BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitianeprints.umm.ac.id/36809/4/jiptummpp-gdl-niniksulas-50043-4-babiii.pdf43 BAB III METODOLOGI PENELITIAN . 3.1 Jenis Penelitian . Jenis

43

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimen murni

(True Experiment) karena penelitian ini telah memenuhi tiga prinsip, yaitu:

randomisasi, replikasi dan adanya kelompok atau perlakuan atau banding dengan

menggunakan Post test only control group design diasumsi bahwa semua

karakteristik adalah sama antar unit populasi dengan metode dilusi untuk

mengetahui efek antimikroba rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) dengan

konsentrasi yang berbeda-beda terhadap bakteri Shigella dysenteriae secara in

vitro.

Gambar 3.1 Skema Design Penelitian

(The postest only control group design)

P8

P6 O6

P1

P2

P3

P4

P5

O4

Rd

O3

O5

O2

O1

P7 O7

P9

P10

K0

K1

O8

O9

O10

O11

O12

44

Keterangan :

Rd ; Randomisasi

P1 ; perlakuan metode rebusan 1 01 = pengukuran 1




P5; perlakuan metode rebusan 5 05 = pengukuran 5






K0 : perlakuan kontrol positif 011 = pengukuran 11

K1:perlakuan kontrol negatif 012= pengukuran 12

Penelitian ini menggunakan 1 faktor dan 2 perlakuan kontrol, jumlah

ulangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 3 kali ulangan, karena telah

memenuhi persamaan (r-1)(r-1)≥ 15 dimana t= jumlah perlakuan dan r= jumlah

ulangan (Hanifiah dan Kemas 1993). Adapun denah Rancangan Acak Lengkap

disajikan dalam gambar berikut:

Gambar 3.2 Denah Rancangan Acak Lengkap

1 2 3 4 5 6

7 8 9

10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 23 24

A1B100 2

A1B40 3

A1B100 1

A1B60 3

A1B20 1

A1B80 1

K+ 3

K+ 2

A1B20 1

A1B50 2

A1B40 1

A1B40 2

A1B70 3

A1B30 3

A1B50 3

A1B60 1

K- 2

A1B90 1

A1B70 2

A1B30 1

A1B10 1

A1B60 2

K- 3

A1B90 2

45

25

26 27 28 29 30

31 32

33 34 35 36

Keterangan :

A1B10 :

Media agar yang ditanami bakteri Shigella dysenteriae dan

diberi air rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.)

konsentrasi 10% .

A1B20 :



konsentrasi 20% .

A1B30 :



konsentrasi 30% .

A1B40 :



konsentrasi 40% .

A1B50 :



konsentrasi 50% .

A1B60 :



konsentrasi 60% .

A1B70 :



konsentrasi 70% .

A1B80 :



konsentrasi 80% .

A1B90 :



konsentrasi 90% .

A1B100 :



konsentrasi 100% .

K (-) Media agar yang ditanami bakteri Shigella dysenteriae

dan kontrol negatif (Aquades).

K (+) Media agar yang ditanami bakteri Shigella dysenteriae

dan kontrol positif (Tetrasiklin).

A1B70 1

A1B30 2

A1B100 3

K- 3

K- 3

K+ 2

A1B10 2

A1B10 3

A1B50 1

A1B20 3

A1B90 3

A1B80 3

46

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Pembuatan rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) dan pengujian terhadap

diameter zona hambat pertumbuhan bakteri Shigella dysenteriae dilakukan di

Laboratorium Biologi Universitas Muhammadiyah Malang yang beralamat di Jl.

Raya Tlogomas No. 246 Malang.

3.3 Populasi dan Sampel

3.3.1 Populasi

Menurut Sugiyono (2012), populasi adalah wilayah generalisasi yang terdiri

atas obyek/subyek yang mempunyai kualitas dan karakteristik tertentu yang

ditetapkan oleh peneliti untuk dipelajari dan kemudian ditarik kesimpulannya.

Populasi bukan hanya orang tetapi obyek dan benda-benda alam yang lain.

Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah biakan bakteri Shigella

dysenteriae yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya Malang.

