5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)

2.1.1 Klasifikasi tanaman

Divisi : Spermatophyta

Sub Divisi : Angiospermae

Classis : Dicotyledoneae

Ordo : Solanaceae

Familia : Acanthaceae

Genus : Andrographis

Spesies : Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees

(Sivananthan and Elamaran, 2013)

2.1.2 Morfologi tanaman

Sambiloto atau dikenal juga dengan sebutan Kalmegh, Kalafath, Kan-jang,

Alui, Charita, Sambilata, Andrograpidis banyak ditemukan dan dibudidayakan di

daerah tropis dan subtropis Asia, Asia Tenggara dan India (Benoy et al., 2012).

Tanaman sambiloto memiliki tinggi 40 cm sampai 90 cm, percabangan banyak

dengan letak yang berlawanan, cabang berbentuk segi empat dan tidak berambut.

Bentuk daun lanset, ujung daun dan pangkal daun tajam atau tegak tajam, tepi

daun rata, panjang daun 3 cm sampai 12 cm dan lebar 1 cm sampai 3 cm, panjang

tangkai daun 5 mm sampai 25 mm; daun bagian atas bentuknya seperti daun

pelindung. Perbungaan tegak bercabang-cabang, gagang bunga 3 mm sampai 7

6

mm, panjang kelopak bunga 3 mm sampai 4 mm. Bunga bibir bentuk tabung,

panjang 6 mm, bibir bunga bagian atas berwarna putih dengan warna kuning di

bagian atasnya, bibir bunga bawah lebar, berwarna ungu. Bentuk buah jorong

dengan ujung yang tajam, bila tua akan pecah menjadi 4 bagian (DepKes RI,

1979).

Gambar 2.1 Herba sambiloto. 1. Tanaman sambiloto, 2. Bunga sambiloto yang

berpigmentasi, 3. Bunga sambiloto dengan warna ungu, 4. Buah

berbentuk jorong, 5. Biji sambiloto yang telah tua (Benoy et

al.,2012)

2.1.3 Habitat tanaman

Sambiloto merupakan herba tegak yang tumbuh secara alami di daerah

dataran rendah hingga ketinggian 1600 dpl, dengan habitat tumbuh di tempat

terbuka seperti ladang, pinggir jalan, tebing, saluran atau sungai, semak belukar,

di bawah tegakan pohon jati atau bambu. Sambiloto tumbuh baik pada curah

hujan 2.000 – 3.000 mm pertahun, Suhu udara 25 – 32 0C serta kelembaban yang

dibutuhkan antara 70 – 90 %. Tumbuhan sambiloto dapat tumbuh pada semua

jenis tanah, yang subur, mengandung banyak humus, tata udara dan pengairan

7

yang baik. Sambiloto tumbuh optimal pada pH tanah 6 – 7 (netral) (Pujiasmanto

dkk., 2007).

2.1.4 Kandungan kimia tanaman

Secara kimia sambiloto mengandung diterpen, flavonoid, stigmasterol,

alkane, keton, aldehid dan mineral (kalsium, natrium, kalium) (Rosidah et al.,

2012). Beberapa jenis diterpen telah teridentifikasi dalam herba sambiloto

diantaranya yaitu andrografolid, deoksiandrografolid, neoandrografolid, 14-

deoksi-11, 12-didehidroandrografolid, isoandrografolid, dan 3,19-dihydroxy-15-

methoxy-entlabda-8(17),11,13-trien-16,15-olide (Song et al., 2013). Komponen

utamanya adalah andrografolid yang merupakan senyawa diterpen lakton

(Rosidah et al., 2012).

2.2 Andrografolid

Andrografolid termasuk kedalam kelompok trihidroksilakton berupa kristal

tak berwarna dan mempunyai rasa yang sangat pahit dengan rumus molekul

C20H30O5 (Chao dan Lin, 2010).

Gambar 2.2 Struktur andrografolid (Chao dan Lin, 2010)

8

Andrografolid mudah larut dalam metanol etanol, piridin, asam asetat, dan

aseton, tetapi sedikit larut dalam eter dan air. Secara fisika memiliki titik leleh

228-230oC (Ratnani dkk., 2012). Spektrum ultraviolet Andrographis paniculata

(Burm.f.) Nees dalam metanol dengan panjang gelombang maksimal 230 nm

(Depkes RI, 2010). Andrografolid dalam bentuk kristalnya akan terdekomposisi

apabila disimpan pada suhu 70˚C dengan kelembaban relatif sebesar 75% selama

3 bulan (Lomlim et al., 2003).

