ANEXO INFORME TECNICO FINAL META 1. CARACTERIZACIÓN DE … · INFORME TECNICO FINAL META 1. CARACTERIZACIÓN DE LAS MIELES PURAS Materia prima ... la solución B y se hicieron reaccionar

ANEXO INFORME TECNICO FINAL

META 1. CARACTERIZACIÓN DE LAS MIELES PURAS

Materia prima Se utilizó miel pura de abeja proveniente de los estados de Chiapas, Estado de México, Oaxaca y Morelos. El análisis de las muestras de miel puras se llevó de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-F-036-1997-NORMEX, Alimentos-Miel-Especificaciones y Métodos de Prueba y el AOAC. Los métodos de análisis utilizados se dan a continuación. 1 Métodos Meta 1 Las mieles de abeja puras se caracterizaron con la determinación de algunas propiedades físicas y químicas: humedad, ceniza, actividad diastásica, azúcares reductores, fructosa, glucosa, sacarosa e hidroximetilfurfural. También se obtuvieron por espectrofotometría FTIR los espectros correspondientes. Para poder analizar la muestra, esta debe estar libre de gránulos y debe estar bien mezclada. Las muestras se analizaron cada una por triplicado. 1.1 Determinación de humedad (AOAC 31.111) La humedad de la miel de abeja se determinó por medio de la lectura directa del índice de refracción colocando una muestra de miel en un refractómetro de Abbe a 20°C. El índice de refracción obtenido se interpola en la Tabla 31:08 de los métodos de análisis del AOAC (1980) (ver anexo) que relaciona el índice de refracción con el contenido de agua para mieles para obtener el porcentaje de humedad correspondiente. Si la determinación se hace a una temperatura diferente de 20 °C, se tendrá que hacer la corrección por temperatura (Tabla 31:08 del AOAC). 1.2 Determinación de ceniza (AOAC 31.112) Para la determinación de ceniza en la miel de abeja, se pesaron de 5 a 10 g de muestra y se colocaron en un crisol de porcelana puesto previamente a peso constante, en una estufa se llevaron a sequedad (100°C) y posteriormente en una mufla se sometieron a una temperatura de calcinación (600°C) hasta lograr un peso constante. Después se enfriaron en la estufa y se transfirieron a un desecador y se pesaron. El porcentaje de ceniza se obtuvo por diferencia del peso inicial y el peso final de la muestra. 1.3 Determinación de actividad diastásica (AOAC 31.154) Para la determinación de la actividad de diastasa en la miel de abeja, se pesaron 5 g de muestra y se disolvieron con 10 a 15 mL de agua destilada. Se adicionaron 2.5 mL de un regulador de acetatos (pH 5.3, 1.59 M) y se transfirieron a un matraz aforado de 25 mL el cual contenía 1.5 mL de una solución de NaCl 0.5 M. Posteriormente se llevó al aforo. Adicionalmente, se preparó una solución de almidón al 1% con agua destilada. En un vaso de precipitado se colocaron 5 mL de la solución de almidón al 1% y 10 mL de la solución de miel, se mezclaron y se dejaron reaccionar por cinco minutos en un baño a 40°C, tomando el tiempo con un cronómetro. En el transcurso de la reacción se tomaron alícuotas de 1 mL cada minuto y se colocaron en una probeta que contenía 10 mL de una solución de yodo (0.007 N), se mezclaron y se diluyeron a un volumen de 20 mL medidos en la probeta. Se midió la absorbancia a 600 nm y se anotó el tiempo de mezclado del almidón y la miel al adicionarse al yodo como tiempo de reacción. Esto se repitió hasta que se logró obtener una lectura de absorbancia menor o igual a 0.235. Con los resultados se hizo una gráfica de absorbancia contra el tiempo de reacción en minutos y se trazó una recta que unía por lo menos los tres últimos puntos de la gráfica para determinar el momento en que se obtuvo la absorbancia de 0.235. El tiempo obtenido se dividió entre 300 para obtener el

índice de diastasa que corresponde al índice de diastasa de la escala Gothe. Los resultados se expresaron como los mL de almidón al 1% hidrolizado por la enzima por 1 g de miel en una hora a 40°C. 1.4 Determinación de azúcares reductores (AOAC 31.120) Se utilizó un método modificado de Lane-Eynon que consistió en titular la solución de Fehling en su punto de ebullición con una solución de los azúcares reductores de la miel utilizando azul de metileno como indicador. Para la preparación de la solución de azucares reductores se pesaron 26 g de miel y se transfirieron a un matraz volumétrico de 100 mL con agua, se agregaron 5 mL de crema de alumbre (preparada como en punto 31.021b del AOAC), se aforó, se filtró y se guardó; 10 mL de la solución obtenida se diluyó a 500 mL y se determinaron los azúcares reductores. Se normalizó la solución de Fehling modificada de la siguiente forma: 5 mL de la solución A y 5 mL de la solución B y se hicieron reaccionar con 50 mg de una solución estándar de azúcar invertido, agregada como 25 mL de dilución para 2 g/L. Para determinar el volumen de agua a utilizar se realizó lo siguiente procedimiento: se tomó con una pipeta, 5 mL de cada una de las soluciones de Fehling (A, B) y se colocaron en un matraz erlenmeyer de 250, se agregaron 7 mL de agua, cuerpos de ebullición y 15 mL de la solución diluída de miel mediante una bureta; la mezcla se calentó y se mantuvo a ebullición moderada durante 2 minutos. Se agregó 1 mL de azul de metileno al 0.2% o de 3 a 4 gotas de una solución al 1%, y mientras permanecía hirviendo, se tituló con pequeñas cantidades de la solución de miel diluída hasta que desapareció el color del indicador en un periodo de tres minutos. El volumen usado de la solución diluída de miel fue igual a x. Se repitió la titulación usando 5 mL de cada solución de Fehling (A y B), (25-x) mL de agua y 13.5 mL de la solución de miel diluída (con una bureta), dejando 1.5 mL en la bureta (cantidad determinada en la titulación anterior), completando así un volumen de 35 mL. Se agregó azul de metileno (1%) y se tituló con pequeñas cantidades de la solución de miel diluída que quedaron en la bureta hasta encontrar el punto final en un plazo de tres minutos y se anotó el volumen empleado (y). La diferencia entre titulaciones duplicadas no fue mayor a 0.1 mL. Expresión de resultado: % de azúcar invertido=2000/(g de muestra de miel x y). 1.5 Determinación de glucosa por un método enzimático (Sigma- Aldrich. GAHK20) (Kunst, 1984; Beuter, 1985; AOAC, 1995) La glucosa es fosforilada por adenosintrifosfato (ATP) en la reacción catalizada por hexoquinasa. La glucosa 6-fosfato (G6P) es entonces oxidada a 6-fosfogluconato en presencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) en la reacción catalizada por glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Durante ésta oxidación, una cantidad equimolar de NAD es reducido a NADH. El consecuente incremento en absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la concentración de glucosa. Reacción: Glucosa + ATP Hexoquinasa Glucosa 6-Fosfato + ADP G6P + NAD G6PDH NADH + 6-Fosfogluconato Se prepararon 3 tubos para cada muestra, cada uno con 2 mL del reactivo que contenía las enzimas, el cual se llevó a la temperatura de reacción (18 – 35 °C). A un tubo se le agregó 0.1 mL de agua desionizada (blanco) y al otro tubo se le agregó 0.1 mL de muestra. Los tubos se mezclaron y se dejaron en reposo durante 15 minutos a temperatura ambiente (18 - 35 °C). Se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a 340 nm. Los cálculos se realizaron de la siguiente forma: ∆A = A muestra – A blanco mg glucosa = (∆A)(TV)(Peso molecular de glucosa)(F) g muestra (ε)(d)(SV)(Factor de conversión de g a mg)

= (∆A)(2.12)(180.2)(F) (6.22)(1)(0.1)(1000) = (∆A)(F)(0.614) Donde: A = Absorbancia a 340 nm TV = Volumen total F = Factor de dilución de la preparación de la muestra ε = Coeficiente de extinción milimolar de NADH a 340 nm d = Grosor de la celda (cm) SV = Volumen de la muestra Tomando la densidad promedio de la miel como 1.42 en promedio, determinado por picnómetro, el resultado anterior se expresó como g/L. mg glucosa x 1.42 g = mg = g/L g muestra mL mL 1.6 Determinación de fructosa por un método enzimático (Sigma-Aldrich. FA20) (Beuter, 1985; AOAC, 1995; Southgate, 1976; Bergmeyer, 1974) La fructosa es fosforilada por adenosintrifosfato (ATP) en la reacción catalizada por hexoquinasa. La fructosa 6-fosfato es convertida a glucosa 6-fosfato por la fosfoglucosaisomerasa (PGI). La glucosa 6-fosfato (G6P) es entonces oxidada por 6-fosfogluconato en presencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) en la reacción catalizada por glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH). Durante ésta oxidación, una cantidad equimolar de NAD es reducido a NADH. El consecuente incremento en absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la concentración de fructosa. Reacción: Fructosa + ATP Hexoquinasa Fructosa 6-Fosfato + ADP Fructosa 6-Fosfato PGI Glucosa 6-Fosfato G6P + NAD G6PDH NADH + 6-Fosfogluconato En el Cuadro 1, se muestra el procedimiento experimental. Aquí se puede observar que para cada determinación se prepararon tres blancos: de la fosfoglucosaisomerasa, de la muestra y del reactivo que contiene las enzimas. Por ejemplo, el blanco de la fosfoglucosaisomerasa se prepara con fosfoglucosaisomerasa, agua y reactivo que contiene las enzimas y así sucesivamente.

