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1 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Maacutester en Microbiota Probioacuteticos y Prebioacuteticos
Anaacutelisis y caracterizacioacuten
metagenoacutemica de la microbiota
intestinal en nintildeos con PIMS post-
COVID-19 Estudio exploratorio
Dr Christian Boggio Marzet
Tutor Dr Guillermo Alvarez Calatayud
Trabajo Fin de Maacutester - Antildeo 2021
2 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
INDICE
1INTRODUCCIOacuteN PAacuteG 3
2JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA PAacuteG 5
3MARCO TEOacuteRICO PAacuteG 7
4HIPOacuteTESIS PAacuteG 11
5OBJETIVOS PAacuteG 11
6METODOLOGIacuteA PAacuteG 12
7CRITERIOS DE INCLUSIOacuteNEXCLUSIOacuteN PAacuteG 13
8DEFINICIOacuteN DE VARIABLES PAacuteG 16
9RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PAacuteG 18
10ANAacuteLSIS ESTADIacuteSTICO PAacuteG 23
11BIBLIOGRAFIacuteA PAacuteG 24
3 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
INTRODUCCIOacuteN
Desde el inicio de la pandemia algunos nintildeos y adolescentes desarrollaron un
siacutendrome inflamatorio sisteacutemico asociado temporalmente con la infeccioacuten por SARSCoV-2
Este siacutendrome hiper inflamatorio observado en muchos casos entre las 2 a 6 semanas luego
de la infeccioacuten por SARS-CoV-2 recibe el nombre de Siacutendrome Inflamatorio Multisisteacutemico
pediaacutetrico - Asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) o Siacutendrome
Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
La presentacioacuten cliacutenica es variada observaacutendose caracteriacutesticas de Enfermedad de
Kawasaki (completo o incompleto) Sindrome de shock toacutexico Sindrome hemofagociacutetico
secundario o siacutendrome de activacioacuten macrofaacutegica
Estas enfermedades inflamatorias multisisteacutemicas son trastornos emergentes que
resultan de una respuesta inusual a la infeccioacuten por SARS-CoV-2 que estaacute mediada por los
sistemas inmunoloacutegicos innatos y adquiridos del hueacutesped
Existen marcadores bioloacutegicos del proceso inflamatorio que se utilizan para
diagnoacutestico Elevacioacuten de ERS PCR neutrofilia ferritina troponina BNP fibrinoacutegeno
diacutemero D pruebas de funcioacuten hepaacutetica y marcadores sanguiacuteneos convencionales Tambieacuten se
ha observado hipoalbuminemia y prolongacioacuten del RIN Estos son indicadores confiables de
la intensidad del proceso inflamatorio y vuelta a la normalidad a medida que cede la
inflamacioacuten
A su vez hay paraacutemetros sencillos para evaluar la mejoriacutea cliacutenica como la necesidad
de oxigenoterapia inotroacutepicos cuidados intensivos u otro soporte
El PIMS es una nueva entidad que tiene una baja prevalencia pero conlleva un riesgo
importante de complicaciones internaciones de alta complejidad y secuelas desconocidas a
4 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
largo plazo El pronoacutestico actual del PIMS-ST es bueno con reportes de baja mortalidad
aunque su reconocimiento tardiacuteo podriacutea empeorar los resultados Puede requerir el ingreso en
cuidados intensivos y el uso de recursos meacutedicos que ocasionalmente se encuentren limitados
en hospitales generales
Aunque COVID-19 es principalmente una enfermedad respiratoria existe una
creciente evidencia que sugiere que el tracto gastrointestinal estaacute involucrado en esta
enfermedad La composicioacuten del microbioma intestinal se altera en pacientes con COVID-
19 y la composicioacuten perturbada se correlaciona con la gravedad de la enfermedad
Varias liacuteneas de evidencia como la replicacioacuten del SARS-CoV-2 en enterocitos
humanos la deteccioacuten de virus en muestras fecales y la composicioacuten alterada de la microbiota
intestinal en pacientes con COVID-19 sugieren la participacioacuten del tracto GI
La composicioacuten de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 concuerda con
la gravedad de la enfermedad y la magnitud de las concentraciones plasmaacuteticas de varias
citocinas inflamatorias quimiocinas y marcadores sanguiacuteneos de dantildeo tisular En un estudio
realizado por Yeoh et al los pacientes con COVID-19 presentaban disminucioacuten de bacterias
intestinales con potencial inmunomodulador como Faecalibacterium prausnitzii
Eubacterium rectale y varias especies de bifidobacterias Tambieacuten se demostroacute que la
composicioacuten disbioacutetica de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 persiste
despueacutes de la eliminacioacuten del virus
Estos hallazgos sugieren que la peacuterdida en nuacutemero de bacterias intestinales
inmunomoduladoras contribuye a la gravedad de la enfermedad por COVID-19 Se ha
postulado que la microbiota intestinal disbioacutetica que persiste incluso despueacutes de la resolucioacuten
de la enfermedad podriacutea ser un factor en el desarrollo de siacutentomas persistentes yo siacutendromes
5 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de inflamacioacuten multisisteacutemica que ocurren en algunos pacientes despueacutes de la eliminacioacuten del
virus
La restitucioacuten de entornos bacterianos beneacuteficos perdidos durante la infeccioacuten por
COVID-19 podriacutea servir como una viacutea novedosa para mitigar la enfermedad grave lo que
subraya la importancia de controlar la microbiota intestinal de los pacientes durante y despueacutes
del COVID-19
JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA
Desde el inicio del PIMS y en verdad desde el inicio de la pandemia ha habido en la
comunidad meacutedica y cientiacutefica un profundo intereacutes en conocer maacutes acerca de esta entidad por
su importancia y su impacto en la salud de la poblacioacuten a nivel mundial Ha sido un ejemplo
como la comunidad cientiacutefica se ha comunicado y ha actuado de forma solidaria en la
buacutesqueda del conocimiento
El Hospital Garrahan centro asociado para la realizacioacuten de este estudio y centro
pediaacutetrico de referencia estaacute preparado para abordar la complejidad que requiere esta
patologiacutea y se encuentra actualmente involucrado y comprometido en la investigacioacuten de esta
entidad mediante un protocolo madre inicial que involucra multiples especialidades y
permitiraacute conocer maacutes sobre la entidad su evolucioacuten y pronoacutestico
Si bien se ha visto que los pacientes evolucionan favorablemente con los tratamientos
instaurados hasta la fecha auacuten hay numerosos aspectos sobre su fisiopatologiacutea etiologiacutea y
seguimiento a largo plazo que aun desconocemos
Sabemos que la microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos
principalmente bacterias alojadas a lo largo del tracto intestinal donde cumplen un efecto
6 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
barrera frente a posibles patoacutegenos y a la vez modulan la respuesta inmunoloacutegica del
intestino Los viacutenculos entre el SARS-CoV-2 y el sistema digestivo particularmente sobre
coacutemo interactuacutea el virus con la microbiota intestinal es un interrogante que estaacute comenzando
a estudiarse a nivel mundial y plantea la necesidad e intereacutes de examinar el rol y
comportamiento de la microbiota en la evolucioacuten de dicha infeccioacuten viral
Esta nueva liacutenea de investigacioacuten estaacute focalizada en conocer la microbiota y el
microbioma intestinal de pacientes con diagnoacutestico de PIMS y compararlo con nintildeos sanos
Se trata de un trabajo original ya que no hay publicaciones a la fecha que investiguen
esos aspectos que surgen de la necesidad de responder interrogantes que aun no conocemos
si realmente existe una composicioacuten diferente de microbiota intestinal en estos pacientes con
un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) En este sentido en lo que respecta al
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma humano el presente proyecto propone un abordaje teacutecnico y cientiacutefico completo
dentro del equipo de trabajo que lidera el mismo Dicho abordaje end-to-end contempla todos
los pasos requeridos desde la recoleccioacuten de muestras de materia fecal con recipientes
especialmente disentildeados para tal fin pasando por todo el procesamiento y preparacioacuten de
bibliotecas genoacutemicas hasta el post-procesamiento luego de la secuenciacioacuten anaacutelisis e
interpretacioacuten de los resultados de microbiota (taxonomiacutea y abundancias de microbios) y
microbioma (para anaacutelisis de posibles rutas metaboacutelicas que se esteacuten expresando)
El resultado de esta investigacioacuten podriacutea mejorar la atencioacuten de nuestros pacientes
colaborando con la generacioacuten de conocimiento de toda la comunidad cientiacutefica y en general
Los resultados obtenidos a partir de este trabajo exploratorio podraacuten demostrar el
estado de ldquosaludrdquo intestinal de estos pacientes PIMS y abriraacuten nuevas liacuteneas de investigacioacuten
7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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2 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
INDICE
1INTRODUCCIOacuteN PAacuteG 3
2JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA PAacuteG 5
3MARCO TEOacuteRICO PAacuteG 7
4HIPOacuteTESIS PAacuteG 11
5OBJETIVOS PAacuteG 11
6METODOLOGIacuteA PAacuteG 12
7CRITERIOS DE INCLUSIOacuteNEXCLUSIOacuteN PAacuteG 13
8DEFINICIOacuteN DE VARIABLES PAacuteG 16
9RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS PAacuteG 18
10ANAacuteLSIS ESTADIacuteSTICO PAacuteG 23
11BIBLIOGRAFIacuteA PAacuteG 24
3 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
INTRODUCCIOacuteN
Desde el inicio de la pandemia algunos nintildeos y adolescentes desarrollaron un
siacutendrome inflamatorio sisteacutemico asociado temporalmente con la infeccioacuten por SARSCoV-2
Este siacutendrome hiper inflamatorio observado en muchos casos entre las 2 a 6 semanas luego
de la infeccioacuten por SARS-CoV-2 recibe el nombre de Siacutendrome Inflamatorio Multisisteacutemico
pediaacutetrico - Asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) o Siacutendrome
Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
La presentacioacuten cliacutenica es variada observaacutendose caracteriacutesticas de Enfermedad de
Kawasaki (completo o incompleto) Sindrome de shock toacutexico Sindrome hemofagociacutetico
secundario o siacutendrome de activacioacuten macrofaacutegica
Estas enfermedades inflamatorias multisisteacutemicas son trastornos emergentes que
resultan de una respuesta inusual a la infeccioacuten por SARS-CoV-2 que estaacute mediada por los
sistemas inmunoloacutegicos innatos y adquiridos del hueacutesped
Existen marcadores bioloacutegicos del proceso inflamatorio que se utilizan para
diagnoacutestico Elevacioacuten de ERS PCR neutrofilia ferritina troponina BNP fibrinoacutegeno
