Asam Nukleat

  • View
    34

  • Download
    1

Embed Size (px)

Text of Asam Nukleat

  • FOCUS GROUP 4.2 Lita Lianti (1106011120)

    Mohamad Teguh Gumelar (1106000741)

    Nadia

    Rizali Nurcahya Nararya

    Taufik Hidayat Abdullah (1106004071)

    Wahyu Ari Wibowo (1106020983)

    Yulianto (1106002116)

  • ANALISIS ASAM NUKLEAT

  • Staining

    Staining adalah proses identifikasi adanya DNA atau RNA dengan memperikan pewarna (dye) kedalam sampel dan menganalisa warna untuk mengidentifikasi adanya DNA maupun RNA

  • EtBr ( Ethidium Bromide )

    Ethidum bromide memiliki absorbansi sinar UV antara 300 -360 nm dan dapat menyerap energi dari nukleotida degan absorbansi 260 nm.

    EtBr memandarkan warna kuning/ oranye dengan panjang gelombang 590 nm

    EtBr berikatan diantara basa hidrofobik pada nukleotida DNA dan merentangkan fragment DNA sehingga meningkatkan daya pendar

  • Acridine Orange (DNA)

    Pada DNA, acridine orange dapat bereksitasi pada 502 nm dengan emisi 565 nm dan memancarkan warna hijau

    DNA berinterkalasi dengan AO dan menghasilkan warna hijau.

    AO berikatan dengan asam nukleat pada pH 3,5

  • Analisa RNA menggunakan Acridin Orange

    AO akan bereksitasi pada 460 nm dan memancarkan emisi 650 nm (merah)

    Acridine Orange (RNA)

  • DNA Staining

    Pengamatan sel staining berguna untuk :

    1. Mengetahui letak nukleus dimana dapat didentifikasi dari warna pendar

    2. Mengetahui siklus sel dengan menganalisa letak DNA

    3. Untuk mengetahui sel tersebut termasuk sel hidup dengan menganalisa adanya DNA

  • RNA Staining

    RNA staining berfungsi untuk mengetahui siklus sel dari sel yang dianalisis, adanya RNA menunjukkan bahwa suatu sel hidup sedang dalam proses sintesis protein

  • Molecular Probe / Hybridization Proses penghubungan DNA probe dengan DNA sampel untuk mendeteksi kandungan basa nitrogen yang terdpat pada sampel

  • Probe adalah sekuens asam nukleat yang telah diberi label atau penanda yang digunakan untuk mendeteksi basa nitrogen dalam sekuens sampel DNA ataupun RNA

    Probe memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer terhadap urutan BASA nitrogen DNA dan RNA sampel

    Probe biasanya berupa mRNA atau single strained DNA (ssDNA)

    Probe biasanya terdiri dari 20-30 untaian basa dan diberi penanda radioaktif atau penanda pendar

    Radioaktif isotop fosfor atau fosofdiester yang berikatan pada DNA

    PROBE

  • Proses Hibridisasi

    1. Proses Denaturasi: Proses ini dimana DNA sampel dipisahkan sehingga menjadi rantai tunggal. DNA biasanya dipanaskan atau dengan enzim restriksi 2. Proses Renaturasi Proses ini dimana Probe dipasangkan dengan DNA sampel dan kemudian dia analisis

  • Elektroforesis Gel

    elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

  • Sebelum dilakukan electroforesis, DNA terlebih dahulu dipotong-potong dengan enzim restriksi sesuai dengan recognition site yang diinginkan

    Sampel kemudian diletakkan dalam media agar. Media agar yang digunakan adalah media agarose dan poliakrilamid

    Sampel diletakkan pada kutub negatif sumbu-sumbu agar

  • Sebelum dimasukkan sampel diberi pemberat berupa larutan buffer seperti polietilenglikol atau gliserin, bromofenol biru dan aquades agar dapat masuk ke gel dengan baik

    Gel kemudian dialiri listrik, sampel dna akan bergerak menuju kutub positif

    Semakin panjang rantai DNA maka semakin banyak pula waktu yang dibutuhkan untuk menuju kutub positif

    Kemudian sampel diberi warna (staining) agar dapat terlihat jelas

  • GEL-TRANSFER HYBRIDIZATION

    RFLP

    DNA & RNA SEQUENCING

  • Gel-transfer hybridization DNA : Southern blotting RNA : Northern blotting

  • Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

    Perbedaan urutan DNA pada kromosom homolog menghasilkan pola fragmen restriksi yang berbeda

    RFLP dapat ditekesi dengan Southern Blotting

    RFLP diwariskan dengan pola Mendelian, dapat digunakan untuk analisis genetika.

