25
Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 1/25 Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de biocapteurs bactériens luminescents L. Bendriaa, Ph. Daniel, P. Picart, G. Sockalingum, I. Adt, Th. Charrier, M.J. Durand, G. Thouand pr pr é é sentation Philippe DANIEL sentation Philippe DANIEL - - LPEC LPEC GEnie des Procédés Environnement Agroalimentaire UMR-CNRS 6144

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 1/25

Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de

biocapteurs bactériens luminescentsL. Bendriaa, Ph. Daniel, P. Picart, G. Sockalingum, I. Adt,

Th. Charrier, M.J. Durand, G. Thouand

prpréésentation Philippe DANIEL sentation Philippe DANIEL -- LPECLPECGEnie des Procédés

EnvironnementAgroalimentaire

UMR-CNRS 6144

Page 2: Application de la diffusion Raman pour l’étude et la …...Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 −1/25 Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de

Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 2/25

Biocapteurs luminescentsBiocapteurs luminescents

Université de NantesLaboratoire CBAC

UMR CNRS GEPEA 6144

Production des bioélémentsbioluminescents

Université du MaineLaboratoire LPECUMR CNRS 6087

Système de détection Caractérisation des bactéries

Université de NantesENITIAA

UMR CNRS GEPEA 6144

Immobilisation des bactéries

Validation expérimentale des biocapteurs

Université de ReimsUMR MéDIAN 6147

Société Biolumine

Développement commercial

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 3/25

ContexteContexte

Nécessité de compétences transversesProduction et culture des souches bactériennesCaractérisation optiqueConception et mise au point de biocapteursDéveloppement commercial des biocapteursDiffusion Raman appliquée à la compréhension

du mécanisme de détection

Listeria Pesticides

SalmonellaTBT

Mesure et contrôle dans différents secteursAgro-alimentaireEnvironnementSanté publique

Objectif

Page 4: Application de la diffusion Raman pour l’étude et la …...Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 −1/25 Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de

Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 4/25

OrganoOrganoéétainstains: polluant milieu marin: polluant milieu marin-Usage des organoétains comme biocide exemple peintures antisalissures

Tributyltin chloride Tributyltin chloride Tributyltin chloride Tributyltin chloride

Toxicité :- Changement de sexe des gastéropodes- Problème de calcification des huîtres- Tératogène

Répertorié par la CEE dans la liste des polluants à rechercher TBT interdit en 2003 , mais accumulation dans les sédiments

PERSISTANCE jusqu’à 2008 environ

G. G. ThouandThouand et al , Recent Research developments in Microbiology et al , Recent Research developments in Microbiology 55 Part I, 79Part I, 79--93(2001)93(2001)

Page 5: Application de la diffusion Raman pour l’étude et la …...Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 −1/25 Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de

Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 5/25

Principe de fonctionnement dPrincipe de fonctionnement d’’un biocapteurun biocapteur

TRANS-DUCTEURTRANS-

DUCTEURACQUISITION DE DONNEESACQUISITION DE DONNEES

COMPOSE A

DETECTER

COMPOSE A

DETECTER

ELECTRO-NIQUE

ELECTRO-NIQUE

ELECTRO-NIQUE

ELEMENT BIOLOGIQUE

ELEMENT BIOLOGIQUE

SIGNALBIOLOGIQUE

SIGNALBIOLOGIQUE

SIGNAL ELECTRIQUE

SIGNAL ELECTRIQUE

SIGNAL ELECTRIQUE

FIXATION

Ampérométrie,Potentiométrie,

Optique,Calorimétrie,

Electron,Photon,

Ions,Température,Variation de

masse

Enzyme,Anticorps,

Acide nucléique,

cellule

Analyte

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 6/25

Principe de la bioluminescencePrincipe de la bioluminescence

FMNH2 + RCHO + O2

FMN + H2O + RCOOH + lumière

Luciférase bactérienne

B A

Émission de lumière chez Vibrio Harveyi

RCHO

02

FMNH2

TBT biodisponible TBT non

biodisponible

RCOOHFMN

Induction de la luminescence chez E.Coli TBT3

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 7/25

ProblProbléématiquematique

Utilisation des bactéries luminescentes modifiées génétiquement → bactérie E.Coli TBT3

Y a t’il une spécificité des détecteurs optiques vs bactérie ?

