Approches méta-génomiquesen Microbiologie

Pascal SIMONET

•Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS•Laboratoire Ampère, ECL-CNRS

Pascal.simonet@ec-lyon.fr

CONTEXTE

•Eucaryotes microscopiques

•Procaryotes

Whitman et al. 1998 PNAS, 95, 6578-6583. Prokaryotes: The unseen majority.

4-6 x 1030 cellules bactériennes

1,2 x 1029 Océan 2,6 x 1029 Sol3,5 x 1030 Sol profond0,25 - 2,5 x 1030 Sous sol océanique

Microorganismes

The diversity of life

Overview

• Microbes dans l’environnement Microorganismes (bactéries, archaea, champignons, levures)

colonisent tous les écosystèmes de notre planète.

Un gramme de sol de jardin >100 000 000 cellules microbiennes

(100 – 1000 espèces différentes).

Le corps humain: 1 milliard de cellules microbiennes.

Microorganismes: impliqués dans tous les processus globaux

Microorganismes: Rôle fondamental en Biotechnologie (e.g.,

antibiotiques, fermentation, expression, bioremédiation).

Despite temperatures ranging from –5 to –70oC and water contents below 2%, Antarctic terrestrial soils contain 106 – 108 cells per gram.

Large populations of hyperthermophilic bacteria and archaea live in boiling hydrothermal systems.

Culture in vitro

Collections de microorganismes: - Laboratoires académiques- Organisations privées ou publiques

ATTC (USA)LMG (Belgique)DSM (Allemagne)I. Pasteur (France)

- Laboratoires industriels

Approches traditionnelles en microbiologie

Isolats bactériens

Problèmes d’identificationProblèmes de caractérisationProblèmes de taxonomieProblèmes d’évolution (transferts latéraux de gènes)

Problèmes d’accessibilitéProblèmes de représentativité (1% de cultivés)Problèmes de conservationProblèmes de criblage

ADN microbien « environnemental ».

Extraction, Purification, Exploitation

Identification, caractérisation, fonctions et exploitation des bactériesnon cultivées.

Approches « métagénomiques » en microbiologie

PRINCIPE

•Lyse in situ et extraction directe de l’ADN (total), purification.

•Extraction des cellules bactériennes, purification, lyse, purification de l’ADN.

Source ?

•Sélection PCR: Banques de séquences 16S rDNA.•Clonage direct: Banques d’ADN métagénomique•Séquençage direct

Extraction d’ADN

des bactéries (métagénome)

ADN métagénomiq

ue

vecteur

Clonage Transformation

dans hôte cultivable

Banque d’ADN métagénomiqu

ePCR

Clonage séquençage

RISA, T-RFLP DGGE

Criblage moléculaire

Criblage chimique

Criblage biologique

Isolement in vitro de bactéries cultivables

Phylogénie

Estimation de la diversité bactérienne (17)

Caractérisation

Comparaison de différentes situations environnementales

Culture in vitro

OMe CH3O

O

CH3

CH3

O

OHOH

OMe

OMe

Détermination de la structure chimique des molécules produites

Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

Détection de gènes par hybridation

Séquençage direct(shotgun)

Création et exploitation de banques d’ADN métagénomiqueCréation et exploitation de banques d’ADN métagénomique

Renaud NALINRenaud NALINnalin@libragen.comnalin@libragen.com

3 rue des Satellites3 rue des Satellites31400 Toulouse31400 Toulouse

ATOUTS et LIMITES

Génomique: Définition

C'est l'étude exhaustive des génomes et en particulier de l'ensemble des gènes, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur fonction et de leur rôle.

Séquençage massif, Méthodes bio-informatiques

Post-génomique

Sciences en « iques », transcriptomique, protéomique, métabolomique etc…

« Méta -génomique » en Microbiologie ??

Sensu stricto non, mais…

Sensu lato Utilisation de l’ADN oui

Eaux de drainage des mines de fer

Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb (23 000 clones)

Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries.

Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43

Eaux de drainage des mines de fer Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb (23 000 clones)

Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43

Sols cultivés ou forestiers: 109 cellules par gramme 10 000 espèces génomiques dominantes différentes

9 millions de clones (pour des inserts moyens de 40 kb) nécessaires pour un représentant de chaque espèce.

