Asam Nukleat

FOCUS GROUP 4.2 Lita Lianti (1106011120)

Mohamad Teguh Gumelar (1106000741)

Nadia

Rizali Nurcahya Nararya

Taufik Hidayat Abdullah (1106004071)

Wahyu Ari Wibowo (1106020983)

Yulianto (1106002116)

ANALISIS ASAM NUKLEAT

Staining

• Staining adalah proses identifikasi adanya DNA atau RNA dengan memperikan pewarna (dye) kedalam sampel dan menganalisa warna untuk mengidentifikasi adanya DNA maupun RNA

EtBr ( Ethidium Bromide )

• Ethidum bromide memiliki absorbansi sinar UV antara 300 -360 nm dan dapat menyerap energi dari nukleotida degan absorbansi 260 nm.

• EtBr memandarkan warna kuning/ oranye dengan panjang gelombang 590 nm

• EtBr berikatan diantara basa hidrofobik pada nukleotida DNA dan merentangkan fragment DNA sehingga meningkatkan daya pendar

Acridine Orange (DNA)

• Pada DNA, acridine orange dapat bereksitasi pada 502 nm dengan emisi 565 nm dan memancarkan warna hijau

• DNA berinterkalasi dengan AO dan menghasilkan warna hijau.

• AO berikatan dengan asam nukleat pada pH 3,5

• Analisa RNA menggunakan Acridin Orange

• AO akan bereksitasi pada 460 nm dan memancarkan emisi 650 nm (merah)

Acridine Orange (RNA)

DNA Staining

• Pengamatan sel staining berguna untuk :

1. Mengetahui letak nukleus dimana dapat didentifikasi dari warna pendar

2. Mengetahui siklus sel dengan menganalisa letak DNA

3. Untuk mengetahui sel tersebut termasuk sel hidup dengan menganalisa adanya DNA

RNA Staining

• RNA staining berfungsi untuk mengetahui siklus sel dari sel yang dianalisis, adanya RNA menunjukkan bahwa suatu sel hidup sedang dalam proses sintesis protein

Molecular Probe / Hybridization Proses penghubungan DNA probe dengan DNA sampel untuk mendeteksi kandungan basa nitrogen yang terdpat pada sampel

• Probe adalah sekuens asam nukleat yang telah diberi label atau penanda yang digunakan untuk mendeteksi basa nitrogen dalam sekuens sampel DNA ataupun RNA

• Probe memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer terhadap urutan BASA nitrogen DNA dan RNA sampel

• Probe biasanya berupa mRNA atau single strained DNA (ssDNA)

• Probe biasanya terdiri dari 20-30 untaian basa dan diberi penanda radioaktif atau penanda pendar

• Radioaktif isotop fosfor atau fosofdiester yang berikatan pada DNA

PROBE

Proses Hibridisasi

1. Proses Denaturasi: Proses ini dimana DNA sampel dipisahkan sehingga menjadi rantai tunggal. DNA biasanya dipanaskan atau dengan enzim restriksi 2. Proses Renaturasi Proses ini dimana Probe dipasangkan dengan DNA sampel dan kemudian dia analisis

Elektroforesis Gel

• elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

• Sebelum dilakukan electroforesis, DNA terlebih dahulu dipotong-potong dengan enzim restriksi sesuai dengan recognition site yang diinginkan

• Sampel kemudian diletakkan dalam media agar. Media agar yang digunakan adalah media agarose dan poliakrilamid

• Sampel diletakkan pada kutub negatif sumbu-sumbu agar

• Sebelum dimasukkan sampel diberi pemberat berupa larutan buffer seperti polietilenglikol atau gliserin, bromofenol biru dan aquades agar dapat masuk ke gel dengan baik

• Gel kemudian dialiri listrik, sampel dna akan bergerak menuju kutub positif

• Semakin panjang rantai DNA maka semakin banyak pula waktu yang dibutuhkan untuk menuju kutub positif

• Kemudian sampel diberi warna (staining) agar dapat terlihat jelas

GEL-TRANSFER HYBRIDIZATION

RFLP

DNA & RNA SEQUENCING

Gel-transfer hybridization DNA : Southern blotting RNA : Northern blotting

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

• Perbedaan urutan DNA pada kromosom homolog menghasilkan pola fragmen restriksi yang berbeda

• RFLP dapat ditekesi dengan Southern Blotting

• RFLP diwariskan dengan pola Mendelian, dapat digunakan untuk analisis genetika.

DNA Sequencing – Metode Sanger Dideoxy Chain Termination Method

1. DNA yang akan di-sequencing diinkubasi dalam tabung bersama dengan bahan lain yang dibutuhkan untuk sintesis DNA


2. Sintesis DNA akan berlangsung dan berhenti jika dideoksiribonukleotida digunakan. Proses ini menghasilkan DNA dengan panjang yang bervariasi sesuai urutan nukleotida


3. Campuran kemudian dielektroforesis dengan gel polyacrilamide. Fluoresensi dari dideoksiribonukleotida yang digunakan dideteksi oleh detektor

• RNA bersifat relatif kurang stabil dibanding DNA • Agar dapat di-sequencing dengan metode sanger, RNA perlu diubah menjadi cDNA

RNA Sequencing – Metode Sanger Dideoxy Chain Termination Method

ANALISIA KUANTITATIF DNA

DAN RNA

Tahapan Uji Kuantitatif

Mengisolasi DNA atau RNA dengan metode elektorforesis gel agarose

Melakukan Identifikasi DNA atau RNA dengan pewarna berfluoresent

Menggunakan metode spektroskopi untuk menentukkan kemurnian dan konsentrasi DNA atau RNA