diacutemero D pruebas de funcioacuten hepaacutetica y marcadores sanguiacuteneos convencionales Tambieacuten se
ha observado hipoalbuminemia y prolongacioacuten del RIN Estos son indicadores confiables de
la intensidad del proceso inflamatorio y vuelta a la normalidad a medida que cede la
inflamacioacuten
A su vez hay paraacutemetros sencillos para evaluar la mejoriacutea cliacutenica como la necesidad
de oxigenoterapia inotroacutepicos cuidados intensivos u otro soporte
El PIMS es una nueva entidad que tiene una baja prevalencia pero conlleva un riesgo
importante de complicaciones internaciones de alta complejidad y secuelas desconocidas a
4 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
largo plazo El pronoacutestico actual del PIMS-ST es bueno con reportes de baja mortalidad
aunque su reconocimiento tardiacuteo podriacutea empeorar los resultados Puede requerir el ingreso en
cuidados intensivos y el uso de recursos meacutedicos que ocasionalmente se encuentren limitados
en hospitales generales
Aunque COVID-19 es principalmente una enfermedad respiratoria existe una
creciente evidencia que sugiere que el tracto gastrointestinal estaacute involucrado en esta
enfermedad La composicioacuten del microbioma intestinal se altera en pacientes con COVID-
19 y la composicioacuten perturbada se correlaciona con la gravedad de la enfermedad
Varias liacuteneas de evidencia como la replicacioacuten del SARS-CoV-2 en enterocitos
humanos la deteccioacuten de virus en muestras fecales y la composicioacuten alterada de la microbiota
intestinal en pacientes con COVID-19 sugieren la participacioacuten del tracto GI
La composicioacuten de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 concuerda con
la gravedad de la enfermedad y la magnitud de las concentraciones plasmaacuteticas de varias
citocinas inflamatorias quimiocinas y marcadores sanguiacuteneos de dantildeo tisular En un estudio
realizado por Yeoh et al los pacientes con COVID-19 presentaban disminucioacuten de bacterias
intestinales con potencial inmunomodulador como Faecalibacterium prausnitzii
Eubacterium rectale y varias especies de bifidobacterias Tambieacuten se demostroacute que la
composicioacuten disbioacutetica de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 persiste
despueacutes de la eliminacioacuten del virus
Estos hallazgos sugieren que la peacuterdida en nuacutemero de bacterias intestinales
inmunomoduladoras contribuye a la gravedad de la enfermedad por COVID-19 Se ha
postulado que la microbiota intestinal disbioacutetica que persiste incluso despueacutes de la resolucioacuten
de la enfermedad podriacutea ser un factor en el desarrollo de siacutentomas persistentes yo siacutendromes
5 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de inflamacioacuten multisisteacutemica que ocurren en algunos pacientes despueacutes de la eliminacioacuten del
virus
La restitucioacuten de entornos bacterianos beneacuteficos perdidos durante la infeccioacuten por
COVID-19 podriacutea servir como una viacutea novedosa para mitigar la enfermedad grave lo que
subraya la importancia de controlar la microbiota intestinal de los pacientes durante y despueacutes
del COVID-19
JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA
Desde el inicio del PIMS y en verdad desde el inicio de la pandemia ha habido en la
comunidad meacutedica y cientiacutefica un profundo intereacutes en conocer maacutes acerca de esta entidad por
su importancia y su impacto en la salud de la poblacioacuten a nivel mundial Ha sido un ejemplo
como la comunidad cientiacutefica se ha comunicado y ha actuado de forma solidaria en la
buacutesqueda del conocimiento
El Hospital Garrahan centro asociado para la realizacioacuten de este estudio y centro
pediaacutetrico de referencia estaacute preparado para abordar la complejidad que requiere esta
patologiacutea y se encuentra actualmente involucrado y comprometido en la investigacioacuten de esta
entidad mediante un protocolo madre inicial que involucra multiples especialidades y
permitiraacute conocer maacutes sobre la entidad su evolucioacuten y pronoacutestico
Si bien se ha visto que los pacientes evolucionan favorablemente con los tratamientos
instaurados hasta la fecha auacuten hay numerosos aspectos sobre su fisiopatologiacutea etiologiacutea y
seguimiento a largo plazo que aun desconocemos
Sabemos que la microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos
principalmente bacterias alojadas a lo largo del tracto intestinal donde cumplen un efecto
6 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
barrera frente a posibles patoacutegenos y a la vez modulan la respuesta inmunoloacutegica del
intestino Los viacutenculos entre el SARS-CoV-2 y el sistema digestivo particularmente sobre
coacutemo interactuacutea el virus con la microbiota intestinal es un interrogante que estaacute comenzando
a estudiarse a nivel mundial y plantea la necesidad e intereacutes de examinar el rol y
comportamiento de la microbiota en la evolucioacuten de dicha infeccioacuten viral
Esta nueva liacutenea de investigacioacuten estaacute focalizada en conocer la microbiota y el
microbioma intestinal de pacientes con diagnoacutestico de PIMS y compararlo con nintildeos sanos
Se trata de un trabajo original ya que no hay publicaciones a la fecha que investiguen
esos aspectos que surgen de la necesidad de responder interrogantes que aun no conocemos
si realmente existe una composicioacuten diferente de microbiota intestinal en estos pacientes con
un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) En este sentido en lo que respecta al
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma humano el presente proyecto propone un abordaje teacutecnico y cientiacutefico completo
dentro del equipo de trabajo que lidera el mismo Dicho abordaje end-to-end contempla todos
los pasos requeridos desde la recoleccioacuten de muestras de materia fecal con recipientes
especialmente disentildeados para tal fin pasando por todo el procesamiento y preparacioacuten de
bibliotecas genoacutemicas hasta el post-procesamiento luego de la secuenciacioacuten anaacutelisis e
interpretacioacuten de los resultados de microbiota (taxonomiacutea y abundancias de microbios) y
microbioma (para anaacutelisis de posibles rutas metaboacutelicas que se esteacuten expresando)
El resultado de esta investigacioacuten podriacutea mejorar la atencioacuten de nuestros pacientes
colaborando con la generacioacuten de conocimiento de toda la comunidad cientiacutefica y en general
Los resultados obtenidos a partir de este trabajo exploratorio podraacuten demostrar el
estado de ldquosaludrdquo intestinal de estos pacientes PIMS y abriraacuten nuevas liacuteneas de investigacioacuten
7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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3 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
INTRODUCCIOacuteN
Desde el inicio de la pandemia algunos nintildeos y adolescentes desarrollaron un
siacutendrome inflamatorio sisteacutemico asociado temporalmente con la infeccioacuten por SARSCoV-2
Este siacutendrome hiper inflamatorio observado en muchos casos entre las 2 a 6 semanas luego
de la infeccioacuten por SARS-CoV-2 recibe el nombre de Siacutendrome Inflamatorio Multisisteacutemico
pediaacutetrico - Asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) o Siacutendrome
Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
La presentacioacuten cliacutenica es variada observaacutendose caracteriacutesticas de Enfermedad de
Kawasaki (completo o incompleto) Sindrome de shock toacutexico Sindrome hemofagociacutetico
secundario o siacutendrome de activacioacuten macrofaacutegica
Estas enfermedades inflamatorias multisisteacutemicas son trastornos emergentes que
resultan de una respuesta inusual a la infeccioacuten por SARS-CoV-2 que estaacute mediada por los
sistemas inmunoloacutegicos innatos y adquiridos del hueacutesped
Existen marcadores bioloacutegicos del proceso inflamatorio que se utilizan para
diagnoacutestico Elevacioacuten de ERS PCR neutrofilia ferritina troponina BNP fibrinoacutegeno
diacutemero D pruebas de funcioacuten hepaacutetica y marcadores sanguiacuteneos convencionales Tambieacuten se
ha observado hipoalbuminemia y prolongacioacuten del RIN Estos son indicadores confiables de
la intensidad del proceso inflamatorio y vuelta a la normalidad a medida que cede la
inflamacioacuten
A su vez hay paraacutemetros sencillos para evaluar la mejoriacutea cliacutenica como la necesidad
de oxigenoterapia inotroacutepicos cuidados intensivos u otro soporte
El PIMS es una nueva entidad que tiene una baja prevalencia pero conlleva un riesgo
importante de complicaciones internaciones de alta complejidad y secuelas desconocidas a
4 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
largo plazo El pronoacutestico actual del PIMS-ST es bueno con reportes de baja mortalidad
aunque su reconocimiento tardiacuteo podriacutea empeorar los resultados Puede requerir el ingreso en
cuidados intensivos y el uso de recursos meacutedicos que ocasionalmente se encuentren limitados
en hospitales generales
Aunque COVID-19 es principalmente una enfermedad respiratoria existe una
creciente evidencia que sugiere que el tracto gastrointestinal estaacute involucrado en esta
enfermedad La composicioacuten del microbioma intestinal se altera en pacientes con COVID-
19 y la composicioacuten perturbada se correlaciona con la gravedad de la enfermedad
Varias liacuteneas de evidencia como la replicacioacuten del SARS-CoV-2 en enterocitos
humanos la deteccioacuten de virus en muestras fecales y la composicioacuten alterada de la microbiota
intestinal en pacientes con COVID-19 sugieren la participacioacuten del tracto GI
La composicioacuten de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 concuerda con
la gravedad de la enfermedad y la magnitud de las concentraciones plasmaacuteticas de varias
citocinas inflamatorias quimiocinas y marcadores sanguiacuteneos de dantildeo tisular En un estudio
realizado por Yeoh et al los pacientes con COVID-19 presentaban disminucioacuten de bacterias
intestinales con potencial inmunomodulador como Faecalibacterium prausnitzii
Eubacterium rectale y varias especies de bifidobacterias Tambieacuten se demostroacute que la
composicioacuten disbioacutetica de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 persiste
despueacutes de la eliminacioacuten del virus
Estos hallazgos sugieren que la peacuterdida en nuacutemero de bacterias intestinales
inmunomoduladoras contribuye a la gravedad de la enfermedad por COVID-19 Se ha
postulado que la microbiota intestinal disbioacutetica que persiste incluso despueacutes de la resolucioacuten
de la enfermedad podriacutea ser un factor en el desarrollo de siacutentomas persistentes yo siacutendromes