Cuadro 1. Determinación de glucosa por método enzimático SIGMA. Tubo PGI (mL) Muestra (mL) Agua

desionizada (mL)

Reactivo enzimas (mL)

PGI blanco 0.02 --- 0.1 2.0

Muestra blanco --- 0.1 0.02 2.0 Reactivo enzimas blanco

--- --- 0.12 2.0

Muestra 0.02 0.1 --- 2.0

Los tubos se mezclaron, se incubaron por 15 minutos a temperatura ambiente (18 – 35 °C) y se leyó la absorbancia en un espectrofotómetro a 340 nm. Los cálculos se realizaron de la siguiente forma: A blanco total = (A blanco muestra – A reactivo enzimas) + A blanco PGI ∆A = A muestra – A blanco totalmg fructosa = (∆A)(TV)(Peso molecular de fructosa)(F)

(ε)(d)(SV)(Factor de conversión de g a mg) = (∆A)(2.12)(180.2)(F) (6.22)(1)(0.1)(1000) = (∆A)(F)(0.614) Donde: A = Absorbancia a 340 nm TV = Volumen total F = Factor de dilución de la preparación de la muestra ε = Coeficiente de extinción milimolar de NADH a 340 nm d = Grosor de la celda (cm) SV = Volumen de la muestra Tomando la densidad promedio de la miel como 1.42 en promedio, determinado por picnómetro, el resultado anterior se expresó como g/L. mg glucosa x 1.42 g = mg = g/L g muestra mL mL 1.7 Determinación de hidroximetilfurfural (NMX-F-036-1997-NORMEX) La determinación de hidroximetilfurfural para miel de abeja, se basa en el método de Winkler. Se disolvieron 10 g de miel en 20 mL de agua, se tomaron 2 mL de la solución de miel y se agregaron a cada uno 5 mL de p-toluidina (se preparó con 10 g de p-toluidina, 50 mL de isopropanol y 10 ml de ácido acético glacial). A uno de los tubos se le agregó 1 mL de agua (testigo) y a otro 1 mL de ácido barbitúrico (500 mg de ácido barbitúrico en 70 mL de agua), se agitaron por 1 o 2 minutos. Se transfirieron a las celdas rápidamente y se leyó la absorbancia de la muestra a 550 nm ajustando a cero con el testigo. El contenido de hidroximetilfurfural se determinó interpolando el valor de absorbancia obtenida en una curva de calibración previamente realizada. 1.8 Determinación de actividad acuosa (aw) La determinación de actividad acuosa se realizó por medición directa con el Higrómetro marca Aqualab que se encuentra en el Laboratorio de evaluación sensorial. Las muestras (miel de Chiapas, Oaxaca, Morelos y Estado de México) se colocaron en charolas de plástico y éstas a su vez se colocaron en el compartimiento del equipo para su posterior lectura de aw después de 5 minutos, que es el tiempo en que se estabiliza el equipo entre cada muestra. 1.9 Obtención de los espectros infrarrojos de las mieles puras Todas las medidas espectrales se realizaron en Espectrofotómetro Perkin Elmer 1600 series FTIR que se encuentra en el Laboratorio Central de Instrumentación-Investigación del departamento de Biofísica de la ENCB con ayuda del programa PE GRAMS 1600. Los espectros se obtuvieron a una resolución de 4 cm -1, operando en la región del infrarrojo medio (4000 – 650 cm-1), se llevaron a cabo 64 barridos para cada espectro para obtener una buena definición de los picos (Kelly y col., 2004) y poder identificar los compuestos de la muestra. Antes de cada lectura de las muestras se obtuvo el espectro de fondo (background) o blanco contra agua, el cual se leyó bajo las mismas condiciones que las muestras. Para la obtención de los espectros FTIR-HATR, tanto de las muestras de miel como la del blanco, se colocaron sobre el cristal HATR de selenuro de zinc (ZnSe). La geometría del cristal es de un paralelogramo de 45°, la profundidad de penetración es de 1.46 µm. Después de cada determinación,

el cristal de ZnSe fue completamente limpiado con abundante agua potable y desionizada y finalmente se secó con papel suave o con un flujo de gas nitrógeno seco. 2. Resultados Meta 1 2.1 Determinación de humedad Los resultados obtenidos para el porcentaje de humedad, basados en el índice de refracción, de cada una de las muestras de miel de abeja analizadas, se muestran en el Cuadro 2.

Cuadro 2. Porciento de humedad de las diferentes mieles de abeja analizadas. Miel Índice de Refracción % Humedad

Morelos 1.4900 (± 0.009) 18.6 (± 0.00007) Chiapas 1.4910 (± 0.003) 18.2 (± 0.11)

Estado de México 1.4900 (± 0.006) 18.6 (± 0.18) Oaxaca 1.4930 (± 0.000) 17.4 (± 0.00)

Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Valor de la norma NMX-F-036-1997-NORMEX 18 – 20%. En los resultados de porciento de humedad (Cuadro 2) de las diferentes mieles de abeja analizadas se observa que todas las mieles presentan valores por debajo del límite máximo que marca la norma NMX-F-036-1997-NORMEX (un máximo de 20%), el Codex Alimentarius y la Unión Europea (un máximo de 21%). Existen diversas razones por las que en forma natural se puede incrementar el porcentaje de humedad en la miel de abeja, la más común es su cosecha antes de que alcance la humedad adecuada (falta de maduración de la miel en panal), aunque con cierta frecuencia también puede atribuirse a la flora de la cual proviene o a su almacenamiento de la misma en condiciones inadecuadas (Trujillo, 2002). 2.2 Determinación de ceniza Los resultados obtenidos en la determinación de ceniza en las mieles de abeja se muestran en el Cuadro 3.

Cuadro 3. Porciento de ceniza en base húmeda de las diferentes muestras de miel de abeja analizadas.

Miel Ceniza (%) Morelos 0.0924 (± 0.0110) Chiapas 0.1430 (± 0.0051)

Estado de México 0.1434 (± 0.0124) Oaxaca 0.1495 (± 0.0128)

Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Valor de la norma NMX-F-036-1997-NORMEX 0.6% En el Cuadro 2 se observa que todas las mieles de abeja analizadas cumplen con el valor máximo de cenizas permitido por la NMX-F-036-1997-NORMEX (máximo 0.6 %), el Codex Alimentarius y la Unión Europea (máximo 0.6%) ya que están por debajo de este valor máximo permitido. Estos resultados indican que ninguna de las mieles fue contaminada con agentes sólidos extraños, pues esta medida se relaciona con problemas de higiene (tierra y arena). Cabe mencionar que cuando la miel es adulterada con melaza puede presentar un alto porcentaje de cenizas (Trujillo, 2002). El contenido de cenizas es un criterio de calidad para evaluar el origen botánico de la miel de abeja (Bogdanov, 2001). Las mieles florales poseen un menor contenido de cenizas que las mieles de mielada (% cenizas ≤ 1.2) (miel que procede principalmente de secreciones de partes vivas de las plantas o de excreciones de insectos succionadores de plantas que se encuentran sobre ellas) (NMX-

F-036-1997-NORMEX; Trujillo, 2002), por lo tanto, de esto se puede deducir que las mieles con las que se trabajó son florales y no de mielada. 2.3 Determinación de actividad diastásica Los resultados obtenidos de la determinación del índice de diastasa se muestran en el Cuadro 4.

Cuadro 4. Actividad diastásica de las muestras de mieles de abeja puras.