Andrografolid tersebar sekitar 4%, 0,8-1,2% dan 0,5-6% pada ekstrak herba

yang dikeringkan, batang, dan daun (Chao dan Lin, 2010). Di dalam daun, kadar

senyawa andrografolid memiliki jumlah tertinggi yaitu sebesar 2,5-4,8% dari berat

keringnya (Prapanza dan Marito, 2003).

Gambar 2.3 Spektrum KLT-Spektrofotodensitometri dari andrografolid pada

panjang gelombang 235 nm (Pawar, 2010)

Andrografolid telah dilaporkan memiliki beragam efek farmakologi seperti

antidiabetes (Reyes-Balaguer et al., 2005; Yu et al., 2008), anti-agregasi platelet

(Amroyan et al., 1999), antimalaria (Dua et al., 2000), antihiperglikemi (Kumar et

9

al., 2012), imunostimulan (Xu et al., 2007), hepatoprotektif (Singha et al., 2007),

antihiperlipidemia (Sivananthan and Elamaran, 2013).

2.3 Ekstraksi Senyawa Bahan Alam

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair (Depkes

RI, 2000). Pelarut yang digunakan harus dapat mengekstrak substansi yang

diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.

Pada proses ekstraksi pada dasarnya dibedakan menjadi dua fase yaitu fase

pencucian dan fase ekstraksi.

1. Fase Pencucian (Washing Out)

Pada saat penggabungan pelarut dengan simplisia, maka sel-sel yang

rusak karena proses pengecilan ukuran langsung kontak dengan bahan

pelarut. Komponen sel yang terdapat pada simplisia tersebut dapat dengan

mudah dilarutkan dan dicuci oleh pelarut. Dengan adanya proses tersebut,

maka dalam fase pertama ini sebagian bahan aktif telah berpindah ke dalam

pelarut. Semakin halus ukuran simplisia, maka semakin optimal jalannya

proses pencucian tersebut (Voigt, 1994).

2. Fase Ekstraksi (Difusi)

Untuk melarutkan komponen sel yang tidak rusak, maka pelarut harus

masuk ke dalam sel dan mendesak komponen sel tersebut keluar dari sel.

Membran sel simplisia yang mula-mula mengering dan menciut harus diubah

terlebih dahulu agar terdapat suatu perlintasan pelarut ke dalam sel. Hal ini

10

dapat terjadi melalui proses pembengkakkan, dimana membran mengalami

suatu pembesaran volume melalui pengambilan molekul bahan pelarut.

Kemampuan sel untuk mengikat pelarut menyebabkan struktur dinding sel

tersebut menjadi longgar, sehingga terbentuk ruang antarmiselar yang

memungkinkan bahan ekstraksi mencapai ke dalam ruang dalam sel (Voigt,

1994).

Penggunaan pelarut bertitik didih tinggi menyebabkan adanya kemungkinan

kerusakan komponen-komponen senyawa penyusun pada saat pemanasan. Pelarut

yang digunakan harus bersifat inert terhadap bahan baku, mudah didapat dan

harganya murah (DepKes RI, 1986). Menurut Stahl (1969), polaritas pelarut

sangat berpengaruh terhadap daya larut. Indikator kelarutan pelarut dapat

ditentukan dari nilai konstanta dielektrik dan nilai polaritas pelarut. Besarnya nilai

polaritas pelarut proporsional dengan konstanta dielektriknya.

Srijanto et al. (2012) melakukan penelitian mengenai ekstraksi sambiloto

dengan ekstraksi cair-cair. Ekstraksi cair-cair dilakukan dengan variasi waktu (10

menit, 15 menit dan 20 menit) dan variasi jumlah pelarut dengan perbandingan

ekstrak etanol sambiloto : etil asetat, v/v (1:1, 1:2 dan 1:3). Berdasarkan hasil

penelitian menunjukkan waktu ekstraksi memberikan pengaruh pada kadar

andrografolid di dalam ekstrak etanol sambiloto terpurifikasi. Semakin lama

waktu ekstraksi maka semakin besar kadar andrografolid di dalam ekstrak etanol

sambiloto terpurifikasi sampai pada batas tertentu. Sementara itu, semakin besar

nisbah pelarut-bahan baku maka kadar andrografolid di dalam ekstrak etanol

11

sambiloto terpurifikasi akan semakin meningkat dan akan menurun seiring dengan

pertambahan jumlah pelarut.