5 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de inflamacioacuten multisisteacutemica que ocurren en algunos pacientes despueacutes de la eliminacioacuten del
virus
La restitucioacuten de entornos bacterianos beneacuteficos perdidos durante la infeccioacuten por
COVID-19 podriacutea servir como una viacutea novedosa para mitigar la enfermedad grave lo que
subraya la importancia de controlar la microbiota intestinal de los pacientes durante y despueacutes
del COVID-19
JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA
Desde el inicio del PIMS y en verdad desde el inicio de la pandemia ha habido en la
comunidad meacutedica y cientiacutefica un profundo intereacutes en conocer maacutes acerca de esta entidad por
su importancia y su impacto en la salud de la poblacioacuten a nivel mundial Ha sido un ejemplo
como la comunidad cientiacutefica se ha comunicado y ha actuado de forma solidaria en la
buacutesqueda del conocimiento
El Hospital Garrahan centro asociado para la realizacioacuten de este estudio y centro
pediaacutetrico de referencia estaacute preparado para abordar la complejidad que requiere esta
patologiacutea y se encuentra actualmente involucrado y comprometido en la investigacioacuten de esta
entidad mediante un protocolo madre inicial que involucra multiples especialidades y
permitiraacute conocer maacutes sobre la entidad su evolucioacuten y pronoacutestico
Si bien se ha visto que los pacientes evolucionan favorablemente con los tratamientos
instaurados hasta la fecha auacuten hay numerosos aspectos sobre su fisiopatologiacutea etiologiacutea y
seguimiento a largo plazo que aun desconocemos
Sabemos que la microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos
principalmente bacterias alojadas a lo largo del tracto intestinal donde cumplen un efecto
6 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
barrera frente a posibles patoacutegenos y a la vez modulan la respuesta inmunoloacutegica del
intestino Los viacutenculos entre el SARS-CoV-2 y el sistema digestivo particularmente sobre
coacutemo interactuacutea el virus con la microbiota intestinal es un interrogante que estaacute comenzando
a estudiarse a nivel mundial y plantea la necesidad e intereacutes de examinar el rol y
comportamiento de la microbiota en la evolucioacuten de dicha infeccioacuten viral
Esta nueva liacutenea de investigacioacuten estaacute focalizada en conocer la microbiota y el
microbioma intestinal de pacientes con diagnoacutestico de PIMS y compararlo con nintildeos sanos
Se trata de un trabajo original ya que no hay publicaciones a la fecha que investiguen
esos aspectos que surgen de la necesidad de responder interrogantes que aun no conocemos
si realmente existe una composicioacuten diferente de microbiota intestinal en estos pacientes con
un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) En este sentido en lo que respecta al
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma humano el presente proyecto propone un abordaje teacutecnico y cientiacutefico completo
dentro del equipo de trabajo que lidera el mismo Dicho abordaje end-to-end contempla todos
los pasos requeridos desde la recoleccioacuten de muestras de materia fecal con recipientes
especialmente disentildeados para tal fin pasando por todo el procesamiento y preparacioacuten de
bibliotecas genoacutemicas hasta el post-procesamiento luego de la secuenciacioacuten anaacutelisis e
interpretacioacuten de los resultados de microbiota (taxonomiacutea y abundancias de microbios) y
microbioma (para anaacutelisis de posibles rutas metaboacutelicas que se esteacuten expresando)
El resultado de esta investigacioacuten podriacutea mejorar la atencioacuten de nuestros pacientes
colaborando con la generacioacuten de conocimiento de toda la comunidad cientiacutefica y en general
Los resultados obtenidos a partir de este trabajo exploratorio podraacuten demostrar el
estado de ldquosaludrdquo intestinal de estos pacientes PIMS y abriraacuten nuevas liacuteneas de investigacioacuten
7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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4 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
largo plazo El pronoacutestico actual del PIMS-ST es bueno con reportes de baja mortalidad
aunque su reconocimiento tardiacuteo podriacutea empeorar los resultados Puede requerir el ingreso en
cuidados intensivos y el uso de recursos meacutedicos que ocasionalmente se encuentren limitados
en hospitales generales
Aunque COVID-19 es principalmente una enfermedad respiratoria existe una
creciente evidencia que sugiere que el tracto gastrointestinal estaacute involucrado en esta
enfermedad La composicioacuten del microbioma intestinal se altera en pacientes con COVID-
19 y la composicioacuten perturbada se correlaciona con la gravedad de la enfermedad
Varias liacuteneas de evidencia como la replicacioacuten del SARS-CoV-2 en enterocitos
humanos la deteccioacuten de virus en muestras fecales y la composicioacuten alterada de la microbiota
intestinal en pacientes con COVID-19 sugieren la participacioacuten del tracto GI
La composicioacuten de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 concuerda con
la gravedad de la enfermedad y la magnitud de las concentraciones plasmaacuteticas de varias
citocinas inflamatorias quimiocinas y marcadores sanguiacuteneos de dantildeo tisular En un estudio
realizado por Yeoh et al los pacientes con COVID-19 presentaban disminucioacuten de bacterias
intestinales con potencial inmunomodulador como Faecalibacterium prausnitzii
Eubacterium rectale y varias especies de bifidobacterias Tambieacuten se demostroacute que la
composicioacuten disbioacutetica de la microbiota intestinal en pacientes con COVID-19 persiste
despueacutes de la eliminacioacuten del virus
Estos hallazgos sugieren que la peacuterdida en nuacutemero de bacterias intestinales
inmunomoduladoras contribuye a la gravedad de la enfermedad por COVID-19 Se ha
postulado que la microbiota intestinal disbioacutetica que persiste incluso despueacutes de la resolucioacuten
de la enfermedad podriacutea ser un factor en el desarrollo de siacutentomas persistentes yo siacutendromes
5 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de inflamacioacuten multisisteacutemica que ocurren en algunos pacientes despueacutes de la eliminacioacuten del
virus
La restitucioacuten de entornos bacterianos beneacuteficos perdidos durante la infeccioacuten por
COVID-19 podriacutea servir como una viacutea novedosa para mitigar la enfermedad grave lo que
subraya la importancia de controlar la microbiota intestinal de los pacientes durante y despueacutes
del COVID-19
JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA
Desde el inicio del PIMS y en verdad desde el inicio de la pandemia ha habido en la
comunidad meacutedica y cientiacutefica un profundo intereacutes en conocer maacutes acerca de esta entidad por
su importancia y su impacto en la salud de la poblacioacuten a nivel mundial Ha sido un ejemplo
como la comunidad cientiacutefica se ha comunicado y ha actuado de forma solidaria en la
buacutesqueda del conocimiento
El Hospital Garrahan centro asociado para la realizacioacuten de este estudio y centro
pediaacutetrico de referencia estaacute preparado para abordar la complejidad que requiere esta
patologiacutea y se encuentra actualmente involucrado y comprometido en la investigacioacuten de esta
entidad mediante un protocolo madre inicial que involucra multiples especialidades y
permitiraacute conocer maacutes sobre la entidad su evolucioacuten y pronoacutestico
Si bien se ha visto que los pacientes evolucionan favorablemente con los tratamientos
instaurados hasta la fecha auacuten hay numerosos aspectos sobre su fisiopatologiacutea etiologiacutea y
seguimiento a largo plazo que aun desconocemos
Sabemos que la microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos
principalmente bacterias alojadas a lo largo del tracto intestinal donde cumplen un efecto
6 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
barrera frente a posibles patoacutegenos y a la vez modulan la respuesta inmunoloacutegica del
intestino Los viacutenculos entre el SARS-CoV-2 y el sistema digestivo particularmente sobre
coacutemo interactuacutea el virus con la microbiota intestinal es un interrogante que estaacute comenzando
a estudiarse a nivel mundial y plantea la necesidad e intereacutes de examinar el rol y
comportamiento de la microbiota en la evolucioacuten de dicha infeccioacuten viral
Esta nueva liacutenea de investigacioacuten estaacute focalizada en conocer la microbiota y el
microbioma intestinal de pacientes con diagnoacutestico de PIMS y compararlo con nintildeos sanos
Se trata de un trabajo original ya que no hay publicaciones a la fecha que investiguen
esos aspectos que surgen de la necesidad de responder interrogantes que aun no conocemos
si realmente existe una composicioacuten diferente de microbiota intestinal en estos pacientes con
un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) En este sentido en lo que respecta al
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma humano el presente proyecto propone un abordaje teacutecnico y cientiacutefico completo
dentro del equipo de trabajo que lidera el mismo Dicho abordaje end-to-end contempla todos
los pasos requeridos desde la recoleccioacuten de muestras de materia fecal con recipientes
especialmente disentildeados para tal fin pasando por todo el procesamiento y preparacioacuten de
bibliotecas genoacutemicas hasta el post-procesamiento luego de la secuenciacioacuten anaacutelisis e
interpretacioacuten de los resultados de microbiota (taxonomiacutea y abundancias de microbios) y
microbioma (para anaacutelisis de posibles rutas metaboacutelicas que se esteacuten expresando)
El resultado de esta investigacioacuten podriacutea mejorar la atencioacuten de nuestros pacientes
colaborando con la generacioacuten de conocimiento de toda la comunidad cientiacutefica y en general
Los resultados obtenidos a partir de este trabajo exploratorio podraacuten demostrar el
estado de ldquosaludrdquo intestinal de estos pacientes PIMS y abriraacuten nuevas liacuteneas de investigacioacuten
7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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5 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de inflamacioacuten multisisteacutemica que ocurren en algunos pacientes despueacutes de la eliminacioacuten del
virus
La restitucioacuten de entornos bacterianos beneacuteficos perdidos durante la infeccioacuten por
COVID-19 podriacutea servir como una viacutea novedosa para mitigar la enfermedad grave lo que
subraya la importancia de controlar la microbiota intestinal de los pacientes durante y despueacutes
del COVID-19
