L'embryogenèse de la drosophile et la morphogenèse des membres :

application des communications cellulaires Les développementalistes se sont toujours intéressé à la symétrie de l'organisme, et ont voulu

savoir comment s'établit la polarité dorso-ventrale, l'asymétrie droite/gauche… On s'est rendu compte que certains malades comparables à ceux de la mucoviscidose souffraient d'un dysfonctionnement des cellules ciliées des bronches. De plus, une grande proportion de ces malades avaient le cœur à droite…

La mise en place de l'axe droite/gauche n'est pas encore très bien connue, mais on sait qu'elle commence au moment de la formation du nœud de Hensen. On trouve au niveau de ce nœud des cellules ciliées qui assurent le passage de molécules informatives d'un côté à l'autre de l'organisme, et établir ainsi l'asymétrie. Chez les malades étudiés, les cellules fonctionnent mal ou pas du tout, et l'asymétrie se fait mal : c'est pourquoi le cœur se retrouve à droite…

Depuis 20 ans, on s'est rendu compte que les types moléculaires qui assurent la mise en place des différents axes chez la drosophile se retrouvent chez l'homme : on a donc pensé que les mécanismes développementaux sont très conservés dans les différents phylum génétiques. On aura tout de même des différences entre les organismes, mais les bases restent presque strictement identiques.

I) La mise en place des asymétries Dès le stade cellule œuf, on peut repérer des différences entre le pôle animal et le pôle

végétatif: les plaques vitellines ne sont pas de même taille, et on trouve une calotte colorée au pôle animal. De plus, la pénétration du spermatozoïde dans l'ovocyte provoque la rotation de la calotte : on a alors apparition du croissant gris, qui définit le pôle dorsal de l'embryon, et on a également mise en place du centre organisateur de Spemann.

Dans certains cas, ce seront les différentes molécules présentes dans l'œuf, et disposées de

manière inégale, qui pourront débuter la différenciation : on a donc un héritage maternel sous forme d'ARNm et de molécules. Selon l'organisme que l'on étudie, l'héritage maternel jouera un rôle

fondamental, ou bien un rôle plus discret. Si on dessine une blastula d'Amphibien, alors on peut voir des territoires présomptifs qui sont dus à la fois à l'héritage maternel et aux différentes interactions cellulaires. Au stade morula chez la souris, on trouve 8 ou 16 blastomères peu cohésifs que l'on peut facilement séparer. Ces cellules peuvent être cultivées seules, et en les réinjectant à différents endroits dans une autre morula, alors on observe des destinées différentes (cf 1e cours) : c'est donc que l'héritage maternel joue un rôle très faible par rapport aux interactions cellulaires. Les Mammifères constituent un peu un cas particulier, car le développement embryonnaire est lié à 99,9999% aux interactions…

Chez les Amphibiens, on peut provoquer une division de la cellule œuf de telle manière que chacun des blastomères obtenus possèdent un bout de croissant gris. On obtient alors 2 embryons tout à fait normaux, et cela est dû à une régulation par un mécanisme épigénétique. Par contre, si on provoque une division de la cellule œuf dans le plan équatorial, alors le blastomère qui ne contient pas le centre organisateur de Spemann va rapidement dégénérer : dans ce cas, on n'a donc pas eu régulation.

Chez l'oursin, si on coupe la cellule œuf en 4 blastomères selon l'axe animal/végétatif, alors on

peut obtenir 4 larves pluteus normales puis 4 oursins normaux. Par contre, si la division se fait dans un plan équatorial, alors seules les cellules du pôle végétatif pourront donner une larve (avec les cellules du pôle animal, on obtient une blastula anormale). Finalement, le sens de la division sera très important pour l'établissement des différents axes, mais selon les organismes, on aura une plus ou moins grande importance.

On voit bien que le préformisme, cad l'héritage des facteurs maternels, et la régulation, cad les interactions cellulaires, sont étroitement liées, mais l'un aura parfois l'ascendant sur l'autre, qui ne s'exprimera presque plus (cas de l'homme).

L'héritage maternel est représenté par le stockage asymétrique de molécules synthétisées

pendant l'ovogenèse. Après les différentes divisions cellulaires, on aura donc une inégalité de distribution des facteurs dans les blastomères. Ainsi, certains facteurs se retrouvent au pôle végétatif, d'autres au pôle animal, mais d'autres encore ne seront pas localisés …

Driesh et Hoïstadius ont réalisé des travaux sur l'œuf d'oursin, qui présente une partie colorée du cytoplasme. Ainsi, lors des 2 premières divisions (longitudinales), les 4 blastomères reçoivent le même contenu, mais dès que l'on observe une division équatoriale, on obtient :

- des macromères colorés en orange - des micromères et des mésomères non colorés On sait de plus que si l'on divise la blastula selon un plan polaire, alors on pourra obtenir 2

embryons normaux, mais si on la divise selon un plan équatorial, alors les blastomères ne sont pas capables de donner un embryon normal. Driesh et Hoïstadius ont alors divisé l'embryon en différents étages : les mésomères d'un côté, et le pôle végétatif de l'autre, mais on subdivise ce dernier en 3 parties (les micromères, le végétatif 1 et le végétatif 2.

Ils ont alors réalisé différentes associations (mésomères + une des 3 autres) afin de voir lesquelles sont capables de donner un embryon normal :

- avec les micromères, on obtient une larve pluteus normale

- avec le végétatif 2, on obtient une larve pluteus avec quelques défauts

- avec le végétatif 1, on obtient une larve franchement différente

Finalement, l'association entre les mésomères et les micromères reconstitue un embryon tout à fait normal, alors qu'avec les 2 autres parties, on obtient un embryon anormal qui a été plus ou moins corrigé. Driesh et Hoïstadius ont donc supposé qu'il y avait une molécule capable de réorganiser un axe animal-végétatif, et cette molécule serait un morphogène synthétisé par les micromères. Cette molécule donne des indications aux cellules situées au-dessus afin d'initier un axe normal : dans un embryon classique, le morphogène va diffuser et on aura donc installation d'un gradient. Finalement, le morphogène va donner un information de position.

Dans l'expérience de Driesh et Hoïstadius, les micromères fabriquent toujours le morphogène en grande concentration, et on aura ensuite un gradient au sein même du pôle animal : les cellules de la base de la partie animale se transforment sous l'influence de ce facteur pour devenir "plus végétative" que les autres. On a une véritable reprogrammation des cellules grâce au morphogène. Dans la partie végétatif 2, la concentration en morphogène est déjà moins importante dès le début de l'expérience , puisqu'on a déjà eu diffusion : les cellules de la base de la partie animale recevront donc assez moins de molécules de morphogène que dans la 1e expérience, et elles ne deviendront qu'un peu "végétative". Finalement, la détermination des cellules mésomériques est assez peu poussée, puisque le morphogène est capable de les reprogrammer.

On pourrait se demander pourquoi les micromères sont les seuls à synthétiser le morphogène? En réalité, ce sont les seules cellules qui récupères le cytoplasme non coloré sous la bande colorée : c'est donc l'héritage maternel qui leur confère cette propriété. Si on analysait d'autres interactions, on pourrait se rendre compte que la partie animale de l'embryon synthétise également un morphogène qui diffuse dans le sens contraire du 1e. Cela paraît normal car un gradient nécessite toujours un gradient contraire pour qu'il puisse demeurer : en effet, si on a production en permanence d'une molécule, on va arriver à un équilibre et toutes les parties de l'embryon contiendront la même quantité de morphogène. De la même manière, chez les amphibiens, l'organisateur de Spemann synthétise des facteurs dorsalisants qui diffusent, mais il existe également des substances ventralisantes dont le gradient est opposé.

Finalement chez l'oursin, l'axe animal-végétatif est donc déterminé par la présence de micromères au pôle végétatif, et ils peuvent donc être comparés au centre organisateur de Spemann qui assure la détermination de l'axe dorso-ventral. Le morphogène va modifier l'expression génique de chaque cellule selon sa concentration : c'est un exemple toujours un peu théorique, mais on a pu mettre en évidence un véritable morphogène chez la drosophile.

Wolpert a laissé une image de ces phénomènes de gradients de morphogènes en représentant le drapeau français : si on a beaucoup de morphogène, alors le gène bleu sera exprimé. Si on a un peu moins de facteur, alors ce sera le gène blanc, puis le gène rouge qui seront exprimés. On a donc déterminé des champs morphogénétiques qui pourront être plus ou moins compliqués (représentation simple avec le drapeau français, plus complexe avec le drapeau américain).

-Rm- Cuvier et St Hilaire travaillaient sur des analyses de morphologie comparée, afin de

comprendre un peu mieux l'évolution. Cuvier pensait que les animaux ont un plan d'organisation qui leur est propre, et il est impossible qu'on passe d'un plan à l'autre. De plus, il pensait que si l'on change quelques structures, alors l'organisme ne sera jamais viable. A l'opposé, St Hilaire considérait que ces plans d'organisation étaient interchangeables, et que l'on pouvait modifier certains éléments des plans sans pour autant faire mourir l'organisme. St Hilaire avait donc tout à fait raison, mais l'une de ses déclarations avait posé des problèmes : "Les Insectes vivent dans leurs vertèbres". Il n'existe pas de vertèbres chez les Insectes, donc cette affirmation est fausse, mais les métamères pourraient correspondre à notre colonne vertébrale : on pourrait donc penser que les mécanismes moléculaires sont les mêmes chez les Insectes et les Mammifères.

II) Le développement embryonnaire de la drosophile 1) Description générale La drosophile est un animal de laboratoire depuis 100 ans, depuis Morgan qui avait voulu faire

de la génétique avec un organisme complexe. Le développement de cet insecte est très rapide, et on peut donc très rapidement obtenir un élevage à partir duquel on fera des analyses biochimiques et moléculaires. Le séquençage de la drosophile a été réalisé, et on a ainsi constaté que le génome comprend 20 000 gènes, ce qui est très important.

Le développement de la drosophile ne nécessite qu'une semaine à 20°C, et on aboutit à des

adultes qui se reproduisent très rapidement. L'embryon obtenu après fécondation se développe en 24h environ : toutes les étapes qui assurent la mise en place des organes (segmentation, gastrulation…) sont donc très condensées. On a alors éclosion d'une 1e forme larvaire, qui va muer en 24h : on obtient alors une larve de 2e stade qui mue là encore au bout de 24h. La larve de 3e stade est toujours semblables mais elle va vivre 48h : son installation dans le puparium va permettre le déclenchement de la métamorphose par stimulation de l'ecdysone. La plupart des organes larvaires vont alors être histolysés, sauf le SN, et on aura alors apparition des organes adultes pour obtenir l'imago.

2) L'ovogenèse On distingue 2 ovaires chez les drosophiles : ils sont

constitués de grappes d'ovarioles, et ils sont reliés entre eux par des oviductes. Ces derniers se prolongent par des canaux génitaux, et les ovocytes libérés (bloqués en métaphase 1) pourront alors passer dans la spermathèque pour être fécondés.

Les ovarioles sont constitués de chambres ovariennes contenant un nombre fixe de cellules : on y distingue une assise de cellules formant la paroi (= cellules du follicule), d'origine somatique mésodermique, ainsi que 16 cellules d'origine germinale (15 cellules nourricières et 1 ovocyte).Si on suit l'ovocyte au cours de la maturation de la chambre, on pourra voir qu'il grossit pour devenir la cellule la plus importante. L'ovogenèse se fait donc de manière séquentielle depuis le germarium, et les ovocytes libérés sont toujours remplacés.

Dans le germarium, on trouve de nombreuses cellules qui sont toutes issues de divisions

mitotiques. De plus, on trouve des cellules souches germinales qui se divisent de manière asymétrique : la 1e division mitotique donne ainsi une cellule souche, et une cellule (= cystoblaste) qui va s'engager dans la lignée ovocyte ou cellule nourricière. Ce cystoblaste va se diviser 4 fois, ce qui donnera les 16 cellules de la chambre, mais seule l'une d'elles donnera l'ovocyte.

Pendant les 4 divisions, on voit que les cellules ne se divisent pas complètement : on a une

cytodiérèse imparfaite, qui donne naissance à des ponts cytoplasmique entre les cellules. On peut remarquer que 2 cellules sur les 16 présentent 4 ponts, alors que les autres n'en présentent que 3 : ce sont 2 cellules totalement polarisées et l'un, au hasard, deviendra l'ovocyte. Cependant, la 1e qui commence à se différencier va empêcher l'autre d'évoluer en ovocyte, et elle deviendra alors une cellule nourricière comme les 14 autres cellules.

L'ovocyte va accumuler des molécules nutritives tout comme les cellules nourricières, mais

aussi des déterminants maternels. En effet, les ponts cytoplasmiques restent établis et on aura alors circulation de substances. De plus, on peut remarquer que les cellules nourricières sont polyploïdes,

et elles vont donc synthétiser une grande quantité de molécules qui pourront ensuite passer dans l'ovocyte. Quand l'ovocyte aura atteint sa taille maximale, alors les cellules nourricières vont vider leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte et ce dernier sera alors pondu.

On peut remarquer que l'ovocyte est protégé par un certain nombre d'assises cellulaires : - une membrane vitelline qui protège l'ovocyte : il est synthétisé à la fois par l'ovocyte et les

cellules du follicule. - le chorion, qui est l'équivalent de la coquille des œuf de poule : il est synthétisé par les

cellules du follicule à la fin du développement de l'ovocyte. Le chorion peut émettre des évaginations dorsales qui serviront à l'accrochage de l'embryon dans le milieu extérieur.

