapat

dikatakan baik apabila noda yang terbentuk berada pada nilai selang Rf = 0,3 -0,9.

Dari hasil KLT yang dilakukan telah dihitung nilai Rf isolat ditunjukkan pada Tabel

11 berikut ini.

Tabel 9. Nilai Rf Isolat Pada Dua Variasi Eluen

Fasa Gerak (Eluen) Nilai Rf dari Bercak

Etil Asetat:Metanol (7:3)

Kloroform:Metanol (6:4)

0,6

0,875

Pada R1 dengan jarak tempuh senyawa 3 cm dan jarak tempuh pelarut 5 cm

menghasilkan nilai Rf yaitu 0.6. Selanjutnya harga Rf dari R2 dengan jarak tempuh

senyawa 3.5 cm dan jarak tempuh pelarut 4 cm menghasilkan nilai Rf yaitu 0.875.

Sehingga hasil KLT ini dikatakan baik karena nilai Rf dari R1 dan R2 berada pada

selang Rf = 0.3 -0.9.

4.5 Uji Fitokimia Isolat Murni

Isolat murni ini diuji flavonoid untuk mengetahui apakah senyawa yang

terkandung di dalamnya hanya flavonoid atau masih terdapat senyawa lain.

Tabel 10. Hasil Uji Fitokimia Isolat Murni

No Uji

Fitokimia

Pereaksi

Fitokimia Perubahan dengan Pereaksi Hasil uji

1.

2.

3.

4.

5.

Flavonoid

Alkaloid

Steroid

Saponin

Terpenoid

Mg -HCl

NaOH

H2SO4

Uji Mayer

Uji Wagner

Uji Hager

Liebarman

Bauchar

Aquadest

Panas

Liebarman

Bauchar

Merah bata-Orange tua

Merah bata-Orange muda

Merah bata-Coklat kehitaman

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk endapan

Tidak terbentuk warna hijau

kebiruan

Tidak terbentuk buih/busa

Tidak terbentuk warna merah

bata

(+) F lavonoid

(+) Flavonoid

(+) Flavonoid

(-) Alkaloid

(-) Alkaloid

(-) Alkaloid

(-) Steroid

(-) Saponin

(-) Terpenoid

4.6 Karakterisasi Isolat Murni

Karakterisasi isolat murni dilihat dari gugus fungsi melalui nilai panjang

gelombang dan absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer IR dan UV -

Vis.

4.6.1 Spektrofotometer Inframerah (IR)

Spektrum inframerah senyawa isolat ditunjukkan dalam Gambar 18 dan data

interpretasi spektrum inframerah (gelombang, bentuk pita, intensitas, dan penempatan

gugus terkait) pada Tabel 11.

Gambar 18. Spektrum inframerah dari isolat murni

Pada spektroskopi infra merah bahwa serapan dikatakan kuat apabila memiliki

punc ak yang tinggi transmitan rendah (0-35%), serapan dikatakan sedang apabila

puncaknya tinggi dan memiliki transmitan sedang (75-35%), serapan dikatakan lemah

apabila puncaknya pendek dan memilki transmitan tinggi (90-75%) (Justik, 2010).

Berdasarkan nilai serapan spektrum inframerah, memperlihatkan bahwa senyawa

yang diperoleh menunjukkan serapan melebar dan lemah pada daerah bilangan

gelombang 3321,74 cm-1

yang diduga adalah serapan uluran dari gugus O-H. Serapan

O-H dikatakan lemah karena berada pada transmitan 92% hal ini didukung serapan

lemah apabila berada pada transmitan 90-75% (Justik, 2010). Hal ini diperkuat oleh

adanya serapan tajam dan lemah tekukan O-H aromatik pada panjang gelombang

1115.53 cm-1

. Karena pada serapan ini memiliki transmitan diatas 97%. Serapan

uluran C-H alifatik yang tajam dan lemah muncul pada daerah bilangan gelombang

2944,00 cm-1

dan 2831,84 cm-1

. Hal ini diperkuat oleh tekuk C-H aromatik pada

serapan 654,83 cm-1

dan serapan C-H aromatik keluar bidang pada panjang

gelombang 62 9,77 cm-1

. Serapan tajam dan lemah pada cincin aromatik C꞊C muncul

pada daerah bilangan gelombang 1449,64 cm-1

. Serapan tajam dan kuat uluran C-O

muncul pada daerah bilangan gelombang 1025,62 cm-1

.

