AMARANTO TESIS

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Text of AMARANTO TESIS

INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIN CIENTFICA Y TECNOLGICA, A.C.POSGRADO EN BIOLOGA MOLECULAR

Caracterizacin fisicoqumica y nutracutica de Ttulo de la tesis amaranto (Amaranthus hypochondriacus) cultivado (Tratar de hacerlo comprensible para el pblico general, sin abreviaturas) en San Luis PotosTesis que presenta Cecilia Silva Snchez Para obtener el grado de Doctor en Ciencias en Biologa Molecular

Director de Tesis: Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa Codirector de tesis Dra. Elvira Gonzlez de Meja

San Luis Potos, S.L.P., Marzo 2007.

Crditos InstitucionalesEsta tesis fue elaborada en el Laboratorio de Protemica y Expresin Gnica del Departamento de Biologa Molecular del Instituto Potosino de Investigacin Cientfica y Tecnolgica A.C., bajo la direccin de la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa y tambin en Laboratorio de la Dra. Elvira Gonzlez de Meja del Departamento de Ciencia de Alimentos y Nutricin Humana de la Universidad de Illinois en Urbana-Champaign. Durante la realizacin del proyecto el autor recibi una beca acadmica del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (beca No. 172330), as como del TIES-Training Program perteneciente al US-AID program, Joint Program in Value-Added Foods at the UIUC.

Acta de examen

NDICE GENERAL Pgina

Resumen. Abstract.

i ii

I.1.1

Introduccin.Generalidades del amaranto y pptidos bioactivos. 1

II.2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.3.1 2.2.3.2 2.2.3.3 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.2.1 2.3.2.2 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.4.5 2.4.6 2.4.7

Revisin de literatura.Historia, origen, distribucin, produccin y clasificacin del amaranto. Historia. Origen, distribucin y produccin. Clasificacin. Caractersticas del cultivo. Caractersticas generales de la semilla de amaranto. Tamao y estructura. Composicin qumica. Protenas de reserva y su funcin. Tipos de protenas de reserva. Sntesis de protenas de protenas de reserva. Localizacin de la traduccin de protenas de reserva. Pptidos bioactivos en protenas de reserva. Clasificacin de pptidos activos en protenas de reserva. Lunasin. Caracterizacin y funcin en plantas. Funcin biolgica en clulas de mamfero. Caractersticas generales del almidn de amaranto. Generalidades del almidn. El grnulo de almidn. Composicin qumica del almidn. Biosntesis del almidn. Protemica en grnulos de almidn. Caracterizacin fsica de los grnulos de almidn. Microscopia de fuerza atmica. 4 4 5 5 7 8 8 10 11 12 13 15 15 15 17 17 18 19 19 19 20 21 22 23 24

Pgina

III.3.1 3.2 3.3 3.3.1 3.3.2

Justificacin, hiptesis y objetivos.Justificacin. Hiptesis. Objetivos. Objetivo general. Objetivos especficos. 26 27 28 28 28

IV4.1 4.1.1 4.1.2 4.2 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.1.3 4.2.1.4 4.2.2 4.2.2.1 4.2.2.2 4.2.2.3 4.2.2.4 4.2.2.5 4.2.2.6 4.2.3 4.2.3.1 4.2.3.2

Materiales y mtodos.Materiales. Material biolgico. Reactivos. Mtodos. Caracterizacin de la semilla de amaranto. Rendimiento en campo. Tamao de semilla. Peso de 100 granos. Composicin proximal. Caracterizacin de protenas de reserva. Extraccin de protenas. Cuantificacin de protenas solubles. Determinacin de aminocidos. Electroforesis de protenas unidimensional. Electroforesis de protenas bidimensional. Ensayos RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Caracterizacin de pptidos activos en protenas de reserva de amaranto. Prediccin de pptidos activos en protenas de reserva de amaranto. Identificacin de pptidos activos en la fraccin glutelinas mediante cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LC MS/MS). Caracterizacin de lunasin. Cuantificacin por ensayos de ELISA. Identificacin por Western blot. Ensayo de inmunoprecipitacin. MALDI-TOF(Matrix assisted lasser desorption ioinization). 29 29 29 30 30 30 30 30 30 31 31 31 32 32 32 33 34 34 35 36 36 37 38 38

4.2.3.2 4.2.3.2.1 4.2.3.2.2 4.2.3.2.3 4.2.3.2.4

Pgina 4.2.4 4.2.4.1 4.2.4.2 4.2.4.3 4.2.5 Caracterizacin de grnulos de almidn de amaranto. Extraccin de almidn. Extraccin de protenas asociadas a grnulos de almidn. Caracterizacin fsica del grnulo de almidn de amaranto. Anlisis estadstico. 39 39 39 40 40

V.5.1 5.1.1 5.1.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.3.1 5.1.3.2 5.2 5.2.1 5.2.1.1 5.2.2 5.2.2.1 5.2.2.2 5.2.2.3 5.2.2.4 5.2.2.5