3) La segmentation. Après la fécondation dans la spermathèque via le micropyle, on va assister à une multiplication

nucléaire sans cytodiérèse. Les noyaux mettent environ 8 mn pour se diviser et pendant la multiplication du nombre de noyaux, on n'observe pas de phase G1 ou G2. Les noyaux vont se répartir partout dans le cytoplasme de la cellule, et on a donc un syncitium. Cers la 10 ou 11e division, on assiste à la migration des noyaux vers la périphérie : on arrive au stade "blastoderme" syncitial.

A partir de là, les divisions ont beaucoup plus lentes car on a apparition des phases G1 et G2, et elles ne sont plus synchrones : cela correspond à la transition blastuléenne des amphibiens. Petit à petit, les noyaux s'entourent d'une invagination de la membrane plasmique, et ces invaginations pourront progressivement donner des cellules. On aboutit alors, 2h30 après la fécondation, au stade blastoderme cellulaire, constitué par une monocouche de cellules entourant le vitellus (on a donc un œuf centrolécithe : lécithe correspond au contenu du cytoplasme de l'œuf).

Les cellules vont se diviser ensuite selon leur propre rythme, et le génome zygotique va

commencer à s'exprimer, alors qu'auparavant, tout le développement se baisait sur les molécules synthétisées pendant l'ovogenèse. Ces différentes molécules maternelles ont mis en place un canevas qui servira de base à l'établissement des polarités.

-Rm- Avant même la cellularisation, on peut observer une certaine concentration de noyaux au

pôle opposé au micropyle : ils seront à l'origine des cellules polaires, correspondant aux cellules germinales de l'imago à venir (donc les cellules germinales sont les 1e à se former).

4) Gastrulation et organogenèse. On a apparition d'une invagination dans la partie ventrale du mésoblaste cellularisé : elle sera à

l'origine du mésoderme, et les cellules qui se trouvent à la limite entre la monocouche cellulaire externe (= ectoderme) et le mésoderme s'appelle le mésectoderme. L'ensemble mésoderme + mésectoderme forme la bandelette germinative BG : par un phénomène d'épibolie, cette BG va

s'étendre. Pendant cette phase, on n'observe aucune division cellulaire, mais uniquement des réorganisations, des allongements… menant à une couche monocellulaire. Cette dernière va devenir très longue, et s'enrouler dans la partie postérieur du blastoderme et même sur les 2/3 de la partie dorsale, mais cela provoque des replis de l'ectoderme au niveau du front de l'avancée.

La BG, après s'être étendue, va alors régresser et elle se replace sur la face ventrale. Cependant, le mésoderme s'est étalé sous l'ectoderme et il se dilamine petit à petit en 2 assises : le mésoderme somatique collé à l'endoderme à l'origine des muscles, et le mésoderme splanchnique collé à l'ectoderme, à l'origine des muscles lisses et du "sang". Par contre, on n'observera pas de cœlome entre les 2 mésodermes, ni de corde… De part et d'autre de la soudure du sillon ventral, on a apparition de cellules de grande taille qui ségrègent de l'ectoderme : ce sont des neuroblastes. Ces cellules vont former des petits paquets appelés neuromères, qui donneront les ganglions neuraux : en effet, les neuromères vont fusionner pour donner une chaîne ganglionnaire qui va ensuite se creuser. Quand la BG régresse, le SN va également se repositionner côté ventral, mais une partie de ce SN va rester sur la face dorsale pour donner le ganglion cérébroïde.

L'extension de la BG forme des petits replis, et l'invagination qui se fait côté dorsal est dite proctodéale : elle va se développer de plus en plus à l'intérieur de l'embryon pour former la partie postérieure su système digestif avec l'anus. Lorsque la BG est étendue au maximum, l'anus se retrouve derrière la tête, mais il se replace correctement après le retrait de la BG. Au niveau de la partie antérieure de la BG, on a également formation d'une invagination que l'on dit stomodéale. Cette dernière pourra se développer pour donner la bouche et la partie antérieure du système digestif. A l'extrémité des 2 invaginations, on retrouve des groupes de cellules qui fusionneront pour donner l'intestin moyen en ensérant le vitellus.

L'ensemble de l'embryon présente des structures répétitives, et notamment le SN. En plus,

l'ectoderme présente des petits replis en surface, des ondulations de plus en plus marquées : elles formeront alors les différentes unités métamériques répétitives. Le mésoderme somatique donnera les muscles, et à chaque unité correspondra un certain nombre de muscles.

Chaque ondulation de l'organisme peut être numéroté car ils correspondent aux différents métamères de l'adulte : dès 5h, on peut donc positionner les métamères. Pendant l'extension de la BG, la partie postérieure de l'abdomen se retrouve dans la zone antéro-dorsale, mais avec le retrait de la BG, elle pourra reprendre sa place normale.

La larve de 3e stade va s'isoler du milieu nutritif pour former le puparium, où aura lieu la

métamorphose : on a histolyse de tous les organes sauf le SN et quelques cellules souches en massifs, appelées disques imaginaux. Ces disques sont formés par des invaginations pendant le développement embryonnaire , et ils sont constitués de cellules déterminées activées pendant la métamorphose.

Sous l'influence de l'ecdysone, ces disques vont s'engager dans la formation des appendices de l'imago, comme les antennes, les pattes, les ailes… Au moment de la métamorphose, le disque va s'évaginer et prendre des formes particulières : on aura ainsi déploiement des pattes avec des ondulations assez visibles en surface, qui correspondent aux futurs articles de la patte.

Finalement, on peut donc voir que les disques imaginaux sont fondamentaux pour la métamorphose : à partir de massifs de cellules souches déterminées et présents dans la larve, on obtient tous les organes imaginaux.

III) Mise en place des axes chez la drosophile Dès le stade blastula, on peut dessiner des territoires présomptifs puisque les cellules souches

des disques imaginaux sont déjà déterminés, et on pourra donc savoir quel territoire donnera quel type d'organe. Ainsi, les disques imaginaux destinés à devenir les appendices se forment à partir de l'ectoderme, au niveau des 3 premiers segments thoraciques. On trouve alors le mésoderme dans la partie la plus ventrale, puis le neuroderme, l'ectoderme dorsal puis une fine membrane côté dorsal.

Quand la BG régresse, elle laisse une monocouche cellulaire très fine qui permet de boucher

l'embryon, appelée amnioséreuse : elle va contenir le vitellus pour éviter qu'il ne soit libéré dans le milieu extérieur. Au fur et à mesure de l'évolution de l'embryon, les côtés latéraux de l'embryon vont se rapprocher puis se souder au niveau de la fermeture dorsal : l'amnioséreuse est alors éliminée et l'embryon sera véritablement cylindrique.

1) Mise en place de l'axe dorso-ventral DV La mise en place des axes est préparée dès l'ovogenèse : ainsi, chez les amphibiens,

l'organisation même de l'ovocyte donne un axe animal-végétatif, et lors de la fécondation, on a apparition du croissant gris qui détermine l'axe DV. Chez la souris, l'axe animal-végétatif n'est pas du tout défini, ni même l'axe DV même après la fécondation : ce sont les interactions cellulaires qui interviendront par la suite qui assureront la détermination de ces axes.

Chez la drosophile, les axes animal-végétatif et DV sont mis en place avant même la fécondation : on voit donc que l'on a des différences selon les phyla évolutifs, et la mise en place des axes sera plus ou moins précoce.

Il y a 6 ans, 3 chercheurs ont permis

d'expliquer la mise en place très précoce des axes dans l'ovocyte de drosophile. Ils ont en effet détecté des embryons anormaux, et connaissant les parents, ils ont pu obtenir toute une série de mutants : ils ont alors pu étudier les différences entre ces mutants et les embryons dits normaux. Ils ont également fait ingérer à des drosophiles certaines drogues : ces dernières ont alors pondu des ovocytes anomaux. Finalement, ils ont pu classer les différents mutants selon que c'est l'axe animal-végétatif ou DV qui est atteint.

Les chercheurs ont pu remarqué que la mutation n'intervient pas dans le génotype de l'embryon, mais dans le génotype de la mère : c'est donc que ce sont des déterminants maternels qui sont responsables de la mise en place des axes, et ils ont alors pu déterminer la nature des molécules impliquées.

On sait que la chambre ovarienne est polarisée par l'organisation même des cellules, et par convention, on place toujours l'ovocyte à droite : en effet, la partie de l'ovocyte en contact avec les cellules nourricières donnera la partie antérieure de la larve, que l'on place par convention à droite…

Les larves de drosophiles sont toujours entourés par une enveloppe chitineuse hérissée de spicules, et on a pu remarquer que le nombre et l'organisation de ces spicules est caractéristique de chaque métamère et de la face ventrale ou dorsale. On pourra donc directement savoir si la larve est normale ou non, ce qui permet de recruter facilement les mutants.

a) Les 1e facteurs maternels impliqués

Grâce aux différents travaux menés sur les mutants de drosophiles, les chercheurs ont pu mettre en évidence un grand nombre de gènes dorsaux impliqués dans la mise en place de l'axe DV. En réalité, on a une batterie de gènes qui s'organisent autour de quelques gènes clés… On appelle ces gènes les "gènes dorsaux" car si on les mute, alors l'embryon ne sera formé que par du dos : ils interviennent donc dans la formation de la face ventrale.

Pendant l'ovogenèse, les cellules nourricières synthétisent un grand nombre de molécules qui diffusent vers l'ovocyte à noyau central. Sous l'influence de ces facteurs, le noyau va alors migrer après la 9e division vers la partie dorso-antérieure.

Cette position représente la position finale du noyau et la migration correspond en fait au début

de la mise en place de l'axe DV. La migration nucléaire est déclenchée par l'intervention de gènes dorsaux, et parmi eux, ce sont les gènes Cappuccino, Spine et K10 entre autres qui assurent le déplacement du noyau sur le réseau de microtubules.

La plupart des ARNm que l'on trouve dans le cytoplasme proviennent des cellules nourricières, mais on a une exception pour l'ARNm de gurken : c'est un gène qui s'exprime à la fois à partir du noyau de l'ovocyte et du génome maternel. La transcription de ce gène se fait par l'intermédiaire d'autres gènes dorsaux, et ces derniers vont également favoriser sa localisation. En effet, l'ARNm va se positionner au-dessus du noyau de l'ovocyte, et donc dans la partie dorso-antérieure.

L'ARNm est alors traduit, et la protéine Gurken est adressée à la membrane plasmique de

l'ovocyte, juste au-dessus du noyau. Gurken fait partie de la famille des TGFα (sous-famille EGF), donc son précurseur est membranaire, mais vu que la maturation de cette protéine est incomplète, Gurken restera membranaire : elle sera donc un messager juxtacrine.

La synthèse de Gurken va provoquer un

rassemblement des cellules folliculaires autour de l'ovocyte, et les cellules nourricières ne seront plus protégées que par un couche de cellules très amincies. Le ligand Gurken va alors rentrer en contact avec son récepteur spécifique à activité tyrosine-kinase (appelé Torpedo = Top) que l'on trouve sur la membrane des cellules folliculaires.

Finalement, seules les cellules qui passeront à proximité du pôle dorso-antérieur de l'ovocyte pourront capter le signal : elles deviendront les cellules folliculaires dorsales. La synthèse de Gurken

représente donc le début de la signalisation de la polarisation DV, et elle représente également les 1e communications entre l'ovocyte et les cellules folliculaires. En effet, lorsque les cellules de follicules reçoivent le signal via Gurken, elles vont transmettre de nouveaux messages vers l'ovocyte, et on a alors établissement d'un véritable dialogue moléculaire.

Gurken et Top sont 2 facteurs maternels et on va donc retrouver Top sur toutes les cellules

folliculaires. Cependant, seules les cellules qui ont capté le signal vont déclencher la voie des Ras-Raf MAP kinase : on alors inhibition de l'expression de certains gènes, qui auront une expression normale dans les cellules folliculaires ventrales et latérales. Ainsi, on a activation dans les cellules ventrales d'un gène codant pour la protéine pipe, et cette synthèse s'ajoute à celle des facteurs windbuttel et nudel, qui s'expriment, eux, dans toutes les cellules folliculaires.

D'une manière générale, la protéine Nudel est sécrétée dans tout l'espace péri-vitellin, à partir

des cellules folliculaires, et windbuttel se retrouve dans toutes les cellules folliculaires. Pipe est une sulfotransférase qui est capable de modifier un protéoglycane, et on pense que c'est seulement en présence de windbuttel et de pipe que l'on aura maturation de ce protéoglycane. Cela signifie donc que seules les cellules ventrales seront capables d'avoir un protéoglycane mature, et ce dernier sera ensuite libéré dans l'espace péri-vitellin, mais uniquement côté ventral.

On sait que Nudel, de son côté, est toujours sécrété sous forme inactive dans l'espace péri-vitellin : en présence de protéoglycane, elle devient active (c'est une sérine-thréonine kinase) et cela ne se produira donc que du côté ventral.

A la fin de l'ovogenèse, l'œuf va synthétiser le chorion entre les cellules folliculaires et l'ovocyte, et cela interrompt donc les communications entre les 2 types cellulaires. Cependant, on trouve dans l'espace péri-vitellin toutes les substances nécessaires au bon développement de l'embryon, à savoir les protéoglycanes associés à Nudel.

b) La 2e vague de facteurs maternels Dans l'ovocyte lui-même, on a également synthèse d'un certain nombre de molécules qui vont

être relarguées dans l'espace péri-vitellin : c'est le cas de gastrulation défective, de snake, d'easter et de spätzle (il est relargué plus tard que les autres).

Une fois le chorion mis en place, ces différentes molécules restent en contact avec l'ovocyte, mais les cellules folliculaires sont isolées. Une fois que la fécondation a eu lieu, l'embryon va se déposer sur son milieu de croissance : Nudel va alors commencer à dégrader ses cibles, et notamment gastrulation défective, qui devient mature. Gastrulation défective (GD) est également une sérine-thréonine kinase, donc elle va à la fois activer d'autres molécules de GD et des molécules d'Easter, elle-même une sérine-thréonine kinase. Finalement, on a donc une cascade de phosphorylation qui permet d'amplifier le système, et Easter pourra aller activer Spätzle qui est un facteur de signalisation.