3.3.2 Sampel

Teknik pengambilan sampel yang digunakan adalah simple random

sampling, yaitu teknik pengambilan sampel dengan cara acak sehingga setiap

satuan sampling yang ada dalam populasi mempunyai peluang yang sama untuk

dipilih ke dalam sampel (Rofieq, 2015). Sampel yang digunakan dalam penelitian

ini adalah biakan bakteri Shigella dysenteriae dengan kepadatan yang diperoleh

dari Laboratorium Mikrobiologi MIPA Universitas Negeri Malang. Pengambilan

sampel dengan menggunakan teknik random sampling yang merupakan

pengambilan sampel acak sederhana dimana seluruh unit populasi mempunyai

47

kesempatan untuk menjadi sampel. Dimana untuk mengetahui jumlah sampel,

maka harus mengetahui berapa jumlah ulangan. Menurut Sufianto (2009), cara

menghitung jumlah ulangan yang diperlukan pada penelitian yaitu dengan

menggunakan rumus sebagai berikut:

keterangan t : Treatment (perlakuan)

r : Replikasi (ulangan)

(r-1) (t-1) 15

(r-1) (12-1) ≥ 15

(r-1) (11) 15

11r – 11 15

11r 15+11

11r 26

r 2,36 atau dibulatkan r 3

Jadi ulangan yang digunakan peneliti adalah sebanyak 3 kali ulangan dalam

setiap metode rebusan. Dalam penelitian ini sekelompok subyek yang diambil dari

populasi tertentu di kelompokkan secara acak adalah 12 kali metode rebusan

dengan 3 kali ulangan, sehingga unit sampel yang digunakan untuk penelitian ini

adalah 36 unit biakan Shigella dysenteriae dalam cawan petri.

3.4 Variabel Penelitian

3.4.1 Variabel Bebas

Variabel bebas adalah variabel yang mempengaruhi atau yang menjadi

sebab perubahannya atau timbulnya variabel dependen (Sugiyono, 2012). Variabel

(r-1)(t-1) ≥ 15

48

bebas adalah variabel yang sengaja dipilih dan direncanakan dengan sengaja

diukur variasinya untuk diketahui pengaruhnya terhadap variabel yang diamati.

Variabel bebas dari penelitian ini adalah rebusan daun sirih (Piper betle L.)

dengan berbagai konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%

dan 100%.

3.4.2 Variabel Terikat

Variabel terikat adalah variabel yang dipengaruhi atau yang menjadi sebab

akibat, karena adanya variabel bebas (Sugiyono, 2012).Variabel terikat adalah

sejumlah faktor yang diukur untuk mengetahui dampak adanya perubahan dari

variabel bebas. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah diameter zona hambat

antimikroba rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.) terhadap bakteri Shigella

dysenteriae

3.4.3 Variabel kontrol

Variabel kontrol adalah unsur atau gejala yang sengaja dikendalikan supaya

tidak mempengaruhi variabel bebas maupun variabel terikatnya. Variabel kontrol

dalam penelitian ini yaitu meliputi dua jenis kontrol positif (tetrasiklin) dan (2)

kontrol negatif (aquades) dengan lama inkubasi (24) suhu 370C.

3.5 Definisi Operasional Variabel

Memperjelas maksud dari penelitian ini, maka setiap variabel perlu

didefinisikan sebagai beirkut:

1) Merebus daun sirih hijau (Piper betle L.) adalah cara yang digunakan

untuk memperoleh cairan dari daun sirih hijau (Piper betle L.) dan

aquades yang dipanaskan pada suhu 90 oC selama 15 menit, dengan

49

ketentuan sebanyak 100 gr daun sirih hijau (Piper betle L.) kemudian

dicampur dengan 100 ml aquades, ketentuan ini diambil dari dosis yang

biasa dilakukan masyarakat dalam menakar, sekitar 20-30 gram simplisia

segar (daun sirih hijau segar) dengan penambahan air 3 gelas yakni

sebanyak 600 ml (Sundari dkk, 2015).

2) Konsentrasi adalah banyaknya zat terlarut yang dibandingkan dengan

jumlah pelarut pelarut (Laksono, 2014). Konsentrasi dalam penelitian ini

memakai perhitungan %. Konsentrasi yang digunakan dalam penelitian

ini adalah 0% (kontrol) dan 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%,

80%, 90%, dan 100%.

3) Daun sirih hijau (Piper betle L.) merupakan jenis tumbuhan perdu

merambat dan bersandarkan pada batang pohon lain, batang berkayu,

berbuku-buku, beralur, warna hijau keabu-abuan, daun tunggal, bulat

panjang, warna hijau, perbungaan bulir, warna kekuningan, buah buni,

bulat, warna hijau keabu-abuan (Damayanti dkk, 2006).