→ unicité du biocapteur ?

La réaction de luminescence est elle identique

→ pour tout type de bactéries?

→ pendant toutes les phases de croissance?

→ quelque soit les conditions de croissance?

Nécessité d’une étude amont

étude spectrométrique

Page 8: Application de la diffusion Raman pour l’étude et la …...Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 −1/25 Application de la diffusion Raman pour l’étude et la mise en œuvre de

Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 8/25

Vue dVue d’’ensemble du banc expensemble du banc expéérimentalrimentalBioréacteur

Couplage par faisceau de fibresoptique du spectromètre au bioréacteur

Modèle utilisé:Jobin-Yvon T64000

Colloque CMC2 XXVII, 23 Mai 2002

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 9/25

Spectres de bioluminescenceSpectres de bioluminescence

Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 10/25

Spectres de bioluminescenceSpectres de bioluminescence

Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)

Phase de latencePhase de latence

Phase exponentiellePhase exponentielle

Phase Phase stationnairestationnaire

Longueur dLongueur d’’onde (nm)onde (nm)

Permet l’optimisation du détecteur

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 11/25

W ave leng th (nm)

400 450 500 550 600 650 700 750

Inte

nsity

(a.u

.)

0

4000

8000

12000

16000

Qua

ntum

Effi

cien

cy

0 ,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

C orrected f rom Q E

N on corrected from Q E CCD Q

E

498523

585

585

Spectre dSpectre d’é’émission de mission de VibrioVibrioHarveyiHarveyi avant et apravant et aprèès correction s correction

de lde l’’efficacitefficacitéé quantique de la quantique de la CCDCCD

W avelength (nm)

400 450 500 550 600 650 700

Inte

nsity

(a.u

.)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Qua

ntum

Effi

cien

cy

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

VH spectrumwith CCDVH spectrum

with PM

PM QE

CCD QE

Comparaison du spectre Comparaison du spectre dd’é’émission de VH : CCD et mission de VH : CCD et

photomultiplicateurphotomultiplicateur

G. G. ThouandThouand, Ph. Daniel et al, Luminescence 18, 1, Ph. Daniel et al, Luminescence 18, 1--11 (2003)11 (2003)

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 12/25

Biocapteur bactBiocapteur bactéérien luminescent : Lumisens Irien luminescent : Lumisens I

ObjectifBiocapteur multifonction

Mesure simultanée et in situ Contrôle de croissance des bactéries : DOBioluminescence+ paramètres : O2, pH, température

Simple, rapide, fiable

CIRC ULA TION D’EA U

THER MOSTATEE

A UTOCLA VA B LE

B LM O

L

EN VELOPPEEN VER RE

COUVER CLE

VIS

FAISCEA U DE FIB R ES OPTIQ U ES 2× 1

L

PMT

PDL

M E B M

A

FO

JOINT TOR IQ U E

C ON TROLE & ALIMENTA TION

DOU B LEPAR OI

A XE DU B IOREA CTEUR

EMB A SE

EN TRETOISE

D L

A UTOCLA VA B LE

B LM O

L

EN VELOPPEEN VER RE

COUVER CLE

VIS

FAISCEA U DE FIB R ES OPTIQ U ES 2× 1

L

PMT

PDL

M E B M

A

FO

JOINT TOR IQ U E

C ON TROLE & ALIMENTA TION

DOU B LEPAR OI

A XE DU B IOREA CTEUR

EMB A SE

EN TRETOISE

D L

ACQUISITIONTRAITEMENT DES DONNEES

Spectre initial

300 350 400 450 500 550 600 650 700 750

0

5

10

15

mA

/ W A

U

0

5

10

15

Longueur d’onde (nm)

Transmission totale

Spectre transmis

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 13/25

Plateforme Lumisens IPlateforme Lumisens I

Diode laserMoteur

électrique

Système de détectionPM, PD

Réacteur

Contrôle O2

Contrôle pH

Régulateur T

Fibre optique

Acquisition du signal

Pompe

P. P. PicartPicart, L. , L. BendriaaBendriaa, Ph. Daniel et al, , Ph. Daniel et al, Review of Review of sicentificsicentific instruments, 75(3), instruments, 75(3), 747747--755 (2004)755 (2004)