JUSTIFICACIOacuteN DE LA RELEVANCIA DEL TEMA
Desde el inicio del PIMS y en verdad desde el inicio de la pandemia ha habido en la
comunidad meacutedica y cientiacutefica un profundo intereacutes en conocer maacutes acerca de esta entidad por
su importancia y su impacto en la salud de la poblacioacuten a nivel mundial Ha sido un ejemplo
como la comunidad cientiacutefica se ha comunicado y ha actuado de forma solidaria en la
buacutesqueda del conocimiento
El Hospital Garrahan centro asociado para la realizacioacuten de este estudio y centro
pediaacutetrico de referencia estaacute preparado para abordar la complejidad que requiere esta
patologiacutea y se encuentra actualmente involucrado y comprometido en la investigacioacuten de esta
entidad mediante un protocolo madre inicial que involucra multiples especialidades y
permitiraacute conocer maacutes sobre la entidad su evolucioacuten y pronoacutestico
Si bien se ha visto que los pacientes evolucionan favorablemente con los tratamientos
instaurados hasta la fecha auacuten hay numerosos aspectos sobre su fisiopatologiacutea etiologiacutea y
seguimiento a largo plazo que aun desconocemos
Sabemos que la microbiota intestinal es el conjunto de microorganismos
principalmente bacterias alojadas a lo largo del tracto intestinal donde cumplen un efecto
6 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
barrera frente a posibles patoacutegenos y a la vez modulan la respuesta inmunoloacutegica del
intestino Los viacutenculos entre el SARS-CoV-2 y el sistema digestivo particularmente sobre
coacutemo interactuacutea el virus con la microbiota intestinal es un interrogante que estaacute comenzando
a estudiarse a nivel mundial y plantea la necesidad e intereacutes de examinar el rol y
comportamiento de la microbiota en la evolucioacuten de dicha infeccioacuten viral
Esta nueva liacutenea de investigacioacuten estaacute focalizada en conocer la microbiota y el
microbioma intestinal de pacientes con diagnoacutestico de PIMS y compararlo con nintildeos sanos
Se trata de un trabajo original ya que no hay publicaciones a la fecha que investiguen
esos aspectos que surgen de la necesidad de responder interrogantes que aun no conocemos
si realmente existe una composicioacuten diferente de microbiota intestinal en estos pacientes con
un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) En este sentido en lo que respecta al
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma humano el presente proyecto propone un abordaje teacutecnico y cientiacutefico completo
dentro del equipo de trabajo que lidera el mismo Dicho abordaje end-to-end contempla todos
los pasos requeridos desde la recoleccioacuten de muestras de materia fecal con recipientes
especialmente disentildeados para tal fin pasando por todo el procesamiento y preparacioacuten de
bibliotecas genoacutemicas hasta el post-procesamiento luego de la secuenciacioacuten anaacutelisis e
interpretacioacuten de los resultados de microbiota (taxonomiacutea y abundancias de microbios) y
microbioma (para anaacutelisis de posibles rutas metaboacutelicas que se esteacuten expresando)
El resultado de esta investigacioacuten podriacutea mejorar la atencioacuten de nuestros pacientes
colaborando con la generacioacuten de conocimiento de toda la comunidad cientiacutefica y en general
Los resultados obtenidos a partir de este trabajo exploratorio podraacuten demostrar el
estado de ldquosaludrdquo intestinal de estos pacientes PIMS y abriraacuten nuevas liacuteneas de investigacioacuten
7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
6 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
barrera frente a posibles patoacutegenos y a la vez modulan la respuesta inmunoloacutegica del
intestino Los viacutenculos entre el SARS-CoV-2 y el sistema digestivo particularmente sobre
coacutemo interactuacutea el virus con la microbiota intestinal es un interrogante que estaacute comenzando
a estudiarse a nivel mundial y plantea la necesidad e intereacutes de examinar el rol y
comportamiento de la microbiota en la evolucioacuten de dicha infeccioacuten viral
Esta nueva liacutenea de investigacioacuten estaacute focalizada en conocer la microbiota y el
microbioma intestinal de pacientes con diagnoacutestico de PIMS y compararlo con nintildeos sanos
Se trata de un trabajo original ya que no hay publicaciones a la fecha que investiguen
esos aspectos que surgen de la necesidad de responder interrogantes que aun no conocemos
si realmente existe una composicioacuten diferente de microbiota intestinal en estos pacientes con
un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) En este sentido en lo que respecta al
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma humano el presente proyecto propone un abordaje teacutecnico y cientiacutefico completo
dentro del equipo de trabajo que lidera el mismo Dicho abordaje end-to-end contempla todos
los pasos requeridos desde la recoleccioacuten de muestras de materia fecal con recipientes
especialmente disentildeados para tal fin pasando por todo el procesamiento y preparacioacuten de
bibliotecas genoacutemicas hasta el post-procesamiento luego de la secuenciacioacuten anaacutelisis e
interpretacioacuten de los resultados de microbiota (taxonomiacutea y abundancias de microbios) y
microbioma (para anaacutelisis de posibles rutas metaboacutelicas que se esteacuten expresando)
El resultado de esta investigacioacuten podriacutea mejorar la atencioacuten de nuestros pacientes
colaborando con la generacioacuten de conocimiento de toda la comunidad cientiacutefica y en general
Los resultados obtenidos a partir de este trabajo exploratorio podraacuten demostrar el
estado de ldquosaludrdquo intestinal de estos pacientes PIMS y abriraacuten nuevas liacuteneas de investigacioacuten
7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
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7 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
que podraacuten ahondar en profundidad los diferentes mecanismos de accioacuten no soacutelo de la
microbiota sino de sus productos del metabolismo en relacioacuten al SARS-Cov-2
MARCO TEOacuteRICO
La microbiota intestinal humana estaacute formada por maacutes de un billoacuten de
microorganismos en un ecosistema complejo y dinaacutemico que regula el sistema inmunoloacutegico
y toda nuestra fisiologiacutea Firmicutes y Bacteroidetes son predominantes en el intestino
mientras que Proteobacteria Bacteroidetes y Firmicutes predominan en el pulmoacuten Estos
microbios desempentildean funciones muy importantes en el cuerpo incluido el metabolismo
nutricional el desarrollo y la modulacioacuten de la inmunidad asiacute como la defensa contra
patoacutegenos dantildeinos En el tracto gastrointestinal (TGI) la barrera epitelial protege contra la
invasioacuten de microorganismos patoacutegenos y ayuda a mantener la tolerancia a los antiacutegenos
alimentarios mientras que tambieacuten puede estar asociada con funciones inmunes sisteacutemicas y
pulmonares Una vez dantildeada la barrera los microorganismos se trasladan al torrente
sanguiacuteneo o los pulmones y pueden inducir septicemia o siacutendrome de dificultad respiratoria
aguda La interaccioacuten compleja entre el sistema inmunoloacutegico y la microbiota intestinal se
regulan y se apoyan mutuamente ya que entre el 70 y el 80 de las ceacutelulas inmunitarias del
cuerpo estaacuten presentes en el intestino La disbiosis definida como cambios en la microbiota
intestinal que conducen a un desequilibrio microbiano no solo se ha relacionado
estrechamente con la patogeacutenesis de muchas enfermedades inflamatorias sino que tambieacuten
desempentildea un papel fundamental en diversas infecciones Existe evidencia de una interaccioacuten
entre el tracto respiratorio y el TGI o maacutes precisamente entre la microbiota intestinal y los
pulmones y esta conexioacuten se denomina eje intestino-pulmoacuten
8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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8 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Los pacientes con COVID-19 sufren de diferentes manifestaciones cliacutenicas
relacionadas al proceso inflamatorio (fiebre tos mialgia fatiga y neumoniacutea) que pueden
agravarse hasta el siacutendrome de dificultad respiratoria aguda o disfuncioacuten multiorgaacutenica
Varios estudios han demostrado presencia de siacutentomas gastrointestinales durante el curso de
la enfermedad como naacuteuseas voacutemitos diarrea y dolor abdominal Estos siacutentomas pueden
deberse a la infeccioacuten directa de los enterocitos por el SARS-CoV-2 a traveacutes de un fenoacutemeno
del eje intestino-pulmoacuten que involucra el microbioma intestinal y pulmonar o mediante
mecanismos inmunorreguladores Los cambios en la composicioacuten taxonoacutemica y la
disminucioacuten de la diversidad y funcioacuten de la microbiota intestinal pueden afectar la
inmunidad pulmonar asiacute como la inflamacioacuten pulmonar por siacute misma puede alterar la
microbiota pulmonar autoacutectona
Estudios recientes plantearon la hipoacutetesis de que las endotoxinas los metabolitos de la
microbiota las citoquinas y las hormonas del intestino podriacutean llegar al torrente sanguiacuteneo y
al nicho pulmonar en una comunicacioacuten bidireccional entre el intestino y el pulmoacuten El estado
inmunoloacutegico del hueacutesped estaacute influenciado por la microbiota intestinal y puede influir en el
grado de inmunidad a las infecciones virales incluido el SARS-CoV-2
Varios pacientes con COVID-19 presentaron siacutentomas gastrointestinales y las
manifestaciones prolongadas principalmente la diarrea se correlacionaron inversamente con
la disminucioacuten de la riqueza y diversidad de la microbiota asociada con la disregulacioacuten
inmune y el retraso en la eliminacioacuten del SARS-CoV-2 Se especula que la expresioacuten del
receptor ACE-2 que requiere el SARS-CoV-2 para ingresar a las ceacutelulas hueacutesped podriacutea estar
modulada por el microbioma intestinal
Gu y col en China evaluaron la microbiota intestinal de 30 sujetos COVID-19 24
pacientes H1N1 y 30 controles sanos Los sujetos infectados con SARS-CoV-2 tuvieron una
disminucioacuten en la diversidad de la microbiota intestinal en comparacioacuten con los controles con
9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
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9 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
predominio de geacuteneros oportunistas como Actinomyces Rothia Streptococcus y Veillonella
ademaacutes de una disminucioacuten en la abundancia relativa de microbios beneficiosos como los
geacuteneros de Bifidobacterium
Como la disbiosis podriacutea ser un factor esencial en la gravedad de la enfermedad