Miel Tiempo a una Abs0.235 (min)

ND (número de diastasa 300/t)

Morelos 12.0 (± 0.39) 25.0 (± 0.81) Chiapas 16.0(± 0.59) 18.7 (± 0.69)


Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Valor de la Norma NMX-F-036-1997-NORMEX mínimo 8.0 Estos resultados muestran que todas las mieles de abeja analizadas presentaron un valor de índice de diastasa superior al mínimo indicado en la NMX-F-036-1997-NORMEX que es de 8 (ver en anexo I el ejemplo de cálculo), lo cual indica que las mieles no fueron sometidas a procesos de calentamiento ni a periodos largos de almacenaje, ya que aun conservan actividad enzimática (Bogdanov, 2001). 2.4 Determinación de azúcares reductores Los resultados obtenidos en la determinación del porciento de azúcares reductores se muestran en el Cuadro 5.

Cuadro 5. Porciento de azúcar invertido en las muestras de miel de abeja pura Tipo de miel Azúcar invertido (%)

Morelos 67.4 (± 3.33) Chiapas 56.6 (± 3.91)

Estado de México 70.1 (± 6.40) Oaxaca 57.0 (± 2.11)

Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Valor de la Norma NMX-F-036-1997-NORMEX mínimo 53% Estos resultados indican que las mieles de abeja examinadas no fueron sometidas a algún tipo de adulteración con otro tipo de azúcares, ya que el límite mínimo de azúcar reductor según la norma mexicana NMX-F-036-1997-NORMEX es de 53 %, de acuerdo a su origen. 2.5 Determinación de glucosa por método enzimático La determinación de glucosa se realizó con un método enzimático para alimentos de Sigma – Aldrich. Los resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 6.

Cuadro 6. Contenido de glucosa en las muestras de miel de abeja pura. Miel Glucosa (g/L) Glucosa (p/v) (%)

Morelos 294.6 (± 4.04) 29.5 (± 0.40) Chiapas 293.4 (± 10.1) 29.3 (± 1.01)


Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Valor de la Norma NMX-F-036-1997-NORMEX máximo 38%

Los resultados obtenidos para todas las mieles de abeja examinadas, son adecuados para mieles puras ya que se encuentran por debajo del valor máximo de 38% de glucosa, marcado por la norma NMX-F-036-1997-NORMEX. 2.6 Determinación de fructosa por método enzimático La determinación de fructosa se realizó con un método enzimático para alimentos de Sigma – Aldrich. Los resultados obtenidos se muestran en el Cuadro 7.

Cuadro 7. Contenido de fructosa en las muestras de miel de abeja pura. Miel Fructosa ( g/L) Fructosa (p/v) (%)

Morelos 460.2 (±0.9) 46.0 (± 1.0) Chiapas 473.3 (±0.7) 47.3 (± 0.9)

Estado de México 501.3 (±0.3) 50.1 (± 0.4) Oaxaca 433.978 (±1.2) 43.39 (± 1.1)

Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Estos resultados muestran que todas las mieles de abeja analizadas presentan porcentajes mayores de fructosa con respecto a los de glucosa (Cuadro 6). La norma (NMX-036-1997-NORMEX) no marca un valor específico para fructosa, sin embargo, la USDA considera como promedio un 38.5 % de fructosa y algunos autores han considerado un intervalo de 27.25 – 44.26 % de fructosa en la miel de abeja (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a), por lo tanto, los valores de fructosa de las mieles puras analizadas no se alejan mucho de esos valores, pero cabe mencionar que el contenido de azúcares en las mieles depende del lugar donde provienen (Arvanitoyannis, 2005; Apicultura, 2001). 2.7 Determinación de hidroximetilfurfural Los resultados obtenidos de hidroximetilfurfural, se muestran el Cuadro 8.

Cuadro 8. Contenido de hidroximetilfurfural en las mieles de abeja frescas. Miel Hidroximetilfurfural (mg/kg)

Chiapas 24.30 (± 0.36) Oaxaca 28.54 (± 0.08)

Estado de México 14.72 (± 0.08) Morelos 9.56 (± 0.08)

Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). Las cuatro mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) presentaron valores de hidroximetilfurfural por debajo de 40 mg/kg que es el valor máximo que debe presentar una miel envasada por menos de 6 meses, lo cual indica que las mieles son frescas y que no han sido sometidas a calor. Cuando la miel es sometida a altas temperaturas, parte de la fructosa y glucosa de la miel se deshidratan y se forma hidroximetilfurfural (Bogdanov, 2001; Arvanitoyannis, 2005). 2.8 Determinación de actividad acuosa (aw) Los resultados de aw obtenidos se presentan en el Cuadro 9. Se puede observar que los valores varían entre 0.58 y 0.6, lo cual corresponde a lo reportado por la literatura para mieles de abeja puras (Arvanitoyannis y col., 2005).

Cuadro 9. Actividad acuosa de las diferentes mieles de abeja analizadas. Miel aw

Chiapas 0.5815 (± 0.0007) Oaxaca 0.5860 (±0.009)

Estado de México 0.6085 (± 0.002) Morelos 0.5790 (± 0.001)

Los análisis se hicieron por triplicado, la desviación estándar se presenta entre paréntesis ( ). A partir del estudio de las propiedades químicas: humedad, ceniza, actividad diastásica, azúcares reductores, fructosa, glucosa y aw, se determinó que las mieles de abeja analizadas (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) son mieles puras y por lo tanto fueron utilizadas para el desarrollo de métodos quimiométricos para identificar posibles adulteraciones con edulcorantes más baratos (glucosa de maíz comercial, mezclas de azúcares, jarabe de alta fructosa y azúcar invertido). 2.9 Obtención de espectros de las mieles puras La lectura de los espectros se determinó con las condiciones descritas en la sección de métodos 1.9 La lectura de los espectros se obtuvo inicialmente en unidades de transmitancia (%T) y posteriormente se pasaron a unidades de absorbancia para su análisis. La Figura 1 muestra los espectros obtenidos en el HATR (Accesorio de Reflectancia Total Atenuada Horizontal) de las mieles de abeja puras provenientes de los estados de Chiapas, México, Morelos y Oaxaca, en las regiones del infrarrojo medio (4000 - 400 cm-1). En esta región del espectro infrarrojo se encuentran señales de las vibraciones de los enlaces moleculares con los cuales se puede precisar la composición química de las muestras. Los espectros de las mieles de abeja puras muestran bandas de absorbancia en aproximadamente 772, 915, 1021, 1250, 1342, 1412, 2885 y 2934 cm-1. La región de 1500 - 800 cm-1 corresponde a las zonas de absorción de los principales azúcares constituyentes de la miel: fructosa, glucosa y sacarosa. De 900 a 750 cm-1 son regiones características de configuraciones de sacáridos (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a). Las bandas de 1153 – 904 cm-1 son asignadas a los enlaces C-O y C-C de estiramiento y de 1474 – 1199 cm-1 a los enlaces O-C-H, C-C-H de flexión. Las bandas negativas obtenidas alrededor de 3635 y 1618 cm-1 son debido a las bajas concentraciones de agua en las muestras de miel, ya que se utilizó un blanco contra agua. Las bandas de 3000 a 2700 cm-1 pueden estar relacionadas con aminoácidos primarios (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a).

4000.0 3600 3200 2800 2400 2000 1800 1400 1200 1000 800 650.0-1.00 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2

2.50

Número de onda (cm-1)

ZONA DE LA HUELLA DIGITAL

___ Chiapas ___ Oaxaca ___ Morelos ___ Estado de México

Abs

orba

ncia

Figura 1. Espectros FTIR obtenidos en HATR de las mieles de abeja puras provenientes de los estados de Chiapas, México, Morelos y Oaxaca.

META 2. PREPARACIÓN DE LA SERIE DE CALIBRACIÓN 2.1 Preparación de la serie de muestras de miel adulterada con glucosa de maíz para el sistema de calibración y validación Para la construcción del sistema de calibración, se prepararon series de 49 muestras adulteradas con glucosa de maíz comercial (84 °Brix) para cada miel en el intervalo de 2-100% p/p con cambios de concentración de 2% p/p (Cuadro 10), con la finalidad de abarcar un amplio intervalo de adulteración. También fue necesario preparar 25 muestras de miel adulterada con glucosa de maíz que pertenecieran al mismo intervalo de concentración (2-100% p/p), para formar la serie de validación del método, la cual es necesaria para comprobar su funcionalidad.