Tout cela ne se passe évidemment que dans la partie ventrale puisque la molécule active de

Nudel ne se trouve qu'à cet endroit. A ce stade, tous les facteurs qui sont intervenus sont des facteurs maternels, et le génome du zygote n'a pas encore été transcrit. Si on mute l'un de ces facteurs, alors la mise en place de l'axe DV va se faire de manière erronée.

Spätzle possède un récepteur (= tol) sur la membrane plasmique de l'ovocyte, et ce sur toute la

circonférence. Cependant, la molécule de Spätzle actif ne se retrouve concentré que dans la partie ventrale, puisque son activation dépend indirectement de la présence de Nudel. Suite à la fixation de Spätzle à son récepteur, on a déclenchement d'une voie MAP-kinase qui aboutit à l'activation d'un complexe protéique formé de 2 molécules de "dorsal" et d'une molécule de cactus, que l'on retrouve potentiellement partout dans l'embryon.

Ces 2 protéines sont toujours associées, mais c'est la phosphorylation permise par la voie des MAP-kinase qui assure la séparation de ce complexe. On a alors libération du dimère "dorsal", qui est un facteur de transcription, et qui va donc être transloqué vers les différents noyaux .

-Rm- Le dimère "dorsal" est l'équivalent de

NFκB, qui est le facteur de transcription des lymphocytes. De la même manière, Tol est l'équivalent du récepteur à une cytokine (probablement IL2) , et la cascade de phosphorylation que l'on observe dans la voie des MAP kinase ressemble à la voie d'activation de la coagulation sanguine : finalement, on peut faire de nombreux parallèles entre les voies métaboliques et les molécules mises en jeu.

Pendant les différentes cascades d'activation, on a eu de très nombreuses multiplications nucléaires, et donc seuls les noyaux ventraux vont recevoir le dimère "dorsal". Cependant, plus on s'éloigne de la zone où on trouve Spätzle, mois on aura de dimère dorsal activé : on a donc un véritable gradient de "dorsal" et on peut alors le considérer comme un morphogène. Si on mute le gène codant pour "dorsal", alors l'embryon ne présentera plus de face ventrale, et il ne sera donc constitué que d'une face dorsale : on dit que l'embryon a un phénotype dorsalisant.

c) L'expression du génome zygotique

Après l'activation du dimère dorsal, on va assister à la cellularisation du blastoderme : grâce à la pénétration de "dorsal" dans les différents noyaux, on va commencer à voir des molécules issues du génome zygotique. L'axe DV va alors commencer véritablement à s'établir et selon sa concentration, "dorsal " va activer ou inhiber certains gènes :

- dans la partie ventrale, on a une forte

concentration de "dorsal" et on va alors avoir transcription des gènes twist et snail, qui sont des facteurs de transcription. Les produits de ces gènes vont pouvoir réaliser une auto-régulation (Snail active snail), mais on peut également avoir des phénomènes d'activation croisée (Twist active snail). Finalement, on va trouver une forte concentration en ces 2 facteurs dans la partie la plus ventrale de l'embryon, correspondant au futur mésoderme.

- dans la partie latérale, la concentration en "dorsal" est assez faible, donc snail et twist ne peuvent plus s'exprimer.

- dans la partie dorsale, on n'a plus du tout de "dorsal", et donc plus du tout de snail et de twist. Par contre, on assiste à la synthèse de DPP (décapentaplégique : sa mutation entraîne des problèmes de pattes). C'est une molécule de la famille des TGFβ, et plus précisément de la sous-famille des BMP2.

Finalement, le gradient de "dorsal" conditionne l'expression d'un certain nombre de gènes, qui

vont alors permettre de définir plusieurs zones dans l'embryon : - dans la partie la plus dorsale (amnioséreuse), c'est l'expression du gène zen (zerknültt) qui

prédomine, et son expression est parfaitement calquée sur le territoire présomptif - dans la partie dorsale (ectoderme dorsale et latéral), c'est l'expression de DDP qui

prédomine, même si on retrouve un peu de zen. - dans la partie latérale (neurectoderme), c'est sog (short gastrulation) qui est majoritaire - dans la partie ventrale (mésoderme), ce sont sanil et twist qui prédominent. En réalité, selon la concentration de "dorsal", on a une expression très précise de ces différents

facteurs, et on peut même définir les territoires à la cellule près. On trouve environ 80 cellules sur la périphérie de l'embryon, on donne alors que 20 cellules expriment snail et twist (futur mésoderme), 14 à 16 cellules expriment sog (de chaque côté : futur neurectoderme), et 32 à 34 cellules expriment DPP et zen (futur ectoderme, amnioséreuse comprise).

Dans le domaine neural lui-même, on a pu là encore définir un certain nombre de territoires à la cellule près (on retrouve globalement les mêmes choses pour le mésoderme et l'ectoderme) :

- Sog est exprimé dans la totalité du domaine neural - Rho est exprimé dans 8 à 10 cellules - T3 est exprimé dans 4 cellules - Sim est exprimé dans 1 à 2 cellules. Au vu de la manière dont ces 4 facteurs sont exprimé, on a pensé que leur expression était

encore sous la dépendance de "dorsal", et cela expliquerait le dégradé du pôle ventral vers le pôle dorsal. Ainsi, sim aurait besoin d'une concentration plus forte de "dorsal" que T3 pour être transcrit.

On a vu que DPP s'exprime dans la partie dorsale, de l'amnioséreuse jusqu'à l'ectoderme, et on

s'est demandé comment se faisait réellement la séparation d'avec le neuroderme. En réalité, on a installation d'une compétition très fine avec Sog , qui fait baisser la fonctionnalité de DPP en l'empêchant d'accéder à son récepteur.

On a vu que DPP fait partie de la sous-famille des BMP2 et Sog est pour sa part l'équivalent de

la cordine chez les Vertébrés. On sait que dans les embryons d'Amphibiens, on a formation d'un croissant gris et le mésoblaste forme une bande plus ou moins centrale. A l'opposé du point de fécondation, on trouve le centre de Neuwkoop, qui permet la formation de mésoderme dorsal (= centre organisateur de Spemann).

A partir du centre organisateur, on a sécrétion de cordine, qui est un facteur dorsalisant, mais

on a également libération de facteurs ventralisant qui viennent s'opposer à la cordine, dont BMP2 : cela permet la formation du système nerveux dans la partie la plus dorsale. On s'est rendu compte que sans aucun facteur, les cellules du pôle animal ont une destinée neurale : BMP2 empêche donc la destinée neurale, mais la cordine vient s'opposer au BMP2. Ainsi, seule la zone la plus riche en cordine (et donc la plus pauvre en BMP2) deviendra le neuroblaste.

Chez les Drosophiles, on retrouve le même type de molécules qui interviennent de la même manière, mais Sog est un facteur ventral alors que la cordine était dorsale. On a donc eu retournement de l'axe DV lors de l'évolution (mais on ne sais pas encore comment).

2) Mise en place de l'axe antéro-postérieur AP. Elle peut facilement être mise en relation avec la mise en place de l'axe DV car dans les 2 cas

on retrouve le facteur Gurken. Dans un embryon de drosophile, on peut définir un certain nombre de territoires présomptifs : on retrouve alors 3 territoires pour la tête, 3 pour le thorax et 8 pour l'abdomen. On sait que chaque futur métamère est caractérisé chez l'embryon par une série de piques (expansion de la cuticule), et on a pu ainsi sélectionner plusieurs mutants de l'axe AP. Grâce à l'étude de leur génotype, on a alors pu remonter jusqu'aux gènes mis en cause, et on les a regroupé en 3 grandes classes : les gènes terminaux (acron et telson), les gènes antérieurs (tête et thorax) et les gènes postérieur (abdomen).

Acron et telson existent à tous les stades de développement de la drosophile, mais ils sont assez peu distinguable chez la larve. Ils restent cependant très important dans la mise en place de l'axe AP, puisqu'on a pu observer des mutants avec 2 queues (= 2 telsons) : c'est ainsi qu'on a découvert le gène bicoïd. De la même manière, on a pu mettre en évidence des mutants de très petite taille, et le gène responsable a été appelé nanos. Finalement, on a intervention là encore, comme dans le cas de l'axe DV, de très nombreux facteurs : ils seront maternels (ils conditionnent alors la polarité de l'œuf et du jeune embryon) et zygotiques.

a) Intervention du facteur Gurken

Au début de l'ovogenèse, les cellules folliculaires sont réparties également autour de la chambre ovarienne, et le noyau de l'ovocyte est central. On sais que l'on a transcription du messager gurken à partir du noyau de l'ovocyte, et après traduction, on a émission du facteur Gurken vers la membrane postérieure (le noyau est encore central).

Finalement, on va donc avoir une signalisation vers les cellules folliculaires postérieures, et on

a alors installation d'un dialogue moléculaire. Cependant, on ne connaît pas encore la nature des signaux qui interviennent, mais on sait que la série d'activation qui est déclenchée vient interagir avec le cytosquelette.

Dans la chambre ovarienne, il existe un centre organisateur de microtubules (MTOC : similaire aux nucléoles), que l'on observe entre le noyau de l'ovocyte et l'espace péri-vitellin. On va donc avoir mise en place de microtubules par polymérisation partir de ce MTOC, ce qui paraît normal pour une cellule qui se prépare à se diviser.

Les signaux renvoyés par les cellules folliculaires à la suite de l'émission de Gurken vont

interagir avec le MTOC et le faire disparaître. On va donc avoir une dépolymérisation des microtubules, mais ils se reforment depuis la face antérieure de l'ovocyte. Or, les microtubules sont des structures polarisées, avec une face + et une face - : on a donc inversion de la polarisation.

On sait qu'il existe des molécules motrices qui, par fixation d'ATP, sont capables de changer de conformation et ainsi d'avancer le long des microtubules : c'est le cas de la dinéine, qui progresse vers le pôle - et de la kinésine qui progresse vers le pôle +. Avec la réversion de polarité, les extrémités + passent des cellules nourricières vers le pôle postérieur de la chambre, et cela pourra expliquer la répartition des différents facteurs maternels. En effet, les molécules motrices sont capables de fixer des complexes protéiques et des ARNm : ces facteurs maternels sont donc transportés des cellules nourricières vers l'ovocyte.

b) Les facteurs maternels

Le noyau est capable de s'accrocher aux microtubules et de migrer : on définira alors le pôle dorsal de l'ovocyte en fonction de la destination du noyau (il peut migrer vers le haut ou vers le bas…). De plus, à cause de la réversion de polarisation, certains messagers se retrouvent piégés dans la partie postérieure ou antérieure de l'ovocyte. Les gènes qui sont piégés font partie des 2 grands groupes de gènes engagés dans la mise en place de l'axe AP (gènes terminaux mis à part) :

1. Le gène bicoïd bcd fait partie du système antérieur, et s'il est muté, alors on a formation d'une larve à 2 queues. Dans ce même groupe, on trouve également de nombreux autres gènes qui vont intervenir dans la synthèse même du messager bcd, dans l'accrochage de bcd sur les protéines motrices…: ils favorisent donc le bon placement du messager bcd dans l'ovocyte. On peut observer que bcd migre des cellules nourricières vers la partie antérieure de l'ovocyte au milieu de l'ovogenèse: là, il s'ancre au cytosquelette d'actine.

2. Les gènes du groupe postérieur forment un groupe assez complexe, qui perme la mise en

place du messager d'un morphogène. Si on mute l'un de ces gènes, alors la larve est de petite taille car elle ne contient pas de segments abdominaux. Le gène postérieur principal est nanos, et il est mis en place plus tardivement que bcd, car les différents gènes postérieurs préparent préalablement le cytoplasme postérieur à recevoir nanos.

Lors de l'ovogenèse, on a synthèse de nombreux facteurs qui vont assurer la migration du messager oscar vers le pôle postérieur : il va alors s'associer à d'autres molécules type vasa, et former ainsi des granules ribonucléoprotéiques. Finalement, on a formation d'un cytoplasme très particulier au pôle postérieur de l'ovocyte (il sera par la suite inclus dans les cellules polaires à l'origine de la lignée germinale). Lorsque toutes les molécules sont agglutinées pour former le plasme postérieur (=plasme polaire), nanos peut être accueilli.

En fin d'ovogenèse, les cellules nourricières synthétisent le messager nanos, puis déversent en intégralité leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte : nanos va alors se fixer sur les microtubules, et migrer jusqu'aux granules ribonucléoprotéiques auxquels il se fixe. On assiste ensuite à la ponte de l'ovocyte, et cela correspond à la traduction des différents messagers (idem pour les facteurs antérieurs), mais aussi au début de la multiplication nucléaire.

3. Il existe un 3e facteur très important en plus de bcd et nanos : on a vu que ces derniers se

distribuent de manière très localisée, soit en partie antérieur soit en partie postérieure. Le messager hunchback va, lui, se placer le long de tout l'axe AP, côté dorsal.

Lorsque l'embryon se dépose sur son milieu de croissance, on a à la fois traduction de Bcd et

de Nos qui diffusent de manière à former 2 gradients opposés. La protéine Hunchback va se distribuer de manière très particulière : on n'en retrouve que dans la partie antérieure, et plus du tout dans la moitié postérieure (on a une chute brutale).

