analisis quimico dopaje

8/16/2019 analisis quimico dopaje

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E S T U D IO SC IE N C I S D E L D E P O


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C O N T R O L D fD OA S P E C T O S A N A L ÍT IC O S

P R O H IB ID S E N E L D E P O R

C O N S E J O S O P E R IO RR E D E P O R T E S

E S T O O I O S S O B R EC IE N C IA S D E L


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ÍNDICECONTROL DE DOPAJE:

ASPECTOS ANALÍTICOSDE SUSTANCIAS PROHIBIDASEN EL DEPORTE

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Nuevos desarrollos en la preparación de muestrasy el análisis instrumental para la detección delconsumo de agentes anabolizantes en humanos 9Marcos del Águila J. Segura Noguera J. Pascual Esteban J.A.

Estudio analítico y determinación de corticoesteroidessintéticos mediante cromatografía de gases masasy voltamperometría sobre electrodo de mercurio 61Caballero Losco M. J. García de Tiedra M. R García-Moneó Carra R. M.López Gil M. M. Maynar Marino J. i Maynar Marino M.Pinilla Gil E.Sánchez M¡siego A. Rivero Marabé J. J.

Com paración de procesos de extracciónpara la determinación de diuréticos en orinapor cromatografía gases espectrometría masas 89Muñoz García G.; Muñoz-Guerra Revilla J.A.

Comparación de procesos de derivatizaciónpara la cuantificación de efedrinas en orina porcromatografía de gases espectrometría de masas 113Conde Vilda E. Muñoz-Guerra Revilla J.A.

Método de preparación en fase sólidapara la detección de bajas concentracionesde metabolitos de estanozolol en muestras de orina 133Ibáñez Velasco A.M. Muñoz-Guerra J.A.

IcdN° 31Estudios sobre Ciencias del Deporte Serie de Investigación

MINISTERIO DE EDUCACIÓN CULTURA Y DEPORTEConsejo Superior de Deportes


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NUEVOS DESARROLLOS EN LA PREPARACDE MUESTRAS Y EL ANÁLISIS INSTRUMEN

PARA LA DETECCIÓN DEL CO NSU M OAGENTES ANABOLIZANTES EN HUMA

NEW DlñVF.I.OPMENTS IN SAMPLE PREPARATAND INSTRUMENTAL ANALYSIS FOR THE DETECT

OF THE CONSUMPTION OF ANABOLAGENTS IN HUMANS

Marcos del Águila J.Segura Noguera J.

Pascual Esteban JA.

Dirección para correspondenciaSegura Noguera, J.; Pascual Esteban, J.A.; Marcos del Águila, J.Unitat de Recerca en FarmacologíaInstituí Municipal d Investigació Médica, IMIM.C / Doctor Aiguader, 8008003 BarcelonaTel.: 93 221 10 09Fax: 93 221 32 37Email: [email protected]


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Marcos del Águila].; Segura Noguera].; Pascual EstebanJA.

Josep Marcos del Águila

Licenciado en Ciencias Químicas, estudiante de doctorado y pro-fesor asociado de Química de la Universidad Pompeu Fabra. In-vestigador del análisis de agentes anabolizantes en el InstitutoMunicipal de Investigación Médica (IMIM) de Barcelona. Beca-do por el Consejo Superior de Deportes (CSD) para la realización

- del presente trabajo.

Jordi Segura Noguera

Licenciado y Doctor en Ciencias Químicas. Coordinador dela Unidad de Farmacología del Instituto Municipal de Investiga- ^ción Médica (IMIM) de Barcelona y Profesor Titular de Química ¿ ,,3 aAnalítica de la Universidad Pompeu Fabra. Director del labora-torio acreditado de control antidopaje de Barcelona. Secretario 1 >•d e l a S u b c o m i s i ó n d e D o p a j e y B i o q u í m i c a d e l a C o m i s i ó n M é d i. - L

ca del Comité Olímpico Internacional (COI). Miembro de diver-sas comisiones de la Agencia Mundial Antidopaje (WADA).

José A Pascual Esteban

Licenciado y Doctor en Ciencias Químicas. Adjunto de la Unidad- de Farmacología del Instituto Municipal de Investigación Médi-

• .j^v\ ca (IMIM) de Barcelona y Profesor Asociado de Química de la\ v s - \ Universidad Pompeu Fabra. Miembro de la Comisión Médica del

Comité Paralímpico Internacional (IPC).

Resumen

El abuso de esferoides anabolizantes en la práctica deportiva está prohibido des-de 1976 por el Comité Olímpico Internacional (COI). Esta prohibición se controlamediante el análisis de muestras de orina obtenidas de los atletas. Una vez detectadoel compuesto mediante un procedimiento de cribado, la muestra debe ser re-analiza-da mediante un procedimiento de confirmación. Este procedimiento de confirmacióndebe ser altamente sensible y específico de forma que la identificación de la sustanciasea inequívoca. Además, si la sustancia está presente en concentraciones muy bajas,es necesario mejorar el proceso de extracción de la muestra, de forma que el com-

puesto pueda ser aislado y concentrado en mayor grado. En el presente trabajo se handesarrollado métodos para la extracción y purificación de algunos esferoidesanabolizantes mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). También seha estudiado la formación de distintos derivados y su influencia sobre la sensibilidady especificidad en la detección final.

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Se obtu vo el mejor res ultado utilizando u na columna Hypersil-BDS C-18 en con-diciones isocráticas (mezclas ACN /H2O) específicas para cada com puesto . Bolasteronay Butiazida se prop one n como comp uestos marcador de tiempo de retención relati-vo para la toma de fracciones de HPLC. El análisis instrumental (GC/MS) resultó

óptimo m edian te la formación de derivado s enol-TMS. En estas condiciones se obtu-vieron espectros de masas en mod o full sean , a una concentración en orina hu m anade 2 ng /m l .

Palabras clave

Esteroides, anabolizantes, hum ano s, análisis, cromatografía líquida, espectrometríade masas.

bstract

The us e/ab us e of anabolic steroids in sport has been forbidden since 1976 by theInternational O lympic Com mittee (IOC). This prohibition is implem entedby analyzinguriñe sam ples obtained from the athletes. Once the compound is detected by a screeningmethod, the sample must be re-analyzed using a confirmation p rocedure. This proceduremust be highly sensitive and specific f or the unequivocal identification of the substance.Moreover, if the substance is present in very low concentrations, it is necessary to improve

the extraction process to increase the final concentration of the isolate. In the presentstudy different methods have been developed for the extraction and purification ofsome anabolic steroids using high performance liquid chromatography (HPLC). Theformation of several deriva tives and their influence on the sensitivity and specificity ofthe final detection has also been studied . The best result was obtained u sing a Hypersil-BDS C-18 column in isocratic conditions (ACN/H2O mixtures) specific to eachcom pound . Bolasterone and Butiazide are proposed as relative retention time markersfor HPLC sample collection. The instrumental analysis (GC/MS) was best with theformation of enol-TMS deriva tives. Under these cond itions, full sean mass spectra

were obtained at a urinary concentration of 2 ng /m l.

Key words

Steroids, anabolics, hu m ans , analysis, liquid chromatography, m ass spectrometry.

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Nuev os desarrollos en la prepara ción de muestras y el análisis instrumen tal...

NUEVOS DESARROLLOS EN LA PREPARACIÓN

DE M UESTRAS Y EL ANÁLISISINSTRUMENTAL PARA LA DETECCIÓNDEL CO NSU M O DE AGENTESANABOLIZANTES EN HUMANOS

INTRODUCCIÓN

C O N S I D E R C I O N E S G E N ER L E S

El consum o/abuso de sustancias anabolizantes esteroides y [32-agonisproblema que no afecta tan solo al deporte de alta competición sino tambiminados sectores de nuestra juventud. Diversos estudios muestran que losanabolizantes son objeto de abuso entre la juventud adolescente, que los con el objetivo de mejorar la imagen física p.e. fisioculturistas) 1).

Los esteroides anabolizantes adm inistrados en dosis elevadas y de formpueden crear alteraciones importantes en el equilibrio homeostático e inmdel individuo , y son un riesgo para la salud 2). Entre los efectos adversosvantes cabe señalar el aumento de los factores de riesgo de patologías cardio 3), anormalidades hepáticas cambios estructurales intrahepáticos, colestastumores) 4), efectos endocrinológicos depresión de la producción de h

testiculares y gonadotrofinas, esterilidad, atrofia testicular y ginecomastiarón, o inhibición de la ovulación y virilización en la mujer), efectos psicolpecialmente agresividad y dependencia) 5), afectación perm anente del crpor cierre de la epífisis de los huesos, etc . Por todo ello, su administraciónca sólo está indicada en entidades clínicas muy concretas como el hipogmasculino, algunas alteraciones ginecológicas como la endom etriosis, cánceosteoporosis y algunas anemias o estados de extrema debilidad 6). En todsos es necesario un estricto control médico del tratamiento.

En el ámbito deportivo, el abuso de agentes anabolizantes está prohibi1976 por el Comité Olímpico Internacional COI). Esta prohibición se condiante el análisis de muestras de orina obtenidas de los atletas. El control sedos etapas. En un primer paso todas las muestras son analizadas mediantedo de cribado que perm ite detectar y descartar todas las muestras verdad

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negativas. En un segundo paso, las muestras sospechosas de contener alguncia prohibida son de nuevo alicuotadas y reextraidas para confirmar de fequívoca la presencia del agente anabolizante o de alguno de sus metaboimportancia de los resultados de estos análisis de confirmación hace que, a

una alta sensibilidad, se requiera una alta especificidad para evitar la obtfalsos positivos. Es por este motivo que en este tipo de análisis el COI exigeción de la espectrometría de masas como sistema de detección.