Tabel 11. Interpretasi Spektrum Inframerah (Bilangan Gelombang, Bentuk Pita,

Intensitas dan Penempatan Gugus Fungsi) dari Isolat

N

o

Bilangan Gelombang(cm-1)

Bentuk

Pita Intensitas

Kemungkinan

Gugus Fungsi Isolat Sukadana,

(2010)

Pustaka (

Creswell,et

all,

Silverstein)

Akbar,

(2010)

Arisandy

(2010)

1. 3321.74 3000-3500 3200-3400 3350-

3200 3500-3000 Melebar Lemah Uluran O -H

2. 2944.00

2831 .8 4 2800 -2950 2700 -3000 - 3000-2700

Tajam Lemah Uluran C -H

alifatik Tajam Lemah

3. 1449.64 1400-1650 1500-1475 - 1650-1450 Tajam Lemah Uluran C=C

aromatik

5. 1115.53 1000-1300 1330-1260

-

- Tajam Lemah Tekuk OH

6. 1025.62 990-1100 1000-1260 1260-

1000 1230-1000 Tajam Kuat C-O alkohol

7 . 654.8 3

629.77 650-1000 650-1000 - 900-650 Tajam Lemah

C-H aromatik

kel. bidang

Gugus fungsi yang ditentukan dari hasil panjang gelombang IR dalam sampel

merupakan gugus -gugus fungsi yang terdapat pada senyawa flavonoid. Sehingga

dapat diduga isolat murni tersebut merupakan senyawa flavonoid.

4.6.2 Spektrofotometer UV-Vis

Isolat murni dikarakterisasi dengan UV -Vis, karena UV -Vis merupakan alat

untuk menguji senyawa yang berwarna dan sebagian besar merupakan senyawa

organik. Isolat murni yang didapatkan merupakan senyawa yang berwarna dan

merupakan senyawa organik. Karena isolat diharapkan merupakan senyawa flavonoid

maka panjang gelombangnya berada pada bilangan gelombang kurang dari 600 nm.

Sehingga sangat mudah dikarakterisasi menggunakan UV-Vis. Hasil dari data

spektrum UV -Vis isolat murni dapat dilihat pada hasil spektrofotometer UV-Vis

ditunjukkan pada Gambar 19 dan Tabel 13 berikut.

I II

Panjang gelombang (nm)

Gambar 19. Data pektrum UV-Vis isolat murni

Tabel 13. Data Panjang Gelombang dan Absorbansi dari Isolat Murni dalam Pelarut

metanol.

Pita Panjang Gelombang Absobansi

I

II

282, 00

220,00

0,952

1,852

Spektrum serapan UV-Vis senyawa isolat murni dalam pelarut metanol

memberikan dua pita serapan yaitu pita I merupakan bahu pada panjang gelombang

282.00 nm dan pita II merupakan serapan maksimum pada panjang gelombang

220,00 nm. Serapan pada panjang gelombang 282,00 diduga adanya transisi elektron-

elektron yang tidak berikatan ke orbital anti ikatan (nπ*) oleh suatu gugus C=O.

serapan ini terjadi pada panjang gelombang yang panjang dan intensitasnya rendah

(Sastrohamidjojo, 2001). Sedangkan serapan pada panjang gelombang yang lemah

220,00 nm diduga adanya transisi elektron nσ* yang disebabkan oleh suatu

ausokhrom yang tidak terkonjugasi yang mengabsorpsi cahaya pada panjang

gelombang sekitar 200 nm yang memiliki gugus –OH (Creswell, dkk., 2005).

Ausokhrom adalah gugus jenuh yang bila terikat pada kromofor mengubah panjang

gelombang dan intensitas serapan maksimum (Idrus, 2012). Berdasarkan hasil

karakterisasi spektrofotometer IR dan UV-Vis dapat diduga isolat tersebut merupakan

senyawa flavonoid.