Les gènes bcd et hunchback donnent pour des facteurs de transcription alors que nos code pour

un facteur de traduction. Après la traduction de Bcd et Nos, on a traduction de Hb mais elle est inhibée par Nos : là où le taux de Hb chute, on pourra définir la future césure entre les métamères T3 et A1.

c) Les facteurs zygotiques • Les facteurs gap On est capables de repérer les différents facteurs maternels sous la forme de messagers ou de

protéines par des méthodes d'immunofluorescence. On a donc pu étudier leur répartition avec précision, et on s'est rendu compte que selon les zones étudiées, on aura transcription de gènes particuliers. En effet, les messagers maternels définissent de grandes zones, mais grâce à la traduction de ces messagers et des messagers zygotiques, on a définition de zones de plus en plus petites, jusqu'à arriver à une définition à la cellule près.

Les messagers maternels vus précédemment sont capables de lancer la traduction de différents

gènes zygotiques appelés Gap : ce sont les gènes krupel, giant, knirps et hunchback (on a donc un hb maternel et un hb zygotique grâce à un phénomène d'épissage alternatif).

L'expression de ces 4 gènes va former différentes bandes, et on peut remarquer que

l'expression des 2 types de hb est plus ou moins superposée. Lorsqu'on superpose tous les types de bandes dues aux facteurs zygotiques, on arrive à reconstituer la totalité de l'embryon.

En réalité, l'expression des gènes Gap est représentée par des cloches, et on a donc des zones assez précises. Or, on sait que l'expression de ces différents gènes gap est sous l'influence des facteurs maternels bcd, nos et hb, qui sont des morphogènes.

Selon les 3 gradients qui s'installent, on a des influences

positives ou négatives sur l'expression des gènes zygotiques, dont les produits sont eux-même des facteurs de transcription : on va donc avoir des phénomènes d'autorégulation et de régulation croisée.

Au début, les zones d'expression des 4 gènes gap sont assez lâches, du fait de l'organisation des

3 facteurs maternels. Cependant, au fur et à mesure de leur traduction, on a instauration de nombreuses inhibitions et les zones d'expression vont se préciser petit à petit. Au bout du compte, les 4 messagers zygotiques vont se répartir de manière très précise, presque au noyau près (pendant tous ces phénomènes d'activation, on a eu multiplication nucléaire…). Si l'un des messagers manque, alors une des zones de l'embryon va manquer (on dit que l'on a un trou, d'où gap) et les zones d'expression seront beaucoup moins bien définies.

• Les facteurs "pair rules" On sait que les 4 messagers gap codent pour des facteurs de transcription, et ils vont donc

permettre la transcription puis la traduction d'autres gènes zygotiques dits "pair rules". Ils s'expriment selon 7 bandes chacun, mais certains facteurs s'exprimeront dans les bandes paires, les autres dans les bandes impaires. Par exemple, le gène even-skipped (eve) s'exprime dans les bandes 1,3,5.. alors que le gène fushi-tarazu (ftz) s'exprime dans les bandes 2, 4… On voit donc apparaître

14 bandes qui préfigurent les 14 futurs métamères : ce sont les parasegments, mais ils ne sont pas encore visibles lorsque les gènes "pair rules" commencent à s'exprimer.

-Rm- Environ 5 ou 6h après la fécondation, on a apparition des parasegments : ce sont des

ondulations que l'on numérote de 1 à 14. Vers 9 ou 10h, on a apparition des métamères définitifs, mais ils sont décalés par rapport aux parasegments (ils sont chevauchants)

Dans les gènes "pair rules", on va distinguer 2 classes : les gènes primaires comme eve et les

gènes secondaires comme ftz. Les gènes primaires s'expriment en 1e : on a donc mis en place des 7 bandes impaires, et ftz viendra s'installer dans les trous laissés par eve. Finalement, on peut dire que eve permet d'installer l'alternance des bandes, alors que ftz utilise cette alternance : cela aboutit bien à 14 bandes.

Une bande correspond environ à 4 ou 5 cellules, et on pourrait se demander comment se fait cette expression en bandes. On sait que dans l'embryon, on retrouve les différents produits maternels et les 4 premiers gènes zygotiques : à chaque zone de l'embryon on a une véritable combinatoire et en fonction de la stœchiométrie des différents facteurs, on aura expression ou non de eve.

On a pu mettre en évidence ce phénomène à partir du gène primaire hairy : sur les 15 kbases en

amont du cadre ouvert de lecture, on trouve les séquences de régulation classiques (TATA box…) mais on a également de nombreuses séquences sur lesquelles se fixent des facteurs trans. On a utilisé un gène rapporteur lacZ car il code pour la β-galactosidase facilement repérable (son substrat devient bleu). Selon la séquence promotrice choisie, on a réussi à faire exprimer lacZ dans une seule bande, et les séquences les plus éloignées du point 0 (début du cadre de lecture) permettent la synthèse dans les bandes les plus postérieures.

Selon la stœchiométrie des facteurs (maternels et gap), on aura activation d'une des séquences

et la stœchiométrie se fait au noyau près. Finalement, on installe une organisation AP très précise qui définissent les différents métamères.

• Les facteurs "segment polarity" Ces différents gènes représentent la dernière vague de transcription, et ils s'expriment dans les

14 bandes définies par les facteurs "pair rules". Cependant, chacun des gènes "segment polarity" s'exprime dans 2 cellules, et ce 14 fois.

Jusqu'à l'expression des gènes "pair rules", la cellularisation de l'embryon n'avait pas commencé : les produits gap pouvaient donc diffuser de noyau en noyau. Par contre, les facteurs "pair rules" peuvent plus difficilement diffuser, et la cellularisation est terminée lorsque les facteurs "segment polarity" s'expriment : ils ne sont donc plus capables de diffuser, et une signalisation devient donc nécessaire. Pour cela, les gènes "segment polarity" codent à la fois pour des facteurs de transcription et pour des facteurs de croissance, des récepteurs…

La polarisation de chaque parasegment va aboutir au positionnement des métamères sur les parasegments : la partie antérieure du métamère correspondra à la partie postérieure du parasegment précédent. Finalement, les facteurs "segment polarity" permettent la mise en place polarisée des métamères.

On peut retrouver des équivalents de tous ces gènes chez les Vertébrés pour la mise en place de

la polarité de l'embryon (les équivalents de gap, de pair rules et de segment polarity sont synthétisés par les centres organisateurs).

Il existe une batterie de gènes "segment polarity", et ils fonctionnent de manière plus ou moins différente. On va prendre l'exemple des gènes engrailed en, qui code pour un facteur de transcription et wingless wg qui code pour un facteur de signalisation. Les cellules qui expriment en et wg sont situées de manière très précise, de part et d'autre de la ligne de séparation entre 2 parasegments : on trouve ainsi en en position postérieure d'un parasegment et wg en position antérieure du parasegment suivant.

L'expression de en se traduit par la présence en abondance des facteurs eve ou ftz, alors que la présence en faible quantité de ftz ou de eve se traduit par l'expression de wg : le contrôle de l'expression des gènes "segment polarity" se fait donc par les facteurs de transcription de type "pair rules". Si on modifie l'expression des "pair rules", alors on va automatiquement modifier l'expression des "segment polarity".

Les cellules dites en et wg marquent la séparation entre 2 parasegments, et l'expression de ces 2

gènes ne peut pas s'inverser, car elle est nécessaire à la bonne polarité de l'embryon. On va considérer une cellule en et une cellule wg à proximité l'une de l'autre. On sait que en est un facteur de transcription : il va favoriser l'expression d'une molécule sécrétée appelée hedgehog Hh (pour hérisson : la mutation de ce gène entraîne l'existence de très nombreuses piques sur la larve).

La molécule Hh est diffusible, et elle peut donc être captée par la cellule wg. Hh peut en effet se fixer sur son récepteur (appelé patched, de type récepteur à 7 segments transmembranaires), et l'interaction entre le récepteur et son ligand va entraîner l'activation d'une chaîne de signalisation. On a ainsi activation de "cubitus interrompus", qui est un facteur de transcription. Ce dernier se dirige alors vers le noyau et il va réguler l'expression de wg.

Le facteur wg est une molécule sécrétée, et elle va ensuite diffuser jusqu'à la cellule en où elle se fixe à son récepteur (appelé frizzled, de type récepteur à 7 segment transmembranaires). La fixation du ligand sur son récepteur va alors inactiver par une voie de signalisation la molécule Zw3. Or, cette molécule est capable de dégrader armadillo, qui est une β-caténine : cette dernière n'est donc plus dégradée et va se transloquer dans le noyau associé au facteur Lef/TCF, ce qui entraîne l'activation de la synthèse de en….

Finalement, on voit que l'on a de nombreuses communications entre les 2 types de cellules,

mais les échanges qui se font permettent de renforcer leurs différences. Il existe des équivalents de toutes ces moélcules chez les Vertébrés : - en équivaut à en, et c'est un facteur de transcription - Hh équivaut à Shh (sonic Hh), et c'est un facteur de signalisation - Ci équivaut au facteur Gli , et c'est un facteur de transcription - wg équivaut au facteur Wnt (prononcé wint) et c'est un facteur de signalisation - Zw3 équivaut au facteur GSK3 - Armadillo équivaut à une β-caténine. Dans ce système de régulation, on a 2 boucles qui tournent et qui figent les cellules dans des

états en ou wg : c'est un système que l'on retrouve dans tous les phénomènes de polarisation que l'on va étudier (morphogenèse du membre…). Cette voie est très employée pour décrire la polarisation des embryons, mais c'est en plus un système de signalisation fondamentale pour le cycle cellulaire : en effet, il constitue un véritable intermédiaire entre les interactions cellule-cellule et les autres voies d'interaction, grâce notamment à la β-caténine.

Shh est toujours synthétisé sous forme de précurseur, mais il est capable de s'auto-cliver.

Pourtant, ce n'est pas une enzyme : la maturation de cette protéine est en fait un échange d'électrons, et Shh est un des rares exemples de ce phénomène chez les eucaryotes (mais il est beaucoup plus courant chez les procaryotes). A partir d'un précurseur qui a une fonction précise, on obtient par auto-clivage 2 molécules qui ont chacune un rôle différent, et différent de celui du précurseur. Le segment C-terminal n'a aucun intérêt développemental, alors que l'extrémité N-terminale est le facteur diffusible qui assure la communication entre les cellules en et wg. En réalité, ce segment N-terminal va s'associer à du cholestérol, et c'est ainsi que la diffusion pourra s'effectuer.

Certains moutons en Arizona se nourrissent de plantes riches en alcaloïdes, et on a pu constater qu'une grande proportion de petits sont des cyclopes. Les alcaloïdes interviennent dans le métabolisme du cholestérol, et Shh ne peut donc plus se lier au cholestérol : la diffusion de ce facteur devient impossible, et cela provoque une mauvaise mise en place de l'axe AP.

-Rm- On pourrait faire la comparaison entre les métamères et les vertèbres : chez les Vertébrés,

lorsque le nœud de Hensen régresse, il laisse le long du tube neural un certain nombre de somites.

Ces dernières se subdivisent en 2 zones, et les vertèbres vont se mettre en place à partir de 2 somites différentes : non seulement on a le même type de facteurs que chez la drosophile, mais en plus on a exactement les mêmes mécanismes.

c) Les gènes homéotiques • Chez la drosophile

Finalement, l'embryon de drosophile est découpé en 14 domaines polarisés, mais ces derniers sont tous identiques : pendant la métamorphose, l'imago en formation va acquérir des appendices à partir des disques imaginaux. Les appendices ainsi obtenus seront différents les uns des autres, en fonction de la zone où ils se forment dans l'embryon. Cette différenciation se fait grâce à l'intervention des gènes homéotiques, qui assurent l'acquisition d'une identité pour chaque métamère.

Les gènes homéotiques sont sous le contrôle des gènes "pair rules" (qui contrôle également les gènes "segment polarity" : ils commencent à s'exprimer en début de gastrulation (vers 5 ou 6h), et il sont responsables de l'homeosis : cela correspond au changement d'une structure par une autre.

Par des études génétiques, on a pu caractériser les mutations homéotiques : les drosophiles normales portent une paire d'aile sur T2 et une paire de balancier sur T3. Chez certaines drosophiles, on trouve 2 paires d'ailes et plus de balancier : le métamère T3 porte des ailes au lieu des balanciers, et on dit que la drosophile est de type bithorax. Dans d'autres cas, des drosophiles portent des pattes à la place des antennes : cette mutation est appelée antennapedia.

On a réussi à remonter jusqu'aux gènes responsables de ces mutations : on les a appelé

ultrabithorax ubx et antennapedia ant. En réalité, on a trouvé 8 gènes homéotiques chez la drosophile, tous situés sur le même chromosome : ils s'organisent en 2 groupes de gènes séparés par plusieurs mégabases, au niveau du chromosome 3.

Les différents gènes homéotiques codent pour des molécules portant une

homéoboîte : c'est une séquence de 80 acides aminés très conservée qui s'organise en hélices α. On appelle souvent l'homéoboîte "hth" car on a une organisation en hélice-tour-hélice. En réalité, cette homéoboîte est constituée de 3 hélices α qui permettent l'insertion de la protéine dans le grand sillon de l'ADN : ce sont donc directement des facteurs de transcription. Cependant, ces facteurs peuvent également interagir avec d'autres molécules et ce sera le complexe qui sera un facteur de transcription (on a donc une action indirecte).

Le 8 gènes homéotiques possèdent une homéoboîte strictement identique, et leurs différences se feront sur le reste de la séquence. Ces séquences hélice-tour-hélice ne sont cependant pas spécifiques des gènes homéotiques des drosophiles : en effet, on peut les retrover chez des procaryotes très primitifs, mais également chez tous les animaux et tous les végétaux.

