57

Alur Pikir

1. Lesi pada rongga mulut merupakan suatu reaksi akibat iritasi kronis yang secara

mikroskopis dijumpai perubahan sel berupa metaplasia dan displasia. Keadaan ini

masih bersifat reversible dan iritasi kronis dihilangkan maka sel ini dapat kembali

ke bentuk normal tapi pada keadaan iritasi yang terus-menerus, Sel displasia dapat

mengalami perubahan menjadi sel anaplasia yang dikategorikan sebagai

karsinoma. (Yen CY, Lu MC, Tzeng CC , 2009)

2. Karsinoma sel skuamosa merupakan tumor ganas yang berasal dari sel sepitel

skuamous. Neoplasma ganas disebut kanker dan istilah kanker digunakan untuk

menyebut neoplasma ganas khususnya jenis epiteal yaitu karsinoma.(M. Taha

Ma’ruf, 2007)

3. Di Medan menurut data penelitian yang didapat Octavia (2003) dan Puspasari

(2008) pada tahun 1997-2012 yang dilakukan di laboratorium patologi anatomi

Medan, didapatkan angka insidensi KSS rongga mulut adalah diantara 86%-

90,5% dari seluruh keganasan di rongga mulut

4. Etilogi terjadinya karsinoma sel skuamosa adalah faktor lokal (iritasi

kronis,trauma mekanis atau restotasi yang tidak tepat) Faktor luar ( kebiasaan

merokok,makanan dan status nutrisi, sinar UV, infeksi virus (HPV,EBV,HSV ) dan

jamur, debu industry) Faktor co-carcinogen Faktor yang membantu bahan kimia

lain untuk menimbulkan terjadinya keganasan seperti usia,jenis-kelamin,genetik.

(Taha Ma’ruf M ,2007)

5. Pemeriksaan Imunohistokimia juga sering digunakan untuk penelitian dasar

dalam rangka mengetahui distribusi dan lokasi biomarker ataupun protein

terekspresi pada berbagai macam jaringan pada tubuh. (Ramos-Vara, 2005).

LAMPIRAN 1

Universitas Sumatera Utara

58

6. EBV merupakan salah satu penyebab karsinoma sel skuamosa rongga

mulut.karsinoma sel skuamosa yang terjadi pada penduduk Okinawa jepang sudah

diteliti dan hasilnya ternyata terkait dengan infeksi EBV . (Higa et al, 2002)

7. Infeksi EBV sering terjadi,di Amerika serikat hampir 50% dari anak-anak yang

berumur di bawah lima tahun, dan 95% orang dewasa pernah mengalami infeksi

EBV. (Budhy TI 2005)

8. EBV diketahui sebagai salah satu penyebab utama dari terjadinya penyakit ini.

EBV memiliki potensial dan kemampuan untuk menjadi karsinogenesis (Budhy TI

2005)

9. Genom EBV yang berada pada sel inang berbentuk Latent episome. Dimana pada

latent episome terdapat gen antara lain Lmp-1,EBNA,EBER. (Budhy TI 2005)

10. EBV biasanya ditularkan melalui air liur yang terinfeksi dan memulai infeksi di

orofaring. replikasi virus terjadi pada sel epitel faring dan kelenjar ludah. EBV

adalah penyebab dari mononucleosis infeksiosa. Sel B yang terinfeksi virus

mensintesis imunoglobin. Mononukleosis merupakan transformasi poliklonal sel B.

selama perjalanan infeksi mayoritas penderita antibody heterofil.(M. Taha Ma’ruf

,2007)

11.Lmp-1 secara langsung berhubungan dengan oncogenesi karena Lmp-1 mempunyai

kemampuan menginhibisi terjadinya apoptosis dan dapat meningkatkan konsentrasi

Bcl2

. Apoptosis merupakan hal penting dalam perkembangan dan homeostatsis

jaringan normal (Shao JY, 2004)

12. Lmp-1 mengaktifasi jalan NF-κB , lebih jauh lagi Lmp-1 menginduksi faktor pro-

angiogenik seperti VEGF, FGF-2, MMP9, and COX2, yang memberi kontribusi

menjadi onkogenik. (Robbin and Cotran, 1999)