5.1 Uji Aktivitas Antioksidan

Sampel yang diuji aktivitas antioksidan yaitu ekstrak kental metanol dan

fraksi hasil partisi yang dilakukan pada tindakan awal. Fraksi tersebut yaitu fraksi n-

heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi air. Uji aktivitas antioksidan pada keempat

sampel ini untuk melihat senyawa yang bersifat sebagai antioksidan berdasarkan

kepolarannya.

5.1.1 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode DPPH

Flavonoid dan derivat polifenol merupakan senyawa yang berfungsi s ebagai

antioksidan, karena senyawa tersebut adalah senyawa fenol yaitu senyawa dengan

suatu gugus –OH yang terikat pada karbon cincin aromatik. Produk radikal bebas

senyawa -senyawa ini terstabilkan secara resonansi oleh karena itu tak reaktif

dibandingkan dengan kebanyakan radikal bebas lain, sehingga dapat berfungsi

sebagai antioksidan yang efektif (Fessenden dan Fessenden 1994).

Sampel yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan adalah rimpang

jeringau. Sebelum diuji aktivitas antioksidan sampel rimpang jeringau dimaserasi

yang menghasilkan ekstrak kental metanol. Ekstrak kental metanol rimpang jeringau

dipartisi sehingga menghasilkan fraksi ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan air.

Ekstrak kental metanol, fraksi n-heksan, etil asetat dan air diuji fitokimia. Dari hasil

uji fitokimia yang terdapat pada tabel 7,8,9,10 diatas terlihat bahwa keempat sampel

tersebut mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder terutama flavonoid.

Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode DPPH. Metode

DPPH adalah salah satu uji kuantitatif untuk mengetahui seberapa besar aktivitas

ekstrak kental fraksi air, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan ekstrak metanol

sebagai antioksidan. Metode ini adalah metode kolometri (didasarkan pada

perubahan warna) y ang cepat dan efektif untuk menentukan aktivitas antioksidan.

Menurut Prakash (2001) bahwa radikal DPPH yang memiliki elektron tidak

berpasangan memberikan warna ungu dan menghasilkan absorbansi maksimum pada

panjang gelombang 517 nm. Pengukuran antiradikal bebas dengan metode DPPH

sebagai senyawa radikal bebas stabil yang ditetapkan secara spektrofotometri,

merupakan senyawa aktivitas antiradikal. Metode antioksidan dengan DPPH dipilih

karena metode ini adalah metode sederhana untuk evaluasi aktivitas dari senyawa

bahan alam. antioksidan Radikal DPPH adalah suatu senyawa organik yang

mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada maksimum 517 nm

dan warna ungu gelap. Absorbansi maksimum 517 ini didapatkan dari serapan DPPH

yang memiliki warna ungu yang merupakan warna komplementer pada daerah

serapan 500-560 nm (Molineux, 2003). Setelah bereaksi dengan senyawa antiradikal

maka DPPH akan tereduksi dan warnanya akan menjadi kuning. Perubahan warna

tersebut disebabkan karena berkurangnya ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH,

karena adanya penangkapan oleh zat antiradikal yang menyebabkan tidak adanya

kesempatan elektron tersebut untuk beresonansi dimana perubahan ini dapat diukur

dan dicatat dengan spektrofotometer. Warna akan berubah menjadi kuning saat

elektron berpasangan. Pengurangan intensitas warna yang terjadi berhubungan

dengan jumlah elektron DPPH yang menangkap atom hidrogen. Pengurangan

intensitas warna mengindikasikan peningkatan kemampuan antioksidan untuk

menangkap radikal bebas.

N N

H O2N

NO2

NO2

Gambar 20 . Struktur DPPH reduksi (1,1-difenil-2-fikrihidrazin)

Untuk mengetahui tingkat peredaman warna sebagai akibat adanya

antioksidan yang mampu mengurangi intensitas warna ungu dari DPPH, maka

pengukuran reaksi warna dilakukan pada konsentrasi ekstrak yang berbeda-beda.

Semakin tinggi konsentrasi ekstrak akan semakin besar peredamannya yang ditandai

dengan terbentuknya warna kuning. Dikarenakan pada konsentrasi tinggi senyawa

yang terkandung semakin banyak dan menyebab kan semakin besar pula aktivitas

antioksidannya (Anang dkk., 2008).