Banque métagénomique d’un sol de prairie (100 000 clones) Taille totale de l’ADN cloné : 3,5 x 109 pb5% de la diversité totale (x24 /techniques de culture) Ginolhac A et al. (2003) Appl Environ Microbiol 70, 5522-5527

Extraction et purification de l’ADN environ.

Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S ., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X. and Simonet P. 1999. Quantification of Bias Related to the Extraction of DNA Directly from Soils. Appl. Environ. Microbiol., 65 : 5409-5420.

Lyse cellulaire ??

Taux de récupération de l’ADN ??

APPLICATIONS

Extraction d’ADN

des bactéries (métagénome)

ADN métagénomiq

ue

vecteur

Clonage Transformation

dans hôte cultivable

Banque d’ADN métagénomiqu

ePCR

Clonage séquençage

RISA, T-RFLP DGGE

Criblage moléculaire

Criblage chimique

Criblage biologique

Isolement in vitro de bactéries cultivables

Phylogénie

Estimation de la diversité bactérienne (17)

Caractérisation

Comparaison de différentes situations environnementales

Culture in vitro

OMe CH3O

O

CH3

CH3

O

OHOH

OMe

OMe

Détermination de la structure chimique des molécules produites

Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

Détection de gènes par hybridation

Séquençage direct(shotgun)

Criblage moléculaire d’une banque d’ADN métagénomiquepar hybridation de colonies

La structure des polyketides produits par les PKSI est liée à leur organisation linéaire en domaines et modules.

Type I PKS (PKSI)

Criblage de banques d’ADN métagénomique (sol)

• 60 000 clones 139 « KS » +++

• 40 « KS » séquencés Pas de redondanceNouveauté totale(similarité < 67%)

Ginolhac A., Jarrin C., Gillet B., Robe P., Pujic P., Tuphile K., Bertrand H., Vogel T. M., Perriere G., Simonet P., and Nalin R 2004. Phylogenetic Analysis of Polyketide Synthase I Domains from Soil Metagenomic Libraries Allows Selection of Promising Clones. Appl. Environ. Microbiol. 2004;70 5522-5527

Extraction d’ADN

des bactéries (métagénome)

ADN métagénomiq

ue

vecteur

Clonage Transformation

dans hôte cultivable

Banque d’ADN métagénomiqu

ePCR

Clonage séquençage

RISA, T-RFLP DGGE

Criblage moléculaire

Criblage chimique

Criblage biologique

Isolement in vitro de bactéries cultivables

Phylogénie

Estimation de la diversité bactérienne (17)

Caractérisation

Comparaison de différentes situations environnementales

Culture in vitro

OMe CH3O

O

CH3

CH3

O

OHOH

OMe

OMe

Détermination de la structure chimique des molécules produites

Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

Détection de gènes par hybridation

Séquençage direct(shotgun)

Streptomyces coelicolor

Bacillus subtilisBacillus subtilis

Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens

Escherichia coliEscherichia coli

VecteursVecteurs

A second generation snp-derived Escherichia coli–Streptomycesshuttle expression vector that is generally transferable by conjugation

Nikodinovic, Priestley, Plasmid 56 (2006) 223–227

Criblage chimique

OMe CH3O

O

CH3

CH3

O

OHOH

OMe

OMe

Banques d’ADN métagénomique

ou

Extraction d’ADN

des bactéries (métagénome)

ADN métagénomiq

ue

vecteur

Clonage Transformation

dans hôte cultivable

Banque d’ADN métagénomiqu

ePCR

Clonage séquençage

RISA, T-RFLP DGGE

Criblage moléculaire

Criblage chimique

Criblage biologique

Isolement in vitro de bactéries cultivables

Phylogénie

Estimation de la diversité bactérienne (17)

Caractérisation

Comparaison de différentes situations environnementales

Culture in vitro

OMe CH3O

O

CH3

CH3

O

OHOH

OMe

OMe

Détermination de la structure chimique des molécules produites

Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

Détection de gènes par hybridation

Séquençage direct(shotgun)

Venter et al. 2004.

Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science 304, 66-74.

1800 espèces génomiques148 phylotypes bactériens inconnus

MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences

Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 19 5623–5630

MetaGene can predict a whole range of prokaryotic genes based on the anonymous genomic sequences of a few hundred bases, with a sensitivity of 95% and a specificity of 90% for artificial shotgun sequences (700 bp fragments from 12 species).