Menentukan Konsentrasi DNA dan RNA

• Konsentrasi DNA dan RNA dapat ditentukan dengan menggunakan :

1. Spektroskopi Sinar Tampak

2. Spektroskopi UV-Vis

Spektroskopi Sinar Tampak

• Menggunakan sinar tampak sebagai sumber cahaya

• Panjang gelombang 380 – 750 nm

• Sampel harus dibuat berwarna terlebih dahulu dengan reagen spesifik

Spektroskopi UV-Vis

• Gabungan sinar tampak dan UV

• Panjang gelombang 190 – 380 nm

• Sampel bening bisa langsung dianalisa

Menentukkan Kemurnian DNA

• Rentang kemurnian DNA 1.8 – 2.0

• Kemurnian DNA <1.8 maka isolasi DNA belum murni

• Kemurnian DNA >2.0 maka nilai ddH2O yang diambil lebih banyak dari DNA

Kemurnian = Å260/Å280

Mengukur Konsentrasi DNA dan RNA

• Å260 = Nilai absorbansi pada 260 nm

• 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)

• 40 = 40ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)

[DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran

[RNA] = Å260 x 40 x faktor pengenceran

Metode RT-PCR

Relative Kuantifikasi

• Mengacu pada refrensi internal gen untuk menentukan perbedaan reaksi gen yang diuji

Absolut Kuantifikasi

• Memberikan nilai pasti dari molekul DNA yang diuji dengan mengacu pada DNA standar

Metode Kuantifikasi Logarithmic Scale

1. Threshold Cycle (Ct)

Jumlah siklus yang memiliki threshold kelebihan fluoresens

2. Quantification Cycle (Cq)

Berdasarkan acuan dari MIQE, dimana nilai Cq menjadi pangkat eksponensial dari 2

Menghitung Gen

Kurva Kalibrasi

ΔΔCt-method

MAK2 method

APLIKASI DNA DAN RNA

RNAi (RNA interference) merupakan sebuah mekanisme menghilangkan ekspresi gen setelah gen berhasil ditranskripsi atau suatu proses alami yang meminimalisir atau menghilangkan suatu aktivitas gen tertentu.

Pertama kali diteliti melalui penghasil pigmen pada bunga. Setelah itu diteliti lebih lanjut melalui untai ganda RNA pada cacing, Andrew Fire dan Craig Mello mendapatkan penghargaan atas penemuaanya.

Mekanisme kerja RNAi

• RNAi bekerja dengan menghancurkan molekul messengger yang membawa informasi gen untuk penghasil protein sel.

RNA memicu Memotong RNAi

Fragmen kecil

Menempel pada mRNA Kode/ pesan dihancurkan

Mekanisme RNAi Secara Umum

Aplikasi RNAi

Kanker

- Mengisolasi sel kanker untuk pertumbuhan sel tumor, metastasis, agriogenesis, dan kemoresisten

Terapi Imun Kanker

- Mengaktivkan kembali sistem imun pada tubuh penderita kanker atau merekayasa pertumbuhan imun

Tantangan Dalam Mengembangkan RNAi

Pengiriman Respons

Imun dan Off-Target

Kejenuhan dari

Pembuat RNAi

Memonitor Aktivitas

RNAi

REKAYASA GENETIKA

Pendahuluan

Aplikasi pengetahuan biologi molekular :

1. Pendeteksian dan penyembuhan penyakit

2. Teknologi Obat dan Herbal

3. Teknologi Pangan

4.Rekayasa Genetika

PROTEIN

LEMAK

POLISAKARIDA ASAM

NUKLEAT

Pengetahuan Biologi Molekular

Microinjection

Rekayasa Genetika

Materi Genetik

yang ada di mahluk

hidup

Materi Genetik

yang telah

dimodifikasi

modifikasi

Struktur dan fungsi tertentu Struktur dan fungsi baru

Ada fungsi yang dihilangkan

Yang diketahui : • Struktur dan sifat kimia materi genetik

• Kode yang disusun materi genetik

• Fungsi kode materi genetik

• Replikasi materi genetik

• Isolasi materi genetik

• dll.

Ketahui

Terapkan

Hasilkan

APA SAJA HASILNYA?

Identifikasi

Transfer

Modifikasi

Replikasi

Teknik atau Metode Transfer

Materi Genetik

• Injeksi Mikro

• DNA Recombinant

• Chemical and Electro poration

• Bioballistic

Paru-Paru mencit (abc) normal, (def) infeksi dengan rekayasa genetika,

(ghi) infeksi tanpa rekayasa genetika (Queenie, 2008)

Contoh hasil rekayasa genetika :

• Glow Fish (Pray, 2008)

• Lembu α-lactalbumin (Eyestone, 1999)

• Sapi Omega-3 (Wu, 2011)

• Kelinci penghasil antibodi bispesifik (Hovest et al, 2004)

• Ayam penghasil tetrasiklin (Kwon, 2011)

• Tikus resisten infeksi bakteri (Queenie, 2008)

Anopeles Transgenik Menurunkan Wabah Penyakit Malaria

Ikan Salmon Transgenik

Metode

TERAPI GEN

• Teknik untuk mengoreksi gen-

gen yang cacat yang yang dapat menyebabkan suatu penyakit.

Definisi

• Insersi gen normal, penggantian gen yang tidak berfungsi

•Penghilangan gen abnormal

•Perbaikan gen abnormal

•Pengaturan gen

Prinsip

• Terapi gen somatik

• Terapi gen germinal Jenis

•Cara memasukan gen baru

Terima Kasih

Documents

Asam Nukleat