La eficacia de esta aproximación m etodológica está limitada desde un vista estrictam ente analítico por la sensibilidad y la cantidad de material coextraído en la preparación de las muestras, responsable de la relación sdo del sistema analítico. Desde una perspectiva farmacológica, los anabadministrados por vía oral tienen semividas de eliminación del organiscortas. Además se consumen normalmente en los periodos de entrenadiscontinuándose su administración días antes de la competición, mom eque se practican de forma mayoritaria los controles analíticos. En cualqestas pautas de consumo no hacen más que dificultar su detección. Una trategias para abordar estos problemas ha sido la realización de controles con mayor frecuencia, y especialmente fuera de los períodos de competicaum entar su poder disuasorio. Sin embargo estos procedimientos han deuna eficacia relativa.

La estrategia m ás realista y esperanzadora consiste en mejorar los proce

analíticos para incrementar la sensibilidad y retrospectividad de los mismdios preliminares realizados en practicantes de deportes de alto riesgo p.e. haplicando procedimientos de preparación de muestras m ás selectivos y téclíticas más sensibles, han dem ostrado que se puede tener una m ayor retrosen la detección del consum o de algunos esferoides anabolizantes cuando scon la de la metodología actual 7).

PRO CED IMIENTO S N LÍTICOS P R L DETECCIÓNDE N BOLIZ NTES

El límite de detección actual del análisis de anabolizantes viene definimetodología hoy en día en uso: una hidrólisis enzimática de la orinadesalinización de la misma por extracción en una columna de XAD2, extrdisolventes orgánicos y derivatización del extracto con un agente silanizantracto silanizado se analiza por cromatografía gaseosa en columnas capilarda a la espectrom etría de masas GC /M S). Ésta se realiza en in strucuadrupolares de sobremesa en un rango de 10 a 750-800 unidades de mael impacto electrónico El) el método de ionización. Se monitorizan selecsólo algunos iones del espectro de los compuestos de interés para incresensibilidad 8).



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Nuevos desarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumental...

PLIC CIÓN DE M ÉTO DO S LTERN TIVOS EN EL PROCESODE PREP R CIÓN DE MUESTR S

Los métod os actuales de extracción líquido-líquido y sólido-líquido p ara el análi-

sis de anabolizantes son inespecíficos. El material biológico coextraído es el factorlimitante en la consecución de límites de detección suficientemente bajos. Las dosalternativas más claras al problema son:

- Utilización de cromatografía de inmunoafinidad IAC).

- Separación de fracciones por cromatografía líquida de alta eficacia HPLC) a partirdel extracto obtenido por la técnica convencional de preparación de m uestras.

Los métodos de confirmación tienen, como requisito fundamental, la obtenciónde la máxima información estructural posible de la sustancia detectada. En generalesto se traduce en la obtención de un espectro de masas com pleto. La sensibilidad delos espectrómetros de m asas en modo de barrido SCAN) es m uy inferior a la sensibi-lidad que se obtiene cuando se realiza una m onitorización selectiva de algunos iones m odo SIM). Los métodos de cribado utilizan el modo SIM para ofrecer la m áximasensibilidad, pero ofrecen poca información estructural. Por tanto, para la confirma-ción de muestras encon tradas presun tamente positivas a través del método de criba-do, necesitaremos disponer de extractos mucho más concentrados y limp ios. Una delas opciones para conseguir este objetivo es la utilización de la cromatografía líquidade alta eficacia HPLC) como etapa de separación de fracciones prev ia al análisis porGC/MS. De cada muestra podremos separar tantas fracciones como consideremosnecesario para aislar, de forma lo más pura posible, cada uno de los metabolitos adeterminar. Esta estrategia sólo es aplicable como método de confirmación.

La preparación de m uestras po r HPLC es, adem ás, una alternativa útil en el aná-lisis de confirmación de resultados obtenidos por técnicas de cribado median te IAC,al estar basada en un principio de purificación distinto.

El presen te trabajo se centra, justamente, en el desarrollo de d iversas m ejoras enlos procedimientos analíticos actuales, concretamente en el estudio y desarrollo deprocedimientos mediante cromatografía líquida de alta resolución para la purifica-ción de muestras previa al análisis instrumental.

Los esferoides anabolizantes son sustancias relativamente poco polares que que-dan fuertemente retenidas en columnas convencionales de tipo C18, su separaciónpor HPLC ha sido am pliam ente estudiada 9-14), y ya se han descrito método s defraccionamiento por HPLC para la purificación de orinas 15-16).

No obstante, algunas de estas sustancias contienen grupos amino p.e. estanozolol),responsables de un deterioro muy im portante de su comportamiento cromatográfico.Por otro lado , prácticam ente ninguno de los metabolitos de estas sustancias absorbeluz ultravioleta, sistema de detección más utilizado para HPLC, por lo que lamonitorización en el desarrollo de métodos basados en esta técnica es complicada.

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En el presente trabajo se ha probado la utilización de columnas más polarey especialmente desactivadas para bases BDS) para el desarrollo de un mseparación cromatográfica compatible con todos los compuestos a determ

Las fracciones obtenidas por estos procedimientos se han analizacromatografía de gases acoplada a la espectrometría de masas, tanto por itos cuadrupolares de sobremesa como por trampa de iones, para verificar ldad de esta separación y determinar la necesidad de modificar las condielución en cada caso, de forma que cada fracción obtenida permitiera la delas sustancias objeto de estudio.

Adicionalmente se ha estudiado la utilización de derivados terc-butil-d O-TBS) como alternativa a los der ivados trimetilsilil O-TMS), hab itualmpleados en este tipo de determinaciones.

En la tabla 1 se resumen las sustancias incluidas en este estudio. Las emoleculares y abreviaciones de estos compuestos se muestran en la figura

MATERIAL Y MÉTO DOS

R E C T I V O S

El agua de calidad HPLC se obtuvo mediante un sistema de purificagua Milli-Q Millipore, Molsheim, Francia). La resistividad del agua fude 18.2 MQ-cm. El acetronitrilo de calidad HPLC Merck, Darmstadt, Afue filtrado a través de una mem brana de Nylon de 0.2 um Lida, KenoUSA). El metanol de calidad HPLC, el éter terc-butilmetílico para análispen tano para espectroscopia se obtuvieron de Merck Darm stadt, Alem anglucoronidasa E. Coli K12 se obtuvo de Boehringer-Mannheim Mannhmania). El hidrogenofosfato de sodio dodecahidrato, el dihidrogenofosfatomonohidrato, el carbonato de potasio, el pentaóxido de difósforo, el iamonio, y el 2-mercaptoetanol se obtuvieron de Merck Darm stadt, AlemN-m etil-N-trim etilsilil-trifluoroacetam ida MSTFA), la N-m etil-N-trimheptafluorobu tiram ida MSHFBA), el N-trimetilsilil-imidazol TMSIM) pobtuv ieron de M acherey-Nagel Duren, Alem ania) . La N-m et i lbutildim etilsililtrifluoroacetam ida MTBSTFA) para GC se ob tuvo de Milwaukee, USA).

P TRON ES Y MU ESTR S DE REFERENCI

Metiltestosterona, testosterona, epitestosterona, bolasterona, bolandrosterona, etiocolanolona, cafeína, acetato de testosterona, androstendiro-metandienona y norethindrona, se obtuvieron de Sigma Saint Louis

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Nuevo s d esarrollos en la preparac ión de muestras y el análisis instrumental...

Unidos). 19-noretiocolanolona, 17a-metil-5(3-androstan-3a,17P-diol, 17a-metil-5a-androstan-3a,17(3-diol, m etenolona, 4-androsten-3(3-17(3-diol, 5-androsten-3(3-17(3-diol,5-androsten-3p-17ot-diol y 4-cloro-metandienona se obtuvieron de Research Plus(Bayonne, Estados U nidos). 17P-metil-5P-androst-l-en-3a,17a-diol, m etand ienon a,

6P-hidroxi-cloro-metandienona, 6P-hidroxi-metandienona, 19-norandrosterona, 19-noretiocolanolona, epimetandienona y oxymesterona fueron amablemente suminis-tradas por el Prof M. Do nike. (Deutsche Sporthochschule Kóln, Colonia, Alem ania).3 -hidroxi-estanozolol se obtuvo de Radian Co rporation (Austin, Estados U nidos).Bu t i az ida se ob tuvo de Boehr inger Mannhe im (Mannhe im, Alemania ) .Bendroflumetiazida se ob tuvo de FIDES (Barcelona, España). Benztiazida se ob tuvode AH-Robins Com pany (Richmond, Estados Unidos). Triamterene se obtuvo de La-boratorios Almirall (Barcelona, España). Oxymetholona se obtuvo de Sintex LatinoS.A. (Barcelona, España). Diclofenamida se obtuvo de Frumtost-Zyma (Barcelona,

España). Trenbolona se obtuvo d e Roussel Uclaf (Lyon, Francia). La 7-propilteofilinase sintetizó en nues tro laboratorio a partir de teofilina (Sigma, Saint Lou is, Estad osUnidos) y de iod uro de etilo (Merck, Darm stadt, Alemania).

Se prep araron soluciones metanólicas concentradas de 1 m g /m l de las sustanciasde referencia. Las soluciones de trabajo, preparadas por dilución de las solucionesconcentradas, fueron de 10 ug/ml. Las soluciones se conservaron en congelador auna tem peratura inferior a -20° C.

Las orinas de referencia se prep araro n aña dien do a una orina blanco (libre de los

compuestos a determinar) cantidades adecuadas de soluciones de referencia yhom ogeneizando por agitación.