Cuadro 10. Relación de las adulteraciones de las mieles puras con glucosa de maíz comercial. Solución Miel (g) Glucosa (g) Adulteración (%)

1 9.8 0.2 2 2 9.6 0.4 4 3 9.4 0.6 6 4 9.2 0.8 8 5 9.0 1.0 10 6 8.8 1.2 12 7 8.6 1.4 14 8 8.4 1.6 16

9 8.2 1.8 18 10 8.0 2.0 20 11 7.8 2.2 22 12 7.6 2.4 24 13 7.4 2.6 26 14 7.2 2.8 28 15 7.0 3.0 30 16 6.8 3.2 32 17 6.6 3.4 34 18 6.4 3.6 36 19 6.2 3.8 38 20 6.0 4.0 40 21 5.8 4.2 42 22 5.6 4.4 44 23 5.4 4.6 46 24 5.2 4.8 48 25 5.0 5.0 50 26 4.8 5.2 52 27 4.6 5.4 54 28 4.4 5.6 56 29 4.2 5.8 58 30 4.0 6.0 60 31 3.8 6.2 62 32 3.6 6.4 64 33 3.4 6.6 66 34 3.2 6.8 68 35 3.0 7.0 70 36 2.8 7.2 72 37 2.6 7.4 74 38 2.4 7.6 76 39 2.2 7.8 78 40 2.0 8.0 80 41 1.8 8.2 82 42 1.6 8.4 84 43 1.4 8.6 86 44 1.2 8.8 88 45 1.0 9.0 90 46 0.8 9.2 92 47 0.6 9.4 94 48 0.4 9.6 96 49 0.2 9.8 98

Nota: Adulteraciones en un intervalo de 2-100% de adulteración con glucosa comercial de maíz. 2.2 Preparación de las series de muestras de miel adulterada con mezclas de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa) para el sistema de calibración y validación. Se prepararon 45 mezclas de azucares (glucosa, fructosa y sacarosa) comprendiendo concentraciones de 5, 8, 10, 12, 15, 20 y 25% p/p de azúcar total, mediante diseños de mezclas con el programa estadístico MINITAB 14. Con estas mezclas de azucares se realizaron soluciones a 80 °Brix (esta concentración es igual que la de la miel) para adulterar a las mieles en estudio. Las concentraciones individuales de cada azúcar adulterante variaron una con respecto a la otra de tal forma que se cubrieron concentraciones altas y pequeñas (Cuadro 11). La bibliografía reporta que en este intervalo de concentraciones es donde se han detectado adulteraciones en la miel de abeja (Sivakesava y Irudayaraj, 2001a).

Se prepararon también 15 muestras de miel adulterada con las soluciones de mezclas de azúcares dentro del intervalo de 5-25% p/p, sin que pertenecieran a la serie de calibración (Cuadro 11) para formar la serie de validación del método.

Cuadro 11. Soluciones de mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa utilizadas para adulterar las mieles en estudio y formar el sistema de calibración.

Solución Glucosa (% p/p)

Fructosa ( % p/p)

Sacarosa (% p/p)

Concentración total de azúcar (% p/p)

1 0.5 4 0.5 5 2 1 3.0 1.0 5 3 1.5 2.0 1.5 5 4 2.0 1.5 1.5 5 5 2.5 1.5 1.0 5 6 3.0 1.0 1.0 5 7 3.5 1.0 0.5 5 8 1.0 2.0 5.0 8 9 2.0 3.0 3.0 8

10 3.0 1.0 4.0 8 11 2.0 5.0 1.0 8 12 6.6 2.4 1.0 10 13 6.6 1.0 2.4 10 14 5.2 1.0 3.8 10 15 3.8 5.2 1.0 10 16 2.4 6.6 1.0 10 17 2.4 2.4 5.2 10 18 2.4 1.0 6.6 10 19 1.0 8.0 1.0 10 20 1.0 2.4 6.6 10 21 1.0 1.0 8.0 10 22 1.0 10.0 1.0 12 23 5.5 5.5 1.0 12 24 5.5 1.0 5.5 12 25 1.0 5.5 5.5 12 26 7.0 2.5 2.5 12 27 2.5 7.0 2.5 12 28 5.0 5.0 5.0 15 29 10.0 4.0 1.0 15 30 7.0 7.0 1.0 15 31 10.0 1.0 4.0 15 32 1.0 13.0 1.0 15 33 1.0 10.0 4.0 15 34 3.0 9.0 3.0 15 35 11.2 4.4 4.4 20 36 7.8 7.8 4.4 20 37 7.8 4.4 7.8 20 38 4.4 14.6 1.0 20 39 4.4 11.2 4.4 20 40 4.4 7.8 7.8 20 41 4.4 4.4 11.2 20 42 9.8 9.8 5.4 25 43 7.6 14.2 3.2 25 44 5.4 12.0 7.6 25 45 3.2 7.6 14.2 25

Nota: Datos generados por diseño de mezclas con MINITAB 14

2.3 Preparación de la serie de muestras de miel adulterada con jarabe de alta fructosa (HFCS 55) para el sistema de calibración y validación Para la construcción del sistema de calibración para la miel adulterada con HFCS 55 (77.5 °Brix), se prepararon series de 30 muestras adulteradas para cada miel en el intervalo de 2-60% p/p con intervalos de concentración de 2% p/p (Cuadro 12). También fue necesario preparar 15 muestras de miel adulterada con jarabe de alta fructosa que pertenecieran al mismo intervalo de concentración (2-60% p/p) (pero no utilizadas en la calibración), para formar la serie de validación del método.

Cuadro 12. Relación de las adulteraciones de las mieles puras con jarabe de alta fructosa (HFCS 55).

Solución Miel (g) HFCS 55 (g) Adulteración (%) 1 9.8 0.2 2 2 9.6 0.4 4 3 9.4 0.6 6 4 9.2 0.8 8 5 9.0 1.0 10 6 8.8 1.2 12 7 8.6 1.4 14 8 8.4 1.6 16 9 8.2 1.8 18

10 8.0 2.0 20 11 7.8 2.2 22 12 7.6 2.4 24 13 7.4 2.6 26 14 7.2 2.8 28 15 7.0 3.0 30 16 6.8 3.2 32 17 6.6 3.4 34 18 6.4 3.6 36 19 6.2 3.8 38 20 6.0 4.0 40 21 5.8 4.2 42 22 5.6 4.4 44 23 5.4 4.6 46 24 5.2 4.8 48 25 5.0 5.0 50 26 4.8 5.2 52 27 4.6 5.4 54 28 4.4 5.6 56 29 4.2 5.8 58 30 4.0 6.0 60

Nota: Adulteraciones en un intervalo de 2-60% (p/p) con jarabe de alta fructosa (HFCS 55). Cabe mencionar que hasta un 14% de adulteración, no se modifican los 80 °Brix de la miel, a partir del 16 a 60% de adulteración se mantienen entre los valores de 79.5 a 77.5°Brix, como se puede observar, es difícil identificar por índice de refracción una miel adulterada, ya que hay mieles con valores de hasta 75 °Brix. 2.4 Preparación de la serie de muestras de miel adulterada con azúcar invertido (tipo AI) para el sistema de calibración y validación Para la construcción del sistema de calibración para la miel adulterada con azúcar invertido (tipo AI) (76.5 °Brix), se prepararon series de 25 muestras adulteradas para cada miel en el intervalo de 2-50% p/p con intervalos de concentración de 2% p/p (Cuadro 13). También fue necesario preparar 13

muestras de miel adulterada con azúcar invertido que pertenecieran al mismo intervalo de concentración (2-50% p/p) (pero no utilizadas en la calibración), para formar la serie de validación del método.

Cuadro 13. Relación de las adulteraciones de las mieles puras con azúcar invertido (tipo AI). Solución Miel (g) Azúcar invertido (AI) (g) Adulteración (%)

1 9.8 0.2 2 2 9.6 0.4 4 3 9.4 0.6 6 4 9.2 0.8 8 5 9.0 1.0 10 6 8.8 1.2 12 7 8.6 1.4 14 8 8.4 1.6 16 9 8.2 1.8 18

10 8.0 2.0 20 11 7.8 2.2 22 12 7.6 2.4 24 13 7.4 2.6 26 14 7.2 2.8 28 15 7.0 3.0 30 16 6.8 3.2 32 17 6.6 3.4 34 18 6.4 3.6 36 19 6.2 3.8 38 20 6.0 4.0 40 21 5.8 4.2 42 22 5.6 4.4 44 23 5.4 4.6 46 24 5.2 4.8 48 25 5.0 5.0 50

Nota: Adulteraciones en un intervalo de 2-50% (p/p) de adulteración con azúcar invertido (AI). Cabe mencionar que hasta un 20% de adulteración, no se modifican los 80 °Brix de la miel, a partir del 22 a 50% de adulteración se mantienen entre los valores de 79.5 a 77.5°Brix, como se puede observar, al igual que con HFCS 55, es difícil identificar por índice de refracción una miel adulterada, ya que hay mieles con valores de hasta 75 °Brix.