durante el COVID-19 es esencial mantener un intestino sano Las dietas bajas en fibra y altas
en grasas carbohidratos suelen ser responsables de la disbiosis intestinal y este cambio en la
homeostasis podriacutea ser responsable de una respuesta inmunitaria alterada Se aconseja una
dieta sana y equilibrada rica en cereales cereales integrales legumbres frutas y verduras a
los pacientes de COVID 19 que se encuentren asintomaacuteticos o pacientes con siacutentomas leves o
en cuarentena La correlacioacuten inversa entre el consumo de fibra dieteacutetica y los niveles seacutericos
de proteiacutena C reactiva IL-6 IL-18 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) que son fuertes
citoquinas inflamatorias es la razoacuten principal por la cual enfatizar este tipo de dieta
Hay un nuacutemero creciente de estudios que evaluacutean el efecto de la administracioacuten de
probioacuteticos prebioacuteticos en la reduccioacuten de la incidencia duracioacuten y gravedad de las
infecciones respiratorias virales En vista del conocimiento actual se estaacute investigando la
modulacioacuten de la microbiota como una posible terapia adyuvante para COVID-19 El
potencial uso de probioacuteticos microorganismos vivos que cuando se administran en
cantidades adecuadas confieren un beneficio para la salud del hueacutesped estaacute respaldado por
estudios experimentales metaanaacutelisis y ensayos cliacutenicos sobre virus de influenza rinovirus y
virus sincicial respiratorio Aunque los mecanismos no se han determinado en la infeccioacuten por
SARS-CoV-2 algunas cepas probioacuteticas presentan propiedades antivirales en otros
coronavirus Ademaacutes de prevenir las infecciones de las viacuteas respiratorias inferiores y
superiores los probioacuteticos podriacutean ayudar en el tratamiento de la diarrea asociada con la
infeccioacuten por SARS-CoV-2 en siacute misma o causada por los antibioacuteticos utilizados para tratar
las infecciones pulmonares secundarias La mejora de la microecologiacutea intestinal y el proceso
10 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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de eubiosis mediante la ingesta de probioacuteticos puede promover un sistema inmunoloacutegico
regulado y prevenir una inflamacioacuten excesiva o infecciones secundarias Algunas cepas de
Bifidobacterium Lactobacillus paracasei y L rhamnosus reducen la aparicioacuten de infecciones
respiratorias como H1N1 H3N2 y H5N1 al potenciar las respuestas inmunitarias de la
vacuna Esta mejora de las interacciones entre la microbiota y el sistema inmunoloacutegico de las
mucosas tambieacuten podriacutea beneficiar las respuestas inmunitarias a la vacunacioacuten contra el virus
SARS-CoV-2 Sin embargo aunque se plantea la hipoacutetesis de que la disbiosis o la modulacioacuten
de la microbiota podriacutean afectar potencialmente la eficacia de las vacunas COVID-19 hasta
la fecha no existen estudios publicados sobre la relacioacuten entre la microbiota intestinal y
pulmonar y la vacunacioacuten contra esta infeccioacuten
La microbiota intestinal sana entonces puede controlar la infeccioacuten pulmonar causada
por el SARS-CoV-2 al producir una gran cantidad de ceacutelulas inmunes en comparacioacuten con un
nuacutemero menor de ceacutelulas inmunitarias por disbiosis de la misma Los probioacuteticos y prebioacuteticos
de la dieta son los moduladores cruciales en la regulacioacuten del entorno microbiano intestinal y
podriacutean ser favorables para mantener la homeostasis modificando la infeccioacuten por SARS-
CoV-2 El propoacutesito de los probioacuteticos y otras formas de modular la microbiota intestinal en
COVID-19 exige maacutes exploraciones particularmente ensayos cliacutenicos controlados doble
ciego y aleatorizados que incluyan cohortes maacutes grandes en diferentes edades y cursos de
enfermedad
11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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11 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
HIPOacuteTESIS
Los nintildeos con PIMS tendriacutean un microbioma intestinal desequilibrado (disbioacutetico) La
identificacioacuten de biomarcadores podriacutean predecir la evolucioacuten cliacutenica y esto resulta clave para
ayudar a priorizar a estos pacientes que necesitan un abordaje y tratamiento urgente Por otra
parte evaluar las muestras de hisopado de materia fecal obtenidas de pacientes pediaacutetricos
permitiraacute medir riqueza diversidad y abundancia relativa de bacterias asiacute como anaacutelisis
metagenoacutemico de las muestras
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
bull Caracterizar los perfiles de microbiota y microbioma fecal asociados a nintildeos
con PIMS respecto a nintildeos sanos
OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
bull Enumerar en forma preliminar posibles diferentes perfiles de microbiota y
microbioma en nintildeos sanos y nintildeos con PIMS estratificando por edad y sexo
bull Comparar los perfiles de microbiota y microbioma en nintildeos sanos con los
asociados a nintildeos con PIMS a fin de estudiar las diferencias a nivel de geacuteneros
y especies microbianas
bull Valorar los paraacutemetros cliacutenicos y de gravedad correlacionando el fenotipo de
PIMS y la composicioacuten microbiana
12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
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12 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
METODOLOGIacuteA
Tipo y disentildeo del estudio
Estudio descriptivo prospectivo analiacutetico piloto exploratorio de evaluacioacuten a partir
de muestras de materia fecal
Durante todo el estudio cada paciente soacutelo deberaacute tomar la muestra en una oportunidad
Si el paciente lo desea podraacute solicitar una copia de los resultados de los estudios realizados
los que seraacuten entregados por el investigador posteriormente
Poblacioacuten
Se incluiraacuten pacientes de 3 a 16 antildeos de edad asistidos en el Hospital Garrahan que
cumplan con todos los criterios de inclusioacuten y ninguno de exclusioacuten ingresados desde el 1 de
junio de 2021 al 1 de junio de 2022
Se trataraacute de una muestra consecutiva y seleccionada por conveniencia
La poblacioacuten de nintildeos sanos se tomaraacute siguiendo el mismo grupo etario a partir de
consultorios de salud integral del nintildeo
Por lo tanto la poblacioacuten estaraacute integrada por dos grupos
Grupo 1 pacientes con PIMS de 3 a 16 antildeos de edad
Grupo 2 pacientes control sin patologiacutea de 3 a 16 antildeos de edad
13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
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13 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Tamantildeo de la muestra
Por tratarse de un estudio de tipo piloto con un objetivo primario netamente cientiacutefico
y cliacutenico y con el propoacutesito de obtener informacioacuten de forma sistematizada sin intencioacuten de
generalizar o extrapolar resultados sino maacutes bien de evaluar y caracterizar la microbiota de
los pacientes PIMS se decidioacute la incorporacioacuten de 30 pacientes por grupo de estudio
CRITERIOS DE INCLUSIOacuteN
Todos los nintildeos que cumplan con los siguientes criterios seraacuten considerados elegibles
para este ensayo
1 Nintildeos de 3 a 16 antildeos de edad con diagnoacutestico de Siacutendrome inflamatorio multisisteacutemico
pediaacutetrico - asociado temporalmente con el SARS-CoV-2 (PIMS-TS) de la OMS y CDC
2 Consentimiento informado firmado por el padre tutor o encargado del sujeto en
estudio el meacutedico autorizado y un testigo independiente cuando corresponda
3 Asentimiento informado firmado por el nintildeo en estudio si es mayor de 12 antildeos
CRITERIOS DE EXCLUSIOacuteN
Los sujetos que presenten al menos uno de los siguientes criterios no podraacuten ser
considerados elegibles para el estudio
1 Pacientes identificados con un diagnoacutestico alternativo una vez realizados todos los
estudios iniciales
2 Uso de antibioacuteticos yo corticoides orales entre el uacuteltimo mes y el ingreso
14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
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14 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
3 Presencia de comorbilidades asma alergia inmunodeficiencia primaria
inmunodeficiencia secundaria HIV enfermedad autoinmune artritis idiopaacutetica juvenil
obesidad severa enfermedad pulmonar croacutenica cardiopatiacutea congeacutenita enfermedad renal
croacutenica enfermedad hepaacutetica croacutenica Trastorno neuroloacutegico croacutenico enfermedad de
Kawasaki previa enfermedades neoplaacutesicas anemia drepanociacutetica
4 Imposibilidad de cumplir con los requerimientos del protocolo
Discontinuacioacuten de pacientes
El Investigador podraacute discontinuar la participacioacuten en el estudio de cualquiera de los
pacientes por alguna de las siguientes razones
1 Retiro voluntario del paciente o alguno de sus padrestutores por cualquier razoacuten
2 Incumplimiento de los requerimientos administrativos del protocolo
3 Recibir cualquier otro tratamiento para la enfermedad de base durante el transcurso del
presente protocolo
En el caso en que el paciente retire su consentimiento se deberaacuten registrar las razones
que motivaron tal decisioacuten en la historia cliacutenica y en el FRD
Definicioacuten operativa de variables de estudio y medicioacuten de resultados
Definicioacuten de caso PIMS (preliminar) seguacuten OMS
Nintildeos y adolescentes entre 0 y 19 antildeos con Fiebre ge 3 diacuteas con DOS de los siguientes
criterios
1 Exantema o conjuntivitis bilateral no supurativa yo afectacioacuten mucocutaacutenea
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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and intervention Nat Rev Immunol 202020363ndash74 httpsdoi101038s41577-020-
0311-8
12 Vabret N Britton GJ Gruber C et al Immunology of COVID-19 current state of the
scienceImmunity202052910 41 httpsdoi101016jimmuni202005002
13 Cheung EW Zachariah P Gorelik M et al Multisystem inflammatory syndrome
related to COVID-19 in previously healthy children and adolescents in New York
City JAMA 2020324294 httpsdoi101001jama202010374
14 Verdoni L Mazza A Gervasoni A et al An outbreak of severe Kawasaki-like disease
at the Italian epicentre of the SARS-CoV-2 epidemic an observational cohort study
Lancet 20203951771ndash8 httpsdoi101016S0140-6736(20)31103-X
15 Zuo T Zhang F Lui GCY et al Alterations in gut microbiota of patients with COVID-
19 during time of hospitalization Gastroenterology 2020159944ndash55
httpsdoi101053jgastro202005048
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and dysfunctional immune responses in patients with COVID-19 Gut 202170698-
706
17 Gu S Chen Y Wu Z Chen Y Gao H Lv Feifei Guo L Zhang L Luo R Huang C