INSTRUMENT CIÓN

Cromatografía líquida

Se utilizó un cromatógrafo HP1090 (Hew lett-Packard, W aldbronn , Alem ania) coninyección automática y detector de diodos en serie. Para inyecciones de volumensuperior a 25 ul se utilizó un equipo de HPLC modular, com puesto po r una bom bacuaternaria HP1050 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Alemania), un detector UV delongitud de on da variable HP 1050 (Hewlett-Packard, W aldbronn, Alemania) y unaválvu la de inyección de 6 pu erto s (Rheodyne, Cotati, California, USA) equ ipada conun bucle de 150 ul. A la salida de los detectores de am bos s istemas se colocaron capi-lares de acero (50 x 0.17 mm ID) de forma que fuera pos ible colectar las fracciones.

Las colum nas em plead as fueron las siguientes: Spherisorb P henyl, 75 x 4 mm ID,con un tamaño de partícula de 3 um (Tracer, Barcelona, España); Spherisorb Pnenyl250 x 4.6 mm ID, con un tamaño de partícula de 5 um (Tracer, Barcelona, España);Hy persil BDS C18,100 x 4.6 mm ID, con un tamaño de partícula de 3 um (Hypersil,Runcorn, Inglaterra).

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romatografía de gases

El análisis instrumental se realizó en un espectrómetro HP5973, acopcromatógrafo de gases HP6890 equipado con un inyector automático HP7

columna capilar HP19091A-002 (16,5 m x 0.2 mm I.D.; 0.11 um de espesola) (Hewlett-Packard). Las inyecciones se llevaron a cabo en modo splitlessión de flujo), y el gas portador fue helio. El horno del cromatógrafo fue pdesde 180° C hasta 230° C (3o C/m in) , luego hasta 310° C (40° C/m in) y manten310° C durante 3 minutos .

También se empleó un detector de trampa de iones GCQ, acoplacromatógrafo de gases GCQ equipado con un inyector automático A200SMat) y una colum na capilar HP 19091-002 (17 m x 0.2 mm I.D; 0.11 um depelícula) (Hewlett-Packard). Se inyectaron 2 ul en modo split (1/20) y el gfue helio. El horno del cromatógrafo fue programado desde 181° C hastaoC/m in), luego hasta 310° C (40° C/min) y mantenido a 310° C durante 3

M ÉTO DO DE TR T MIENTO DE MUESTR S

El tratamiento de la muestra previo a la separación mediante HPLC cabo utilizando las condiciones de extracción utilizadas rutinariamente esis de control antidopaje (17). Se partió de un volumen de orina entre 1distribuido en diversas alícuotas de 5 mi cada una. El procedimiento de tde la muestra utilizado fue el siguiente:

1.- Extracción sólido-líquidoA cada una de las alícuotas de 5 mi de orina se les añade el marcador y

tran en columnas de extracción sólido-líquido XAD-2 (resina neutra de pdivinilbenceno) previamente acondicionadas con 2 mi de metanol y 2 mLas columnas se lavan con 2 mi de agua, las muestras se eluyen con 2 mi y se juntan los eluatos correspondientes a las diferentes alícuotas en un m

2.- Hidrólisis enzimática

El extracto metanólico se lleva a sequedad bajo corriente de nitrógenoevaporado el metanol, se redisuelve el extracto en 1 mi de tampón fosf0.21VÍ a pH 7 y luego se añaden 50 ul de 6-glucuronidasa (E. Coli K12hom ogeneizada, la muestra se incuba duran te 1 hora en un baño de agua

3.-Extracción líquido-líquidoSe enfría la muestra hidrolizada hasta temperatura ambiente y se alca

250 ul de K2CO3 5 (p /v ). Se añaden 5 mi de n-pentano (excepto en el casomuestras de STÁ-metl que se extraen con 5 mi de terc-butilmetileter), s



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minutos y se centrifuga a 3.500 rpm durante 5 minutos. La fase orgánica, qudrá la fracción conjugada de la orina, es trasvasada a un nuevo tubo; se esequedad bajo corriente de nitrógeno a 30° C. Finalmente el residuo se redi50 ul de MeOH y se trasvasa a un microvial cónico mediante una pipeta Pa

Este residuo es inyectado en el sistema de HPLC y se colectan las fraccirrespondientes a los analitos en tubos situados a la salida del detector. A cción se le añade el estándar interno, se evaporan a sequedad bajo corrientegeno a 50° C y se procede a la derivatización y al posterior análisis por G C

RESULTADOS Y DISCU SIÓN

PROC EDIM IENTOS DE DERIV TIZ CIÓN LTERN TIVOS

Se estudió la utilización de diferentes reactivos de derivatización. Se deride seis formas diferentes: 500 ng de MET-metl, MET-met2, NAN-m etl, MESTA-metl y ISTD MET). Los reactivos y condiciones de estos seis ensayos dos A - F) se resumen en la tabla 2. El análisis se realizó con el espectrómetrocuadrupolar en modo de barrido SCAN).

Entre los experimentos C y F no se observaron grandes diferencias. En ediciones los derivados mayoritarios formados para cada uno de los seis cofueron: mono-O-TBS-mono-O-TMS-MET-metl, mono-O-TBS-mono-O-TMmet2, mono-O-TBS-mono-O-TMS-metiltestosterona, mono-O-TBS-mono-MED-met3,bis-O-TBS-NAN-metl y bis-TBS-mono-TMS-STA-metl. Otros que se formaron fueron el bis-O-TMS-MET-metl y dos derivados mono-O-TO-TMS-NAN-metl figuras 2 y 3). Los espectros correspondientes a estos ctos se dan en las figuras 4-7.

En las condiciones de los experimentos B y E no se observó la formación

gún derivado de la metiltestosterona; para el resto de cinco compuestos, lodos mayoritariamente formados fueron: mono-O-TBS-MET-met2, mono-O-Tm etl, mono-O-TBS-MED-met3 bis-TBS-STA-metl y bis-O-TBS-NAN-metl.de la NAN-m etl, también se formó el derivado mono-O-TBS; su abundancirespecto al derivado bis-O-TBS disminuyó al aumentar el tiempo de derivde 20 a 40 minutos; para el resto de compuestos no se observaron diferencambos experimentos. En las figuras 8 y 9 se muestran los cromatogramas en el experimento B y E, respectivamente, y en las figuras 10,11 y 12 los espalgunos de los derivados obtenidos.

Los resultados obtenidos en los experimentos A y D fueron análogos a lodos en los experimentos B y E para todos los compuestos, a excepción de la figuras 13 y 14). Para este compuesto en las condiciones más energéticasmento D) no se observó la formación del mono-O-TBS derivado figura 14

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PURIFIC CIÓN MED I NTE CROM TOGR FÍ LÍQUID

Se probaron column as de diferentes dimensiones y em paq uetad as con diferen-tes fases estacionarias (Fenil y C18 desactivada para bases). Alguno s de los com-puestos objeto de estudio, por ejemplo la norandrosterona, absorben poco la luzultravioleta (figura 15), por lo que su monitorización mediante un detector UV-Visible sólo es posible inyectando soluciones concentradas. La inyección de estassoluciones de referencia perm ite establecer los tiemp os de retención en las diferen-tes condiciones ensayadas. No obstante, en los extractos de muestras de orina lam onitorizac ión d e los com pues tos a colectar es imposible, debid o a su baja concen-tración y al m aterial biológico coextraido. El mé todo más fiable p ara dete rm inar lafracción exacta a colectar consiste en la utilización del tiempo de retención de unasustancia cromófora como referencia de los tiempos a los que hay que empezar yacabar de colectar la fracción. Esta sustancia cromófora den om inad a ma rcado r de -berá ser adicionad a a la mues tra an tes de realizar la extracción y deberá eluir an tesque el analito. Entre los marcadores ensayados hay esteroides endógenos (p.e. latestosterona), esteroides exógenos (p.e. la metiltestosterona) y sustancias sin estruc-tura esteroida l (p.e. la cafeína). La determinación de los tiempos de retención de losposibles m arcado res se realizó inyectand o soluciones de referencia dilu idas , típica-men te de concentración igual a 10 u g /m l.

CO LU M N S TIPO FENIL

Para la separación se utilizó una columna Spherisorb Ph enyl, 3 um . (75 x 4 mmI.D.). La fase móvil fue una m ezcla agua :acetonitrilo (90:10) a un flujo de 1 m l/ m in .El con tenido inicial de acetonitrilo se aum entó hasta u n 20 en 20 m inu tos, hastaun 50 en 30 m inu tos, y hasta un 100 en 35 m inu tos, m ante nid o al 100 du ran -te 3 m inu tos y vue lto a condiciones iniciales. El volum en de inyección fue de 10 uly se registró el espectro de lo ngitu des d e onda com prend ido entre 190 y 400 nm . En

estas condiciones se analizaron soluciones metanólicas concentradas de cada unode los esteroides objeto de estu dio. En la tabla 3 se resumen los tiempo s d e reten-ción y las longitudes de onda máximas obtenidos en estas condiciones para losdiferentes analitos estudiados. En el caso del STA-metl se confirmó la identidadrecogien do la fracción co rrespond iente al pico, derivatizánd ola y analizánd ola porG C /M S en mo do de barrido. En estas mismas condiciones se inyectaron un a seriede sustancias con el objetivo de encontrar marcadores p ara cada uno de los analitos.En la tabla 4 se resum en los tiem pos de retención y las long itudes de o nda má xim asobte nido s en estas condiciones para las diferentes sustancias en say ada s. En la figu-

ra 16 se presenta la superposición de algunos de los crom atogram as corresp ond ien-tes a estas inyecciones.

Para el metabolito del estanozol no se encontró un buen marcador. Para losmetabolitos de la metiltestosterona y de la nandrolona, la boldenona fue escogida

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Nuevos desarrollos en la preparación de m uestras y el análisis instrumental...

como marcador. Añ adiend o 20 n g /m l de este marcador se realizaron extraccionesde m uestras enriquecidas con estos 4 analitos, partiendo de 15 mi d e orina. A cadauna de las fracciones colectadas se les añadió 500 ng de metiltestosterona comoestándar interno y se evaporaron a sequedad. Las muestras se derivatizaron

disolviéndolas en 50 ul de M ST FA /N H J/ HS CH2)2OH 1000:2:6 v / p / v y calentan-do a 60° C du rante 20 min utos.