META 3. SELECCIÓN DE METAS ESPECTRALES

3.1 Elección de la región espectral para los modelos de calibración Un importante parámetro para el desarrollo de un método quimiométrico es la región espectral que se utilizó en la construcción del modelo de calibración, lo cual hizo necesario el análisis del espectro FTIR-HATR para seleccionar la región espectral más adecuada para el método. La literatura informa que si en el espectro de la muestra existen regiones en donde las bandas de absorción son muy intensas, estas no serán lineales con respecto a la Ley de Beer, por lo que no es adecuado utilizarlas (Sivakesava e Irudayaraj, 2001). Una de las formas que se emplearon para identificar las regiones espectrales adecuadas, fue seleccionar la mejor la correlación espectral entre las concentraciones del adulterante (mezcla de azúcares, glucosa de maíz comercial, jarabe de alta fructosa y azúcar invertido) y la absorbancia. Las regiones que presentaron la mayor correlación fueron las más

indicadas para utilizarse en la construcción del modelo de calibración para cada sistema de adulteración estudiado. 3.2 Obtención de espectros de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con glucosa de maíz comercial Se obtuvieron 296 espectros (49 espectros para calibración y 25 para validación por miel) de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con glucosa de maíz comercial. Se determinó el índice de refracción y los °Brix de cada muestra adulterada para monitorear que se mantuvieran cerca del valor de 80 °Brix que tienen en promedio las mieles de abeja puras. Los espectros de cada muestra de las mieles adulteradas se determinaron bajo las mismas condiciones de trabajo empleadas en la determinación de los espectros de las mieles puras (de la sección de métodos de la Meta 1). En las Figuras 2 y 3 se muestra un ejemplo de 25 espectros FTIR-HATR de los 49 obtenidos de las muestras de miel de abeja de Chiapas adulterada con glucosa de maíz para el sistema de calibración. En la Figura 2 se observa toda la zona de absorción de 4000 – 650 cm-1 y en la Figura 6 se hace un acercamiento de la zona de absorción de la huella digital que corresponde a los mayores azúcares constituyentes de la miel (1500 – 800 cm-1). En la Figura 3 se puede observar que existe una diferencia proporcional entre algunas zonas de absorción con la concentración, lo cual es esencial para el desarrollo del método quimiométrico. Esto se realizó también para las mieles de Oaxaca, Morelos y Estado de México y los espectros obtenidos en la zona de la huella digital se presentan en el apéndice II.

Aumento de adulteración

Figura 2. Espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con glucosa de maíz obtenidos con HATR.


Figura 3. Región amplificada de 1600 – 800 cm-1 de los espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con glucosa de maíz obtenidos con HATR. 3.3 Obtención de espectros de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con mezclas de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa) Se obtuvieron 280 espectros (45 espectros para calibración y 25 para validación por miel) de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con las mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa. Se determinó el índice de refracción y los °Brix de cada muestra adulterada para monitorear que se mantuvieran cerca del valor de 80 °Brix que tienen en promedio las mieles de abeja puras. Los espectros de cada muestra de las mieles adulteradas se determinaron bajo las mismas condiciones de trabajo empleadas en la determinación de los espectros de las mieles puras. En las Figuras 4 y 5 se muestra un ejemplo de 25 espectros FTIR-HATR de los 45 obtenidos de las muestras de miel de abeja de Chiapas adulterada con los jarabes obtenidos de las mezclas de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa) para el sistema de calibración. En la Figura 4 se observa toda la zona de absorción de 4000 - 650 cm-1 y en la Figura 5 se hace un acercamiento de la zona de absorción de la huella digital que corresponde a los mayores azúcares constituyentes de la miel (1500 - 800 cm-1). En la Figura 5 se puede observar que existe una diferencia proporcional entre algunas zonas de absorción con la concentración, lo cual es esencial para el desarrollo del método quimiométrico. Esto se realizó también para las mieles de Oaxaca, Morelos y Estado de México y los espectros obtenidos se muestran en el apéndice III.


Figura 4. Espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con mezclas de azucares (glucosa, fructosa y sacarosa) obtenidos con HATR.


Figura 5. Región amplificada de 1600 – 800 cm-1 de los espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con mezclas de azucares (glucosa, fructosa y sacarosa) obtenidos con HATR. 3.4 Obtención de espectros de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con jarabe de alta fructosa (HFCS 55) Se obtuvieron 180 espectros (30 espectros para calibración y 15 para validación por miel) de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con jarabe de alta fructosa (HFCS 55). Se determinó el índice de refracción y los °Brix de cada muestra adulterada para monitorear que se mantuvieran cerca del valor de 80 °Brix que tienen en promedio las mieles de abeja puras. Los espectros de cada muestra de las mieles adulteradas se determinaron bajo las mismas condiciones de trabajo empleadas en la determinación de los espectros de las mieles puras. En las Figuras 6 y 7 se muestran los 30 espectros FTIR-HATR obtenidos de las muestras de miel de abeja de Chiapas adulterada con jarabe de alta fructosa (HFCS 55) para el sistema de calibración. En la Figura 6 se observa toda la zona de absorción de 4000 - 650 cm-1 y en la Figura 7 se hace un acercamiento de la zona de absorción que corresponde a los mayores azúcares constituyentes de la miel (1500 - 800 cm-1). En la Figura 7 se puede observar que existe una diferencia proporcional entre algunas zonas de absorción con la concentración, lo cual es esencial para el desarrollo del método quimiométrico. Esto se realizó también para las mieles de Oaxaca, Morelos y Estado de México e igual que en los otros casos anteriores se presentan en el apéndice lV.


Figura 6. Espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con jarabe de alta fructosa (HFCS 55) obtenidos con HATR.


Figura 7. Región amplificada de 1600 – 800 cm-1 de los espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada jarabe de alta fructosa (HFCS 55) obtenidos con HATR.

3.5 Obtención de espectros de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con azúcar invertido (tipo AI) Se obtuvieron 160 espectros (25 espectros para calibración y 15 para validación por miel) de las mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con azúcar invertido (tipo AI). Se determinó el índice de refracción y los °Brix de cada muestra adulterada para monitorear que se mantuvieran cerca del valor de 80 °Brix que tienen en promedio las mieles de abeja puras. Los espectros de cada muestra de las mieles adulteradas se determinaron bajo las mismas condiciones de trabajo empleadas en la determinación de los espectros de las mieles puras. En las Figuras 8 y 9 se muestran los 25 espectros FTIR-HATR obtenidos de las muestras de miel de Chiapas adulterada con azúcar invertido para el sistema de calibración. En la Figura 8 se observa toda la zona de absorción de 4000 - 650 cm-1 y en la Figura 9 se hace un acercamiento de la zona de absorción que corresponde a los mayores azúcares constituyentes de la miel (1500 - 800 cm-1). En la Figura 9 se puede observar que existe una diferencia proporcional entre algunas zonas de absorción con la concentración, lo cual es esencial para el desarrollo del método quimiométrico.


Figura 8. Espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con azúcar invertido (tipo AI) obtenidos con HATR.


Figura 9. Región amplificada de 1600 – 800 cm-1 de los espectros FTIR de miel de abeja del Estado de Chiapas adulterada con azúcar invertido (tipo AI) obtenidos con HATR. 3.6 Selección de la región espectral para la calibración Un importante parámetro que se utilizó en el método de calibración es la selección del intervalo espectral para la construcción del modelo. Primeramente, se alimentaron los espectros FTIR-HATR de cada sistema de calibración de los diferentes adulterantes por separado al programa multivariante QUANT+ por medio del programa Spectrum. A cada sistema de calibración se le dio un nombre, se especificó su ubicación y el número de variables que se trabajaron, para el caso de la adulteración con glucosa de maíz comercial, jarabe de alta fructosa y azúcar invertido, fue una variable; en cambio, para la adulteración de las mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa, fueron tres variables. Posteriormente, se asignó el valor del porcentaje de adulteración que le correspondía a cada espectro y se especificaron las condiciones de trabajo, entre estas condiciones se encontraba la región espectral. Si son regiones con fuertes picos de absorción (no linear con respecto a la Ley de Beer) es mejor escoger regiones de otro lado excluyendo esas bandas. Aunque los factores de análisis PLS1, PLS2 y PCR pueden corregir algunas no linearidades, no pueden corregir sobreabsorbancias (A > 3.0). Además es necesario hacer un análisis espectral y seleccionar las regiones que muestran alta correlación entre absorbancia (o %T) y concentración de los adulterantes (Sivakesava e Irudayaraj, 2001a,b). Las regiones espectrales seleccionadas para construir el modelo de calibración de cada sistema de mieles (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) adulteradas con glucosa de maíz comercial, jarabe de alta fructosa, azúcar invertido y mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa fue de 4000 - 650 cm -1, ya que en toda la región se encontró una alta correlación entre absorbancia y la concentración de los adulterantes. Cabe mencionar, que en la adulteración con mezclas de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa), se obtuvieron espectros muy similares a los de la miel de abeja pura y a los de las muestras adulteradas con glucosa de maíz, jarabe de alta fructosa y azúcar invertido, por eso se consideró el mismo intervalo espectral (4000 – 650 cm-1).