Metode ekstraksi dipilih berdasarkan beberapa faktor seperti sifat dari bahan

mentah obat, daya penyesuaian dengan tiap macam metode ekstraksi dan

kepentingan dalam memperoleh ekstrak yang sempurna (Ansel, 1989). Menurut

DepKes RI (2000), ekstraksi dengan dapat dilakukan dengan cara dingin dan cara

panas. Cara dingin yaitu metode maserasi dan perkolasi, sedangkan cara panas

antara lain dengan refluks, sokletasi, digesti, dekok dan infus.

2.3.1 Maserasi

Maserasi ialah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut

dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada tempratur ruangan

(kamar). Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinyu (terus-

menerus) dan remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut

setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya (DepKes RI,

2000). Pada metode ekstraksi dengan maserasi, cairan penyari akan masuk ke

dalam sel melewati dinding sel. Isi sel akan larut karena adanya perbedaan

konsentrasi antara larutan di dalam sel dengan di luar sel. Larutan yang

konsentrasinya tinggi akan terdesak keluar dan diganti oleh cairan penyari dengan

konsentrasi rendah (proses difusi). Simplisia yang akan diekstraksi ditempatkan

pada wadah atau bejana yang bermulut lebar bersama larutan penyari yang telah

ditetapkan, bejana ditutup rapat kemudian dikocok berulang-ulang sehingga

memungkinkan pelarut masuk ke seluruh permukaan simplisia (DepKes RI,

1986).

12

Menurut Pratiwi (2010) rendemen yang diperoleh dari ekstraksi

andrografolid pada Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees menggunakan

metode maserasi berkisar antara 5,7-7,0%. Rendemen terendah terdapat pada

waktu maserasi 4 jam, dan rendemen tertinggi terdapat pada waktu maserasi 24

jam. Rata-rata rendemen yang diperoleh yaitu 6,4%. Hal ini menunjukkan bahwa

semakin lama maserasi, maka rendemen yang dihasilkan pun semakin tinggi. Pada

metode ini dipengaruhi oleh waktu kontak yang lama antara pelarut dan simplisia,

sehingga pelarut dapat lebih mudah masuk ke dalam sel dan menarik senyawa-

senyawa secara maksimal. Adanya pengadukan juga sangat membantu

mempermudah pelarut dalam melarutkan senyawa-senyawa tersebut.

2.3.2 Refluks

Refluks merupakan ekstraksi dengan pelarut pada tempratur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik (DepKes RI, 2000).

Gambar 2.4 Alat refluks (Houghton dan Raman, 1998)

Kondensor

Pelarut

Sampel

13

Prinsip kerja pada metode refluks yaitu penarikan komponen kimia yang

dilakukan dengan cara sampel dimasukkan ke dalam labu alas bulat bersama-sama

dengan cairan penyari lalu dipanaskan, uap-uap cairan penyari terkondensasi pada

kondensor bola menjadi molekul-molekul cairan penyari yang akan turun kembali

menuju labu alas bulat, akan menyari kembali sampel yang berada pada labu alas

bulat, demikian seterusnya berlangsung secara berkesinambungan sampai

penyarian sempurna (Akhyar, 2010). Cara ini digunakan untuk simplisia yang

kandungan zat aktifnya tahan terhadap pemanasan. Pemanasan dimaksudkan

untuk mempermudah cairan penyari menembus dinding sel simplisia karena

dengan pemanasan sel simplisia mengalami pengembangan sehingga rongga-

rongga selnya terbuka dengan demikian pelarut mudah mencapai zat aktif di

dalam dan diluar sel cepat tercapai (Sudjadi, 1986).

Keuntungan menggunakan teknik ini adalah membutuhkan alat yang

sederhana dengan biaya murah dan waktu ektraksi yang diperlukan lebih cepat

dibandingkan dengan ekstraksi menggunakan maserasi dengan perolehan kembali

yang tinggi (Pratiwi, 2010; Mohan et al., 2013). Sedangkan kerugiannya adalah

sulitnya mencapai ekstraksi yang sempurna meskipun penggunaan pelarut yang

cukup banyak dan seringkali melarutkan oligomer yang lebih rendah. Metode ini

juga hanya dapat dilakukan pada senyawa yang tahan terhadap pemanasan (Bart,

2005).