Los cromatogramas obtenidos mediante el análisis por G C/M S dem ostraron quelas fracciones recogidas contenían a los analitos de interés. En estos cromatogram asse observan mu chas men os interferencias que en los correspond ientes al análisis delas mismas m uestras extraídas m ediante el procedimiento h abitual, es decir sin reali-zar la purificación p or HPLC figura 17). Para aum entar la sensibilidad del m éto do seprobó inyectar u n v olum en may or en el sistema de H PLC; no o bstante, la inyecciónde 15 ul de un a solución metanólica provocaba un ensancham iento de los picos, tal ycomo se pued e o bservar en la figura 18, donde se com paran las inyecciones de 10 y 15ul de una solución metanólica de 10 u g /m l de testosterona.

La utilización de una column a de mayores dimensiones Spherisorb Phenyl, 5um. 250 x 4.6 mm I.D.) no solucionó el problema del ensanchamiento de picos alaumentar el volumen de inyección, por lo que se optó por probar columnas empa-quetadas con otro tipo de fase estacionaria.

C O L U M N A T IP O C 8 D E S A C T I VA D A S PAR A B A S E S

Se estudió como variaba la forma de los picos al aum entar el volum en de m etanolinyectado en un a co lum na Hy persil BDS, 3 um . 100 x 4.6 mm I.D.). Para ello se inyec-taron volúm enes crecientes de una solución m etanólica d e 10 u g / m l de testosterona,me tiltestosterona, ep itestosterona y bolasterona. La fase m óvil fue una mezclaagua:acetonitrilo 67:33 v / v a un flujo de 1 m l/m in y se mo nitorizó la señal a 244 um .En la figura 19 se pued e observar los cromatogramas correspondientes a estas inyec-ciones y como, en este tipo d e columnas, la inyección de 35 ul de so lución metanólicano p rodu ce deterioro en la forma de los picos.

A un flujo de 1 m l/ m in , se ensayaron diferentes com posiciones de m ezclasagua:acetonitrilo como fase móvil en régimen isocrático. El volumen de inyección fuede 10 ul y se registró el espectro de longitudes de onda com prend ido entre 190 y 400nm . En estas condiciones se analizaron soluciones m etanólicas concentradas de cadaun o de los esteroides objeto de estudio y de algunos posibles marcadores. En las tablas5-8 se resum en los tiemp os de retención y las longitudes de onda m áximas obtenidos alutilizar mezclas 70:30,65:35, 75:25 y 50:50 para las diferentes sustancias estu diadas .

Los métodos finalmente establecidos en régimen isocrático para cada analito seresum en en la tabla 9, ind icand o el porcentaje d e acetonitrilo, el marcador em plea do ,su tiem po de retención y la fracción recogida.



21/160

Marcos del Águila/.; Segura Noguera ].; Pascual Esteban¡.A.

17CC METIL ES TE ROIDE S

La purificación de la muestra mediante cromatografía de inmunoafinidad (IAC)para este tipo de com puesto s ME T-metl, MET-met2 y STA-metl) es posible, ya queexisten a nticuerpos con los que presentan una alta afinidad. Para el STA-metl ya sehan descrito procedimientos de purificación con los que se obtienen excelentes resul-tados, debido a la especialmente elevada reactividad cruzada que presen ta esta sus-tancia por dicho anticuerpo 18). Para los dos metabolitos de la metiltestosterona, lapurificación mediante IAC no ha sido descrita. Mediante los m étodos de purificaciónpresentados en la tabla 9 se obtienen extractos que permiten la confirmación inequ í-voca de estos dos com pues tos figura 21).

9 NORETIOCOLANOLONA

Se aplicó el método descrito en la tabla 9 para este compuesto, resultando sersuficientemente sensible. En este caso, partiendo de 15 mi de orina con una concen-tración de 2 ng /m l, derivatizando con 50 ul de MSTFA/NH4I/ HS CH2)2OH 1000:2:6v /p /v 60° C, 20 minutos), y analizando la m uestra en el instrumento de trampa deiones, se obtiene un espectro adec uado figura 20).

9 NORANDR OSTERONA

Combinando el m étodo descrito en la tabla 9 con la detección en un instrum entode tramp a de iones en m odo SCAN figura 22), o bien con la detección en un instru-mento cuadrupolar en m od o SIM figura 23), se obtienen resultados óptimos para laconfirmación de este com puesto. No obstante, cabe destacar que en todos las mues-tras analizadas, al colectar la fracción correspo ndien te a la N A N -m etl figura 24), se

colecta también una sustancia de origen endóg eno. Esta sustancia coeluye con el picocorrespondiente a la NAN -metl al analizar el extracto por GC/MS. La identidadpropuesta p ara este interferente es la de un androstendiol, deb ido a la similitud entresu espectro y el que presentan algunos de los andro stendio les conocidos figura 25);sin embargo ningun o de los tres an drostendioles disponibles en nuestro laboratoriopresenta el mismo tiempo de retención tabla 10).

La presencia de este interferente no induce a errores en la identificación de laNAN-met l , ya que las diferencias entre las abundan cias relativas de tres iones en-contradas en la orina de referencia y la orina positiva no difirieron en más de un 20 ,tal y como exige el COI tabla 11). En las orinas blanco analizadas también se obtuvouna pequ eña respuesta; sin embargo las abundan cias absolutas y relativas obtenidasdifieren mucho de las correspondientes a la orina de referencia tabla 11).

22 Consejo Superior de Deportes. Serie ICd n° 31 2001


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Nuevo s desarrollos en la preparac ión de muestras y el análisis instrumental...

Otra estrategia ensayada para el proceso de derivatización, consistente en la for-mación del de rivad o m ono-O-TMS m ediante la adición de 50 ul de MSHFB:TMSIm(1000:2) v / v y posteriorm ente la formación del derivado bis-O-TMS m edian te la adi-ción de 10 ul d e MSTFA :NH4I:2-mercaptoetanol (100:2:6), aporta mayor información

estructura l pero im plica analizar la mu estra dos veces (figura 26).Por últim o se ensayó la formación del deriva do bis-O-TBS med iante la adición

de 50 ul de M TBSTFA:NH4I:2-mercaptoetanol (1000:2:6) p / v / p . En estas condicio-nes también coeluye un interferente, como se observa en los análisis de una orinablanco (figura 27) y de una orina de referencia enriquecida con 3 ng/ml de NAN-metl (figura 28).

17f3-METIL-5a-ANDROST-l-EN-3a,17a-DIOL

Igual que en el caso de la NA N -m etl, com binando el mé todo descrito en la tabla 9con la detección en un ins trum ento de tramp a d e iones en m od o SCAN , se obtienenresultados ó ptimo s para la confirmación de este comp uesto. Para este comp uesto laderivatizació n consistente en la formación del derivad o bis-O-TMS med iante la adi-ción de 50 ul de MSHFB:TMSIm (1000:2) v /v , o bien en la formación del m ismocom puesto m ediante la adición de 50 ul de MSTFA:NH4I:2-mercaptoetanol (1000:2:6)(figura 29), conduc en a la identificación inequívoca de este com puesto .

CONCLUSIONES

Para los esferoides estudiados, la utilización de derivados terc-butil-dimetilsilil(O-TBS) no supone ninguna mejora, en cuanto a sensibilidad, respecto a los deriva-dos trimetilsilil (O-TMS) habitualm ente emp leados. En el caso de la noran drostero na

se puede alcanzar una total formación del derivado bis-O-TBS. No obstante, en elanálisis de orinas purificadas por HPLC la respuesta de este deriv ado está interferidapor un com puesto de origen endógeno.

La utilización de m ezclas de dos reactivos de derivatización (MTBSTFAy MSTFA)cond uce a la formación de m ás de un deriv ado , excepto en los casos del 17a-metil-5(3-androstan-3a,17(3-diol y del 3 -hidroxi-estanozolol, en los que la utilización de estasmezclas puede ser una alternativa válida en el proceso de derivatización.

La realización del proceso de derivatización en do s etapas consecutivas; prim ero

formando el de rivado mono-O-TM S median te la adición de 50 ul de MSHFB:TMSIm(1000:2) v /v , y después formando el derivado bis-O-TMS med iante la adición de 10ul de MSTFA:NH4I:2-mercaptoetanol (100:2:6), requiere u n d oble análisis, pero en elcaso de la norandro sterona aporta m ás información estructural.

Consejo Superior de Deportes. Serie lCd, n 31, 2001 23


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Marcos del Águila, /. ; Segura Noguera, /. ; Pascual Esteban, j.A.

Los métodos desarrollados en el presente trabajo para aislar fracciones pcon una columna C18 desactivada para bases, permiten una correcta purifcada uno de los esteroides estudiados. El aumento en la sensibilidad obtente la identificación inequívoca de estos compuestos, cumpliendo los criteri

cidos por el Comité Olímpico Internacional, a concentraciones de 2 n g /m lEl método de purificación por HPLC desarrollado para la norandrostpermite la separación de ésta de un compuesto de origen endógeno, posiblandrostendiol. La comprobación de la identidad de este interferente sólo seanalizando estándares de estos dos compuestos. A pesar de la presenciinterferente, la identificación de la norandrosterona en las muestras anapuede realizar de forma inequívoca utilizando un instrumento cuadrupolade monitorización selectiva de iones, o bien mediante la utilización de un ito de trampa de iones en modo de barrido.

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B, 687 (1996) 93-116.