Resultados y discusin.Caracterizacin fisicoqumica de las semillas de amaranto cultivadas en San Luis Potos. Propiedades fsicoqumas de la semilla de amaranto. Variabilidad gentica intra especie mediante anlisis de RAPD. Composicin qumica de las semillas de amaranto. Patrn electrofortico de las protenas de reserva de amaranto. Caracterizacin de glutelinas de amaranto mediante electroforesis bidimensional. Identificacin de glutelinas por LC MS/MS. Caracterizacin de pptidos bioactivos en protenas de reserva de amaranto. Prediccin de pptidos con actividad biolgica potencial en protenas de reserva. Identificacin de pptidos activos en la fraccin glutelinas de amaranto. Caracterizacin del pptido tipo Lunasin en protenas de reserva de amaranto. Contenido de Lunasin en protenas de reserva de amaranto. Deteccin del pptido tipo Lunasin mediante Western blot. Purificacin del pptido tipo Lunasin por ensayos de inmunoprecipitacin. Identificacin del pptido tipo Lunasin por MALDI-TOF. Caracterizacin de Lunasin en glutelinas de amaranto mediante electroforesis bidimensional. Caracterizacin de almidn de amaranto Caracterizacin bioqumica de las protenas asociadas a grnulos de almidn. Protenas asociadas a grnulos de almidn mediante electroforesis unidimensional. Caracterizacin de las protenas asociadas a grnulos de almidn mediante electroforesis bidimensional. 41 41 42 43 46 48 52 54 54 56 59 59 61 64 64 66 66 66 66 67

5.3 5.3.1 5.3.1.1 5.3.1.2

Pgina 5.3.1.3 5.3.2 Anlisis de las protenas asociadas a grnulos de almidn mediante MALDI-TOF. Caracterizacin fsica de los grnulos de almidn de amaranto. 68 70

VI.6.1

Conclusiones y perspectivas.Conclusiones. 74 75

VII. VIII.Anexo I Anexo II

Referencias. AnexosCaptulo en libro Characterization of bioactive pepetides in Amaranthus hypochondriacus seed storage proteins Artculo de investigacin Bioactive peptides in Amaranth (amaranthus hypochondriacus)

85 93

NDICE DE TABLAS Pgina Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6 Tabla 7 Tabla 8 Tabla 9 Tabla 10 Tabla 11 Rendimiento en campo de amaranto, algunos cereales y leguminosas. Comparacin de la composicin proximal entre amaranto y algunos cereales. Composicin de aminocidos esenciales de semillas de tres especies de amaranto en (g/100g de protena). Mezcla de reaccin para PCR. Condiciones de PCR para RAPD. Oligonucletidos para RAPD. Propiedades fsicas de las semillas de amaranto cultivadas en San Luis Potos. Anlisis proximal de las semillas de amaranto cultivadas en San Luis Potos. Fracciones protenicas de amaranto cultivado en San Luis Potos. Identificacin de protenas de glutelinas de amaranto mediante espectrometra de masas. Biopptidos identificados en la digestin trptica de las glutelinas de amaranto mediante cromatografa de lquidos acoplado a espectrometra de masas. Concentracin del pptido tipo Lunasin en extractos totales de protena y fracciones de protenas en g/g de protena total cuantificados por ELISA. Concentracin del pptido tipo Lunasin en extractos totales de protena y fracciones de protenas en g/g de harina cuantificados por ELISA. 8 10 11 33 34 34 41 44 44 53 58 60 60

Tabla 12

Tabla 13.

NDICE DE FIGURAS Pgina Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Apariencia del cultivo de amaranto. Microgrfica electrnica del grano de amaranto. Sntesis de glicina en cotiledones de soya. Ruta biosinttica de almidn mediante ADP-glucosa. Organizacin de amilopectina para formar el grnulo de almidn. Productos de amplificacin de las cuatro variedades de amaranto para el ensayo RAPD. Composicin de aminocidos de harinas de amaranto cultivado en San Luis Potos. Composicin de aminocidos de las fracciones de protenas de reserva de amaranto cultivado en San Luis Potos. Patrn electrofortico de la fracciones de protenas de reserva de amaranto cultivado en San Luis Potos. Patrn bidimensional de glutelinas de amaranto pH 3-10 lineal. Comparacin de glutelinas Criolla vs. Nutrisol pH 3-10 mediante Image Master (GE Healthcare). Patrn bidimensional de glutelinas de amaranto pH 4-7. Comparacin de glutelinas Criolla vs. Nutrisol pH 4-7 mediante Image Master (GE Healthcare). Patrn bidimensional de glutelinas de amaranto pH 6-11. Comparacin de glutelinas Criolla vs. Nutrisol pH 6-11 mediante Image Master (GE Healthcare). Glutelinas de amaranto variedad Criolla que fueron analizadas por LC MS/MS. Prediccin de pptidos con potencial actividad biolgica en protenas de amaranto. Curva estndar de Lunasin sinttico mediante ELISA. Deteccin del pptido tipo lunasin mediante Western blot. Western blot de extractos totales de protenas de amaranto mezcladas con Lunasin de soya. Western blot despus de la inmunoprecipitacin de glutelinas Masas monoisotpicas de cuatro fragmentos detectados por anlisis de MALDI-TOF y sus secuencias esperadas. Identificacin del pptido tipo lunasin mediante electroforesis bidimensional. Patrn electrofortico de protenas asociadas a grnulos de almidn. 6 9 14 21 24 42 45 46 47 49 49 50 50 51 51 52 55 59 62 63 64 65 66 67

Figura 9 Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17. Figura 18. Figura 19. Figura 20. Figura 21. Figura 22. Figura 23. Figura 24.

Pgina Figura 25. Electroforesis bidimensional de protenas asociadas a grnulos de almidn variedad Criolla. Figura 26. Identificacin de protenas asociadas a grnulos de almidn por MASCOT. Figura 27. Fragmento de los resultados de BLAST protena-protena para la sintetasa unida a grnulos de almidn. Figura 28. Microscopia Electrnica de Barrido de grnulos completos de almidn de amaranto variedad Criolla. Figura 29. Imgenes de grn