4) Suhu inkubator adalah temperatur didalam alat inkubator yang sudah

diatur agar tetap stabil pada suhu 37o

C, supaya bakteri Shigella

dysenteriae yang ditanam pada media perbenihan dapat tumbuh dengan

baik.

5) Lama inkubasi dalam inkubator adalah waktu yang diperlukan supaya

bakteri Shigella dysenteriae dapat tumbuh optimal yaitu sekitar 24 jam.

50

6) Jenis media adalah media yang digunakan untuk menumbuhkan mikroba

yang mengandung bahan makanan dan nutrisi bagi mikroba. Media yang

digunakan dalam penelitian ini adalah media Shigella dysenteriae.

7) Diameter zona hambat adalah suatu area bening yang ada disekitar paper

disk yang menunjukkan kemampuan rebusan dalam menghambat bakteri

Shigella dysenteriae. Pengukuran diameter zona hambat menggunakan

alat yang disebut jangka sorong dengan pengukuran yang berawal dari

tepi daerah zona hambat yang terpanjang lainnya. Sedangkan satuan

pengukurannya digunakan mm.

3.6 Prosedur Penelitian

Prosedur penelitian ini memerlukan 3 tahap, yaitu: tahap persiapan, tahap

pelaksanaan, dan tahap pengamatan.

3.6.1 Persiapan Penelitian

Persiapan sebelum melakukan kegiatan penelitian dilaboratorium ada

beberapa hal yang harus dipersiapkan, yaitu:

Alat

A. Pembuatan Rebusan Daun Sirih Hijau (Piper betle L.)

1) Saringan 1 buah

2) Kertas saring secukupnya

3) Kompor gas 1 buah

4) Panci 2 buah

5) Beaker Glass 5 buah

6) Timbangan analitik 1 buah

51

B. Alat Pengujian Daya Antimikrobial Sterilisasi dan Pembuatan

Media

1) Autoclave 1 buah

2) Timbangan Analitik 1 buah

3) Magnetik Stirrer 1 buah Erlenmeyer

4) 500 ml 3 buah

5) Beaker Glass 250 ml 2 buah

6) Gelas Ukur 100 ml 1 buah

7) Cawan Petri D-10 cm 36 buah

8) Tabung reaksi 6 buah

9) Rak Tabung Reaksi 1 buah

10) Pipet Tetes 5 buah

C. Pembuatan Suspensi Bakteri Shigella dysenteriae dan Mac Farland

1) LAF 1 buah

2) Cawan Petri 36 buah

3) Bunsen 1 buah

4) Jarum Ose 2 buah

5) Tabung Reaksi 6 buah

6) Rak Tabung Reaksi 1 buah

D. Inokulasi dan Perlakuan

1) Inkubator 1 buah

2) Batang Sebar 1 buah

3) LAF 1 buah

52

4) Fortex 1 buah

5) Pinset 1 buah

6) Bunsen 1 buah

E. Pembacaan Hasil (Pengukuran Diameter Zona Hambat)

1) Jangka Sorong 1 buah

3.6.2 Bahan

A. Bahan Pembuatan Rebusan Daun Sirih Hijau (Piper betle L.)

1) Daun segar hijau (Piper betle L.) 100 gram

2) Aquades 100 gram

B. Bahan Pembuatan Suspensi Bakteri Shigella dysenteriae

1) Isolat murni bakteri Shigella dysenteriae

2) Larutan Barium Clorida (BaCl2) 1% 0,05 ml

3) Asam Sulfat (H2SO4) 1% 9,95 ml

C. Bahan Pembuatan Media dan Inokulasi

1) Media Nutrient Agar

2) Isolat Bakteri Shigella dysenteria 1 tabung

3) Aquadest 300 ml

4) Paper Disk 36 lembar

5) Alkohol 70% (dalam botol semprot) 100 ml

6) Spirtus 100 ml

7) Kertas Label secukupnya

8) Plastik Warb secukupnya

9) Kapas DAN Alumunium Foil secukupnya

53

3.6.3 Pelaksanaan Penelitian

1. Sterilisasi Alat

a. Mencuci semua alat yang terbuat dari gelas dengan sabun sampai bersih dan

membiarkan sampai kering.

b. Membungkus semua peralatan dengan kertas sampul

c. Semua alat disterilkan dengan autoklaf dengan suhu 121o C dengan tekanan

15 atm selama 15 menit.