On a pu analyser le profil d'expression des 8 gènes homéotiques, et il est assez particulier : on a

un véritable dégradé d'ARNm, de la partie postérieure vers la partie antérieure. A un endroit donné de l'embryon, on a donc une combinatoire différente, et ces associations de

messagers existent car on a 14 segments pour seulement 8 gènes homéotiques. L'organisation des gènes sur le chromosome 3 est polarisée : à l'extrémité 3' on retrouve le gène lab, alors qu'en 5' on trouve le gène Abd B. On se rend donc compte que les gènes en 5' sont aussi les plus postérieurs dans l'embryon : on peut donc dire que l'on a une colinéarité entre la polarité des gènes sur le chromosome et de leur domaine d'expression. Ce sont les seuls gènes connus qui s'organisent ainsi… Ce phénomène est dû à une régulation de la transcription qui met des limites antérieures décalées les unes par rapport aux autres. Après transcription, les domaines d'efficacité des différents facteurs est plus réduit que les domaines d'expression des messagers : en effet, ces domaines ne sont plus recouvrant.

On va prendre l'exemple du groupe ubx : les 3 gènes de ce groupes se répartissent sur une

séquence de 300 kbases, et chaque gène peut subir un épissage alternatif : ainsi, on obtiendra différentes molécules d'Ubx qui iront plutôt dans le SN, ou plutôt ailleurs…

On s'est rendu compte que les séquences situées entre les 3 gènes du groupe sont aussi important que le reste : en effet, si on mute ces séquences intermédiaires, on pourra observer des mutations homéotiques. En réalité, ce sont des séquences régulatrices et selon la concentration de tous les facteurs maternels et zygotiques synthétisés plus tôt (gap, pair rules…), on aura des phénomènes de régulation.

Par exemple, dans les zones où on trouve beaucoup de protéine Hunchback, alors on n'aura pas de messager ubx, mais si on n'a pas de Hb, alors on trouvera des messagers ubx. Or, on a vu que le domaine d'expression de Hb s'arrête postérieurement au niveau de la limite entre T3 et A1 : cela explique donc la limite antérieure d'expression des messagers ubx, qui traduit la même transition. Finalement, il faut que l'expression d'ubx soit en phase avec les métamères : les gènes Gap vont intervenir pour une localisation grossière, et ce seront les gènes "pair rules" qui assureront les limitations les plus fines.

Une fois les ARNm bien placés, on aura traduction des ces différents messagers pour assurer la

mise en place de l'identité des différents métamères. On est capable de fabriquer des drosophiles transgéniques : on place le gène ubx sous le

contrôle d'un promoteur de type heat-shock (activé par l'augmentation de la température). Les gènes endogènes sont transcrits puis traduits : on va alors chauffer l'embryon, ce qui permet l'expression

d'ubx transgénique. Du fait de son promoteur, le gène ubx transgénique pourra être traduit de manière homogène dans tout l'embryon (sensible à la température et plus à la combinatoire).

On a donc laissé la combinatoire se placer mais l'ubx exogène s'exprime partout : on obtient

une mouche anomale qui ne possède que des segments A1 en guise de tête et de thorax. On ne change rine dans les métamères abdominaux puisque ubx endogène s'exprime. Par contre, l'expression d'ubx en amont de la transition T3/A1 va provoquer l'identité A1 quelle que soit la combinatoire : on dit qu'on a dominance postérieure car ubx prime sur tous les gènes du groupe antérieur.

On réalise alors une autre expérience : on mute le gène ubx pour le rendre non fonctionnel :

d'après la morphologie de la larve, on peut en déduire que le domaine d'expression du gène ant s'étend sur tout le domaine théorique d'ubx. On a donc supprimer la dominance postérieure qu'exerçait ubx sur ant. On a étudié avec précision les niveaux d'expression des gènes ubx et ant dans la région de trasition entre thorax et abdomen. Elle est assez particulière puisqu'au niveau de T3, les 2 gènes s'expriment, mais de manière rapidement décrémentielle. Si on élimine ubx, alors l'expression d'ant dans le métamère T3 devient similaire à celle du métamère T2, et c'est pour cela qu'on obtient une mouche bithorax.

On se rend compte que l'on obtient le même type de résultat si l'on mute le gène ant : ce sera alors le domaine d'expression de src qui gagne du terrain. Finalement, on peut facilement jouer sur les gènes homéotiques pour modifier le plan d'organisation des drosophiles.

A partir de la combinatoire des gènes homéotiques, on a donc mise en place de l'identité de

l'organisme. Ces gènes permettent en effet l'expression de nombreux gènes qui assureront la transformation des disques imaginaux en appendices différents selon les gènes activés (et donc selon la combinatoire). Lors de l'évolution animale, on est passé d'individus sans pattes et non métamérisés (planaires) à des individus métamérisés avec des pattes toutes semblables puis à des individus type drosophile. On a supposé qu'on pouvait retracer toute cette évolution dans la morphogenèse des drosophiles. En effet, en mutant les gènes homéotiques, on pourra faire apparaître des intermédiaires évolutifs et remonter ainsi le temps.

Les hoxologues essaient de cette manière de retracer l'histoire évolutive des Ivertébrés marins par modification des gènes homéotiques. Ceci dit, on s'est rapidement aperçu que toutes les mutations ne sont pas réalisables : par exemple, une mutation qui atteindrait le devenir du disque génital empêcherait toute descendance, et donc la pérennité de l'espèce.

• Chez les Vertébrés Il existe bien entendu des équivalents des gènes homéotiques chez tous les animaux. On a ainsi

pu trouver un ancêtre commun à tous les organismes, qui présentait une certaine combinatoire de gènes homéotiques On a également pu trouver des gènes homéotiques chez les végétaux, et les homéodomaines hélice-tour-hélice se retrouvent également.

On a d'autre part essayé de déterminer la combinaison minimale de gènes homéotiques pour

obtenir un animal fonctionnel, appelé zootype. Cette recherche du zootype est intéressante puisque tous les organismes vivants présentent les mêmes gènes homéotiques.

Par un crible du génome des Vertébrés, on a pu retrouver les équivalents des gènes homéotiques de la drosophile, et on les a appelé gènes hox. L'évolution de ces gènes a été complexe puisqu'on a eu des phénomènes de duplication… : pour cela, on retrouve 4 groupes de gènes hox, situés sur 4 chromosomes différents. Ces 4 groupes sont appelés orthologues A, B, C et D, et à l'intérieur, on va retrouver les gènes classiques (ant, ubx…) mis ils ne sont pas séparés par plusieurs mégabases.

Dans chacun des orthologues, on retrouve de 9 à 13 paralogues notés Ai, mais on ne retrouve

pas systématiquement les 13 dans chaque orthologue. Les séquences codantes comme les séquences inermédaires sont très conservées chez tous les Vertébrés : ainsi les gènes 3' s'expriment toujours dans la partie la plus antérieure et les gènes 5' dans la partie la plus postérieure. En effet, les 1e somites qui s'expriment synthétisent les gènes homéotiques de type 1, et on a donc bien une colinéarité (et on a aussi des phénomènes de dominance postérieure).

Chez la drosophile, tous les métamères sont mis en place en même temps, mais c'est un cas assez particulier car d'ordinaire, la mise en place est chronologique. Les gènes 3' s'expriment en 1e et la colinéarité se fait donc sur 3 plans : de 3' vers 5', de la partie antérieure vers la partie postérieure, de l'expression précoce vers l'expression tardive. Finalement, un gène homéotique doit s'exprimer au bon endroit et au bon moment.

On a pu étudier l'expression des gènes par hybridation in situ : on a ainsi pu voir que l'on a un

gradient d'expression tout comme chez la drosophile, mais les orthologues de même type (A1 et B1, A5 et C5…) s'expriment au même niveau.

Cependant, il est évident que tous les Vertébrés ne présentent pas la même morphologie : ainsi

le poulet a un cou plus long que la souris, alors que cette dernière a une queue beaucoup plus longue que le poulet. On s'est donc demandé si cela se traduisait par une différence dans le nombre de gènes homéotiques…

Le domaine d'expression des orthologues est le même quel que soit l'espèce, et cela signifie

donc que les gènes hox ne définissent pas le nombre de vertèbres mais simplement l'identité des métamères ou des zones de l'organisme. C'est notamment le cas du bassin qui se met en place au niveau des lombaires. L'existence de ce bassin est à mettre en relation avec les orthologues Ai, Bi et Ci (i>9) qui ne se retrouvent pas chez la drosophile : c'est justement sur ces vertèbres que s'ancrent le bassin.

La mutation des gènes hox va provoquer comme chez la drosophile le remplacement d'une structure par une autre (augmentation du nombre de vertèbres et donc de côtes par exemple). Cependant, les gènes homéotiques ne régissent pas uniquement la structure de la colonne vertébrale : en effet, certains gènes hox vont s'exprimer dans le neurectoderme.

A priori , la moelle épinière n'est pas métamérisée, mais au niveau du rhombencéphale, des ondulations apparaissent lors de l'embryogenèse, puis disparaissent : on parle de rhombomère, et on peut en distinguer 8. L'existence de ces "métamères" est à mettre en relation avec l'expression de gènes homéotiques : on retrouve un gradient de gènes hox, mais il ne dépasse pas le rhombomère 1 vers la partie antérieure du SNC. La moelle épinière est donc également caractérisée par une combinatoire, mais aussi par une dominance postérieure.

L'apparition du cerveau moyen et supérieur est tardive, et la combinatoire initiale de gènes hox

ne les atteint pas. On retrouve tout de même des gènes particuliers qui s'expriment spécifiquement, mais ils ne possèdent pas les caractéristiques des gènes homéotiques. La mutation des gènes hox responsables de la mise en place polarisée de la moelle épinière peut entraîner des malformations, car chacun des nerfs principaux part toujours d'une vertèbre en particulier.

On va retrouver également certains gènes homéotiques au niveau du système endodermique, mais c'est ici beaucoup plus complexe. On sait que le TD est régionalisé, et on retrouve effectivement une combinatoire de gène hox, avec une colinéarité comme pour les autres (n°1 vers la partie antérieure, n°13 vers la partie postérieure). Cependant, le TD n'est pas une structure métamérisée, et on retrouve donc bien l'idée comme quoi les gènes hox assurent simplement l'identité et pas la métamérie.

Dans tous les cas, les gènes hox sont régulés de manière très précise par tous les gènes

exprimés depuis la fécondation : cela concerne donc les facteurs maternels, les gènes gap, les gènes "pair rules". De plus, les produits même des gènes homéotiques vont pouvoir réguler leur propre expression et l'expression des autres puisque ce sont des facteurs de transciption. Finalement, il

existe de très nombreuses régulations qui assurent la mise en place de l'identité des métamères des organismes.

• Les gènes comparables aux gènes homéotiques Par les processus de criblage, on a pu trouver des gènes possédant une homéoboîte modifiée :

ce ne sont donc pas des gènes homéotiques. Cependant, ces gènes codent pour des facteurs de transcription contenant une homéoboîte, donc on les rapproche souvent des gènes homéotiques.

Par exemple, les gènes paired sont constitués par une homéoboîte modifiée et par une boîte

"paired'" qui caractérise la famille. Chez les Vertébrés, on retrouve cette famille : elle regroupe les gènes pax qui jouent un rôle très important dans la mise en place des autres axes de l'organisme (pax 3 caractérise la partie dorsale du tube neural, pax caractérise la partie latérale du sclérotome…). En réalité, l'ensemble pax est formé par des gènes développementaux qui assurent des identités à certains territoires. En plus, ils jouent un rôle dans les interactions épithélio-mésenchymateuses qui assurent la formation des organes.

Chez la drosophile, on connaît le gène eyeless qui est un gène contenant un boîte paired : sa mutation entraîne l'absence d'yeux. On réalise une expression ectopique de ce gène dans le disque imaginal de patte pour connaître son activité : la mouche présente alors un œil au bout d'une patte, et cet œil est relié au SNC. Cela signifie que les gènes paired sont capables à eux seuls de déclencher la formation d'un organe entier : pour cela, on parle de gène maître.

Chez les Vertébrés, le gène eyeless correspond au gène pax6 : sa mutation entraîne la malformation de l'iris. On réalise l'expression ectopique de pax6 dans le disque imaginal d'une drosophile : cela déclenche la formation d'un œil (de drosophile bien sût) au bout de la patte. Finalement, la fonction fondamentale du gène a été conservée, même si les 2 types d'yeux sont complètement différents. On parle en réalité d'identité de fonction des yeux.

IV) Mise en place des champs secondaires chez les Vertébrés : l'organogenèse du membre. Lors de la gastrulation, on assiste au début de l'organogenèse et les organes commencent à

changer de forme. Dans la neurula, on peut distinguer un certain nombre de petites zones responsables de la formation des membres, des branchies… : ce sont les champs morphogénétiques secondaires.

Après la mise en place des axes AP et DV, on a donc mise en place de structures externes : si on enlève le champ à l'origine d'un membre, alors le membre correspondant n'apparaîtra pas. Par contre, si on greffe les cellules du champs à un autre endroit, alors on observera la formation d'un membre surnuméraire : cela signifie donc que les champs morphogénétiques sont des territoires présomptifs où les cellules sont déjà déterminées. On va alors analyser les interaction épithélio-mésenchymateuses qui vont participer à cette organogenèse.

1) Quelques généralités On pourrait se poser plusieurs questions devant la mise en place des membres : comment les

cellules sont-elles déterminées ? Comment se fait la polarisation du membre, et donc la mise en place des axes ? Une fois les précurseurs mis en place, on pourra avoir croissance du membre et établissement du patron : la dernière étape de la formation du membre sera alors la différenciation fonctionnelle des cellules, et cette étape n'est pas toujours liée au développement embryonnaire (elle peut se faire plus tard).