Meta 4. OBTENCIÓN DEL MODELO DE CALIBRACIÓN Y VALIDACIÓN DEL MODELO DE PREDICCIÓN

4.1 Obtención de los modelos de calibración para cada adulterante Para obtener los modelos de calibración para cada adulterante (glucosa comercial de maíz, mezclas de azucares, jarabe de alta fructosa y azúcar invertido), se alimentaron los espectros FTIR-HATR de las muestras adulteradas pertenecientes a cada sistema de calibración, al programa multivariante QUANT+ junto con las concentraciones respectivas de adulterante. Se probaron los tres algoritmos con que cuenta el programa: PLS1 (Mínimos cuadrados parciales, sin interacción de variables), PCR (Regresión de componentes principales) y PLS2 (Mínimos cuadrados parciales, con interacción de variables). 4.2 Optimización de los modelos de calibración para cada adulterante Se realizó la optimización de los métodos obtenidos, en donde se variaron diferentes parámetros entre cada corrida de cada uno de los métodos, tales como: las regiones espectrales, el intervalo del espectro, la disminución de ruido por medio de suavizar los espectros (smothing), el mínimo de absorbancia considerado para el análisis de los espectros, las regiones de blancos y el número de factores. La selección del mejor método de calibración dependió de los siguientes criterios estadísticos: a) el número de factores, b) el error estándar de calibración (SEC), y c) el coeficiente de correlación, R2, el cual debe ser lo más cercano a 1. En caso de que los criterios estadísticos no sean los adecuados, se procede a un análisis de “outliers” (muestras que se alejan mucho de las características de la población total de muestras y que tiene una distancia de Mahalonobis (parámetro estadístico) mayor a 1, para eliminarlas. Por otro lado, se tendrá que aumentar el número de muestras de la serie de calibración para ver su efecto sobre los parámetros estadísticos anteriores y ver la mejora del método. 4.3 Análisis de los parámetros estadísticos de los sistemas de calibración de mieles de abeja adulteradas con glucosa de maíz comercial, mezcla de azúcares (glucosa, fructosa y sacarosa), jarabe de alta fructosa (HFCS 55) y azúcar invertido, aplicando los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR y su posterior validación Los modelos de calibración multivariable para cada miel de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) fueron desarrollados utilizando los algorítmos PLS1, PLS2 y PCR. Estos modelos establecieron una correlación entre los datos espectrales y las concentraciones de adulterante(s) (glucosa de maíz comercial, jarabe de alta fructosa, azúcar invertido y mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa). En la construcción de cada modelo, se obtuvieron datos estadísticos para cada sistema de adulteración (glucosa de maíz comercial, jarabe de alta fructosa, azúcar invertido y mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa) y para cada algoritmo utilizado (PLS1, PLS2 y PCR), los cuales ayudaron a la elección del mejor modelo de calibración. Ejemplos de estos datos estadísticos se muestran en las Figuras 14 – 19 que corresponden a la adulteración de miel de Chiapas con glucosa de maíz comercial obtenidos con el algoritmo PLS1, estos datos se obtuvieron después de analizar y modificar los parámetros (las regiones espectrales, el intervalo del espectro, la disminución de ruido por medio de suavizar los espectros (smothing), el mínimo de absorbancia considerado para el análisis de los espectros, las regiones de blancos y el número de factores) en 5 modelos previos para lograr la optimización. Los gráficos pertenecen al método quimiométrico ya optimizado. Para los casos de los otros tres edulcorantes, se requirió variar los parámetros antes mencionados de más de 15 modelos previos (hasta 30) para lograr la optimización del modelo de calibración.

En la Figura 10 se observa la correlación obtenida de los datos especificados (concentraciones reales del adulterante) y estimados (concentraciones estimadas del adulterante) de la adulteración de la miel de abeja de Chiapas con glucosa de maíz comercial con el algoritmo PLS1 para la serie de calibración. En ésta Figura se observa que la correlación es muy cercana a 1 (R2=0.9981) y éste es uno de los indicadores para determinar que la predicción del método es buena. Los valores de los coeficientes de correlación para los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR para todos los sistemas de calibración y validación se muestran en los Cuadros 18,19 ,20 y 21 (pág. 73- 78).

VALORES ESPECIFICADOS (%) VS ESTIMADOS (%) DE LA SERIE DE CALIBRACIÓN DE LA MIEL DE CHIAPAS OBTENIDOS CON PLS1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

ESPECIFICADOS (%)

ESTIMADOS(%)

R2 = 0.9987

Figura 10. Gráfica de calibración de los valores especificados (reales) y estimados para la miel de abeja de Chiapas adulterada con glucosa comercial de maíz obtenida con el algorítmo PLS1 optimizado. En la construcción del modelo de calibración se buscan obtener errores de calibración y de predicción por debajo de 3 (hasta 3.5 máximo) para que sea confiable, en la Figura 10 se puede observar que en donde se tiene el menor SEP (Error Estándar de Predicción) es con un número de componentes principales o factores de 6 (zonas espectrales que contribuyen a la variabilidad en la absorbancia de los espectros), es decir que para la construcción del modelo es el óptimo número de factores que se utilizó. Los factores representan todas las fuentes significativas de variación en los datos de los espectros, cada factor representa una individual fuente de variación. Este número de factores óptimo no se obtiene con el primer sistema de calibración, sino que, hay que optimizar el método para obtenerlo, es decir, se corre el programa variando el número de factores “n” veces. En la Figura 11 también de puede observar que al aumentar al número de factores, disminuye el SEP, sin embargo, no siempre se tiene este comportamiento, puesto que llega un momento en que al aumentar el número de factores, aumenta el SEP, debido a que lo que se toma en cuenta es el ruido espectral y no las variaciones espectrales. Este hecho debe considerarse al realizar la optimización del método. También se obtuvo el número de factores para los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR de las mieles en estudio sometidas a todos los tipos de adulteración (glucosa comercial de maíz, jarabe de alta fructosa, azúcar invertido y mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa), los cuales se muestran en los Cuadros 18, 19, 20 y 21 (pág. 74 - 79). La Figura 12 muestra el espectro de regresión que representa el 46.19% de variación de los espectros de la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial, con el factor o componente principal 1; por lo tanto, los otros 5 componentes representan el 53.81% de la variación espectral, utilizando el algoritmo PLS1. Espectros similares se obtuvieron para cada algoritmo (PLS1, PLS2 y PCR) y para cada tipo de adulteración de las mieles en estudio.

0.0 2 4 6 7.01.1

10

20

29.6

PCs en modelo

SEP

Est

imad

o

Figura 11. Gráfica del número de componentes rincipales contra el error estándar de predicción obtenida con el algoritmo PLS1 en el método quimiométrico desarrollado con la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial.

4000.0 3500 3000 2500 2000 1500 1000 648.0-1.24

-1.0

-0.5

0.0

0.5

0.91

cm-1

PC

1 (4

6.19

%)

Figura 12. Gráfica del número onda contra el componente principal 1 obtenida con el algorítmo PLS1 en el método quimiométrico desarrollado con la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial.

La Figura 13 muestra la influencia que tuvo cada zona espectral en el desarrollo del método quimiométrico. Se puede observar que tres regiones de todo el intervalo espectral en el que se trabajó (4000 – 650 cm-1) contribuyeron más para la construcción del método utilizando el algoritmo PLS1. Se obtuvieron graficas de influencia para cada algoritmo utilizado (PLS1, PLS2 y PCR) y para cada sistema de calibración de mieles adulteradas. En las Figuras 14, 15 y 16 se observa que en el método optimizado existieron algunas muestras, cuatro en este caso, que se alejan con respecto a la población, esto es porque presentan más variaciones espectrales con respecto a las demás, sin embargo, esto no indica que deban rechazarse, ya que estas variaciones pudieron ser importantes en la construcción del método de calibración. En el caso de la Figura 14, existen muestras que están por arriba de la línea de división horizontal, las cuales representan algunas variaciones diferentes al resto de la población. Algo similar sucede en la Figura 15, aunque algunas muestras se encuentren un poco alejadas de las demás presentan una alta contribución, y en este gráfico se puede observar que las variaciones son aceptables, ya que presentan una distancia de Mahalanobis menor a 1, la distancia de Mahalanobis es un método lineal de análisis de discriminación. La influencia positiva de estas muestras se confirma con la Figura 16, aquí se puede observar que las muestras tienen valores de residuales con valores menores a 2, lo cual es muy aceptable. Estos resultados correspondientes al modelo optimizado, muestran que se logró obtener la contribución de la mayoría de las muestras de miel de Chiapas adulterada con glucosa comercial de maíz, obteniéndose una buena correlación espectral con las concentraciones de adulterante, lo cual se comprueba con los valores de los coeficientes de correlación y de los errores de calibración y predicción de los Cuadros 18, 19, 20 y 21 (pág. 74 - 79). Lo mismo se realizó para cada sistema de calibración de cada miel de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) con los diferentes adulterantes (glucosa de maíz comercial, jarabe de alta fructosa, azúcar invertido y mezclas de glucosa fructosa y sacarosa) y con cada algoritmo (PLS1, PLS2 y PCR).