1000 2000 3000 4000 50000

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0,18

Den

sité

opt

ique

Bio

lum

ines

cenc

e (p

W)

Temps (min)

TBT1,25 µM

TBT0,125 µM

TBT1,25 µM

Décanal300 µM

culture continue

DOLuminescence

500 1000 2000 3000 4000 50000

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0

0,03

0,06

0,09

0,12

0,15

0,18

Den

sité

opt

ique

Bio

lum

ines

cenc

e (p

W)

Temps (min)

TBT1,25 µM

TBT0,125 µM

TBT1,25 µM

Décanal300 µM

culture continue

DOLuminescenceDOLuminescence

500

Temps de réponsetR = 50 minutes

Temps de recouvrementtRec = 500 minutes

Limite de détectionCmin = 0,125 µM

Performances

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 14/25

CaractCaractéérisation physicorisation physico--chimique chimique par spectroscopie Ramanpar spectroscopie Raman

1. Caractérisation en fonction de l’ageVibrio harveyiTrois phases de croissance :

latence, exponentielle,stationnaire

2. Effet du TBT sur E.coli TBT3 4 concentrations : 1, 3, 5, 10 µMDO = 1Temps d’induction : t = 1h

(collaboration Univ. Reims, Dr G. Sockalingum, I. Adt)

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 15/25

CaractCaractéérisation des bactrisation des bactééries ries conditions expconditions expéérimentalesrimentales

Conditions expérimentales Longueur d’onde excitatrice : λ = 785 nm, P = 50 mW

Objectif de microscope : ×100

Substrat : ZnSe

Temps d’acquisition : t = 200 secondes

Zone spectrale : 600-1750 cm-1

Traitement des spectres : filtrage et normalisation sous Labspec

Préparation des bactéries

culture en over-night

centrifugation deux fois à 4°C, 5 min, 4000 g

5 µL du culot déposé sur substrat et séché sous

vide, 15 minCulot bactérien sous microscope

Spot laser≈1 µm

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 16/25

ÉÉtude en fonction des phases de tude en fonction des phases de croissancecroissanceVibrio HarveyiVibrio Harveyi

600 800 1000 1200 1400 1600 1800-0 ,02

0 ,00

0 ,02

0 ,04

0 ,06

0 ,08

0 ,10

0 ,12

0 ,14

0 ,16

0 ,18in

tens

ité (u

.a)

nom bre d'onde (cm -1)

⎯ Phase de latence⎯ Phase exponentielle⎯ Phase stationnaire

Spectres obtenusAc

ides

nuc

léiq

ues

Phén

ylal

anin

e

Lipi

des

Car

bohy

drat

es

Am

ide

III

Acid

es n

uclé

ique

s

Lipi

des

Am

ide

II

Am

ide

I, Li

pide

s

croissance de VH en milieu VH à 25°C, 1%

00,5

11,5

22,5

33,5

44,5

0 100 200 300 400 500 600

temps (min)

dens

ité o

ptiq

ue Phase de latence

Phase exponentielle

Phase stationnaire

p1 p2

p3

p4

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Analyse des spectresAnalyse des spectresClassification HiClassification Hiéérarchique Ascendante (CHA)rarchique Ascendante (CHA)

Création de pôles d’individus qui se ressemblent à partir d’un calcul de distance entre individus

{W1, W2, …, Wn } un ensemble d’individus qui appartiennent à ℜn,{X1, X2, …Xp} un ensemble de variablesM matrice symétrique définie positive, contient les poids donnés aux variables Xi.

Distance entre individus:

Analyse de spectres Raman: calcul de distances euclidiennes entre spectres

( ) ( ) ( )Tjijiji WWMWWWWd −−=,

( ) ( ) ( )fSfSSSd bfa 2121 sup, −= ≤≤

( ) ( ) ( )∫ −=b

adffSfSSSd 2

2121,

( ) ( ) ( )∫ −=b

adffSfSSSd 2121,

Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 17/25

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 18/25

Analyse des spectresAnalyse des spectresClassification HiClassification Hiéérarchique Ascendante (CHA)rarchique Ascendante (CHA)