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan membuat larutan standar, dimana

larutan standar yang digunakan dalam penelitian ini yaitu vitamin C (asam askorbat).

Karena vitamin C mudah meng alami oksidasi oleh radikal bebas karena mempunyai

ikatan rangkap dan dengan adanya dua gugus –OH yang terikat pada ikatan rangkap

tersebut. Radikal bebas akan mengambil atom hidrogen dan menyebabkan muatan

negatif pada atom oksigen yang selanjutnya akan didelokalisasi melalui resonansi.

Sehingga menghasilkan radikal bebas yang stabil dan tidak membahayakan.

merupakan senyawa antioksidan sintetis yang memiliki aktivitas antioksidan yang

sangat tinggi. Struktur vitamin C dapat dilihat pada Gambar 21 berikut.

O

HO

O

OHOH

OH

Gambar 21 . Struktur L-asam askorbat

Vitamin C (asam askorbat) sebanyak 56,2 mg dilarutkan dalam 25 ml

metanol menghasilkan 2248 mikrogram/ml (ppm). Larutan standar ini dibuat dalam

beberapa konsentrasi yaitu 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, dan 400 ppm.

Variasi konsentrasi ini dilakukan untuk melihat pengaruh konsentrasi terhadap

absorbansi. Jika absorbansi berubah pada setiap perubahan konsentrasi, maka ini

menandakan bahwa aktivitas antioksidan baik untuk di uji dengan DPPH. Diinkubasi

pada suhu 37oC selama 30 menit. Tujuan dari inkubasi ini agar reaksi terjadi dengan

sempurna. Vitamin C merupakan antioksidan sintetik, memiliki kemampuan

meredam radikal bebas (DPPH) membentuk senyawa yang stabil. Larutan standar

dari masing-masing konsentrasi diukur absorbansinya menggunakan UV -Vis dengan

panjang gelombang 517 nm. Hasil pengukuran absorbansi standar berturut-turut yaitu

0,7931, 0,7654, 0,7051, 0,5534, dan 0,2311. Pengujian larutan blanko (DPPH)

dilakukan dengan mencampur kan 0,5 ml DPPH dengan metanol sebanyak 4,5 ml,

yang kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan UV -VIS pada panjang

gelombang 517 nm. Penambahan metanol bertujuan untuk pengenceran larutan. Jika

larutan pekat maka dan juga sangat encer maka akan mempengaruhi pembacaan

absorbansi pada UV -Vis. Hasil absorbansi blanko yaitu 0,8175. Pengukuran

absorbansi larutan standard dan blanko yaitu untuk mendapatkan persamaan regresi

liniear yang dapat digunakan untuk menghitung aktivitas antioksidan dari sampel.

Tabel 14. Pengukuran Absorbansi Standard (Asam Askorbat) dan Blanko (DPPH)

Konsentrasi

mg/mL

Konsentrasi

yang sebenarnya

(m g/ml) = x

Absorbansi

Blanko

Absorbansi

Standar

Abs B - Abs Std

Y

25

50

100

200

400

28, 1

56,2

112,4

224,8

449,6

0,8175

0,8175

0,8175

0,8175

0,8175

0,7931

0,7654

0,7051

0,5534

0,2311

0,0244

0,0521

0,1124

0,2641

0,5864

Dari hasil pengukuran absorbansi ini didapatkan persamaan regresi liniear

yaitu y = 0,0013x - 0,0267. Grafik persamaan liniear dapat dilihat pada Gambar 22

berikut.

Gambar 22. Grafik Persamaan Regresi Liniear

Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan menghitung absorbansi

sampel pada konsentrasi 25 ppm, 50 ppm, 100 ppm, 200 ppm, dan 400 ppm dan

absorbansi blanko. Kemudian dihitung menggunakan persamaan regresi liniear pada

y = 0.0013x - 0.0267 R² = 0.9975

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 100 200 300 400 500

Nilai Y

Konsentrasi (ppm)

Gambar 22 di atas. Persamaan regresi liniear ini didapatkan dari nilai absorbansi

blanko (DPPH) dan nilai absorbansi standar (asam askorbat). Kedua nilai absorbansi

ini dihitung selisihnya yaitu absorbansi blanko-absorbansi standard dan dijadikan

sebagai nilai y. Dari persamaan regresi liniear yang didapatkan maka nilai x sebagai

aktivitas antioksidan. Hasil aktivitas antioksidan yang menggunakan persamaaan

regresi liniear dapat dilihat pada tabel 15 berikut.