On prend un système endodermique qui ne présente a priori pas de spécificité (tube digestif par exemple). On prend alors un bourgeon épithélial qui est destiné à former un poumon, et on le place en contact du mésenchyme de chaque partie du TD (estomac, intestin, foie), et même avec d'autres types de mésenchymes. On voit alors que l'on obtient des structures différencies du TD à partir de l'épithélium initialement pulmonaire : c'est donc que l'identité de l'organe nécessite une interaction épithélio-mésenchymateuse, mais surtout que c'est le mésenchyme qui donne l'orientation : on dit que l'on a un aspect "dominateur".

De la même manière, on a réalisé le même type d'expérience sur les membres de poulet. On sait que d'une manière générale les pattes des poulets sont recouverts d'écaille et les ailes de plume. Cependant, si on place en contact de l'épithélium d'aile et du mésenchyme de patte, on obtiendra des ailes recouvertes d'écailles (idem pour l'inverse). Là encore on voit que le mésenchyme joue un rôle essentiel sur la destinée d'un épithélium.

Ce phénomène peut s'expliquer en partie par l'origine des épithélium : ils peuvent avoir des

origines très diverses, à savoir l'ectoderme, l'endoderme ou même le mésoderme. A l'opposé, le mésenchyme provient à 90% du mésoderme, sauf peut-être pour le mésenchyme de la crête neural, puisqu'il a une origine ectodermique…

2) Déroulement de la croissance du membre

a) Les étapes principales Chez la souris, on peut voir apparaître des petits bourgeons de membres à partir de 9,5 jours de

développement. A 10 jours, ce sont les bourgeons antérieurs qui se sont le plus développés : c'est un phénomène normal puisque la différenciation se fait de la partie antérieure à la partir postérieure, selon un axe céphalopodal.

En réalité, le bourgeon de membre passe de l'aspect d'un petit monticule informe en position latérale à une petite palette. A 12 jours, la sculpture du membre commence, mais les mains sont

encore entièrement palmées. Ce sera à partir du 14e jour que les doigts apparaîtront grâce à un phénomène d'apoptose spécifique.

Tous les membres des Vertébrés Tétrapodes sont fabriqués sur le même modèle, et les axes sont définis par un patron morphogénétique. On va ainsi distinguer un axe DV (ventre = paume de la main), AP (antérieur = pouce) et proximo-distal (proximal = épaule). Dans ce dernier axe, on va différencier 3 segments qui se retrouvent systématiquement : de la zone proximale à distale, on distingue ainsi le stylopode, le zeugopode et l'autopode.

b) La détermination des cellules de bourgeon de membre Les 2 bourgeons latéraux qui forment les prémices des pattes et des ailes sont constitués par de

l'ectoderme et du mésenchyme. On prélève un morceau de mésenchyme éloigné de l'ectoderme dans le bourgeon postérieur. On le greffe alors dans le mésenchyme du bourgeon antérieur accolé à l'ectoderme.

Les cellules qui devaient initialement donner des cellules à la jonction entre humérus et radius/

cubitus vont intervenir dans la formation des doigts, qui seront de type orteil (alors qu'on est dans l'aile). Cela signifie que l'on a modifié la destinée des cellules dans leur situation à l'intérieur de l'axe PD, mais la mémoire n'a pas été modifiée : une cellule de patte reste une cellule de patte, même si elle est transférée dans une aile.

Finalement, les cellules sont destinées très tôt à devenir des cellules de patte ou d'aile : a priori, on pourrait penser que cela dépend de la combinatoire des gènes homéotiques puisque les bourgeons se retrouvent à tel ou tel endroit dans l'axe AP. L'aspect moléculaire de la détermination des cellules semble en réalité plus complexe, et on a pu réaliser plusieurs types d'expérience qui ont montré cette complexité.

On prend un embryon d'Axolotl et on récupère un champ morphogénétique de patte. Si on le coupe, alors on va obtenir 2 pattes entières, mais si on superpose 2 champs identiques, alors on n'obtient qu'une seule patte. De la même manière, si on dissocie les cellules d'un champ morphogénétique et qu'on observe le résultat, on remarque qu'une patte tout à fait normale peut se développer. Finalement, on voit bien que les cellules sont bien déterminées et que même si on enlève une partie des cellules, les autres sont douées de régulation.

Harrison a réalisé une autre expérience sur la larve d'amphibien : il choisit d'étudier un champ

morphogénétique d'une larve au stade 29 (la neurulation est déjà faite). Il découpe le champ et le fait tourner afin d'observer le devenir de la patte ainsi former, selon le degré de rotation. Si on fait tourner le champ de 180° ou si on échange les pôles antérieur et postérieur, alors on voit que la patte se développe dans le sens inverse. Par contre, si on échange les pôles dorsal et ventral, alors on n'observe aucun changement : cela signifie que l'axe AP est déjà déterminé alors que le bourgeon de membre n'est pas encore formé (on est encore au stade de territoire présomptif), alors que l'axe DV non. Cela n'est pas étonnant puisque la mise en place de l'axe AP se fait de manière très précoce dans l'embryon.

On renouvelle l'expérience avec un embryon au stade 35 : on voit alors que les 2 axes AP et

DV sont déterminés, alors que le bourgeon n'est toujours pas apparu. Finalement, lorsque le bourgeon pousse, on a uniquement mise en place de l'axe PD car les cellules le constituant sont déjà déterminées à la fois du point de vue des axes et de leur destinée de patte ou d'aile.

Ces données sont tout à fait valables pour tous les Vertébrés Tétrapodes : par exemple chez le

poulet, l'axe AP se met en place au stade 10/11, l'axe DV au stade 13/14 ,et l'axe PD ou stade 17 (soit environ 3 jours). En réalité, le dernier axe qui se met en place permet la formation du membre.

Toujours chez le poulet, les somites sont mises en place dès le 3e jour de développement, ce qui signifie que le nœud de Hensen a déjà bien régressé. Le bourgeon d'aile apparaît précocement à

partir des somites 15 à 20 alors que le bourgeon de patte apparaît plus tardivement au niveau des somites 25 à 30. D'une manière générale chez tous les Vertébrés, les cellules qui participent à la formation du membre ont 2 origine :

- l'assise somatique de la somatopleure, qui permet la formation des os et des cartilages principalement

- les somites, qui vont surtout former les muscles. 3) L'aspect moléculaire de la morphogenèse du membre

a) La crête épidermique apicale AER. L'épithélium et le mésenchyme du futur membre sont séparés par une lame basale. Au début de

la morphogenèse, on a apparition d'un petit monticule un peu allongé et arrondi, formant comme une palette. On voit alors que l'ectoderme va se séparer légèrement pour former un bourrelet entre la partie dorsale et la partie ventrale du membre.

Lorsque la palette se forme, l'ectoderme constitue la "crête épidermique apicale" ou AER, qui

va réagir à la croissance du bourgeon. Les cellules mésenchymateuses que l'on retrouve juste sous l'AER vont alors subir une très forte prolifération cellulaire : on a ainsi formation de la ZP (zone de prolifération).

Entre l'AER et la ZP, on a mise en place d'interactions mésenchymateuses qui permettront

ensuite la mise en place des axes. En effet, on a pu mettre en évidence un poulet mutant appelé polydactyle qui présente le double de doigts : on s'est rendu compte que c'est la conséquence de la présence de 2 AER.

L'association expérimentale d'un ectoderme de mutant et de mésenchyme normal provoque la formation d'un membre normal alors que l'association d'un ectoderme normal et d'un mésenchyme mutant provoque la multiplication du nombre de doigts. On voit donc bien que là encore c'est le mésenchyme qui joue un rôle prépondérant, et c'est une mutation atteignant le mésenchyme qui provoque le phénotype polydactyle.

Afin de connaître le rôle exact de l'AER dans le développement du membre, on a décidé

d'enlever cette zone à différents moments de l'organogenèse, alors que le bourgeon commence à peine à se développer. On remarque alors que l'AER semble essentiel au développement, mais tout ce qui a été déterminé avant d'enlever l'AER peut se développer normalement. En réalité, sans AER, les cellules arrêtent de se multiplier, mais les signaux envoyés avant peuvent continuer à être efficaces.

L'AER a un rôle très important dans la croissance du bourgeon de membre car il envoie des

signaux prolifératifs vers le mésenchyme sous-jacent. Pour démontrer cela, on a réalisé plusieurs séries d'expériences :

- on enlève en totalité l'AER : on remarque alors que le membre est tronqué - on ajoute un AER surnuméraire : on obtient alors un membre double - on place sous l'AER un mésenchyme différent de celui que l'on trouve habituellement : on

voit assez rapidement l'AER disparaître et le membre sera tronqué. Cela signifie donc que le

mésenchyme a un rôle essentiel pour le maintien de l'AER et que l'AER est nécessaire à la prolifération du mésenchyme.

- on place une barrière physique perpendiculairement à l'AER : on obtient un membre apparemment normal, mais il manque toutes les structures antérieures. C'est donc que l'on a bloqué la circulation d'un élément nécessaire à la mise en place du bourgeon, et ce serait quelque chose qui diffuse du pôle postérieur au pôle antérieur.

b) La zone d'activité polarisante ZAP. Grâce à cette expérience, on a pu mettre en évidence une zone postérieure appelée ZAP (zone à

activité polarisante) très importante pour le développement du bourgeon de membre. On a donc supposé qu'il existe un morphogène qui diffuse du pôle postérieur vers le pôle antérieur afin de donner une identité aux cellules : cela explique pourquoi l'axe AP est mis en place avant même que le bourgeon ne se développe.

La réalisation de l'axe PD sera sous la dépendance des interactions proximo-distales entre l'épithélium et le mésenchyme : plus une cellule reste dans la zone d'interaction (dans la ZP), plus elle aura une destinée distale.

Cela signifie également que plus la ZP prolifère, plus on aura de parties distales. Cela entraîne

enfin que l'AER n'a qu'un rayon d'action assez restreint et qu'une cellule trop éloignée ne pourra pas proliférer pendant longtemps : assez rapidement, elle va se différencier et donner une structure proximale.

On a voulu vérifier si la ZAP avait le même rôle que le centre organisateur de Spemann : en effet, on sait que la duplication de la lèvre supérieure du blastopore entraîne la formation de 2 embryons et que de la même manière 2 ZAP entraînent la formation de 2 membres. Cela pourrait s'expliquer dans les 2 cas par la synthèse d'un morphogène, et on aurait établissement d'un gradient partant de la ZAP.

La duplication de la ZAP provoque la formation de 2 gradients opposés, et cela provoque ainsi

la formation de doigts en miroir, tout comme la lèvre du blastopore crée 2 embryons en miroir. Selon la position de la ZAP surnuméraire, on aura duplication d'un nombre de doigts différent, et on pourra même prédire la formation des doigts selon la zone d'intégration de la ZAP grâce à la concentration du morphogène. Si on a beaucoup de cellules de ZAP en zone antérieure, alors on aura une forte probabilité d'avoir multiplication de doigts. Finalement, on peut dire que la ZAP détermine l'axe AP de la main.

c) Formation de l'axe DV

On pense que c'est le résultat de l'ectoderme non AER du bourgeon qui est engagé dans ce processus : on modifie la position dorsale ou ventrale en découpant l'ectoderme non AER et en le faisant tourner. On a alors formation d 'un membre à l'envers, et apparemment, la réalisation de l'axe dépend bien de l'ectoderme.

A quel moment on a apparition de zones polarisantes ? On découpe pour cela le flanc de l'embryon de poulet en nombreux petits carrés, que l'on greffe

ensuite au niveau de la marge antérieure du bourgeon de membre. Si on a multiplication de doigts, alors c'est que la zone correspondante du flanc a une activité polarisante. On remarque alors que l'on a progressivement mise en place de 2 zones polarisantes, l'une pour l'aile puis l'autre pour les pattes, cad que l'on suit la progression de l'embryogenèse (antéro-postérieure). L'activité polarisante du champ de l'aile apparaît seulement après le passage du nœud de Hensen, et cela signifie que la détermination des cellules responsables de la mise en place du bourgeon se fait très tôt, bien avant la formation du bourgeon.

On peut ensuite se demander pourquoi le bourgeonnement commence, et à quel moment… On sait que l'AER est responsable de la prolifération du mésenchyme, mais cette zone n'apparaît qu'un peu après le début de formation du bourgeon. Pendant la migration du nœud de Hensen, on place une barrière entre le nœud de Hensen (donc les somites) et le mésoderme latéral. On met alors en évidence une signalisation en relais depuis les somites vers le mésoderme latéral par plusieurs étapes : ces signaux provoquent la prolifération des cellules et donc le début du bourgeonnement. Quand la barrière est mise suffisamment tôt, on n'obtient pas de membre, mais si elle est placée tardivement, alors les signaux sont déjà passés et on a développement d'un membre tout à fait normal.

L'un des derniers relais de ce signal a été identifié : il s'agit du FGF8, qui est un facteur

mitogène. Il est capté par des récepteurs des cellules du mésenchyme et cela déclenche la voie des MAP kinase. En réalité, on a prolifération car les cellules du mésenchyme sont compétente pour proliférer.

Pourquoi les cellules du mésenchyme ne sont –elles compétentes qu'à 2 endroits seulement de

l'embryon, à savoir au niveau des somites 15 à 20 (futures ailes) et 25 à 30 (futures pattes) ? Cela est tout simplement dû au fait que l'on a une information de position suite à l'expression

des gènes homéotiques responsables de la mise en place de l'axe AP. Ainsi, C6 et C7 sont caractéristiques de la zone de l'aile, alors que C9 et C10 sont spécifiques de la zone de la patte. Ce sera donc la combinatoire des gènes homéotiques qui déterminera la compétence des cellules à répondre à FGF8.