Late

nce

Late

nce

Late

nce

Stat

ionn

aire

Stat

ionn

aire

Stat

ionn

aire

Expo

nent

ielle

Expo

nent

ielle

Expo

nent

ielle

Hét

érog

énéi

Classification sur la zone : 600-1750 cm-1

Late

nce

Late

nce

Late

nce

Stat

ionn

aire

Stat

ionn

aire

Stat

ionn

aire

Expo

nent

ielle

Expo

nent

ielle

Expo

nent

ielle

Hét

érog

énéi

Classification sur la zone : 1450-1750 cm-1

Distinction facile entre bactéries jeunes et bactéries âgées

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 19/25

Effet du TBT sur la bactEffet du TBT sur la bactéérie rie E.coli TBT3E.coli TBT3

600 800 1000 1200 1400 1600 1800-0 .02

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20in

tens

ité (u

.a)

n om bre d 'onde (cm -1)

⎯ TBT3 seule⎯ TBT3 + 1 µM de TBT⎯ TBT3 + 3 µM de TBT⎯ TBT3 + 5 µM de TBT⎯ TBT3 + 10 µM de TBT

L.BendriaaL.Bendriaa, P. , P. PicartPicart , Ph. Daniel et al, , Ph. Daniel et al, soumissoumis àà Analytical and Analytical and BioanalyticalBioanalytical Chemistry Chemistry --01/0601/06

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 20/25

Effet du TBT sur la bactEffet du TBT sur la bactéérie rie E.coli TBT3E.coli TBT3Analyse CHA, zone spectrale 900Analyse CHA, zone spectrale 900--1200 cm1200 cm--11

10

µM

10 µ

M

10 µ

M

3 µ

M

3 µ

M

3 µ

M

Tém

oin

Tém

oin

Tém

oin

Hét

érog

énéi

A

10 µ

M

10 µ

M

5 µM

5 µM

5 µM

10 µ

M

Tém

oin

Tém

oin

Tém

oin

Hét

érog

énéi

B

Tém

oin

Tém

oin

Tém

oin

1 µM

1 µM

1 µM

3 µM

3 µM

3 µM

Hét

érog

énéi

C

Tém

oin

Tém

oin

Tém

oin

5 µM

5 µM

5 µM

3 µM

3 µM

3 µM

Hét

érog

énéi

D

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 21/25

Effet du TBT sur la bactEffet du TBT sur la bactéérie rie E.coli TBT3E.coli TBT3

Effet de TBT sur la bactérie : sucres, lipideszone spectrale 900-1200 cm-1

3 classes :classe 1 : pas d’effet de TBT

CTBT < 1 µM

classe 2 : classification en fonction de la concentration1 µM < CTBT < 5 µM

classe 3 : effet de saturation, pas de discriminationCTBT > 5 µM

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 22/25

ConclusionConclusion

Caractérisation spectroscopique des bioéléments

Etude en fonction du tempsClassification en fonction de l’état physiologique

Evolution au niveau de la composition chimique : protéinesEtude préliminaire pour une caractérisation des bactéries immobilisées

Effet du TBT sur la bactérie E.Coli TBT3Evolution au niveau des sucres (carbohydrates) et lipides

Classification en fonction de la concentration en TBTEffet de seuil : à partir de CTBT = 3 µM

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 23/25

PerspectivesPerspectives

Caractérisation des bactéries immobilisées Améliorer les conditions d’immobilisation

Durée de vie des bioéléments, leur viabilité,...etc

Suivre l’effet du TBT sur E.coli TBT3 au cours du tempsComprendre la réaction entre toxique et bactérie

Déterminer le seuil de détection

Mise en œuvre du Raman SERS Développement des biocapteurs multicanaux

surfaces actives SERS

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 24/25

MISE EN MISE EN ŒŒUVRE DU RAMAN SERS SUR UVRE DU RAMAN SERS SUR VIBRIO HARVEYIVIBRIO HARVEYI

40000

30000

20000

10000

Intensity (a.u.)

800 1000 1200 1400 1600 1800Wavenumber (cm-1)

Amplification notable du signal, gamme 1200-1400 cm-1

amides

SERS SERS

classiqueclassique

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Colloque GFSV – 25-27 janvier 2006 − 25/25

Merci de votre attentionMerci de votre attention