Lu H Zheng B Zhang J Yan R Zhang H Jiang H Xu Q Guo J Gong Y Tang L
Li L Alterations of the Gut Microbiota in Patients With Coronavirus Disease 2019 or
26 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
H1N1 Influenza Clinical Infectious Diseases 2020 71(10)2669ndash2678
httpsdoiorg101093cidciaa709
18 Silva Andrade B Siqueira S de Assis Soares WR et al Long-COVID and Post-
COVID Health Complications An Up-to-Date Review on Clinical Conditions and
Their Possible Molecular Mechanisms Viruses 202113(4)700 Published 2021 Apr
18 httpsdoi103390v13040700
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SARS-CoV-2 Paediatr Drugs 2021 Mar23(2)119-129 httpsdoi101007s40272-
020-00435-x
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microbiome and COVID-19 A systematic review PLOS ONE 16(6) e0253293
httpsdoiorg101371journalpone0253293
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COVID-19 JAMA2020 324603doi101001jama202012603
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children a systematic review EClinicalMedicine 2020 26 100527
httpsdoi101016jeclinm202010052
23 Namiki T Hachiya T Tanaka H Sakakibara Y MetaVelvet an extension of Velvet
assembler to de novo metagenome assembly from short sequence reads Nucleic Acids
Research Volume 40 Issue 20 1 November 2012 Page e155
httpsdoiorg101093nargks678
24 Kim M Ligo JG Emad A Farnoud F Milenkovic O Veeravalli VV MetaPar
Metagenomic sequence assembly via iterative reclassification 2013 IEEE Global
Conference on Signal and Information Processing 2013 pp 43-46
httpsdoiorg101109GlobalSIP20136736807
27 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
25 Kanehisa M Goto S Kawashima S Okuno Y Hattori M The KEGG resource for
deciphering the genome Nucleic Acids Research Volume 32 Issue suppl_1 1
January 2004 Pages D277ndashD280 httpsdoiorg101093nargkh063
26 Tatusov RL Fedorova ND Jackson JD et al The COG database an updated
version includes eukaryotes BMC Bioinformatics 4 41 (2003)
httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
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Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
15 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
2 Hipotensioacuten o shock
3 Disfuncioacuten miocaacuterdica pericarditis valvulitis o anomaliacuteas coronarias (datos
ecocardiograacuteficos) yo elevacioacuten de paraacutemetros de dantildeo miocaacuterdico (troponina yo NT-Pro
BNP)
4 Coagulopatiacutea (alteracioacuten TP TTPA fibrinoacutegeno diacutemero D elevado 6X05 FEU (estudios
de adultos)
5 Afectacioacuten gastrointestinal (voacutemitos diarrea o dolor abdominal)
y
bull Elevacioacuten de PCR (gt50 mgL) yo PCT gt 1 ngdl yo Velocidad de Sedimentacioacuten
(ERS)
bull Ninguna otra causa microbiana evidente de inflamacioacuten incluida la sepsis bacteriana
los siacutendromes de choque estafilocoacutecicos o estreptocoacutecicos
bull Evidencia de infeccioacuten COVID-19 (RT-PCR serologiacutea nexo epidemioloacutegico)
NOTA Considerar este siacutendrome en nintildeos con manifestaciones de enfermedad de Kawasaki
tiacutepica o atiacutepica o de siacutendrome de shock toacutexico
Definicioacuten de caso del CDC para el Siacutendrome Inflamatorio multisisteacutemico en nintildeos (MIS-C)
Un individuo menor de 21 antildeos que presenta fiebre (i) evidencia de laboratorio de inflamacioacuten
(ii) y evidencia de enfermedad cliacutenicamente grave que requiera hospitalizacioacuten con afectacioacuten
de oacuterganos multisisteacutemicos (gt 2) (cardiacuteacos renales respiratorios hematoloacutegicos
gastrointestinales dermatoloacutegicos o neuroloacutegicos)
y
16 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
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bull No hay diagnoacutesticos alternativos plausibles
bull Positivo para infeccioacuten por SARS-CoV-2 actual o reciente mediante RT-PCR
serologiacutea o prueba de antiacutegeno o exposicioacuten al COVID-19 dentro de las 4 semanas
anteriores al inicio de los siacutentomas
i Fiebregt 380 degC durante ge24 horas o informe de fiebre subjetiva que dura ge24 horas
ii Incluyendo entre otros uno o maacutes de los siguientes una proteiacutena C reactiva elevada
(PCR) velocidad de sedimentacioacuten de eritrocitos (VSG) fibrinoacutegeno procalcitonina diacutemero
D ferritina aacutecido laacutectico lactatodeshidrogenasa (LDH) o interleucina 6 (IL-6) neutroacutefilos
elevados linfocitos reducidos y albuacutemina baja
Comentarios adicionales
bull Algunas personas pueden cumplir con los criterios totales o parciales de la enfermedad
de Kawasaki pero se deben informar si cumplen la definicioacuten de caso para MIS-C
bull Considerar MIS-C en cualquier muerte pediaacutetrica con evidencia de infeccioacuten por
SARS-CoV-2
DEFINICIOacuteN DE VARIABLES Y SU OPERACIONALIZACIOacuteN
Variables demograacuteficas
bull Fecha de internacioacuten
bull Fecha diagnoacutestico de PIMS
17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
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27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
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17 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Edad (variable cuantitativa expresada en antildeos)
bull Sexo (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Peso (variable cuantitativa expresada en gramos)
bull Talla (variable cuantitativa expresada en centiacutemetros)
bull IMC (variable cuantitativa)
bull Criterio de enrolamiento (serologiacutea PCR)
bull Criterio de inclusioacuten OMSCDC
Variables cliacutenicas
bull Diacuteas de fiebre al diagnoacutestico (variable cuantitativa)
bull Voacutemitos diarrea dolor abdominal otros siacutentomas gastrointestinales
bull Presencia de Shock al ingreso (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Tipo de Shock (variable categoacuterica dicotoacutemica)
Variables de laboratorio
bull Recuento de linfocitos y neutroacutefilos (variable cuantitativa)
bull Valores de hemoglobina al ingreso albumina (variable cuantitativa)
bull PCR y otros reactantes de fase aguda (variable cuantitativa)
bull Rescate de geacutermenes en Coprocultivo viroloacutegico en materia fecal (variable categoacuterica
dicotoacutemica)
bull Serologiacuteas virales (variable categoacuterica dicotoacutemica)
bull Fenotipo de presentacioacuten alteracioacuten de microbioma y afectacioacuten tipo sisteacutemica o simil
Kawasaki (variable categoacuterica dicotoacutemica)
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
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Lu H Zheng B Zhang J Yan R Zhang H Jiang H Xu Q Guo J Gong Y Tang L
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children a systematic review EClinicalMedicine 2020 26 100527
httpsdoi101016jeclinm202010052
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assembler to de novo metagenome assembly from short sequence reads Nucleic Acids
Research Volume 40 Issue 20 1 November 2012 Page e155
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deciphering the genome Nucleic Acids Research Volume 32 Issue suppl_1 1
January 2004 Pages D277ndashD280 httpsdoiorg101093nargkh063
26 Tatusov RL Fedorova ND Jackson JD et al The COG database an updated
version includes eukaryotes BMC Bioinformatics 4 41 (2003)
httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
18 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
bull Requirioacute gammaglobulina diacuteas de respuesta Corticoides Antibioacuteticos (variable
categoacuterica dicotoacutemica)
bull Criterio de gravedad diacuteas de UCI ARM Inoacutetropicos (variables cuantitativa y
categoacuterica dicotoacutemica)
Variables Microbioma intestinal
bull Perfiles de microbiota y microbioma del paciente PIMS y comparacioacuten con poblacioacuten
de nintildeos sanos
RECOLECCIOacuteN Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
El presente estudio toma como punto de partida el hecho de que los PIMS no tienen
un tratamiento meacutedicofarmacoloacutegico con probada eficacia La propuesta de este trabajo
cuenta con las mejoras registradas debido a la regulacioacuten nutricional para encontrar factores
geneacuteticosproteoacutemicos de los microorganismos presentes en el intestino A continuacioacuten se
detallan los aspectos metodoloacutegicos especiacuteficos en lo que respecta a recoleccioacuten
procesamiento y anaacutelisis de muestras de materia fecal para anaacutelisis de microbiota y
microbioma para cumplir con los objetivos propuestos
Recoleccioacuten de muestras
Las muestras de materia fecal seraacuten recolectadas por un adulto responsable del nintildeo
utilizando el kit DNARNA shield fecal collection tube de Zymo Research para lo cual dicha
19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
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Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
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19 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
persona adulta seraacute capacitada por el profesional de la salud que se lo proporcione Cada
muestra contenida en el kit de recoleccioacuten de Zymo Research podraacuten permanecer a
temperatura ambiente sin someterlas a exposicioacuten solar hasta ser entregada al equipo meacutedico
que lidera el proyecto Dicho kit inactiva rompiendo paredes celulares de los microbios y
conserva las muestras dejaacutendolas listas para iniciar el procesamiento de eacutestas
Pre-procesamiento de muestras
Una vez se encuentren todas las muestras recolecadas se procederaacute a realizar la
purificacioacuten del ADN para luego continuar con el armado y preparacioacuten de bibliotecas
genoacutemicas La purificacioacuten seraacute realizada con el kit ZymoBIOMCS DNA MiniPrep de Zymo
Research mientras que el armado y preparacioacuten de bibliotecas genoacutemicas se realizaraacute con el
kit Nextera DNA Flex Library Prep siguiendo todos los pasos de acuerdo al protocolo
sugerido por Zymo Research e Illumina respectivamente La secuenciacioacuten se llevaraacute a cabo
conteniendo las muestras mezcladas en un mismo tubo en un equipo NextSeq de Illumina
Post-procesamiento de muestras anaacutelisis de microbiota y microbioma
El anaacutelisis metagenoacutemico de las muestras luego del proceso de secuenciacioacuten
comienza con el ensamblado de las lecturas de secuencia maacutes cortas para asiacute obtener
secuencias maacutes largas (contigs o scaffolds) para lo que se utilizaraacuten herramientas como
MetaVelvet (Namiki et al 2012) o MetaPar (Kim et al 2013) ya que las lecturas maacutes largas
proporcionan una anotacioacuten de genes y una prediccioacuten de la filogenia maacutes precisas Para
identificar los genes putativos de codificacioacuten de proteiacutenas se realizaraacute una buacutesqueda en
BLASTX (Brit et al 2001) contra una base de datos no redundante o una base de datos de