Quel type de réponse observe-t-on suite à la réception du FGF8 ? Lorsque l'on a prolifération des cellules du mésoderme intermédiaire, on a synthèse de FGF10

suite à l'activation de la voie des MAP kinases. L'ectoderme reçoit donc du FGF10, et les cellules répondent à ce signal par la synthèse de nouveaux signaux mitogènes : l'ectoderme est devenu l'AER. Les signaux provenant des somites est alors arrêté, mais la réponse est déjà lancée, et elle va être entretenue. L'AER libère en direction du mésenchyme du FGF8 puis du FGF2 + FGF4, et le bourgeon commence alors à se développer. On a donc un relais permanent de facteurs FGF qui maintiennent l'AER et la ZP.

En fonction de la combinatoire des gènes homéotiques, on obtiendra ensuite une aile ou une

patte, et les cellules mises en jeu sont déjà déterminées : les gènes hox permettent la synthèse de facteurs caractéristiques des ailes (TBX5) et des pattes (TBX4). En aval de ces 2 molécules, on ne sait pas encore ce qui permet de différencier une patte d'une aile…

Comment le bourgeon apparaît-il exactement sur le flanc de l'embryon ? On a voulu obtenir un membre dorsal : pour cela, il faut obligatoirement placer un AER

ectopique car l'AER endogène se retrouve toujours latéralement. On voit donc que l'AER se place à

chaque fois sur une frontière intangible entre face dorsale et face ventrale, qui sont toutes les 2 des conséquences de cette frontière.

La caille et le poulet sont 2 oiseaux au développement embryonnaire tout à fait comparable, mais les cellules de caille ont des noyaux qui se colorent différemment. Ce cellules vont se comporter de la même manière que les cellules de poulet, mais on pourra toujours suivre leur devenir après des greffes du fait de leur propriété.

Par tâtonnement, on a découpé des morceaux d'ectoderme et d'endoderme d'embryon de caille et on les a greffé chez les poulet : on a ainsi trouvé une zone responsable de la formation de l'aile et donc de l'AER, et elle est située avec précision. Si on prend des cellules un peu plus dorsale, alors elles participeront à la partie dorsale, et inversement pour les cellules un peu plus ventrales. En plus, les cellules de caille participent à la partie dorsale de l'AER, et les 2 types cellulaires ne se mélangent jamais.

On a bien une véritable barrière infranchissable entre la face ventrale et la face dorsale. Cette

barrière reste virtuelle, et pourtant elle pré-existe à l'AER : le flanc de l'embryon présente une délimitation mise en place pendant l'organogenèse mais on en sait pas encore comment. A priori, on pense que les gènes mis en jeu sont de même type que les gènes "segment polarity".

A quel moment se positionne la frontière ? On sait que l'on a des signaux émis par les somites vers l'ectoderme : ce dernier devient alors

l'AER juste en face des somites 15 à 20 et 25 à 30 (du fait de la compétence due à la combinatoire des gènes homéotiques). On a cependant d'autres signaux qui interviennent : le mésoderme somatique et ventral peaufine la détermination ventrale alors que la pièce intermédiaire peaufine la détermination dorsale. Finalement, on va donc avoir formation d'un ectoderme ventral, d'un pré-AER et d'un ectoderme dorsal. L'embryon va ensuite s'arrondir, ce qui permet une délimitation géographique de ces 3 zones. Le pré-AER ne deviendra un véritable AER (formation d'un bourrelet) uniquement sous l'influence du FGF8, comme on l'a vu précédemment.

Une fois l'AER formé, on assiste à la véritable différenciation des 2 types d'ectoderme, qui enverront ensuite des signaux différents vers le mésenchyme : on a bien mise en place d'un relais permanent. On a pu identifier des facteurs caractéristiques de chaque zone :

- Wnt7a qui s'exprime côté dorsal - en qui s'exprime côté ventral jusqu'à la frontière - Radical frindge côté dorsal et au-delà de la frontière Le gène "en" a un rôle très important dans la coordination car il s'oppose à l'expression des 2

autres gènes : en effet, son domaine d'expression s'étend jusqu'à la frontière et c'est donc lui qui positionne l'AER. Grâce aux 2 autres gènes, on a mise en place de la zone qui deviendra le pré-AER.

Tout cela sera tout de même déclenché par des facteurs provenant du mésenchyme. Quand le bourgeon commence à se former, les 2 axes AP et DV sont donc déjà déterminé, et son développement entraîne automatiquement la formation de l'axe PD.

-Rm- Wnt7a est un facteur de signalisation qui permet la transcription d'autres facteurs

caractéristiques de la partie dorsale. Si on réalise une expression ectopique de Wnt7a dans le mésenchyme ventral, alors on n'aura plus que du mésenchyme dorsal dans tout l'embryon…

Quel est le fonctionnement de la ZAP ? La ZAP permet le maintien de l'AER : c'est donc qu'elle envoie des signaux vers le

mésenchyme, qui renvoie lui-même d'autres signaux. Le morphogène de la ZAP a été déterminé grâce à l'étude de la drosophile : on s'est en effet demandé s'il existe une molécule identique à hedgehog qui permettait de faire le lien entre les cellules à "en" et les cellules à "wl". Effectivement, on a retrouvé chez les Mm la molécule Shh, qui joue un rôle dans la mise en place de l'axe AP : la ZAP sera donc une structure polarisante grâce à Shh.

Shh intervient à la fois dans les gènes "segment polarity" de la drosophile et dans la mise en place de l'aile au niveau des 3 axes du membre. Si on place des cellules synthétisant Shh, des morceaux de ZAP ou bien des billes ayant adsorbé du Shh, alors on observe une duplication des membres.

Bien que Shh intervienne sur la mise en place des 3 axes des membres, la concentration de Shh

jouera surtout sur la polarisation de l'axe AP. On isole la ZAP par une barrière physique : on voit alors que l'AER disparaît, ce qui montre que la ZAP a un rôle dans le maintien de l'AER. La molécule Shh est libérée selon un gradient et par l'intermédiaire d'un facteur X, régulé par Shh, on a maintien d'une signalisation vers l'AER, qui peut continuer à exister.

Lorsque le bourgeon commence à se former, le FGF10 synthétisé par le mésenchyme activé permet la différenciation de l'AER. En retour, on a synthèse de FGF8 qui assure la prolifération du mésenchyme. La ZAP va alors commencer à se former : on a donc synthèse de Shh et du facteur X en relais : l'AER répondra à ces signaux en synthétisant FGF2 et FGF4 entre autres : on a en fait synthèse de FGF2 de manière diffuse et de FGF4 dans sa partie postérieure. Le FGF4 qui est donc synthétisé en face de la ZAP permet de maintenir l'expression de Shh, et on a mise en place d'une boucle de régulation.

Si Shh joue vraiment un rôle de coordinateur entre les 3 axes, comment sera alors le mutant Shh correspondant ?

On observe que le stylopode se met en place normalement selon ses 3 axes : cela signifie donc que le 1e segment du membre des Vertébrés n'est pas sous le contrôle de Shh. Pour cela, on est revenu sur les réflexions à propos du morphogène de la ZAP. Si on donne à des femmes enceintes certains médicaments, on obtient des enfants mal formés chez qui la mise en place des axes se faisait très mal. Ce médicament agirait a priori sur la signalisation des FGF, mais il existe d'autres substances qui ont le même effet : c'est le cas de certains aliments riches en vitamine A, qui provoque chez des souris des naissances anormaux. On s'est rapidement rendu compte que l'acide rétinoïque, qui est un dérivé de la vitamine A, est tératogène (teratos = monstre).

Les gènes homéotiques antérieurs sont plus sensibles à l'acide rétinoïque que les gènes

homéotiques postérieurs. On a donc pensé que cette molécule était directement un morphogène, et qu'il pouvait modifier la mise en place des membres.

On greffe une bille d'acide rétinoïque à l'opposé de la ZAP : on obtient alors une duplication de membre. Suite à cette expérience, on a donc réellement supposé que l'acide rétinoïque était le morphogène de la ZAP.

Cependant, on a réalisé une expérience aux résultats troublants. On greffe une ZAP

surnuméraire dans un bourgeon de membre et on prélève ensuite les cellules en périphérie. On les place alors dans la partie antérieure d'un autre bourgeon, et on voit que l'on a un membre normal : c'est donc que ces cellules n'avaient aucune capacité duplicatrice. Si on réalise la même chose avec des billes d'acide rétinoïque, alors les cellules en périphéries greffées sur un autre bourgeons provoquent la duplication du membre. L'acide rétinoïque joue donc un rôle dans la mise en place des axes, en rendant des cellules compétentes pour être polarisantes.

On sait que Shh n'est pas capable d'initier les 1e étapes de la formation du membre : la présence d'un stylopode normal chez les mutants pourrait donc s'expliquer par le fait que l'acide rétinoïque initie le bourgeonnement.

L'acide rétinoïque est donc une molécule morphogène : il serait internalisé dans les cellules où

il est apparemment pris en charge par des protéines transporteurs du fait de son caractère lipophile. Il est ensuite capté par des récepteurs à la surface du noyau, puis c'est le complexe qui pourra y pénétrer. Les récepteurs mis en jeu présentent des domaines en doigts de zinc ce qui montre que l'acide rétinoïque va jouer un rôle de facteur de transcription. On a pu prouver que les gènes régulés étaient justement les gènes homéotiques et cela signifie que la combinatoire des gènes hox serait plus ou moins sous le contrôle de l'acide rétinoïque. Pour tout cela on pense que l'acide rétinoïque est synthétisé par le nœud de Hensen qui, en se rétractant, laisse une information de position.

On connaît un gène homéotique caractéristique de l'aile dont le domaine d'expression est limité

au niveau de la ZAP: c'est le gène hoxb8. Des billes d'acide rétinoïque provoque la synthèse de hoxb8 : c'est donc que l'acide rétinoïque joue un rôle de régulation directe sur ce gène. De plus, si on place des bille de hoxb8 en position antérieure dans un bourgeon de membre, on peut observer un duplication de doigts : c'est donc que hoxb8 permet la mise en place à la fois du membre et de la ZAP. En réalité, hoxb8 permet aux cellules du 1/3 postérieur du mésenchyme de l'aile de percevoir différemment FGF8 : on aura donc synthèse spécifique de Shh et de FGF4 au niveau de ce 1/3 postérieur → mise en place de la boucle de régulation.

Finalement, l'acide rétinoïque permet la différenciation de la ZAP via hoxb8 : on comprend

donc bien que la bille d'acide rétinoïque transforme les cellules alentour en cellules de ZAP, et donc que ce n'est pas un morphogène. La 1e étape du bourgeonnement du membre est liée à l'apparition de la ZAP, et elle permet la mise en place du stylopode, et on a toute une batterie de gènes sous l'influence de l'acide rétinoïque qui permet la mise en place des axes de cette portion de membre. Une fois la ZAP mise en place, on pourra avoir mise en place des axes des 2 autres segments de membres.

-Rm- On place des larves de

drosophiles dans des milieux de concentration en acide rétinoïque variable. On remarque alors que selon la concentration ou selon le temps qu'on l'on les laisse dans le milieu, on a disparition de la queue, puis de la tête. C'est donc que l'acide rétinoïque est bien une molécule teratogène qui modifie la mise en place des axes, puisqu'il intervient dans la transcription des gènes homéotiques.

On choisit alors d'étudier les différentes zones d'une gastrula afin d'observer les zones de synthèse de l'acide rétinoïque. On voit alors qu'il est principalement synthétisé dans la lèvre dorsale du blastopore (= centre organisateur de Spemann = nœud de Hensen chez les Vertébrés). Le nœud de Hensen synthétise tout au long de sa vie de l'acide rétinoïque, mais c'est également le lieu d'une intense prolifération. Les 1e cellules qui se divisent et qui sortent donc du nœud de Hensen ont peu subi l'influence de l'acide rétinoïque : ce sont donc les gènes hox qui auront été activés, et ces cellules seront étroitement liées au pôle antérieur de l'embryon…

d) Rôle des gènes homéotiques dans la mise en place du membre. On sait que Shh joue un rôle sur un certain nombre de cibles, et on pourra observer des

réponses cellulaires : par exemple, on peut avoir synthèse de molécules des familles hox et BMP (bone morphogenetic protein), qui permettent la mise en place des différents axes du membre. On a ainsi BMP2, BMP4 et BMP7 qui s'expriment autour de la ZAP, et on a des concentrations différentes selon l'avancée du membre.

Ces facteurs régulent la prolifération en agissant sur l'AER : on va avoir synthèse de FGF, ce qui maintient le signal mitogène sous l'AER et donc la croissance du membre. Avec beaucoup de BMP, on favorise la différenciation et on inhibe la prolifération, et ces molécules vont donc intervenir à la fois sur la croissance et la différenciation du membre (formation des os, des muscles…).

En parallèle, les gènes hox vont donner une identité au

bourgeon de membre en croissance, où les différents axes sont déjà mis en place : ce ne sont donc pas ces gènes qui assurent la croissance. On a analysé l'expression des gènes hox dans le bourgeon, et on s'est aperçu que 2 orthologues seulement sont exprimés (hox A et hox D), pour les paralogues 9 à 13 (qui ont dérivé de abd B de la drosophile). Par des hybridations in situ, on a pu repérer les messagers : on voit alors que l'apparition de la ZAP s'accompagne de l'expression de tous les gènes, mais on a ensuite une expression en "poupées russes" autour de la ZAP.

Lorsque le bourgeon grandit, on retrouve les gènes hox A dans l'axe PD et les gènes hox D dans l'axe AP : on pourrait donc définir différentes zones d'expression, et selon certains modèles, elles correspondraient avec l'organisation du membre (stylopode, zeugopode et autopode avec les doigts). On veut alors vérifier ce modèle : on fait exprimer hox D11 de manière ectopique dans tout le bourgeon. A priori, on ne va modifier que les zones où seuls les gènes hox D9 et hox D10 s'expriment. Effectivement, on observe bien une duplication de structures, et on a 3 zones de type 9+10+11 : on a eu homéosis.