TABLAS Y FIGU RA S

Tabla 1. Sustancias estudiadas

: SUSTAN CIA A ESTUDIAR ** ** PR EC UR SO R

19-norandrosterona^ « m^ NANDROLONA

19-noretiocolanolona ;- H •

17P-m etil-5a-androst-1 -en-3oc, 17a-diol METANDIENO NA

3'-hidroxi-estanozolol ESTANOZOLOL

17a-metil-5a-a ndrostan-3 a , 17(3-diolMETILTESTOSTERONA

17a-metil-5P-androstan-3a,17P-diol

Consejo Superior de Deportes. Serie lCd n° 31 2001 25


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Marcos del Águila].; Segura Noguera].; Pascual Esteban}.A.

Tabla 2. Reactivos de derivatización y condiciones ensayadas

& P - * fe"* r'*WV5r Reac t ivo ^ « — ^ Tiempo (min)

A 50 /¿I MTBSTFA/NH, / HS(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v 100 20

B 50 fú MTBSTFA/NH4I/ HS(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v

30 ¡Í\ MTB STFA/NH.I/ HS(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v20 /xl MSTFA/NH4I/ H S(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v

D 50 iú MTB STFA/NH, / HS(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v

E

F

50 fú MTBSTFA/NH4I/ HS(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v

30 /¿I MTBSTFA/NH4I/ HS(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v

20 /xlMSTFA/NH» / H S(CH 2)2OH 1000:2:6 v/p/v

8

80

,60

100

8

80

60

4

4

4

Tabla 3. Tiempos de retención, cantidades inyectadas y longitudes de onda máximas para

diferentes esferoides. Columna: Spherisorb Phenyl, 3 ¡im. 75 x 4 mm I.D., flujo: lml/min,solvente A: Agua, solvente B: acetonitrilo; gradiente: 10 B, lineal hasta 20 B en 20 min.,

lineal hasta 50 en 30 min., lineal hasta 100 en 35 min

NOMBRE

NAN-metl

NAN-met2

MET-metl

MET-met2

STA-metl

Cantidadinyectada (ng)

10.000

10.000

20.000

20.000

200

Tiempo deretención (min)

10.16

10.02

11 44

10.99

16.80

Longitud deonda (nm)

290

290

200

200

224

26 onsejo Superior de Deportes. Serie ¡Cd, n° 31 2001


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Nuevos desarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumental...

Tabla 4. Tiempos de retención, cantidades inyectadas y longitudes de onda máximas paradiferentes sustancias ensayadas com o marcadores. Columna: Spherisorb Phenyl 3 ¡im. 75x 4 mm I.D., flujo: lml/min, solvente A: Agua , solvente B: acetonitrilo; gradiente: 10 B,lineal hasta 20 B en 20 min., lineal hasta 50 en 30 min., lineal hasta 100 en 35 min

NOMBRE

Cafeína

Oxymetholona

Trenbolona

Boldenona

Norethindrona

Testosterona

Metandienona

Oxymesterona

Epitestosterona

Metiltestosterona

Metenolona

Androstendiona

Bolasterona

4-cloro-metand¡enona

Epimetandienona

Acetato de testosterona

Cantidadinyectada (ng)

100

100

100

100

100

100

200

100

100

100

íob

100

100

100

100

Tiempo deretención (min)

75

3 87

8.124

9 753

10.105

11.013

11.026

11.746

12.013

12.431

12.764

13.613

13.636

13.880

22.200

Longitud deonda (íim)

273

248 .

340

248

248

248

248

278

248

248

248

248

248

26 0

248

248

onsejo Superior d e Deportes. Serie ICd, n° 31, 2001


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Marcos del Águila, / ; Segura Noguera , ].; Pascual Esteban, ¡.A.

Tabla 5. Tiempos de retención, cantidades inyectadas y longitudes de onda máxpara diferentes esferoides. Columna: Hypersil BDS, 3 ¡un. 100 x 4.6 mm I.Dflujo: lml/min, solvente A: Agua, solvente B: acetonitrilo; ¿socrático: 30 B

N O M B R E

S TA m e t1

Testoterona

Epitestosterona

M E T m e t2 *° mm>

M E T m e t 1

CuntichidInyectada ng)

200

100

100

5000

5000

Tiempo deretención min)

4 715

12.286

20.587

27.091

30.266

Long i tud deonda nin)

224

244

244

200

200

Tabla 6. Tiempos de retención, cantidades inyectadas y longitudes de onda máximdiferentes esteroides. Columna: Hypersil BDS, 3 ¡im. 100 x4.6 mm I.D., flujlml/min, solvente A: Agua, solvente B: acetonitrilo; isocrático: 35 B

N O M B R E

Testosterona

Epitestosterona

N A N m e t 2

NAN met1

Etiocolanolona

Androsterona

Cant idadinyectada ng)

100

1005

5

5

5 ,

rI lempo deretención min)

6 384

9 877

11.778

14.126

17.522

19.250

Longi tud deonda nm)

244

244200

200

200

200

28 Consejo Superior de Deportes. Serie ¡Cd, n° 31, 200


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Tabla 7. Tiempos de retención, cantidades inyectadas y longitudes de o nda máximas paradiferentes esteroides y otras sustancias. Columna: H ypersil BDS, 3 \im. 100 x 4.6 mm I.D.,

flujo: Jml/min, solvente A: Agua , solvente B: acetonitrilo; isocrático: 25 B

N O M B R E

4-c loro-metandienona

6P-h¡drox¡-cloro-

me tand i enona

4P-hidroxi-estanozolol

STA-me t1

Cant idadinyectada ng)

100

100

200

200

1 lempo deretención niin)

6 427

7 740

12.217

12.666

Long i tud deonda nm)

244

25 6

22 4

244

Tabla 8. Tiemp os de retención, cantidades inyectadas y longitudes de o nda máximaspara diferentes esteroides. Columna: Hypersil B DS, 3 ¡im. 100 x 4.6 m m I.D.,flujo: Iml/min, solvente A: Agua, solvente B: acetonitrilo; isocrático: 50 B

NOMBR E Cantidad Tiempo de Longitud de

inyectada ng) retención min) onda nm)

Testos te rona 1 0 0 2 809 244

Epi tes tos te rona 1O o 3 646 244

M E D - m e t 3 5 O o 9 260 200

Consejo Superior da Deportes. Serie lCd, n° 31, 2001 9


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Marcos de l Águila, /.; Segura Noguera, /.; Pascual Esteban, ¡.A.

Tabla 9. Resumen de las condiciones experimentales de los métodos propuestospara la purificación mediante HPLC de los diferentes esteroides

Columna: Hypersil BDS, 100 x 4.6 mm, 3 pm. Flujo: 1 ml /mi nSolventes: A: K,O, B: CH 3 CN. Isocrático

SUST NCI

STA-metl

MED-met3

NAN-met2

NAN-metl

MET-met2

MET metl

B

25

5

35

35

35

35

M RC DOR

NOMBRE

Butiazida

Bolasterona

Bolasterona

X nm

270

244

244

~T R

min

11.78

3.73

10.76

COLECCIÓN

FRACCIÓN TRR¡ ATRf)

1.31 2.5 min

2.35 1.2 min

1.00 2.2 min

1.17 2.3 min

1.06 3.0 min ¡ m m m ¿ l ¿ ¡ m m r

Tabla 10. Tiempos de retención y tiempos de retención relativosal IST (metiltestosterona) de la sustancia interferente y detres androstendioles en las condiciones de análisis descritas

NOMBRE Tr min) Tr ISTD) min.) TRR |

4-androsten-3p-17P-diol 12.060 15.071 0.8002

5-androsten-3p-17 3-diol 12.285 15.079 0.8147;

5-androsten-3P-17a-diol 11.476 15.070 0.7615

Interferente

androstendiol ?)9 51 15.060 6 1

Consejo Superior de Deportes. Serie ICd n 31 200


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Nuevos desarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumental.

Tabla 11. Tiempos de retención, abundancias absolutas (expresadas como el áreadel pico correspondiente al ion) y rela tivas (porcen taje respecto al área

del ion más abun dante) de tres iones diagnósticos de la NAN -metl

M/Z

.... 405.,.,

420

315

225

M/Z

405

420

315

225

ORINA

Tiempo deretención

... 8,89 ,

8,88

8,89

8,89

DE REFERENCIA

Área Ratio

93.791 .

65.125

24.810

16.021

ORINA BLANCC

Tiempo deretención

8,89

8,89

8,89

8,89

Área

627

1.435

461

2 269

100

69,44

26,45

17,08

M

Ratio

27.63

63.24

20.32

100

ORINA POSITIVA

Tiempo deÁrea Ratioretención

8,89

8,89

8,89

8,89

33.672

23.692

9

6 276

100

70,36

26,73

18,64

ORINA BLANCO 2

Tiempo deretención

8,89

8,89

8,89

8,89

Área

1.446

4 654

1.276

8 69

Ratio

16.64

53.56

14.68

100

Consejo Superior de Deportes. Serie lCd, n 31, 2001


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Marcos del Águila, ].; Segura Noguera, ].; Pascual Esteban, JA.

O

HO1

19-norandrosterona NA N-metl)

CH3...OH

HO

17P-metU-SP-androst-l-en-3a,17a-diol MED-met3)

C H3

H OH

17a-metil-5a-androstan-3a ,17P-diol MET-metl)

HO

19-noretiocolanolona NAN-met2)

.C H3

3 hidroxi estanozolol

STA-metl)

...CH3

17a-mctil-5p-androstan-3cx,17P-diol

MET-met2)

Figura 1. Estructuras moleculares, nombres triviales y abreviaturasde los esferoides estudiados

32 Consejo Superior de Deportes. Serie ÍCd, n 31, 20


32/160

Nuevos desarrollos en la preparación de muestras el análisis instrumen tal...