2. Pembuatan media

1. Pembuatan rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.)

a. Mencuci bersih daun sirih hijau (Piper betle L.)

b. Menimbang daun sirih hijau (Piper betle L.) yang masih segar sebanyak 100

gram

c. Memasukkan daun sirih hijau (Piper betle L.) kedalam panci yang sudah

mendidih airnya kurang lebih 15 menit dengan suhu 90o C

d. Mendiamkan sampai dingin

e. Menyaring dengan kerta saring

f. Melakukan pengenceran sesuai dengan konsentrasi perlakuan yaitu 10%,

20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 100%.

3. Pembuatan NA (Nutrient Agar)

1) Menimbang bubuk NA

Perhitungan pembuatan Nutrient Agar

36 cawan petri = 36 cp x 15 ml = 540 ml

Gram NA =

54

=

= 10,8 gram

2) Menambahkan aquadest steril pada bubuk NA sesuai dengan kebutuhan.

3) Mengaduk bahan hingga homogen.

4) Menghomogenkan larutan NA hingga tercampur menggunakan magnetic

stirrer dengan suhu 300oC dan kecepatan 8 rpm.

5) Mendinginkan hasil larutan kemudian dituang kedalam cawan petri sebanyak

15 ml.

6) Membiarkan suspensi padat dan menyimpannya ke dalam LAF selama 24 jam

(dalam ruangan steril dengan menyemprotkan desinfektak alkohol 70%).

4. Pembuatan Suspensi

Larutan Mac Farland nomor tabung 0,5 digunakan dengan membandingkan

kekeruhan biakan bakteri dalam media cair dengan kepadatan 1,5 x 108 sel/ml

dengan langkah sebagai berikut:

1) Membuat larutan dengan memasukan 0,05 ml Barium Clorida (BaCl2) 1%.

2) Membuat larutan dengan memasukkan 9,95 ml Asam Sulfat (H2SO4) 1%.

3) Mencampur kedua larutan pada tabung reaksi, dengan perbandingan 0,05 ml

BaCl2 1% dan 9,95 ml H2SO4 1%.

4) Menyimpan larutan dalam suhu kamar dan tempat gelap serta tidak terkena

sinar matahari langsung.

5) Mengambil 3-7 koloni biakan Shigella dysenteriae dan diencerkan dengan

aquades 10 ml sampai tercapai larutan homogen untuk mendapatkan kepadatan

bakteri yaitu 1,5 x 108 sel/mm.

6) Membandingkan dengan larutan standar Mac Farland 0,5. Jika biakan bakteri

55

Shigella dysenteriae belum sama dengan larutan pembanding, maka

ditambahkan bakteri dengan jarum ose hingga sama kekeruhannya.

Tabel 3.1 Standar Mac Farland

No. Tabung BaCl 1% (ml) H2SO4 1% (ml) Jumlah Koloni (108/ml)

0,5 0,05 9,95 1,5

1 0,1 9,9 3

2 0,2 9,8 6

3 0,3 9,7 9

4 0,4 9,6 12

5 0,5 9,5 15

6 0,6 9,4 18

7 0,7 9,4 21

8 0,8 9,2 24

9 0,9 9,1 27

10 0,10 9,0 30

(Sumber: Riyanto, 2013 dalam Maslikah, 2014)

5. Inokulasi Bakteri Shigella dysenteriae

1) Mendinginkan selama beberapa saat media NA untuk menghilangkan uap air

pada cawan petri.

2) Mengambil suspensi Shigella dysenteriae yang telah diencerkan dengan cara

menuangkan pada cawan petri, kemudian menginokulasi secara merata pada

permukaan NA dengan teknik sinambung menggunakan swap hal ini dapat

dilihat pada gambar 3.2 di bawah ini:

56

Gambar 3.3 Teknik Sinambung

3) Merendam paper disk pada botol flakon yang sudah terdapat berbagai

konsentrasi rebusan daun sirih hijau selama 5 menit.

4) Memasukan paper disk ke dalam cawan petri yang telah terisi media NA dan

ditanam tepat ditengah-tengah media.

5) Menutup cawan petri, kemudian dipanaskan 180˚C diatas api bunsen dengan

memutar-mutar agar cawan petri lebih steril.