secuencias genoacutemicas microbianas especiacuteficas para el entorno o sitio de intereacutes Los datos
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Dove Matthew L et al Multisystem inflammatory syndrome in children survey of
protocols for early hospital evaluation and management The Journal of Pediatrics 229
(2021) 33-40
2 Kabeerdoss Jayakanthan et al Severe COVID-19 multisystem inflammatory
syndrome in children and Kawasaki disease immunological mechanisms clinical
manifestations and management Rheumatology international (2020) 1-14
3 Dufort Elizabeth M et al Multisystem inflammatory syndrome in children in New
York State New England Journal of Medicine 3834 (2020) 347-358
4 Henderson Lauren A et al American College of Rheumatology Clinical Guidance
for Multisystem Inflammatory Syndrome in Children Associated With SARSndashCoV‐2
and Hyperinflammation in Pediatric COVID‐19 Version 1 Arthritis amp Rheumatology
7211 (2020) 1791-1805
5 Kohn-Loncarica G et al Recomendaciones para el manejo inicial del siacutendrome
inflamatorio multisisteacutemico relacionado temporalmente con COVID-19 en nintildeos y
adolescentes Arch Argent Pediatr 1186 (2020) e514-e526
6 Sahn Benjamin et al Features of intestinal disease associated with COVID-related
multisystem inflammatory syndrome in children JPGN 723 (2021) 384
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coronavirus disease 2019 impact on disease course and in‐hospital mortality Journal
of gastroenterology and hepatology 362 (2021) 421-429
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25 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
9 World Health Organization Siacutendrome Inflamatorio Multisisteacutemico En Nintildeos y
Adolescentes Con COVID-19 World Health Organization Geneva Switzerlands
(2020) 1-3
10 Centers for Disease Control and Prevention Interim clinical guidance for management
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and intervention Nat Rev Immunol 202020363ndash74 httpsdoi101038s41577-020-
0311-8
12 Vabret N Britton GJ Gruber C et al Immunology of COVID-19 current state of the
scienceImmunity202052910 41 httpsdoi101016jimmuni202005002
13 Cheung EW Zachariah P Gorelik M et al Multisystem inflammatory syndrome
related to COVID-19 in previously healthy children and adolescents in New York
City JAMA 2020324294 httpsdoi101001jama202010374
14 Verdoni L Mazza A Gervasoni A et al An outbreak of severe Kawasaki-like disease
at the Italian epicentre of the SARS-CoV-2 epidemic an observational cohort study
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15 Zuo T Zhang F Lui GCY et al Alterations in gut microbiota of patients with COVID-
19 during time of hospitalization Gastroenterology 2020159944ndash55
httpsdoi101053jgastro202005048
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and dysfunctional immune responses in patients with COVID-19 Gut 202170698-
706
17 Gu S Chen Y Wu Z Chen Y Gao H Lv Feifei Guo L Zhang L Luo R Huang C
Lu H Zheng B Zhang J Yan R Zhang H Jiang H Xu Q Guo J Gong Y Tang L
Li L Alterations of the Gut Microbiota in Patients With Coronavirus Disease 2019 or
26 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
H1N1 Influenza Clinical Infectious Diseases 2020 71(10)2669ndash2678
httpsdoiorg101093cidciaa709
18 Silva Andrade B Siqueira S de Assis Soares WR et al Long-COVID and Post-
COVID Health Complications An Up-to-Date Review on Clinical Conditions and
Their Possible Molecular Mechanisms Viruses 202113(4)700 Published 2021 Apr
18 httpsdoi103390v13040700
19 Esposito S Principi N Multisystem Inflammatory Syndrome in Children Related to
SARS-CoV-2 Paediatr Drugs 2021 Mar23(2)119-129 httpsdoi101007s40272-
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httpsdoiorg101371journalpone0253293
21 Carfigrave A Bernabei R Landi F et al Persistent symptoms in patients after acute
COVID-19 JAMA2020 324603doi101001jama202012603
22 Ahmed M Advani S Moreira A et al Multisystem inflammatory syndrome in
children a systematic review EClinicalMedicine 2020 26 100527
httpsdoi101016jeclinm202010052
23 Namiki T Hachiya T Tanaka H Sakakibara Y MetaVelvet an extension of Velvet
assembler to de novo metagenome assembly from short sequence reads Nucleic Acids
Research Volume 40 Issue 20 1 November 2012 Page e155
httpsdoiorg101093nargks678
24 Kim M Ligo JG Emad A Farnoud F Milenkovic O Veeravalli VV MetaPar
Metagenomic sequence assembly via iterative reclassification 2013 IEEE Global
Conference on Signal and Information Processing 2013 pp 43-46
httpsdoiorg101109GlobalSIP20136736807
27 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
25 Kanehisa M Goto S Kawashima S Okuno Y Hattori M The KEGG resource for
deciphering the genome Nucleic Acids Research Volume 32 Issue suppl_1 1
January 2004 Pages D277ndashD280 httpsdoiorg101093nargkh063
26 Tatusov RL Fedorova ND Jackson JD et al The COG database an updated
version includes eukaryotes BMC Bioinformatics 4 41 (2003)
httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
20 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
funcionales de las proteiacutenas predichas se inferiraacuten mediante la buacutesqueda en bases de datos de
rutas metaboacutelicas como KEGG (Kanehisa et al 2004) y COG (Tatusov et al 2003) La
estructura y composicioacuten de la microbiota a analizar se evaluaraacute cuantificando e interpretando
similitudes basadas en los anaacutelisis de diversidad intra e intergrupo (diversidad alfa y beta
respectivamente) Para la diversidad alfa se calcularaacute la mejor cobertura y el nuacutemero de
unidades taxonoacutemicas operativas (OTUs) asiacute como la cantidad de ASVs (Amplicon sequence
variant) de cada muestra utilizando Qiime2 (Bolyen et al 2018) y el paquete Vegan de R
(Oksanen et al 2015) La diversidad beta se evaluaraacute utilizando distancias UniFrac
generalizadas basadas en la filogenia calculada con el paquete GUniFrac de R (Chen et al
2012) Las comparaciones entre grupos de individuos se realizaraacute utilizando la funcioacuten adonis
(ANOVA usando matrices de distancia) del ANOVA multivariado permutacional
(PERMANOVA) implementado en el paquete Vegan de R (Oksanen et al 2015) Los
paraacutemetros cliacutenicos bioquiacutemicos y antropomeacutetricos medidos se expresaraacuten como media y se
utilizaraacute el test ANOVA para comparar las diferencias entre los grupos de estudio elegidos
CODIFICACIOacuteN DE PACIENTES
A todos los pacientes se les otorgaraacute un coacutedigo uacutenico de identificacioacuten por el cual
seraacuten identificados a lo largo de todo el estudio Este coacutedigo seraacute otorgado de manera
consecutiva de acuerdo a la inclusioacuten del paciente al protocolo
Una vez firmado el consentimiento informado y verificado el cumplimiento de todos
los criterios de elegibilidad se procederaacute a la toma de 1 muestra (hisopado)
DESCRIPCIOacuteN DE LAS VISITAS DEL ESTUDIO
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Dove Matthew L et al Multisystem inflammatory syndrome in children survey of
protocols for early hospital evaluation and management The Journal of Pediatrics 229
(2021) 33-40
2 Kabeerdoss Jayakanthan et al Severe COVID-19 multisystem inflammatory
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3 Dufort Elizabeth M et al Multisystem inflammatory syndrome in children in New
York State New England Journal of Medicine 3834 (2020) 347-358
4 Henderson Lauren A et al American College of Rheumatology Clinical Guidance
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and Hyperinflammation in Pediatric COVID‐19 Version 1 Arthritis amp Rheumatology
7211 (2020) 1791-1805
5 Kohn-Loncarica G et al Recomendaciones para el manejo inicial del siacutendrome
inflamatorio multisisteacutemico relacionado temporalmente con COVID-19 en nintildeos y
adolescentes Arch Argent Pediatr 1186 (2020) e514-e526
6 Sahn Benjamin et al Features of intestinal disease associated with COVID-related
multisystem inflammatory syndrome in children JPGN 723 (2021) 384
7 Zhang Lei et al Diarrhea and altered inflammatory cytokine pattern in severe
coronavirus disease 2019 impact on disease course and in‐hospital mortality Journal
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8 Lamers Mart M et al SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes
Science 3696499 (2020) 50-54
25 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
9 World Health Organization Siacutendrome Inflamatorio Multisisteacutemico En Nintildeos y
Adolescentes Con COVID-19 World Health Organization Geneva Switzerlands
(2020) 1-3
10 Centers for Disease Control and Prevention Interim clinical guidance for management
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related to COVID-19 in previously healthy children and adolescents in New York
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16 Yeoh YK Zuo T Lui GC et al Gut microbiota composition reflects disease severity
and dysfunctional immune responses in patients with COVID-19 Gut 202170698-
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Lu H Zheng B Zhang J Yan R Zhang H Jiang H Xu Q Guo J Gong Y Tang L
Li L Alterations of the Gut Microbiota in Patients With Coronavirus Disease 2019 or
26 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
H1N1 Influenza Clinical Infectious Diseases 2020 71(10)2669ndash2678
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18 Silva Andrade B Siqueira S de Assis Soares WR et al Long-COVID and Post-
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SARS-CoV-2 Paediatr Drugs 2021 Mar23(2)119-129 httpsdoi101007s40272-
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microbiome and COVID-19 A systematic review PLOS ONE 16(6) e0253293
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21 Carfigrave A Bernabei R Landi F et al Persistent symptoms in patients after acute
COVID-19 JAMA2020 324603doi101001jama202012603
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Research Volume 40 Issue 20 1 November 2012 Page e155
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25 Kanehisa M Goto S Kawashima S Okuno Y Hattori M The KEGG resource for
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January 2004 Pages D277ndashD280 httpsdoiorg101093nargkh063
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version includes eukaryotes BMC Bioinformatics 4 41 (2003)
httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
21 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Durante todo el estudio el paciente deberaacute cumplir con una sola visita Durante esta
visita se llevaraacuten a cabo todas las evaluaciones necesarias para determinar la inclusioacuten del
paciente al estudio
Los procedimientos a realizarse durante esta visita son
1 Apertura de la historia cliacutenica El Investigador Principal o el profesional por eacutel