Hideki Noguchi*, Jungho Park and Toshihisa Takagi

Department of Computational Biology, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, Kashiwa, Chiba 277-8562, Japan

Extraction d’ADN

des bactéries (métagénome)

ADN métagénomiq

ue

vecteur

Clonage Transformation

dans hôte cultivable

Banque d’ADN métagénomiqu

ePCR

Clonage séquençage

RISA, T-RFLP DGGE

Criblage moléculaire

Criblage chimique

Criblage biologique

Isolement in vitro de bactéries cultivables

Phylogénie

Estimation de la diversité bactérienne (17)

Caractérisation

Comparaison de différentes situations environnementales

Culture in vitro

OMe CH3O

O

CH3

CH3

O

OHOH

OMe

OMe

Détermination de la structure chimique des molécules produites

Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

Détection de gènes par hybridation

Séquençage direct(shotgun)

Fortes teneurs en métaux lourds

« Sols » chimiquement déséquilibrés

Ni Cr, Co,

C, N, P…

Carence en éléments essentiels

Modèle : Déblais de mines de nickel en Nouvelle-Calédonie

Gènes de résistance au nickel

Fall, Herrera, Helassa, Bernillon, Simonet, Vogel, Navarro

Banques plasmidiques

Taille des fragments : 2-9Kb

Taille des fragments : 20-40Kb

Banques cosmidiques

50Kb

2 clones MS1 et MS2

8 mM

3 clones MS3, MS7 et MS43

8 mM

ORF1 ORF2

ATPase E1-E2

nreA nreB

HP HP RT

MS3

DedANicOchrB nreB rcnA nreA ORF1 ORF2chrA wcaK

MS7/43

ORFs impliqués dans la résistance au nickel :

nreB - rcnA

101

81

81 1

Determining the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approachDiaz-Torres et al. 2006 FEMS Microbiol Lett 258, 257–262

Bouche: Prévalence de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques

Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortiumWoyke et al. 2006, Nature Vol 443, 26 October 2006

Olavius algarvensis, (vers marin) Microsymbiontes remplacent bouche et tube digestif

Microbial diversity in the deep sea and the underexplored ‘‘rare biosphere’’Sogin et al. 2006, PNAS vol. 103 no. 32 12115–12120

Grande profondeur: Complexité jusqu’à 2 ordres de grandeur > autres environnements. Des milliers de populations faiblement représentées

Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus CommunitiesCulley et al. 2006, SCIENCE VOL 312 23 JUNE 2006

Océans: un réservoir de virus à ARN inconnus

Comparative Metagenomics of Microbial Communities

Tringe,1,2* von Mering,3* Kobayashi,1 Salamov,1 Chen,4 Chang,5 Podar,5 Short,5 Mathur,5 Detter,1 Bork,3 Hugenholtz,1 Rubin1,2.

1Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute, 2800 Mitchell Drive, Walnut Creek, CA 94598, USA. 2Lawrence Berkeley National Laboratory, Genomics Division, Berkeley, CA 94720, USA. 3European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, 69117 Heidelberg, Germany. 4University of California, Berkeley, Department of Electrical Engineering and Computer Science, Berkeley, CA 94720, USA.5Diversa Corporation, 4955 Directors Place, San Diego, CA 92121, USA

22 APRIL 2005 VOL 308 SCIENCE

« The identification of environment-specific genes through a gene-centric comparative analysis presents new opportunities for interpreting and diagnosing environments. »

Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach.

A reduced complexity of the bacterial phylum Firmicutes as a signature of the faecal microbiota in patients with CD. Presence of new bacterial species.

Six healthy donors and six patients with CD.

Bacterial diversity (16S rRNA gene).

Gut. 2006 Feb;55(2):205-11.

C Manichanh, L Rigottier-Gois, E Bonnaud, K Gloux, E Pelletier, L Frangeul, R Nalin, C Jarrin, P Chardon, P Marteau, J Roca and J Dore

INRA, Genoscope, Genopôle IP, LibraGen etc

ADN environ. Ecologie µbienne Environ.

Détecter, identifier, localiser, compter les µorganismes.

Identifier des gènes / Déterminer des activités potentielles.

Exploiter des ressources génétiques.

Applications méta-génomique?

Improved inverse PCR scheme for metagenome walking

Taku Uchiyama and Kazuya Watanabe

Marine Biotechnology Institute, Kisarazu, Japan

BioTechniques 41:183-188 (August 2006)