4

B0Ú000

7

«MODO

V10.50 1i oO 11̂50 12J0 13.30 13.00 13.B0 14.00 14 JO 15.00 15.S0 I M } is la) 17.00 T7I5Ó Jaleó " io sb IBIÓO If ll sb ' ¿olfió Z& 5¿>

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Figura 2. Cromatogramas obtenidos en el análisis de patrones m ediante GC /MSen las condiciones del experimento C. Superior: 500 ng de ME T-met2, NAN-metl

y STA-m etl. Inferior: 500 ng de ME T-metl, MED -met3 metiltestosterona ISTD)

Consejo Superior de Deportes. Serie ICd n° 31 2001


33/160

Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, }.; Pascual Esteban, ¡.A.

Figura 3. Cromatogramas obtenidos en el análisis de patrones mediante GC/MScondiciones del experimento F. Superior: 500 ng de MET-met2, NAN-metl y S

Inferior: 500 ng de MET-metl, MED-met3 y metiltestosterona (ISTD)

Conse jo Superior de Deportes. Serie ICd, n 31, 20


34/160

Nuevos desarrollos en la preparación e muestras y el análisis instrumen tal..

120000

110000

100000

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Figura 4. Espectros e masas e los derivados mono-0-TM S-mono-0-TBS -MET -met2 superior) y mono -0-TMS-m ono-O-TB S-ME T-metl inferior)

Consejo Superior e Deportes. Serie ICd, n° 31, 2001 35


35/160

Marcos del Águila, ].; Segura Noguera, / ; Pascual Esteban, JA.

40000

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30000

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4 0̂ 4¿o 4Íq 440 450 4¿Ó 470 4Ífl 4K

Figura 5. Espectros de masas de los derivados mono-O-TMS-mono-O-TBS-

metiltestosterona superior) y mono-0-TMS-mono-0-TBS-MED-met3 inferior)

Consejo Superior de Deportes. Serie ICd, n 31, 2001


36/160


bta TBS mono TMS STA met1

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iFigura 6. Espectros de masas de los derivados bis-TBS-mono-TMS-STA -metl

(superior) y bis-O-TBS-NAN-m etl (inferior)



37/160

Marcos del Águila, ].; Segura Noguera, / ; Pascual Esteban, ¡.A.

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38/160

Nuevos desarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumen tal..

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Figura 8. Cromatogramas obtenidos en el análisis de patrones mediante GC /MS en lascondiciones del experimento B. Superior: 500 ng de MET-met2, NAN -metl y STA-metl

Inferior: 500 ng de MET-metl, MED -met3 y metiltestosterona ISTD)



39/160

Marcos del Águila, /. ; Segura Noguera, / .; Pascual Esteban, J.A.

10.50 HJM 11 JO 12 M U SO 13.00 13.50 14.00 14 50 15.00 1SJ 0 18.00 16 .» 17.00 17.50 18 00 18 50 1B.00 18.30 20 00

J

Figura 9. Cromatogramas obtenidos en el análisis de patrones mediante GC/Mcondiciones del experimento E. Superior: 500 ng de MET-met2, NAN-metl y

Inferior: 500 ng de MET-metl, MED-met3 y metiltestosterona ISTD)

4 Consejo Superior de D eportes. Serie ICd, n° 31, 20


40/160


Figura 10. Espectros de masas de los derivados mono-O-TBS-ME T-metl (superior)y mono-O-TB S-MET-m et2 (inferior)



41/160

Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, / ; Pascual Esteban, ¡A.

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Figura 11. Espectros de masas de los derivados mono-O-TBS-MED-met3 (supy bis-TBS-STA-metl (inferior)



42/160

Nuevos desarrollos en la preparación de mu estras el análisis instrumental...

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43/160

Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, ].; Pascua l Esteban, j.A.

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Figura 75 Cromatogramas obtenidos en el análisis de patrones mediante GC/MScondiciones del experimento A. Superior: 500 ng de MET-met2, NAN-metl y

Inferior: 500 ng de MET-metl, MED-meÜ y nietiltestosterona (ISTD)

44Consejo Superior de Deportes. Serie ICd, n 31, 2


44/160

Nuevos desarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumental.

Figura 14, Cromatogramas obtenidos en el análisis de patrones mediante G C/MS en condiciones del experimento D. Superior: 500 ng de MET-metl, NAN-metl y STA-

Inferior: 500 ng de MET-metl, MED-meÜ y metiltestosterona ISTD)

Consejo Superior de Deportes. Serie ICd, n° 31, 2001


45/160

Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, / ; Pascual Esteban, j.A.

D A D 1 , 14.1 19(8 9.1 mA u.Apx Ftef=10.183 11.122 of NANI35.D

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10.432 of TEI35.D

300 325 350 375 ntr

Figura 15. Espectros UV registrados al inyectar 10.000 ng de norandrosterona (sy 100 ng de testosterona (inferior)



46/160


Figura 16. Crom atogranias superpuestos correspondientes a las inyecciones de:oxymetholona (1), trenbolona (2), boldenona (3), metandienona (4), m etenolona (5),

epimetandienona (6) y acetato de testosterona (7). Columna : Spherísorb Phenyl, 3 \im.75 x 4 mm I.D., flujo: lml/min, solvente A: Agua, solvente B: acetonitrilo; gradiente: ¡0% B,

lineal hasta 20%B en 20 min, lineal hasta 50% en 30 min., lineal hasta 100% en 35 m in

B

sl ¿ kFigura 17. Análisis de una orina de referencia (5 ng/ml NAN -metl y NAN -met2).

Cromatogranias (GC-M S) del total de iones: (A) Muestra purificada po r H PLC medianteel métod o descrito. Las flechas indican los picos de los dos metabolitos de la nandrolona.(B) Muestra no purificada por H PLC. Las flechas indican los tiempos

de retención de los dos m etabolitos de la nandrolona



47/160

Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, / ; Pascual Esteban, J.A.

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897\TE-G22O)

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10 12 min

Figura 18. Cromatogramas correspondientes a la inyección de 10 \ii (superiory 15 ¡x (inferior) de una solución de ¡O fig/ml de testosterona. Columna:

Spherisorb Phenyl, 3 ¡im. 75 x 4 mm I.D., flujo: Iml/min, solvente A: Aguasolvente B: acetonitrilo; gradiente: 10%B, lineal hasta 20%B en 20 min,

lineal hasta 50% en 30 min, lineal hasta 100% en 35 min



48/160

Nuevo s d esarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumental...

VWD1 A, Wavetength=244 nm AATEMB2.D)

VWD1 A, Wavalength=244 nm A:\TEMB3.D)

VWD1 A, Wavelenglh=244nm A YTEMB4.D)

VWD1 A, Wavelength=244nm A:\TENC6.D)

Figura 19. Cromatogramas correspondientes a la inyección de 10 ¡x (A), 20 al (B),30al (C) y 35 al (D) de una solución de 10 ag/ml de testosterona (1), metiltestosterona (2),

epitestosterona (3) y bolasterona (4). Colum na: Hypersil BDS, 3 am . 100 x 4.6 m m I.D.,flujo: lml/min. Fase móvil: agua :acetonitrilo 67:33 v v



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Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, /.; Pascual Esteban, J.A.

C : \ . \REAC 97\2 3 0997\NAN_0__F1 O9/2 3/97 20:16:21

bis-O-TMS-NAN-met2

8.17 min)

C:\.-.\REAC

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3 0997\NAN_0_F1 O9/2 3/97 2 0 : 1 6 : 2 1

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200 400 if¡o ÜOO

Figura 20. Resultados obtenidos en el análisis de una orina de referencia 2 ng/ml de NAN-met2). Cromatograma del total de iones A), cromatograma ex

a m/z 405 B) espectro de masas del bis-0-TMS-NAN-met2 (C)



50/160

Nuevos desarrollos en la preparación de muestras el análisis instrumental...

fjü : 2 •• 8 = 9 6O

98 tro 902

C: \ . . . \REAC9?\ 2 3O997VIT_O_F 09/23/97 21 :5 5:19

Kanqá : 1 t: o 18 41 1.00 á 9 6O4 78

bis-O-TMS-MET-metl 10.26 min)

bis-0-TMS-MET-met2 10.35 min)

9:32 10:02 10:32 11:02

c

M í

09/J1/97 21:55:19

Figura 27. Resultados obtenidos en el análisis de una orina de referencia

2 ng/ml de ME T-metl y MET-met2). Cromatogram a del total de iones A),cromatograma extraído a m/z 435 B), espectro de masas del

bis-O-TMS-ME T-metl C) y del bis-0-TMS-M ET-met2 D)

Consejo Superior de Deportes. Serie ICd, n° 31, 2001 51


51/160


52/160

Nuevos desarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrume ntal...

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10000

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5000

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53/160

Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, ].; Pascua l Esteban, J.A.

Figura 24. Cromatograma de HPLC a una longitud de onda de 244 nm obtenal analizar una orina de referencia de NAN-metl (15 mi).

Fracción colectada: 11.89 - 14.35 min.Marcador empleado: bolasterona (50 ng/ml)



54/160

Nuevos des rrollos en la prepara ción de muestras y el análisis instrumen tal...

5 Espectros de masas del pico interferente superior) y de un patrónde bis-O-TMS- 5-androsten-3b-17b-diol inferior)

Consejo Superior de Deportes. Serie ICd, n° 31, 2001 55


55/160

Marcos del Águila, / .; Segura Noguera, /. ; Pascual Esteban, J.A.

mono-O-TMS-NAN-met l 5.42 min)

bis-O-TMS-NAN-met l 6.47 min)

4 6 007: 02

8

9:3

10 0 01 1 : 0 2

Figura 26. Resultados obtenidos en el análisis de una orina de referencia 5 ng/ml de NAN-metl). Cromatograma extraído a in/z 258 A) y espectro de m

del mono-O-TMS-NAN-metl B) producido al derivatizar con MSHFB.TMSCromatograma extraído a m/z 405 C) y espectro de masas del bis-O-TMS-NAN-

producido al añadir 10 /¿/ de MSTFA:NH4I:mercaptoetanol 100:2:6

56 Consejo Superior de Deportes. Serie ¡Cd, n° 31, 200


56/160

Nuev os desarrollos en la preparac ión de muestras y el análisis instrumen tal...