delegado entrevistaraacute a cada paciente o madre o padre tutor o encargado seguacuten corresponda
y lo interrogaraacute sobre antecedentes que puedan confirmar o impedir su posible inclusioacuten en el
protocolo Se efectuaraacute la anamnesis y la evaluacioacuten cliacutenica necesaria para confirmar el
diagnoacutestico
2 Proceso de consentimiento informado Durante la entrevista se le explicaraacute al
pacientemadre padre tutor o representante legal el protocolo y se le daraacute a leer la Hoja de
Informacioacuten para Pacientes y el Formulario de Consentimiento Informado A los menores de
edad pero mayores de 12 antildeos se les daraacute un asentimiento el que tambieacuten le seraacute leiacutedo y
explicado Una vez que ella pacientemadre padre tutor o representante legal haya leiacutedo y
comprendido toda la informacioacuten administrada y haya solicitado las aclaraciones necesarias
se le solicitaraacute que firme Consentimiento Informado y si el paciente es menor de edad pero
mayor de 12 antildeos se le pediraacute que firme un asentimiento
3 Estudios complementarios Por las caracteriacutesticas del protocolo dado que se trata de
un anaacutelisis ex vivo no seraacuten necesarios estudios complementarios pero siacute seraacuten adjuntados a
la historia cliacutenica en el caso de que se realicen para un anaacutelisis posterior
Una vez cumplidas todas las evaluaciones mencionadas se procederaacute a la toma de las
muestras de hisopado (ver seccioacuten toma de muestras) y el paciente podraacute retirarse del sitio de
investigacioacuten sin necesidad de nuevos controles ambulatorios
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Dove Matthew L et al Multisystem inflammatory syndrome in children survey of
protocols for early hospital evaluation and management The Journal of Pediatrics 229
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Adolescentes Con COVID-19 World Health Organization Geneva Switzerlands
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706
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26 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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18 Silva Andrade B Siqueira S de Assis Soares WR et al Long-COVID and Post-
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22 Ahmed M Advani S Moreira A et al Multisystem inflammatory syndrome in
children a systematic review EClinicalMedicine 2020 26 100527
httpsdoi101016jeclinm202010052
23 Namiki T Hachiya T Tanaka H Sakakibara Y MetaVelvet an extension of Velvet
assembler to de novo metagenome assembly from short sequence reads Nucleic Acids
Research Volume 40 Issue 20 1 November 2012 Page e155
httpsdoiorg101093nargks678
24 Kim M Ligo JG Emad A Farnoud F Milenkovic O Veeravalli VV MetaPar
Metagenomic sequence assembly via iterative reclassification 2013 IEEE Global
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27 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
25 Kanehisa M Goto S Kawashima S Okuno Y Hattori M The KEGG resource for
deciphering the genome Nucleic Acids Research Volume 32 Issue suppl_1 1
January 2004 Pages D277ndashD280 httpsdoiorg101093nargkh063
26 Tatusov RL Fedorova ND Jackson JD et al The COG database an updated
version includes eukaryotes BMC Bioinformatics 4 41 (2003)
httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
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Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
22 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Con esta visita finalizaraacute el ensayo cliacutenico Si el paciente lo desea podraacute solicitar el
resultado de los cultivos y estudios realizados los que seraacuten entregados por el investigador
una vez finalizados los mismos y en una fecha pactada entre ambos
INTERRUPCIOacuteNDISCONTINUACIOacuteN DEL ESTUDIO
El estudio podraacute ser discontinuado cuando por razones ajenas a los Investigadores o a
los Patrocinadores no pudiera obtenerse la provisioacuten del material necesario para el estudio de
las muestras o su procesamiento
PROCEDIMIENTO PARA RECOLECCIOacuteN DE DATOS (INSTRUMENTOS Y
MEacuteTODO PARA CONTROL DE CALIDAD)
Manejo de datos
Luego de completar los CRF se entraraacuten todos los datos a una base de datos Se
realizaraacute un control y validacioacuten de datos con doble carga para asegurar la agudeza y
consistencia de los datos cargados Toda discrepancia generada como resultado de este control
deberaacute ser resueltas en formularios de aclaracioacuten de datos (FAD) que deberaacuten ser confirmados
por el investigador Una vez que todas las dudas sean resueltas la base de datos seraacute cerrada
y se realizaraacute el anaacutelisis estadiacutestico
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
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and Hyperinflammation in Pediatric COVID‐19 Version 1 Arthritis amp Rheumatology
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13 Cheung EW Zachariah P Gorelik M et al Multisystem inflammatory syndrome
related to COVID-19 in previously healthy children and adolescents in New York
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16 Yeoh YK Zuo T Lui GC et al Gut microbiota composition reflects disease severity
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706
17 Gu S Chen Y Wu Z Chen Y Gao H Lv Feifei Guo L Zhang L Luo R Huang C
Lu H Zheng B Zhang J Yan R Zhang H Jiang H Xu Q Guo J Gong Y Tang L
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26 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
H1N1 Influenza Clinical Infectious Diseases 2020 71(10)2669ndash2678
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18 Silva Andrade B Siqueira S de Assis Soares WR et al Long-COVID and Post-
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27 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
25 Kanehisa M Goto S Kawashima S Okuno Y Hattori M The KEGG resource for
deciphering the genome Nucleic Acids Research Volume 32 Issue suppl_1 1
January 2004 Pages D277ndashD280 httpsdoiorg101093nargkh063
26 Tatusov RL Fedorova ND Jackson JD et al The COG database an updated
version includes eukaryotes BMC Bioinformatics 4 41 (2003)
httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
23 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
Formulario de reporte de caso (CRF)
Todos los datos generados en el estudio deberaacuten ser registrados en el CRF
correspondiente a cada paciente Los datos reportados sobre el CRF deben ser consistentes
con los documentos-fuente Cualquier discrepancia deberaacute ser correctamente explicada Se
abriraacute un CRF en todos aquellos pacientes que luego de la evaluacioacuten inicial sean admitidos
en el protocolo
Los CRF deberaacuten ser completados por el personal del sitio de investigacioacuten y con tinta
de color negro Cualquier cambio o correccioacuten que se realice sobre el mismo deberaacute estar
inicializada y fechada por la persona que realiza el cambio sin ocultar la informacioacuten que
reemplaza (tachando soacutelo con una liacutenea la informacioacuten original) Otra opcioacuten seraacute la
elaboracioacuten de formulario en RedCap
ANAacuteLISIS ESTADIacuteSTICO
Se presentaraacute una estadiacutestica descriptiva de todas las variables analizadas La
descripcioacuten de las variables numeacutericas y categoacutericas seraacuten resumidas de la siguiente manera
bull Variables numeacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) media desviacuteo estaacutendar (DE)
miacutenimo maacuteximo media primer cuartilo (Q1) y tercer cuartilo (Q3)-
bull Variables categoacutericas nuacutemero de datos obtenidos (n) frecuencias y porcentajes Los
datos faltantes no seraacuten considerados para los porcentajes
Para comparar variables continuas se utilizaraacute una prueba t o prueba de Wilcoxon mientras
que para las variables no continuas o categoacutericas se utilizaraacute un test de chi-cuadrado o de
Fisher
24 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
BIBLIOGRAFIacuteA
1 Dove Matthew L et al Multisystem inflammatory syndrome in children survey of
protocols for early hospital evaluation and management The Journal of Pediatrics 229
(2021) 33-40
2 Kabeerdoss Jayakanthan et al Severe COVID-19 multisystem inflammatory
syndrome in children and Kawasaki disease immunological mechanisms clinical
manifestations and management Rheumatology international (2020) 1-14
3 Dufort Elizabeth M et al Multisystem inflammatory syndrome in children in New
York State New England Journal of Medicine 3834 (2020) 347-358
4 Henderson Lauren A et al American College of Rheumatology Clinical Guidance
for Multisystem Inflammatory Syndrome in Children Associated With SARSndashCoV‐2
and Hyperinflammation in Pediatric COVID‐19 Version 1 Arthritis amp Rheumatology
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httpsdoiorg1011861471-2105-4-41
27 Bolyen E Rideout JR Dillon MR Bokulich NA Abnet C Al-Ghalith GA Alexander
H Alm EJ Arumugam M Asnicar F Bai Y Bisanz JE Bittinger K Brejnrod A
Brislawn CJ Brown CT Callahan BJ Caraballo-Rodriacuteguez AM Chase J Cope E Da
Silva R Dorrestein PC Douglas GM Durall DM Duvallet C Edwardson CF Ernst
M Estaki M Fouquier J Gauglitz JM Gibson DL Gonzalez A Gorlick K Guo J
Hillmann B Holmes S Holste H Huttenhower C Huttley G Janssen S Jarmusch AK
Jiang L Kaehler B Kang KB Keefe CR Keim P Kelley ST Knights D Koester I
Kosciolek T Kreps J Langille MG Lee J Ley R Liu Y Loftfield E Lozupone C
Maher M Marotz C Martin BD McDonald D McIver LJ Melnik AV Metcalf JL
Morgan SC Morton J Naimey AT Navas-Molina JA Nothias LF Orchanian SB
Pearson T Peoples SL Petras D Preuss ML Pruesse E Rasmussen LB Rivers A
Robeson II MS Rosenthal P Segata N Shaffer M Shiffer A Sinha R Song SJ Spear
JR Swafford AD Thompson LR Torres PJ Trinh P Tripathi A Turnbaugh PJ Ul-
Hasan S van der Hooft JJ Vargas F Vaacutezquez-Baeza Y Vogtmann E von Hippel M
Walters W Wan Y Wang M Warren J Weber KC Williamson CH Willis AD Xu
ZZ Zaneveld JR Zhang Y Zhu Q Knight R Caporaso JG 2018 QIIME 2
Reproducible interactive scalable and extensible microbiome data science PeerJ
Preprints 6e27295v2 httpsdoiorg107287peerjpreprints27295v2
28 Anaacutelisis metagenoacutemico de microbiota en nintildeos con PIMS
28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
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28 Oksanen J Blanchet FG Kindt R Legendre P Minchin PR OrsquoHara RB
Simpson GL Solymos P Stevens MHH and Wagner H (2014) Vegan
Community Ecology Package R Package Version 22-0
httpCRANRprojectorgpackage=vegan
29 Chen J Bittinger K Charlson ES Hoffmann C Lewis J Wu GD Collman RG
Bushman FD Li H Associating microbiome composition with environmental
covariates using generalized UniFrac distances Bioinformatics 2012 Aug
1528(16)2106-13 httpsdoi101093bioinformaticsbts342