Tabel 15. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kental Fraksi Air, n-Heksan,

Etil Asetat dan Metanol disetarakan dengan aktivitas antioksidan asam

askorbat.

Kode

Aktv

Antioksidan

(AEACm g)

Aktv Antioksidan

(AEACm g/g

sampel = ppm)

Rerata

Fraksi Air 30,3077

30,7692

3,7463155

3,7939865 3,77015

Fraksi n-

heksana

103,8462

101,5385

11,5512963

11,6043956 11,57785

Fraksi etil asetat 246,9231

251,1538

31,1378407

30,8922320

31,01504

Ekstrak metanol 272, 3077

266,6154

28, 5138945

28, 2731055 28,39350

Nilai aktivitas antioksidan pada tabel ini hanya untuk melihat perbandingan

nilai aktivitas antioksidan antara vitamin C dengan sampel. dimana pada fraksi air,

3,77015 mg vitamin C (Asam askorbat) setara dengan 1 g sampel. Fraksi n-heksan,

11,57785 mg vita min C (Asam askorbat) setara dengan 1 g sampel. Fraksi etil asetat,

31,01504 mg vitamin C (Asam askorbat) setara dengan 1 g sampel. Pada ekstrak

metanol, 28,39350 mg vitamin C (Asam askorbat) setara dengan 1 g sampel.

Berdasarkan hasil ini dapat dihitung standar deviasi yang bertujuan untuk mengetahui

kisaran nilai aktivitas antioksidan jika dilakukan banyak pengulangan.

Tabel 16. Nilai Standar Deviasi Dan Rata-rata Standar Deviasi

Fraksi Standar

Deviasi Rata-rata ± SD

Fraksi Air 0,033708517 3,770151 ± 0,033709

Fraksi n-heksan 0,03754687 11,57785 ± 0,037547

Fraksi Etil Asetat 0,173671593 31,01504 ± 0,173672

Ekstrak metanol 0,170263541 28, 3935 ± 0,170264

Nilai rata-rata standar deviasi fraksi air memberikan informasi bahwa jika

dilakukan banyak pengulangan untuk uji aktivitas antioksidan, kurang lebihnya akan

berkisar pada 0,033709 sampai 3,70515, fraksi n-heksan 0,03747 sampai 11,57785,

fraksi etil asetat 0,173672 sampai 31,01504 dan ekstrak metanol 0,170264 sampai

28,3935.

Nilai standar deviasi yang dihasilkan dilakukan uji anava satu jalur. Uji ini

untuk melihat perbedaan aktivitas antioksidan dari keempat fraksi. Hasil perhitungan

uji anava adalah ada perbedaan yang signifikan antara ekstrak kental fraksi air, fraksi

n-heksan, fraksi etil asetat dan ekstrak metanol.

Berdasarkan perhitungan uji anava menunjukkan bahwa terdapat perbedaan

pada bahan uji, dilihat dari besarnya signifikasi pada uji anava (0,000) yang lebih

kecil dari nilai α 5%. Untuk mengetahui adanya perbedaan yang signifikan dilakukan

uji pasca anava dengan metode duncana dengan hasil pada tabel 18 dibawah ini.

Tabel 17. Hasil Uji Anava Metode Duncana

Fraksi N *Subset for alpha = 0.05

Fraksi Air

Fraksi n-Heksan

Ekstrak Metanol

Fraksi Etil Asetat

Sig

2

2

2

2

3,7702d

11,5778c

28,3935b

31,0150a

1,000

Keterangan:*angka yang diikuti huruf yang berbeda menunjukkan adanya

beda nyata pada taraf α 0.05

Berdasarkan hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan fraksi air, n-

heksan, etilasetat dan ekstrak metanol memberikan perbedaan yang nyata. Uji

statistik secara anava satu jalur menunjukan bahwa keempat perlakuan dalam

penelitian ini ada perbedaan yang bermakna atau beda signifikan. Pengujian ini

terlihat ada perbedaan signifikan antara fraksi air, fraksi n-heksan, fraksi etil asetat,

dan ekstrak metanol dengan nilai signifikan >0.05. Sehingga dapat disimpulkan

ketiga larutan uji tersebut ada perbedaan yang bermakna.