Menurut penelitian yang telah dilakukan Mohan et al. (2013) melaporkan

ekstraksi andrografolid dari sambiloto (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees)

menggunakan metode refluks selama 12 jam diperoleh rendemen sebanyak

14

19,004% hingga 19,060% menggunakan pelarut air dan 18,396% hingga 19,210%

menggunakan pelarut metanol. Pada penelitian tersebut menunjukkan pelarut

metanol mampu memberikan rendemen paling tinggi dengan kadar andrografolid

sebanyak 1,654%.

2.4 Identifikasi Andrografolid dengan Metode KLT-

Spektrofotodensitometri

Kromatografi lapis tipis ialah metode pemisahan fisiko kimia. Lapisan yang

memisahkan terdiri atas bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada

penyangga berupa plat gelas, logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang

akan dipisah berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita (awal). Setelah

plat atau lapisan ditaruh di dalam bejana tertutup rapat yang berisi larutan

pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama perambatan

kapiler (pengembangan). Selanjutnya, senyawa yang tidak berwarna harus

ditampakkan atau dideteksi (Stahl, 1985).

Densitometer atau Thin Layer Chromato Scanner sudah banyak digunakan

secara luas. Densitometri adalah metode analisis instrumental yang berdasarkan

interaksi radiasi elektromagnetik dengan analit yang merupakan noda pada KLT.

Densitometri lebih dititikberatkan untuk analisis kuantitatif analit-analit dengan

kadar yang sangat kecil yang perlu dilakukan pemisahan terlebih dahulu dengan

KLT (Mulja dan Suharman, 1995).

15

Gambar 2.5 Spektrofotodensitometer yang dihubungkan ke PC (Mulja dan

Suharman, 1995)

Farmakope Herbal Indonesia (FHI) menggunakan KLT sebagai metode

untuk identifikasi penentuan senyawa andrografolid pada herba sambiloto. Sistem

KLT yang digunakan adalah fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak kloroform

P : metanol (9:1). Senyawa pembanding yang digunakan sebagai senyawa

identitas herba Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees adalah andrografolid

0,1% dalam etanol P dengan nilai Rf sebesar 0,55. Pendeteksian dilakukan dengan

menggunakan lampu UV 230 nm (DepKes RI, 2010).

Pawar et al. (2010) melaporkan pengembangan dan validasi metode

penetapan kadar andrografolid dari Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees

menggunakan metode HPTLC secara sederhana, cepat, reprodusibel dan selektif.

Hasil yang diperoleh pada validasi metode yang dilakukan menunjukkan nilai

yang sesuai dengan persyaratan.

16

Gambar 2.6 Hasil KLT herba Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees pada

pengamatan di bawah lampu UV 254 nm dan 366 nm. Sampel

ekstrak etanol dari sambiloto (T1, T2, T3 dan T4), standar

andrografolid (S2 dan S3) (Pawar et al., 2010)

Pada gambar 2.6 menunjukkan KLT pada pengamatan dibawah lampu UV

254 nm dan 366 nm. Pada penelitian tersebut digunakan plat KLT silika gel 60

GF254 dengan toluene : etil asetat : asam formiat (5:4,5:0,5) v/v sebagai fase gerak.

Pemisahan tersebut menunjukkan andrografolid berada pada Rf 0,38 di bawah

lampu UV 254 dengan warna spot abu-abu gelap dan pada UV 366 nm tidak

menunjukkan pita secara signifikan (Pawar, 2010).

2.5 Validasi Metode

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter

tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Validasi metode menurut United States Pharmacopeia (USP) dilakukan untuk

17

menjamin bahwa metode analisis akurat, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada

kisaran analit yang akan dianalisis.

2.5.1 Ketepatan (Akurasi)

Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau kedekatan antara nilai

terukur dengan nilai yang diterima baik nilai konvensi, nilai sebenarnya, atau nilai

rujukan (Gandjar dan Rohman, 2007). Akurasi dapat pula diartikan sebagai

ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit

yang sebenarnya (Harmita, 2004).