  • DNA Sequencing Metode Sanger Dideoxy Chain Termination Method

    1. DNA yang akan di-sequencing diinkubasi dalam tabung bersama dengan bahan lain yang dibutuhkan untuk sintesis DNA

  • DNA Sequencing Metode Sanger Dideoxy Chain Termination Method

    2. Sintesis DNA akan berlangsung dan berhenti jika dideoksiribonukleotida digunakan. Proses ini menghasilkan DNA dengan panjang yang bervariasi sesuai urutan nukleotida

  • DNA Sequencing Metode Sanger Dideoxy Chain Termination Method

    3. Campuran kemudian dielektroforesis dengan gel polyacrilamide. Fluoresensi dari dideoksiribonukleotida yang digunakan dideteksi oleh detektor

  • RNA bersifat relatif kurang stabil dibanding DNA Agar dapat di-sequencing dengan metode sanger, RNA perlu diubah menjadi cDNA

    RNA Sequencing Metode Sanger Dideoxy Chain Termination Method

  • ANALISIA KUANTITATIF DNA

    DAN RNA

  • Tahapan Uji Kuantitatif

    Mengisolasi DNA atau RNA dengan metode elektorforesis gel agarose

    Melakukan Identifikasi DNA atau RNA dengan pewarna berfluoresent

    Menggunakan metode spektroskopi untuk menentukkan kemurnian dan konsentrasi DNA atau RNA

  • Menentukan Konsentrasi DNA dan RNA

    Konsentrasi DNA dan RNA dapat ditentukan dengan menggunakan :

    1. Spektroskopi Sinar Tampak

    2. Spektroskopi UV-Vis

  • Spektroskopi Sinar Tampak

    Menggunakan sinar tampak sebagai sumber cahaya

    Panjang gelombang 380 750 nm

    Sampel harus dibuat berwarna terlebih dahulu dengan reagen spesifik

    Spektroskopi UV-Vis

    Gabungan sinar tampak dan UV

    Panjang gelombang 190 380 nm

    Sampel bening bisa langsung dianalisa

  • Menentukkan Kemurnian DNA

    Rentang kemurnian DNA 1.8 2.0

    Kemurnian DNA 2.0 maka nilai ddH2O yang diambil lebih banyak dari DNA

    Kemurnian = 260/280

  • Mengukur Konsentrasi DNA dan RNA

    260 = Nilai absorbansi pada 260 nm

    50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)

    40 = 40ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)

    [DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran

    [RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran

  • Metode RT-PCR

    Relative Kuantifikasi

    Mengacu pada refrensi internal gen untuk menentukan perbedaan reaksi gen yang diuji

    Absolut Kuantifikasi

    Memberikan nilai pasti dari molekul DNA yang diuji dengan mengacu pada DNA standar

  • Metode Kuantifikasi Logarithmic Scale

    1. Threshold Cycle (Ct)

    Jumlah siklus yang memiliki threshold kelebihan fluoresens

    2. Quantification Cycle (Cq)

    Berdasarkan acuan dari MIQE, dimana nilai Cq menjadi pangkat eksponensial dari 2

  • Menghitung Gen

    Kurva Kalibrasi

    Ct-method

    MAK2 method

  • APLIKASI DNA DAN RNA

  • RNAi (RNA interference) merupakan sebuah mekanisme menghilangkan ekspresi gen setelah gen berhasil ditranskripsi atau suatu proses alami yang meminimalisir atau menghilangkan suatu aktivitas gen tertentu.

    Pertama kali diteliti melalui penghasil pigmen pada bunga. Setelah itu diteliti lebih lanjut melalui untai ganda RNA pada cacing, Andrew Fire dan Craig Mello mendapatkan penghargaan atas penemuaanya.

  • Mekanisme kerja RNAi

    RNAi bekerja dengan menghancurkan molekul messengger yang membawa informasi gen untuk penghasil protein sel.

    RNA memicu Memotong RNAi

    Fragmen kecil

    Menempel pada mRNA Kode/ pesan dihancurkan

  • Mekanisme RNAi Secara Umum

  • Aplikasi RNAi

    Kanker

    - Mengisolasi sel kanker untuk pertumbuhan sel tumor, metastasis, agriogenesis, dan kemoresisten

    Terapi Imun Kanker

    - Mengaktivkan kembali sistem imun pada tubuh penderita kanker atau merekayasa pertumbuhan imun

  • Tantangan Dalam Mengembangkan RNAi

    Pengiriman Respons

    Imun dan Off-Target

    Kejenuhan dari

    Pembuat RNAi

    Memonitor Aktivitas

    RNAi

  • REKAYASA GENETIKA

  • Pendahuluan

    Aplikasi pengetahuan biologi molekular :

    1. Pendeteksian dan penyembuhan penyakit

    2. Teknologi Obat dan Herbal

    3. Teknologi Pangan

    4.Rekayasa Genetika

    PROTEIN

    LEMAK

    POLISAKARIDA ASAM

    NUKLEAT

    Pengetahuan Biologi Molekular

    Microinjection

  • Rekayasa Genetika

    Materi Genetik

    yang ada di mahluk

    hidup

    Materi Genetik

    yang telah

    dimodifikasi

    modifikasi

    Struktur dan fungsi tertentu Struktur dan fungsi baru

    Ada fungsi yang dihilangkan

    Yang diketahui : Struktur dan sifat kimia materi genetik Kode yang disusun materi genetik Fungsi kode materi genetik Replikasi materi genetik Isolasi materi genetik dll.

    Ketahui

    Terapkan

    Hasilkan

  • APA SAJA HASILNYA?

    Identifikasi

    Transfer

    Modifikasi

    Replikasi

    Teknik atau Metode Transfer

    Materi Genetik

    Injeksi Mikro DNA Recombinant Chemical and Electro poration Bioballistic

  • Paru-Paru mencit (abc) normal, (def) infeksi dengan rekayasa genetika,

    (ghi) infeksi tanpa rekayasa genetika (Queenie, 2008)

    Contoh hasil rekayasa genetika :

    Glow Fish (Pray, 2008)

    Lembu -lactalbumin (Eyestone, 1999)

    Sapi Omega-3 (Wu, 2011)

    Kelinci penghasil antibodi bispesi