5.1.2 Hasil Uji Aktivitas Antioksidan

Aktivitas antioksidan IC50 merupakan parameter yang digunakan untuk

mengukur potensi antioksidan dalam kerjanya. Aktivitas antioksidan menunjukkan

kemampuan suatu antioksidan dalam menghambat radikal bebas (dalam bentuk %),

sedangkan IC50 menunjukkan konsentrasi suatu antioksidan dalam menghambat

sebesar 50% dari radikal bebas.

Tabel 18. Peredaman Radikal Bebas dan Hasil Metode IC50

Sampel Konsentrasi

(ppm)

Aktivitas

penangkap

radikal

(%)

Persamaan regresi

liniear IC50 (ppm)

Fraksi air

Fraksi n-

heksan

Fraksi etil

asetat

Ekstrak

metanol

25

50

100

200

400

25

50

100

200

400

25

50

100

200

400

25

50

100

200

400

0,86

1,63

4,33

10,02

21,03

7,73

13,25

27,07

47,14

68,82

13,98

22,39

36,67

50,78

73,49

12,87

21,06

36,01

49,69

72,92

y=0.054x - 0.896

R² = 0.999

y= 0.162x + 7.64

R² = 0.962

y=0.151x+ 15.95

R² = 0.957

y=0.153x+14.78

R² = 0.957

942,52

261,48

225,50

230,20

Dari keempat sampel ini tingkat keefektifan sebagai antioksidan berturut-turut

yaitu fraksi etil asetat dengan IC50 sebesar 225.50 ppm, ekstrak metanol dengan IC50

sebesar 230,20 ppm, fraksi n-Heksan dengan IC50 sebesar 261,48 dan fraksi air

dengan IC50 sebesar 942,52 ppm. Semakin kecil IC50 maka sampel tersebut semakin

efektif, sebaliknya semakin besar nilai IC50 maka sampel tersebut semakin tidak

efektif. Dari keempat sampel ini yang paling efektif sebagai antioksidan yaitu fraksi

etil asetat karena memiliki nilai IC50 yang paling kecil dari keempat sampel. dapat

dilihat histogram IC50 pada gambar 23 berikut.

Gambar 23. Histogram Nilai IC 50

Tingkat kekuatan aktivitas antioksidan dapat ditentukan berdasarkan nilai

IC50. Tingkatan aktivitas antioksidan dari keempat sampel dapat dilihat pada Tabel 19

berikut.

Tabel 19. Tingkat kekuatan antioksidan metode DPPH (Jun’er, AL, 2003)

Intensitas Nilai IC 50

Sangat aktif

Aktif

Sedang

Lemah

Tidak Aktif

< 50 ppm

50-100 ppm

101-250 ppm

250-500 ppm

>500 ppm

942.52

261.48 225.5 230.2

0100200300400500600700800900

1000

Fraksi Air Fraksi n-Heksan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanol

Nil

ai

IC 5

0 p

pm

Fraksi

Berdasarkan ini dapat dilihat bahwa pada fraksi air aktivitas antioksidannya

termasuk pada intensitas tidak aktif, karena nilai IC50 lebih besar dari 500 ppm yaitu

942,52 ppm. Fraksi n-Heksan aktivitas antioksidannya termasuk pada intensitas

lemah, karena nilai IC50 diantara 250-500 ppm yaitu 261,48 ppm. Untuk fraksi etil

asetat dan metanol aktivitas antioksidannya termasuk pada intensitas sedang, karena

nilai IC50 diantara 101-250 ppm yaitu 225,50 ppm dan 230,20 ppm. Sehingga dapat

dianalisa bahwa yang berperan sebagai antioksidan adalah senyawa semi polar yang

terkandung dalam fraksi etil asetat dan ekstrak metanol. Karena ekstrak metanol

termasuk sampel yang memiliki aktivitas antiksidan sedang maka ekstrak ini dapat

dijadikan sebagai antioksidan.