Kecermatan ditentukan dengan dua cara, yaitu metode simulasi (spiked-

placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method).

a. Metode Simulasi (Spiked Placebo Recovery)

Sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam plasebo (semua

campuran reagen yang digunakan minus analit), lalu campuran tersebut

dianalisis dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standar yang ditambahkan

(kadar yang sebenarnya). Recovery dapat ditentukan dengan cara membuat

sampel plasebo (eksepien obat, cairan biologis) kemudian ditambah analit

dengan konsentrasi tertentu (biasanya 80% sampai 120% dari kadar analit

yang diperkirakan), kemudian dianalisis dengan metode yang akan divalidasi

(Harmita, 2004).

b. Metode Penambahan Baku (Standard Addition Method)

Bila tidak memungkinkan membuat sampel plasebo karena matriksnya tidak

diketahui seperti obat-obatan paten, atau karena analitnya berupa suatu

senyawa endogen, maka dapat dipakai metode adisi. Metode adisi dapat

18

dilakukan dengan menambahkan sejumlah analit dengan konsentrasi tertentu

pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis dengan metode tersebut. Persen

perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa persen analit yang

ditambahkan dapat ditemukan (Harmita, 2004).

2.5.2 Keseksamaan (Presisi)

Keseksamaan adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara

hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen. Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau

simpangan baku relatif (koefisien variasi). Suatu data dikatakan memenuhi

keseksamaan bila nilai KV < 2% (Harmita, 2004).

Jika hasil analisis adalah x1, x2, x3, x4,......xn, maka nilai simpangan

bakunya (SD) dapat dihitung sesuai dengan persamaan 2.1 berikut.

1

2

n

xx

SD ....................................................... persamaan 2.1

Keterangan:

SD = simpangan baku

n = jumlah sampel

Sedangkan nilai simpangan baku relatif/koefisien variasi (KV) dapat

dihitung sesuai dengan persamaan 2.2 sebagai berikut.

𝐾𝑉 = 𝑆𝐷

�̅� × 100% ……...................................................... persamaan 2.2

Keterangan:

KV = koefisien variasi

�̅� = rata-rata hasil analisis

19

2.5.3 Linearitas dan rentang

Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon

yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik,

proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah

pernyataan batas terendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat

ditetapkan dengan kecermatan, keseksamaan dan linieritas yang dapat diterima. Di

dalam pustaka, sering ditemukan rentang konsentrasi yang digunakan antara 50 –

150% kadar analit dalam sampel. Parameter yang diamati adalah nilai r dari

persamaan linier dan simpangan baku residual (x

Sy). Suatu data dikatakan linier

apabila nilai r = 1 atau -1 (Harmita, 2004). Untuk menghitung nilai x

Sy

digunakan persamaan 2.3.

2

2

11

N

yy

xSy ....................................................... persamaan 2.3

Keterangan:

y1= AUC senyawa yang terukur alat (respon detektor)

ŷ1= AUC hasil perhitungan berdasarkan persamaan garis lurus (ŷ1 = a+bx)

N = jumlah standar yang diukur

2.5.4 Spesifisitas/Selektifitas

Spesifisitas (selektifitas) merupakan kemampuan untuk menaksir dengan

seksama keberadaan komponen yang diharapkan untuk ada, misalnya

membedakan antara pengotor, matriks dan komponen lain yang ada dalam sampel

(ICH, 2005). Dengan kata lain, spesifisitas merupakan kemampuan metode

20

analisis untuk dapat mengukur respon analit diantara komponen-komponen yang

mungkin ada dalam sampel (Huber, 2010).

Dalam identifikasi analit, menurut ICH (2005) ujii dentifikasi yang sesuai

harus dapat membedakan komponen dengan berbagai struktur yang kemungkinan

terdapat dalam sampel. Perbedaan dapat dicari dengan membandingkan hasil dari

sampel yang mengandung analit (dapat dicari dari pustaka) dengan hasil dari

sampel yang tidak mengandung analit (ICH, 2005). Parameter selektivitas yang

baik yaitu memiliki nilai resolusi > 1,5 (Pescok dkk, 1976).

2.5.5 LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantification)

Batas deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dibandingkan dengan

blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji batas. Batas kuantitasi (LOQ)

merupakan parameter pada analisis renik dan diartikan sebagai kuantitas terkecil

analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

LOD dan LOQ dapat dihitung dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:

LOD =slope

xSy

3 …...................................................................persamaan 2.4

LOQ = slope

xSy

10

......................................................................persamaan 2.5

Keterangan:

LOD = Limit of Detection

LOQ = Limit of Quantification

xSy

= simpangan baku residual

Slope = kemiringan

(Harmita, 2004)