Los métodos que finalmente fueron seleccionados, ya optimizados, para cada uno de los algoritmos empleados (PLS1, PLS2 y PCR), se muestran en los Cuadros 18, 19, 20 y 21; la región espectral en la que se trabajó fue la región completa del espectro, de 4000 a 650 cm-1, que fue el intervalo en el que se obtiene la mayor correlación. En los Cuadros 18, 19, 20 y 21 también se muestran los coeficientes de correlación de las series de validación, los cuales se calcularon en el programa Excel, recopilando cada respuesta de predicción del programa QUANT+ para cada una de las muestras de validación correspondientes a cada algoritmo (PLS1, PLS2 y PCR) y a cada tipo de adulteración (con glucosa de maíz comercial, con jarabe de alta fructosa, azúcar invertido y con mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa). Estos fueron aproximadamente 1176 datos que fueron extraídos de los reportes de predicción para graficar los valores predichos contra los especificados o reales y así obtener el valor del coeficiente de validación el cual indica que el método quimiométrico desarrollado es aceptable (las gráficas de los valores reales y predichos de los mejores modelos obtenidos, se encuentran en el apéndice VI ).

1.0 10 20 30 40 50.50.02

0.2

0.4

0.55

Muestra

Influ

enci

a

4000.0 3000 2000 1000 648.00.00

0.1

0.2

0.32

cm-1

Influ

enci

a

Figura 13. Gráfica del número onda contra la influencia obtenida con el algorítmo PLS1 en el método quimiométrico desarrollado con la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial.

Figura 14. Gráfica de la influencia obtenida con el algorítmo PLS1 en el método quimiométrico desarrollado con la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial.

Figura 15. Gráfica de la influencia con respecto a la distancia de Mahalanobis en la construcción del método obtenida con el algorítmo PLS1 en el método quimiométrico desarrollado con la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial.

Figura 16. Gráfica de residuales con respecto la influencia obtenida con el algorítmo PLS1 en el método quimiométrico desarrollado con la miel de Chiapas adulterada con glucosa de maíz comercial

x

xx

xx

xxxx

x

xxx

x

xxx

x

xxxxx

x

xxxx

x

x

xxxxxxxxxxxxxxx

x

0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.520.0

1

2.0

Influencia

Dis

tanc

ia

0.00 0.1 0.2 0.3 0.4 0.520.0

1

2

3

3.7

Influencia

Res

idua

les

xx xx xxxx xx xx xxx xx xxxxxx xx xx xx xxxx xxx x xxx x xxxx x

xx

xx x

x

x

x

x

x

x

x

xx

x

xx

x

x

xx

x

x

x

xx

x

x

xxxx

xxx

xx x

xxx

xxxx

x

Al realizar el análisis de los datos presentados en el Cuadro 18, se observa que en general todos los valores de coeficientes de correlación correspondientes al sistema de calibración para las 4 mieles de abeja analizadas (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) son muy cercanos a la unidad para cualquiera de los tres algoritmos (PLS1, PL2 y PCR) en la construcción del método quimiométrico cuando se adulteró con glucosa de maíz comercial. El mismo comportamiento se observa para los valores de los coeficientes de correlación para el sistema de validación, lo cual indica que todos los métodos obtenidos son confiables para predecir la concentración de los adulterantes. Cabe mencionar, que aunque en general los errores de predicción (SEP) son mayores que los de calibración (SEC), no rebasan el valor máximo (= 3.5) permitido para realizar una buena predicción. Por lo tanto, los mejores métodos para las cuatro mieles (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) fueron los obtenidos con el algoritmo PLS2 enfatizado en negritas, ya que es el que presenta los mayores coeficientes de correlación (R2= 0.9988, 0.9994, 0.9966 y 0.9984, respectivamente) y SEP menores al valor máximo (= 3.5) en los 4 casos.

Cuadro 18. Número de factores, coeficientes de correlación, error estándar de calibración y error estándar de predicción correspondientes a los métodos quimiométricos obtenidos con los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR de las diferentes mieles de abeja adulteradas con glucosa de maíz comercial.

Algoritmo Factoresa R2b SECc R2

b

Validación SEPd

MIEL DE CHIAPAS PLS1 6 0.9987 1.168 0.9981 2.065 PLS2 7 0.992 0.9365 0.9988 1.905 PCR 4 0.9916 2.839 0.9896 3.248

MIEL DE OAXACA PLS1 6 0.9993 0.8705 0.9989 1.719 PLS2 7 0.9995 0.6853 0.9994 1.500 PCR 5 0.9923 2.734 0.996 3.5

MIEL DEL ESTADO DE MEXICO PLS1 4 0.9987 1.156 0.9966 1.655 PLS2 6 0.9987 1.209 0.9966 1.567 PCR 7 0.9982 1.327 0.9952 1.587

MIEL DE MORELOS PLS1 5 0.9988 1.075 0.9978 1.387 PLS2 8 0.9996 0.6362 0.9984 1.171 PCR 8 0.9983 1.309 0.9966 1.508

a Optimo número de factores b Coeficiente de correlación c Error estándar de calibración d Error estándar de predicción Nota: El algoritmo con un mayor valor de correlación (R2)de validación se presenta en negritas. En el Cuadro 19, se muestran los resultados de las adulteraciones con mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa, en donde se puede observar que en general los coeficientes de correlación para calibración y predicción, son mayores para sacarosa, luego le sigue fructosa y por último glucosa, cuando se utilizó el algoritmo PLS1. Los coeficientes de validación muestran que la predicción de los tres componentes (Glucosa, Fructosa y Sacarosa) es bastante confiable. En cuanto a los algoritmos PLS2 y PCR, para sacarosa se observa el mismo comportamiento, no así para fructosa y glucosa. En lo que respecta a los errores de calibración (SEC) y predicción (SEP), el de predicción es mayor para todos los algoritmos (PLS1, PLS2 y PCR), pero no rebasa el límite máximo (= 3.5) y por lo tanto es confiable. Por lo que todos los métodos obtenidos, son confiables para predecir. Por lo tanto, los mejores algoritmos para la predicción de los adulterantes en la miel de abeja de Chiapas son: para glucosa PLS1 (R2= 0.9369 y SEP= 1.212), para fructosa PLS2 (R2= 0.9316 y

SEP= 1.193) y para sacarosa PLS1 (R2= 0.9553 y SEP= 0.5021), los cuales se encuentran enfatizados en negritas en el Cuadro 19. En lo que respecta a la miel de abeja de Oaxaca: para glucosa, fructosa y sacarosa PLS1 (enfatizado en negritas) fue el mejor algorítmo (R2= 0.8534, 0.901, 0.9173 y SEP= 1.876, 1.629, 0.3740, respectivamente). En la miel de abeja del Estado de México: para glucosa y fructosa fue el algoritmo PCR (R2= 0.8459, 0.916 y SEP= 1.231, 1.555, respectivamente); para sacarosa fue PLS2 (R2= 0.9542 y SEP= 0.8802), los cuales se encuentran enfatizados en negritas. Finalmente, en la miel de abeja de Morelos se obtuvo: para glucosa y fructosa fue el algoritmo PLS1 (enfatizados en negritas) (R2= 0.8808, 0.9053 y SEP= 1.835, 1.528, respectivamente) y para sacarosa PLS2 (R2= 0.9728 y SEP=1.003).