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1923[TTJBaznm]: 3B W3ZJJ

22 239

Figura 27. Resultados o btenidos en el análisis de una orina blanco al derivatizar

con MT BSTF A:NH 4I:2-mercaptoetanol 1000:2:6) p/v/pSuperior: cromatogram a del total de iones indicando con una flecha el pico interferente nferior espectro de masas del pico interferente

Consejo Superior de D eportes. Serie ¡Cd, n° 3 1, 2001


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Marcos del Águila, / ; Segura Noguera, / ; Pascual Esteban, j.A.

Ubundance

140000

130000

120000

110000

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90000

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10000

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nm e > 16.00 16.20 16.40 16 16 80 17 00 17 20 17 40 17 60 17 60 18 00 18 20 16 40 16 60 18 80 S»nia¡4(1/.«3Smln):3681033.O

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5¿0

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Figura 28. Resultados obtenidos en el análisis de una orina de referencia(3 ng/ml NAN-metl) al derivatizar con MTBSTFA:NH4l:2-mercaptoetan

(1000:2:6) p/v/p. Superior: cromato grama del total de iones indicando con una flel pico correspondiente al NAN metl. Inferior: espectro de masas del picodonde aparecen iones correspondientes al interferente



58/160

Nuevo s d esarrollos en la preparación de muestras y el análisis instrumental.

blt-O-TMS-MED-meO(6.73 mln)

B

• ^ V ^ ^

bÍs-O-TMS-MED-nx*t3(C.71 inin)

D

ÍUS

1.ÓO ISO

Figura 29. R esultados obtenidos en el análisis de una orina de referencia

(5 ng/ml de MED -met3). Cromatogram a extraído a in/z 358 (A)y espectro de masas bis-O-TMS-ME D-met3 (B) producido al derivatizarcon MSHF B.TMSIm . Croma tograma extraído a m/z 358 (C) y espectro de masas

del bis-O-TMS-ME D-met3(D) producido al derivatizar con MST FA:NH 41:2-ercaptoetanol

Consejo Superior de Deportes. Serie ¡Cd, n 31, 2001


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ESTUDIO ANALÍTICO Y DETERMINACDE CORTICOESTEROIDES SINTÉTIC

MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DGASES-MASAS Y VOLTAMPEROMETR

SOBRE ELECTRODO DE MERCUR

ANALYTICAL STUDY AND DETERMINATION OF SYNTHCORTTCOSTEROIDS BY GAS CHROMATOGRAPHY W

MASS DETECTION AND VOLTAMMETRY OHANGING MERCURY DROP ELECTROD

Cab allero Losco M. J.; García de Tiedra M. P.García-Moneó Carra R. M.; López G il M. M.

Maynar Marino J. / ; Maynar Marino M.Pinilla Gil E.; Sánchez Misiego A.

Rivero Marabú J. J.

Dirección para correspondenciaMaynar Marino J. I.Departamento de Química Analítica y ElectroquímicaAvda. Elvas s/nUniversidad de Extremadura06071 BadajozTel.: 924 28 93 92Email: [email protected]


61/160

Maynar Marino /. /., Pínula Gil £. , García de Tiedra M. R ...

Juan I Maynar Marino es Doctor en Ciencias (sección de Qumicas) por la Universidad de Extremadura y Profesor TitUniversidad en el Área de Química Analítica. Su línea detigación se centra en dos temas principales cuales son EnoQuímica Analítica y Dopaje y Química Analítica. Actuatrabaja en un equipo multidisciplinar en temas relacionadel ejercicio físico y el rendimiento deportivo. En la actutiene dos proyectos de investigación sobre Enología y Dorelación con el estudio y caracterización del color y arovinos de Ribera del Guadiana, así como el estudio de Nandy sus metabolitos en sujetos sedentarios y deportistas som

a diferentes cargas de actividad física. Es coautor de 55 publicaciones nacionales e internacionales, ha participado o participa en 17 proyectos deción y ha asistido a 54 comunicaciones a Congresos o Jornadas tanto naciointernacionales. Es miembro numerario de la Sociedad Española de Químca, de la Asociación Española de Químicos, del Colegio Oficial de QuímGrupo de Investigaciones Enológicas.

Eduardo Pinilla Gil es profesor titular de Química Analítica dUniversidad de Extremadura. Obtuvo el grado de Doctor ecias, Sección de Químicas, por la misma Universidad en 19la tesis titulada Estudio polarográfico y determinacióncloroteofilina. Determinación de teofilina mediante inmunocon detección amperométrica . Su línea de investigación setrado en las aplicaciones de las técnicas electroanalíticas determinación de especies orgánicas e inorgánicas en mambientales o biológicas. Actualmente trabaja en el desarmétodos para el análisis de muestras atmosféricas, con e

determinar contaminantes inorgánicos, proyecto subvencionado por laExtrem adura y que se desarrolla en colaboración con el Servicio de Proteccital de esta Institución. Es coautor de 16 publicaciones en revistas internaccomo de 23 comunicaciones a Congresos. Ha realizado estancias de investiUniversidad de Cincinnati (Cincinnati, OH, EE.UU.) en 1989, en el Centro dciones de Jülich (Jülich, Alemania) en 1992,1993 y 1998, y en la UniversidFederico Santa M aría (Valparaíso, Chile) en 1999. Es miembro numerario dad Española de Química Analítica.

62 Consejo Superior de Deportes. Serie ¡Cd n° 31 2001


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Estudio analítico y determinación de corticoesteroides sintéticos...

M a Paz García de Tiedra es profesora asociada del D epartamentde Química Analítica y Electroquímica de la Universida

Extremadura. Obtuvo el grado de Doctor en Farmacia pUniversidad de Salamanca en 1993, con la tesis titulada Fción de Hidrocarburos Halogenados Volátiles durantPotabilización y en las Redes de Distribución de seis Pob

' PJÍMJ n e s de Ia Provincia de Salamanca . Su línea de investigació

§ § • 1 ha centrado en las aplicaciones de la cromatografía de gasel l ^H la determinación de especies orgánicas e inorgánicas en di

tes matrices. Actualmente trabaja en dos líneas de investiga) desarrollo de métodos para el análisis de muestras fisiológicas, con el fin

minar esteroides naturales y sintéticos, proyecto subvencionado por la Extremadura; y b) estudio de la evolución aromática y color en vinos de la dción de Origen Rivera del Guadiana. Es coautora de 10 publicaciones en reternacionales, así como de 18 comunicaciones a Congresos.

M.J. CaballeroLosco

Profesora Titularde Universidad.Departamento deFarmacologíay Psiquiatría.Facultad deMedicina. UEX.

J.J. RiveroMarabé

Becario.Departamento

de QuímicaAnalítica y

Electroquímica.Facultad de

Ciencias. UEX.

R.M. García Moneó Carra. Profesora Titular de Universidad. DepartamentoQuímica Analítica y Electroquímica. Facultad de Ciencias. UEX.M.M. López G il. Becaria. Departamento de Química Analítica y Electroqu

Facultad de Ciencias. UEX.M. Maynar M arino. Profesor Titular de Universidad. Departamento de Fis

gía. Facultad de Ciencias del Deporte. UEX.A. Sánchez Misiego. Catedrático de Universidad. Departamento de Quím

Analítica y Electroquímica. Facultad de Ciencias. UEX.



63/160

Maynar Marino, ]. /. , Pínula Gil, £., Carda de Tiedra, M. P,...

Resumen

La detección d e sustancias ilegales en el dep orte está cob rand o un interés crecien-

te , con implicaciones científicas d e ind uda ble importancia en el cam po de la Quím icaAnalítica. La existencia de procedim ientos d e dopaje basa dos en el emp leo de nuev osderiv ado s esteroides cuyos m etabolitos logran elud ir los controles clásicos aconsejala pue sta a pu nt o de nuevo s método s de análisis para garantizar ma yor sensibilidady selectividad hacia estos tipos de sustancias.

Entre las sustancias dopantes, resulta en la actualidad altamente interesante elgru po de los corticoesteroides sintéticos, dadas las dificultades analíticas q ue presen-ta su determinación y la de sus metabolitos urinarios.

El con tenid o concreto de este trabajo se centra en dos técnicas analíticas bien dife-renciadas: la cromatografía de gases con detección de masas y la voltamperometríasobre electrodo de gota d e mercurio. Se exponen los resultados de la aplicación d eestas do s técnicas sobre diversos corticoesteroides sintéticos.

Palabras clave

Corticoesteroides, dexam etasona, triamcinolon a, GC-MS, voltam perom etría.

bstract

Determination of illegal substances in sports is a matter of growing interest withundoubtedly important scientific implications in the analytical chemistry field. Do-ping procedures based on the use of steroid derivatives, which produce urinarymetabo lites that can t be detected by the usual analytical m ethod s m ake it essential todevelo p new , mo re sensitive analytical meth ods which are mo re selective for the sesubstances.

An interesting grou p of dop ing substances is that of the synthetic corticosteroids,du e to the analytical challenges that they and also their urinary metabolites represent.

This s tudy i s focussed on two independent analy t ica l techniques : gaschrom atography with mass detection and voltamm etry on a hanging m ercury d ropelectrode. Results using both techniques on several synthetic corticosteroids arediscussed.

Key wordsCorticosteroids, dexam etasone, triamcinolone, GC-MS, voltamm etry.