6) Membungkus dan melapisi bagian tepi cawan petri menggunakan plastic

wrap, kemudian membungkus kembali menggunakan kertas yang disterilkan

dengan alkohol 70%.

7) Menginkubasi pada suhu 37˚C selama 1 x 24 jam dengan posisi terbalik.

3.7 Pengamatan Penelitian

a. Setelah diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 370

kemudian meletakkan

cawan-cawan petri berderet diatas meja sesuai dengan perlakuannya.

b. Meletakkan cawan petri secara terbalik, dalam hal ini tutup cawan petri tidak

dibuka.

c. Mengukur zona hambat pada masing-masing perlakuan dengan sorong

setelah 1 x 24 jam.

57

3.8 Teknik Pengambilan Data

Penelitian ini menggunakan teknik pengumpulan data dengan observasi

hasil eksperimen, yaitu teknik pengambilan data secara langsung dengan prosedur

yang melibatkan kegiatan melihat dan mencatat aktivitas. Observasi dilakukan

dilaboratorium terhadap obyek perlakuan. Observasi eksperimen yang dilakukan

dalam penelitian ini yaitu variabel terikat yang sebelumnya telah diberi perlakuan,

kemudian data yang diperoleh dicatat ke dalam tabel. Tabel 3.2 mencakup

pengukuran rerata diameter daerah hambat yang dibentuk oleh Shigella

dysenteriae setelah diberi perlakuan dengan berbagai konsentrasi air rebusan daun

sirih hijau (Piper betle L.) kemudian dokumentasi merupakan teknik

mengumpulkan data setelah kegiatan observasi berhasil dilakukan, kemudian

melakukan pengamatan dan memotret.

Tabel 3.2 Data Rerata Diameter Zona Hambat

Perlakuan

konsentrasi

(%)

Ulangan Rerata

I II III

10%

15%

20%

25%

30%

Kontrol (+)

3.9 Teknik Analisis Data

Analisis data yang dilakukan dalam penelitian ini adalah perhitungan SPSS

menggunakan uji One Way ANOVA untuk melihat apakah ada perbedaan efektif

dari masing-masing konsentrasi rebusan daun sirih hijau (Piper betle L.). Syarat

ketentuan uji One Way ANOVA adalah data berdistribusi normal dan varians data

58

sama atau homogen, sehingga dapat dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA, uji

ini digunakan untuk menguji apakah Ho ditolak atau diterima dan menguji suatu

efek, akibat atau pengaruh dari suatu variabel tertentu yang diteliti. Uji lanjut

setelah ANOVA yaitu dengan Uji Beda Jarak Duncan’s. Uji ini dilakukan untuk

menentukan atau memilih perlakuan yang terbaik atau paling efektif dari sejumlah

dan perlakuan dengan berdasarkan pada nilai rerata. Perbedaan perlakuan yang

diikuti notasi huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata, sedangkan

perlakuan yang diikuti dengan notasi huruf yang tidak sama menunjukkan berbeda

nyata.

59

3.10 Alur Kerja Pelaksanaan Penelitian

Gambar 3.4 Bagan Alur Pelaksanaan Pengujian Daya Antimikroba

Rebusan Daun Sirih Hijau (Piper betle L.) terhadap Pertumbuhan

Bakteri Shigella dysenteriae secara in vitro

Mensterilkan alat dan bahan yang digunakan

Mengencerkan rebusan

daun sirih hijau dengan

macam konsentrasi

Siapkan suspensi bakteri

Shigella dysenteriae

Membuat media NA

dan masukkan ke

cawan petri

Merendam paper disk

selama 5 menit didalam

setiap konsentrasi

rebusan daun sirih hijau

Meletakan paper disk yang telah direndam dalam rebusan daun sirih hijau diatas

media NA

Inkubasi selama 18- 24 jam di dalam inkubator dengan suhu 37o C

Melakukan pengukuran diameter zona hamba (daerah bening)) disekitar

cakram.

Analisis hasil

Mengoleskan secara

merata suspensi bakteri

Shigella dysenteriae

pada media NA

Documents

BAB III METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Jenis Penelitianeprints.umm.ac.id/36809/4/jiptummpp-gdl-niniksulas-50043-4-babiii.pdf43 BAB III METODOLOGI PENELITIAN . 3.1 Jenis Penelitian . Jenis