Cuadro 19. Número de factores, coeficientes de correlación, error estándar de calibración y error estándar de predicción correspondientes a los métodos quimiométricos obtenidos con los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR de las diferentes mieles de abeja adulteradas con mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa.


b Validación

SEPd

MIEL DE CHIAPAS PLS1

Glucosa 4 0.9412 0.7727 0.9369 1.212 Fructosa 4 0.9559 0.7135 0.9157 1.306

Sacarosa 4 0.9828 0.2695 0.9553 0.5021 PLS2

Glucosa 8 0.9721 0.5956 0.8816 1.028 Fructosa 8 0.9787 0.5544 0.9316 1.193 Sacarosa 5 0.9567 0.4377 0.8292 0.6011

PCR Glucosa 5 0.8291 1.358 0.5958 1.596 Fructosa 5 0.9118 1.052 0.8472 1.487 Sacarosa 5 0.9422 0.4290 0.9365 0.5729

MIEL DE OAXACA PLS1


PLS2 Glucosa 5 0.7025 1.840 0.6857 2.153 Fructosa 5 0.9789 0.5985 0.8503 0.8859 Sacarosa 5 0.9744 0.4654 0.781 0.6538

PCR Glucosa 7 0.8305 1.292 0.8166 1.607 Fructosa 2 0.6546 2.394 0.7552 2.390 Sacarosa 4 0.9610 0.6282 0.9103 0.7248

Cuadro 19 (continuación). Número de factores, coeficientes de correlación, error estándar de calibración y error estándar de predicción correspondientes a los métodos quimiométricos obtenidos con los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR de las diferentes mieles de abeja adulteradas con mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa.


b Validación

SEPd

MIEL DEL ESTADO DE MÉXICO PLS1


PLS2 Glucosa 8 0.8728 1.139 0.7288 1.504 Fructosa 6 0.8807 1.430 0.8964 1.706

Sacarosa 8 0.9468 0.6662 0.9542 0.8802 PCR


MIEL DE MORELOS PLS1


PLS2 Glucosa 8 0.8888 1.082 0.7253 1.823 Fructosa 4 0.7408 2.010 0.8348 2.148

Sacarosa 6 0.9311 0.8659 0.9728 1.003 PCR

Glucosa 8 0.8220 1.369 0.7366 1.868 Fructosa 1 0.3758 3.182 0.483 2.933 Sacarosa 5 0.9177 0.9376 0,9584 1.132

a Optimo número de factores b Coeficiente de correlación c Error estándar de calibración d Error estándar de predicción Nota: El algoritmo con un mayor valor de correlación de validación se presenta en negritas. En el Cuadro 20, se muestran los resultados obtenidos de las adulteraciones con jarabe de alta fructosa (HFCS 55). El rango en el que se trabajó fue de 3000 – 800 cm-1, que es en donde se presentó la mejor correlación. Se puede observar que los mejores métodos para predecir el adulterante se obtuvieron con el algoritmo PLS1, en donde los coeficientes de correlación en la validación, presentaron los mayores valores. Por lo tanto, estos modelos se pueden utilizar para determinar si la miel está adulterada con jarabe de alta fructosa (HFCS 55) en las concentraciones de 2 a 60% de adulteración.

Cuadro 20. Número de factores, coeficientes de correlación, error estándar de calibración y error estándar de predicción correspondientes a los métodos quimiométricos obtenidos con los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR de las diferentes mieles de abeja adulteradas con jarabe de alta fructosa (HFCS 55).


b

Validación SEPd





a Optimo número de factores b Coeficiente de correlación c Error estándar de calibración d Error estándar de predicción Nota: El algoritmo con un mayor valor de correlación de validación se presenta en negritas. En el Cuadro 21, se muestran los resultados obtenidos de las adulteraciones con azúcar invertido. Se puede observar que los mejores métodos para predecir el adulterante son: para la miel de Chiapas, PLS1 y PLS2, ya que presentaron las mismas correlaciones; y para la miel de Oaxaca, Morelos y Estado de México, fue PLS1. Los métodos obtenidos, al igual que en las adulteraciones anteriores, son capaces de identificar adulteraciones con azúcar invertido en un 2 a 50% de adulteración.

Cuadro 21. Número de factores, coeficientes de correlación, error estándar de calibración y error estándar de predicción correspondientes a los métodos quimiométricos obtenidos con los algoritmos PLS1, PLS2 y PCR de las diferentes mieles de abeja adulteradas con azúcar invertido.

Algoritmo Factoresa R2

b SECc R2b

Validación SEPd





a Optimo número de factores b Coeficiente de correlación c Error estándar de calibración d Error estándar de predicción Nota: El algoritmo con un mayor valor de correlación de validación se presenta en negritas. Como se puede observar en las Tablas anteriores (18–21), los métodos quimiométricos desarrollados detectaron adulteraciones más bajas (2-98% para glucosa de maíz; 5-25% para mezclas de azúcares, 2-60% para HFCS y 2-50% para azúcar invertido) que otros métodos convencionales, tales como cromatografía de gases que solo detecta hasta 13% de adulteración en miel de abeja (Low, 1995).

CONCLUSIONES

• Se desarrolló un método quimiométrico por Espectroscopia Infrarroja por Transformada

de Fourier Reflectancia Total Atenuada Horizontal capaz de detectar adulteraciones en la miel de abeja de los estados de Chiapas, Oaxaca, Morelos y Estado de México.

• Se realizó la caracterización química de las mieles de abeja provenientes de Chiapas,

Oaxaca, Morelos y Estado de México, la cuales presentaron valores de humedad, ceniza, índice de diastasa, azúcares reductores, fructosa y glucosa dentro de los límites para mieles puras según lo indica la norma NMX-036-1997-NORMEX, por lo tanto pudieron ser utilizadas para el análisis de adulteración.

• Se prepararon muestras de miel de abeja adulteradas con mezclas de azúcares

(sacarosa, glucosa y fructosa), jarabe de maíz, soluciones de maltodextrina, jarabe de alta fructosa y azúcar invertido a diferentes concentraciones.

• Los espectros FTIR de las 4 mieles de abeja puras obtenidos con HATR son muy

similares entre sí, principalmente en la zona de absorción (1500 – 800 cm-1) de los principales azúcares componentes de la miel (glucosa y fructosa).

• Los espectros FTIR de las muestras de miel de abeja adulterada con glucosa de maíz comercial obtenidos con HATR muestran diferencia significativa entre ellos y abarcan concentraciones de adulteración entre 2 y 100%.

• Los espectros FTIR de las muestras de miel de abeja adulterada con las mezclas de

glucosa, fructosa y sacarosa, obtenidos con HATR muestran diferencia significativa entre ellos y abarcan concentraciones de adulteración entre 5 y 25% de adulteración.

• Los espectros FTIR de las muestras de miel de abeja adulterada con jarabe de alta

fructosa (HFCS 55) obtenidos con HATR muestran diferencia significativa entre ellos y abarcan concentraciones de adulteración entre 2 y 60% de adulteración.

• Los espectros FTIR de las muestras de miel de abeja adulterada con azúcar invertido

(tipo AI) obtenidos con HATR muestran diferencia significativa entre ellos y abarcan concentraciones de adulteración entre 2 y 50% de adulteración.

• La adulteración con maltodextrina no se realizó, debido a que no se logró obtener un

jarabe con una concentración de 80 °Brix, por la baja solubilidad de la misma.

• Las zonas de absorción que se escogieron para el desarrollo del método quimiométrico abarca todo el espectro que incluye todos los componentes de la miel de abeja (4000 – 650 cm-1 y 3000 – 800 cm-1), tanto azúcares mayoritarios en la miel, como grupos amino primarios.

• Los errores estándares de calibración (SEC) fueron menores que los errores

estándares de predicción (SEP) para los tres algoritmos (PLS1, PLS2 y PCR) en las cuatro adulteraciones de las mieles de abeja, sin embargo, todos ellos debajo del límite máximo recomendado para una buena predicción.

• En las muestras de miel de abeja de Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos

adulteradas con glucosa de maíz comercial, PLS2 fue el que presentó una mejor predicción.

• En las muestras de miel de abeja de Chiapas, Oaxaca y Morelos adulteradas con

mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa; jarabe de alta fructosa y azúcar invertido, PLS1 fue el que presentó una mejor predicción, a excepción de la miel del Estado de México adulterada con las mezclas de azúcares que fue PCR.

• Los métodos quimiométricos obtenidos con las adulteraciones con las mezclas de

azucares (glucosa, fructosa y sacarosa) son capaces de predecir adulteraciones desde un 5% hasta un 25% de adulteración.

• Los métodos quimiométricos obtenidos con las adulteraciones con jarabe de alta

fructosa (HFCS 55) son capaces de predecir adulteraciones desde un 2% hasta un 50% de adulteración.

• Los métodos quimiométricos obtenidos con las adulteraciones con azúcar invertido

(tipo AI) son capaces de predecir adulteraciones desde un 2% hasta un 50% de adulteración.

• Los métodos quimiométricos obtenidos para las cuatro adulteraciones (con glucosa de

maíz comercial, con jarabe de alta fructosa, con azúcar invertido y con mezclas de glucosa, fructosa y sacarosa) de las cuatro mieles de abeja (Chiapas, Oaxaca, Estado de México y Morelos) pueden realizar buenas predicciones de las concentraciones de los adulterantes estudiados en la miel.

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ANEXO INFORME TECNICO FINAL META 1. CARACTERIZACIÓN DE … · INFORME TECNICO FINAL META 1. CARACTERIZACIÓN DE LAS MIELES PURAS Materia prima ... la solución B y se hicieron reaccionar