Cependant, chez la souris, ce n'est pas si simple que ça : une souris KO modifiée pour un gène

hox voit son phénotype modifié, mais la modification ne peut être expliquée seule par la mutation. On pense que l'on a de nombreux autres éléments qui viennent s'ajouter à l'homéosis. De plus, une souris double KO (pour hox A11 et hox D11 par exemple) ne présente pas un phénotype qui serait la superposition des 2 phénotypes hox A11

- et hox D11- : la régulation de l'expression est donc

complexe. De la même manière, si on mute le gène hox D13, on ne devrai modifier que le phénotype des

doigts postérieurs : or, ce sont tous les doigts qui sont modifiés. C'est donc qu'un gène homéotique est responsable de l'identité de tout le membre, et le phénotype ne correspond pas à une combinatoire simple : le modèle n'est donc pas le bon.

Bien évidemment, une mutation de gène hox se traduit par une modification des axes, mais pas

celle à laquelle on s'attendait : la mutation due hox D13 entraîne la formation de doigts de très petite taille, et les doigts postérieurs sont encore plus atteints. Cela signifie que l'on a eu moins de prolifération cellulaire, et donc moins de cellules disponibles pour la formation des doigts.

Finalement, l'expression de hox D13 détermine le nombre de cellules engagées dans la morphogenèse, et elle est donc liée à la prolifération : les gènes hox n'ont donc plus seulement un impact sur l'identité, puisqu'ils sont capables de réguler le nombre de cellules engagées dans un processus.

On sait que l'on a une colinéarité dans l'expression des gènes : les plus postérieurs (n° 13) sont aussi les plus tardifs, alors que les plus antérieurs (n°1) sont les plus précoces. Les cellules prolifèrent dans la plaque segmentaire, puis finissent par en sortir. Les cellules qui restent longtemps dans la plaque expriment les gènes 13 et donnent donc une identité postérieure : l'expression homéotique est donc reliée à une horloge, mais on a en réalité mise en place d'une boucle de régulation car les gènes hox influencent également l'horloge…

Comment cette horloge s'exprime-t-elle ? On sait que les séquences régulatrices des gènes sont bloquées dans une structure solide : plus on a de divisions, plus la structure solide se délite. Quelques divisions ne permettent l'ouverture que du gène 1, mais plus les cellules se divisent (donc plus elles restent dans la plaque segmentaire), plus on ouvre la chromatine et donc plus on accède aux gènes postérieurs. Finalement, on comprend bien pourquoi l'expression des gènes hox est liée à la prolifération cellulaire.

Quelle est alors l'expression précise des gènes homéotiques ? On a 3 grandes vagues d'expression de ces gènes hox lors de la morphogenèse du membre :

-1- Elle intéresse uniquement les gènes hox D9 et hox D10, qui s'expriment dans tout le mésenchyme. Si on mute l'un de ces 2 gènes, alors on n'a plus formation du stylopode. Or, on sait que la mise en place du stylopode est sous le contrôle de l'acide rétinoïque : cela signifie qu'on passe donc par l'expression des gènes hox D9 et hox D10 pour former ce segment.

-2- Elle intéresse en plus les gènes hox D11 et hox D12 : on a alors une combinatoire complexe basée sur la partie postérieure, où tous les gènes s'expriment. Cette 2e vague permet de marquer une zone intermédiaire où on n'a pas eu expression des gènes de la 1e vague. Cela permet ainsi la formation du zeugopode -3- Les gènes hox D13 et hox A13 vont s'exprimer en plus de tous les autres, et ils sont caractéristiques de l'autopode : c'est pour cela que la mutation de hox D13 entraîne la disparition des doigts. On peut remarquer que dans l'autopode, les gènes hox D de 9 à 12 s'expriment à l'envers par rapport au zeugopode (9 est postérieur) : on a donc eu réversion de l'axe d'expression, et c'est une évolution fondamentale car c'est l'autopode qui caractérise le membre des Vertébrés.

e) Le principe de la récapitulation On sait que ce principe est visible dans le développement des structures rénales : chez les

Mammifères, on passe du pronéphros au mésonéphros puis au métanéphros. Pour les membres, on peut tout à fait retrouver ce phénomène : les poissons ne possèdent qu'un stylopode, puis on a acquisition du zeugopode, et enfin de l'autopode.

D'autre part, chez la Lamproie, on ne retrouve que des nageoires postérieures : on retrouve bien

les gènes hox A et hox D (de 9 à 13 pour les 2) responsables de l'identité des membres. Au cours de l'évolution, les gènes 9 à 13 se sont dupliqués pour former une 2e série de membre en position antérieure, mais on ne connaît pas encore pourquoi on a eu cette duplication.

Chez les Poissons, le stylopode présente à son extrémité des formations cartilagineuses issues de l'ectoderme : on ne peut pas encore parler de zeugopode. Cependant, au fur et à mesure de l'évolution des Poissons, on peut observer l'allongement du membre par empilement de structures osseuses : on a apparition progressive du zeugopode. Puis on a apparition de branchements à partir du stylopode et du zeugopode, mais arrivé au stade des doigts, on a eu rotation des branchements.

Au moment où on a eu cette rotation, on a eu simultanément réversion de l'expression des gènes hox A et hox D. Les gènes hox A13 et hox D13 sont sous le contrôle d'un promoteur particulier qui permet leur expression au bon moment, au bon endroit, mais à l'envers…

On a analysé plus précisément les souris KO pour hox A13 ou hox D13 : on observe alors des

malformations des doigts, mais elles sont différents selon la souris étudiée (double ou simple hétérozygote). De plus, on a dans les 2 cas absence de développement du génitalia, à l'origine du pénis et du clitoris. Cela signifie donc que le promoteur des gènes hox en question permet leur expression dans ces 2 zones et seulement là.

On peut se demander quel est l'intérêt évolutif de ce promoteur très particulier. Nos ancêtres se trouvaient dans l'eau de mer : ils possédaient donc des nageoires et pratiquaient la fécondation externe (les spermatozoïde peuvent facilement se déplacer). Une fois sortis de l'eau, on a formation d'un membre plus sophistiqué, et la fécondation externe devient plus difficile. L'apparition de l'autopode s'accompagne de la formation d'organes génitaux complexes, qui assurent une fécondation efficace. Bien évidemment dans les 2 cas, cette évolution est résumée pendant l'embryogenèse.

A priori, le principe de récapitulation favorise un développement embryonnaire plus long : on

aurait pu avoir formation de gènes qui donneraient directement les structures finales, et qui éviteraient donc que l'histoire se répète. On ne sait pas vraiment pourquoi on a gardé les anciens gènes, et la seule donnée est que les gènes les plus anciens ont plus de mutation que les gènes récents…

Une cellule souche qui se différencie va exprimer un répertoire particulier de gène, représentatifs de l'état dans lequel elle s'engage. Or, on constate que les 1e gènes qui sont transcrits sont les plus anciens, puis on a expression des gènes les plus récents. On a donc là encore une récapitulation. On pense en fait que les gènes mutés auraient une organisation chromatinienne plus fragile et donc plus facile à ouvrir. Selon la pression du milieu, on aura expression de l'un ou l'autre type de gène, ancien ou récent. Finalement, la récapitulation dans la mise en place du membre correspondrait à une récapitulation d'expression des gènes dans les cellules souches…

4) La différenciation des cellules dans le membre

a) Les principales étapes de la différenciation La mise en place des membres par développement du bourgeon va se terminer par la

différenciation des cellules. On obtiendra ainsi de l'os à partir du mésoderme latéral somatique et des muscles à partir des somites. Les cellules formant les précurseurs des membres migrent des somites vers le bourgeon pour constituer les muscles : elles se répartissent alors selon 2 zones (dorsale et ventrale). De la même manière, les cellules de l'assise somatique à l'origine des condensations cartilagineuses forment des structures tout autant visibles, et ce assez rapidement dans la formation du membre. L'innervation et la vascularisation qui se développe à partir de l'aorte vont enfin envahir le bourgeon.

On a pu montrer que si on bloque la progression de l'innervation, alors on a arrêt total du développement. En réalité, les nerfs permettent d'apporter des facteurs trophiques essentiels comme les FGF et les NGF, qui permettent de maintenir le processus de différenciation. Grâce aux vaisseaux, on a apports d'hormones qui là encore interviennent dans la différenciation, et notamment pour les cellules musculaires, qui sont très sensibles à tous ces types de facteurs.

Le membre va ensuite pouvoir se sculpter, ce qui est principalement permis par l'apoptose, qui assure l'élimination des cellules surnuméraires. Au niveau de l'autopode, on assiste à de grands bouleversements morphologiques : on a au départ une raquette pleine où les doigts commencent à peine à apparaître. L'apoptose permet ensuite d'éliminer les cellules entre les doigts afin d'enlever la palmure : bien entendu, elle restera chez certains animaux comme le canard.

Au bout d'un certain temps, la croissance va s'arrêter : la zone de prolifération va alors disparaître, et les condensations cartilagineuses commencent à s'ossifier dans l'axe PD. Cependant, on a pu constater dans des coupes que ce sont les os formés le plus tôt sont situés dans la partie postérieure : ils correspondent en fait à l'ancienne localisation de la ZAP…

b) La formation des os

• La chondrogenèse Les cellules qui sortent de l'AER vont être capable de se différencier : au départ, le

mésenchyme est identique partout, et toutes les cellules se ressemblent. A un moment donné, elles commencent à se condenser mais aussi à rétrécir : elles continuent cependant à proliférer pour former des condensations pré-cartilagineuses. Quand elles sont suffisamment nombreuses, elles commencent à sécréter des molécules de matrice extracellulaire afin de former le véritable cartilage.

CONDENSATION FORMATION

DIFFERENCIATION

On a analysé les différents facteurs engagés dans ce processus : on note ainsi l'intervention de BMP2 et de Msx qui assure également la prolifération dans la zone de progression. De plus, on a expression de TGFβ1 qui induit la synthèse de tenascine (molécule de la matrice). On se trouve alors au stade chondroblaste : on n'a plus de division et les cellules ainsi activées s'engagent dans un processus de condensation et de rétrécissement. On pourra alors avoir mise en place d'interactions cellule/cellule, et dès lors, TGFβ1 assure la libération de fibronectine et de NCAM. On assiste ensuite à la libération de cadhérine, ce qui permet aux cellules de se condenser efficacement et de former ainsi la structure pré-cartilagineuse dans une matrice de protéoglycane et de collagène fibrillaire.

Sous l'effet de toutes ces molécules, les cellules vont alors s'engager dans un nouveau processus : elles vont exprimer un nouveau répertoire matriciel et donner ainsi les véritables condensations cartilagineuses. Là encore plusieurs types de molécules interviennent : ainsi BMP5 facilite le passage entre condensation et différenciation, alors que d'autres facteurs inhibe la synthèse du 1e répertoire matriciel.

On peut étudier l'exemple du protéoglycane Syndeca, qui est implanté dans la membrane des chondroblastes : c'est un héparansulafte qui est capable de présenter des signaux de signalisation aux récepteurs (surtout FGF). Il va ainsi s'opposer aux recrutement des cellules, ce qui a pour effet d'arrêter la condensation. Les cellules déjà recrutées vont alors synthétiser encore un autre type de matrice grâce à une autre étape de la différenciation. On obtient ainsi une matrice caractéristique du cartilage : elle est composée de collagène de type II principalement et d'aggrécan (= chondroïtine sulfate protéoglycane).

• L'ossification endochondrale

Le cartilage est une structure souple composée par une matrice spécifique : sous l'effet d'autres facteurs BMP, les cellules vont encore modifier leur organisation dans l'espace. Ainsi, BMP6 assure la formation dans la condensation cartilagineuse de chondrocytes hypertrophiés. Ces derniers ne synthétisent plus de matrice cartilagineuse, mais on a production de collagène de type X, qui est amorphe. La matrice devient alors molle et va même se dégrader : on a alors infiltration de vaisseaux sanguins qui viennent irriguer le centre du cartilage. La circulation permet d'apporter des ostéoblastes (origine : mésoderme splanchnique), qui assurent la formation de l'os : ils vont progressivement remplacer les chondroblastes et synthétisent une matrice (avec du collagène de type I) qui va se minéraliser.

A l'intérieur de l'os, tout se dégrade : l'apport d'ostéoclastes (origine : mésoderme splanchnique) permet d'accélérer la dégradation de la matrice pour former la moelle osseuse. Une fois l'os terminé, on retrouvera tout de même du cartilage à chaque extrémité, et cela permettra la croissance dans des phases ultérieures du développement.

Finalement, la formation des os s'accompagne de nombreuses vagues de combinaisons matricielles différentes, et ce principe se retrouve pour toutes les organogenèse. Si on empêche la vascularisation, alors on ne pourra pas obtenir d'os solides car les ostéoblastes n'ont pas été amenés. Si on empêche la morphogenèse des os, alors on n'obtiendra jamais de membre, alors qu'on peut tout à fait empêcher la myogenèse : cela signifie que la différenciation du squelette prime sur la différenciation de muscles, et que le mésoderme somatique joue un rôle essentiel sur la formation de membre.

Une fois tous les os formés, on doit avoir formation de branchements entre les différents segments du membre, cad des articulations. Ce phénomène est permis par la formation de zones nécrotiques où l'apoptose va être active. On a en 1e des zones apoptotiques sur les côté afin d'assurer la sculpture du membre, puis au centre afin d'assurer la séparation des masses cartilagineuses. Lorsque la main apparaît, on a de nouvelles zones apoptotiques qui apparaissent , afin de former les doigts. Ces mécanismes sont régulés par des signaux spécifiques, exprimés à un moment donné : on ne connaît par vraiment les signaux engagés mais les BMP joueraient un rôle dans le déclenchement de la sculpture des masses cartilagineuses.