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ESTUDIO ANALÍTICO Y DETERMINACIÓN

DE CORTICOESTEROIDES SINTÉTICOSMEDIANTE CROMATOGRAFÍA DEGASES-MASAS Y VOLTAMPEROMETRÍASOBRE ELECTRODO DE M ERCURIO

INTRO DU CCIÓN Y ANTECEDENTES

ESTRU CTUR Y CL SIFIC CIÓN DE LOS CORTICOESTER OIDES

Los esteroides son compuestos que se encuentran normalmente en la fno saponificable de los aceites vegetales y animales. Su estructura derivacleo del ciclopentanoperhidrofenantreno, cuyas posiciones se numeran smuestra en el esquema.

Estructura básica de los esteroides

Debido a la complejidad y a las posibilidades de asimetría de la estructurapueden derivarse de ella muchos esteroisómeros. Los anillos pueden existir eración silla-bote , y por otra parte pueden estar en posiciones cis-trans en

Los compuestos derivados que poseen uno o varios grupos -OH y carecepos -COOH y -C=O, se denominan esteróles o esteroides. El más conocicolesterol, presente en todas las células animales y particularmente abundatejido nervioso y en el hígado.

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El colesterol (esquema) es el precursor de otros muchos esteroides de los tejidosanimales, incluyendo ácidos biliares, andrógen os (hormonas sexuales m asculinas),estrógenos (ho rmon as sexuales femeninas), horm ona s progestacionales y horm ona sadrenoco rticales o corticoesteroides. Los com puestos estud iado s en esta Mem oria serelacionan estructuralmente con este último grupo de com puestos.

Estructura del colesterol

Los corticoesteroides se caracterizan p or poseer los siguientes g rup os funcionalessobre la estructura básica indicada anteriormente:

• Un enlace doble entre los carbonos 4 y 5.

• Un gru po cetónico en posición 3.

• Un g rup o cetónico o un g rupo hidroxilo en posición 11, responsable del ca-rácter glucocorticoide.

• Send os grupos metilo en las posiciones 10 y 13.

• Una cadena -CO-CH2-OH en posición 17.

Según su función fisiológica predominante, los corticoesteroides se clasifican enmineralocorticoides y glucocorticoides.

Los mineralocorticoides actúan en forma preponderante sobre el metabolismoinorgánico , sobre todo del sodio, po r lo que influyen decisivam ente en el trans portede electrolitos y, po r tan to, sobre la distribución de agua en el organ ism o. El com-puesto representativo de este grupo es la aldosterona (esquema), responsable del95 de la actividad mineralocorticoide en el ser humano.

Los glucocorticoides poseen una acción preponderante sobre el metabolismo or-gánico, especialmente d e los hidrato s d e carbono, actuan do tam bién sobre el de lasproteínas y los lípidos. El compuesto representativo de este grupo es el cortisol ohidro cortison a y su forma isómera, la cortisona (esquema). El cortisol es responsabledel 95 de la actividad glucocorticoide en el ser hu m ano.

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Estudio analítico y determinación de corticoesteroides sintéticos..

Estructura de la aldosterona

Estructuras del cortisol y de la cortisona

BIOQU ÍMIC DE LOS CORTICOESTEROIDES N TUR LES

Los corticoesteroides naturales se biosintetizan en la corteza adrenal, siendo suprecu rsor in m ediato el colesterol. La horm ona adrenocorticotrófica hipofisiaria ACTH) representa el estímulo prim ario para la síntesis de esteroides.

La biosíntesis y liberación de glucocorticoides está por tanto bajo el control delsistema hipo tálam o-hip ofisiario. El hip otálam o elabora un factor liberador d ecorticotrofina CRF) que favorece la liberación de AC TH, la cual, a su vez, estimu la laliberación y biosíntesis de glucocorticoides.

Respecto a los mineralocorticoides, el control de la secreción de aldosterona esrelativamente independiente de ACTH. El estímulo primario para la liberación dealdosterona es la reducción del volum en san guíneo y de la concentración plasmáticade sodio.



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En cuanto a los mecanismos de acción de los corticoesteroides, se conoce hoy endía que actúan intracelularmente. Atraviesan la membrana y forman un complejoesteroide-receptor que después de sufrir una serie de cambios emigra el núcleo y seun e a la crom atina. Después el esteroide estimu la la síntesis de proteín as resp onsa-

bles de los efectos metabó licos.La me tabolización de los corticoesteroides, previa a su eliminación d el org anis-

mo , se prod uce en el híga do . El cortisol sufre u na reducción en el doble enlace entrelos carbonos 4 y 5, transformándose en dihidrocortisol. Posteriormente el grupocetónico en posición 3 sufre un proceso de reducción, dando lugar a la formaciónde tetrahidrocortisol que finalmente se conjuga con acido glucurónico y en menorproporción con sulfato. Los derivados tetrahidro, al ser ulteriormen te reducido s enposición 20, da n lu gar a cortol y cortolona. Por otra pa rte la cortisona se transformaen cortisol y finalmente sufre los cambios ya citados.

La eliminación de los corticosteroides tiene lugar po r la orina. En ella aparecen losproductos de biotransformación en proporciones variables. La concentración de cortisollibre en orina es muy baja, deb ido a que se absorbe con facilidad en el túb ulo renal.

O RTI O ESTERO IDES SINTÉTI OS

El descub rimiento de la actividad antiinflamatoria de la cortisona ha im pu lsad ola utilización farmacológica de los corticoesteroides. En este sentido se ha n desarro -llado diversos corticoesteroides sintéticos, con el fin de minimizar los efectosmineralocorticoides indeseables retención de líquidos, por ejemplo) qu e se prod u-cen como consecuencia del empleo de corticoesteroides naturales, mien tras se man -tienen o potencian los efectos glucocorticoides. A este grupo de los corticoesteroidessintéticos pertenecen los dos com puestos estud iados en esta M emoria, la triamcinolonay la dexametasona.

Las modificaciones estructurales más importantes que se han llevado a cabo apartir del cortisol para la obtención de corticoesteroides sintéticos son las siguientes las estructuras de tod os los com puestos se presentan en el esquem a):

• Introducción de un doble enlace entre las posiciones 1 y 2. Los compue stosque contienen esta modificación se den om inan delta corticoesteroides. Ejem-plos de corticoesteroides sintéticos con esta configuración son la predniso nay la prednisolona.

• Introdu cción de un grupo metilo en posición 6-a, adicional a la modificaciónanterior. Un ejemplo es la metilprednisolona.

• Introdu cción de átom os de flúor en posiciones 6-a o 9-f3, po r ejemplo en lafluorocortisona.



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• Metilación en posición 16-cc o 16- 3, adicional a la introducción de flúor. Seencuentra, por ejemplo, en los compuestos betametasona, dexametasona yparametasona.

• Hidrox ilación en posición 16-a o 16- 3, también adicional a la introducción deflúor. Un ejemplo es la triamcinolona.

Cuand o las sustituciones son múltip les, las características finales del producto encuan to a actividad glucocorticoide y mineralocorticoide son difíciles de predecir.

H OH

o

Estructura básica de los corticoesteroides sintéticos

E M PL EO D E L O S C O RT I C O ES T E R O ID E S C O M O S U S T N C I S D O P N T E S

Las acciones farmacológicas de los corticoesteriodes son po tentes y vari ada s. Sedistin guen en pricipio las actividades glucocorticoide y mineralocorticoide, que pre-sentan en ma yor o menor grado todo s los miembros del grupo , tanto naturales comosinté t icos a lgun os de es tos ú l t im os carecen prác t icam ente de ac t iv idadmineralocorticoide).

En función de estos do s tipos de actividad se puede n en contrar en mayo r o m enormedida los siguientes efectos:

• Efectos sobre el me tabolismo de los hid ratos de carbono, prote ínas y grasas.Elevan la glucemia y el catabolismo proteico, por lo que tienen una acciónantianabolizante.

• Efecto antiinflamatorio, que constituye la razón fundam ental del uso clínicode los glucocorticoides.

• Efecto antialérg ico.• Efecto inmuno depresor, que contribuye al agravam iento de las enfermeda-

des infecciosas.



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• Efectos sobre la piel, el sistema múscu lo esquelético, el apara to diges tivo y elsistema nervioso central. A dosis moderad as, los glucocorticoides m ejoran ladebilidad muscular, pero a dosis altas se produce el efecto contrario por suacción antianabólica. Además provocan sensaciones de euforia, insomnio,

intranquilidad e incremento de la actividad motora y el apetito.Es fácil deducir que, al estar algunos de los efectos comentados direc tamente rela-

cionados con la actividad física, se haya detectado el empleo de corticoesteroides com osustancias dopantes. Se ha sugerido que los corticoesteroides son el sustitu to actual delas anfetaminas en el dopaje para depor tes que requieren un gran esfuerzo físico.

Los efectos secundarios indeseables, unidos a la necesidad de dosis muy elevadasen tiempo prolongado para p roducir el efecto fisiológico buscado por el deportista osus preparadores, hacen de los corticoesteroides un grupo de alta peligrosidad den-tro del m un do del dopaje. El dopaje m edian te corticoesteriodes natu rales sue le esca-par a los controles analíticos habituales, debido a la dificultad para distinguir estasituación en u n perfil analítico urina rio. En cambio la presencia de corticoesteroidessintéticos sí pu ede distingu irse claramente en el perfil urina rio del deportista.

El empleo de corticoesteroides por los deportistas está prohibido por vía oral yparentera l B.O.E. del 22 de junio de 2001), aun que se autoriza su uso a dosis terapéu-ticas en aplicaciones locales, en inhalación y en inyecciones peri e intra articulares,previa comunicación por escrito del médico responsable del deportista.

Com o fácilmente se deduce de los comentarios recogidos en el apartado anterior,el desarrollo de métodos analíticos para la determinación de corticoesteroides es untema de gran interés y actualidad dentro de las investigaciones sobre el control deldopaje, y

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