Universitas Sumatera Utara

59

13. EBV yang telah menginfeksi epitel akan menetap secara laten dan secara perio-

dik menjadi aktif. Pada Hairy leukoplakia ditemukan partikel EBV sampai 100%

(Hu li Fu, 1995)

14. Lmp-1 merupakan gen laten EBV yang pertama ditemukan yang dapat

mentransformasi jalur sel dan merubah fenotip sel karena potensi onkogeniknya

(Yenita, Asri A, 2012)

15. EBV dapat menginfeksi oral mukosa yang laten. Tampilan Lmp-1 sebagai penanda

onkoprotein dari virus pada kasus EBV positif diindikasikan bahwa infeksi laten

bisa menjadi salah satu penyebab transformasi onkogeni dari oral ephitelium yang

terinfeksi. (Gonzalez M dkk , 2002)

Berdasarkan uraian diatas, maka peneliti ingin melakukan penelitian dengan

melihat tampilan produk gen latent membrane protein-1 (Lmp-1) pada kasus

karsinoma sel skuamosa rongga mulut. Dengan mengkaji ekspresi gen EBV pada

karsinoma sel skuamosa rongga mulut dapat digunakan sebagai upaya pencegahan

dini.

Masalah

Bagaimana tampilan immonohistokimia Lmp-1 yang dihasilkan EBV yang pada

KSS rongga mulut?

Universitas Sumatera Utara

60

Tujuan

1. Untuk melihat karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang menampilkan gen

latent membrane protein-1 (Lmp-1).

2. Untuk melihat tampilan imunohistokimia Lmp-1 pada sub-tipe karsinoma sel

skuamosa rongga mulut.

3. Untuk melihat hasil tampilan imunohistokimia Lmp-1 pada karsinoma sel

skuamosa rongga mulut.

Manfaat

1. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat untuk

mengetahui tampilan Latent membrane peotein-1 (Lmp-1) dengan Karsinoma sel

skuamosa rongga mulut.

2. Memberikan informasi mengenai EBV sebagai salah satu karsinogen

3. Data awal untuk penelitian lanjutan

Universitas Sumatera Utara

61

Kerangka Teori

Kerusakan sel normal oleh: • Khemis • Radiasi • Virus

Sel Epitel normal

Peradangan

Pre-kanker (Displasia)

Karsinoma Rongga mulut

Infeksi Epstein-barr virus

erusakan DNA yan tidak dapat diperbaiki

Mutasi gen

Aktivasi onkogenesis Pencegahan apoptosis Inaktivasi tumor suppresor gen

LAMPIRAN 2

Universitas Sumatera Utara

62

Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 pada KSS rongga mulut

Gambar 1. Kontrol positif (kontrol internal)

hasil pewarnaan imunohistokia Lmp-1 pada KSS rongga mulut dengan tampilan warna coklat paling kuat pada membran (A).inti sel tumor pembesaran 40x (dokumentasi).

Gambar 2. Hasil pewarnaan imunohistokim- ia Lmp-1 tampilan negatif pada KSS rongga mulut pembesaran 40x (dokumentasi).

A

LAMPIRAN 3

Universitas Sumatera Utara

63

Gambar 3. Hasil pewarnaan imunohistokimia Lmp-1 yang tertampil sedang pada (A) Inti sel KSS rongga mulut pembesaran 40x (dokumentasi).

Gambar 4. Hasil pewarnaan imunohisto- kimia Lmp-1 tertampil kuat pada (A) Inti sel KSS rongga mulut pembesaran 40x (dokumentasi).

A

A

Universitas Sumatera Utara

64

Alat dan Bahan

Gambar 5. Tissue Embading centre compressor cooled colid spot

Gambar 6. Semi motorized rotary microtome

LAMPIRAN 4

Universitas Sumatera Utara

65

Gambar 7. Deparafinization and target retrieval PT Link DACO

Gambar 8. A. IHC diluent , B.antibodi monoclonal Lmp-1 , C. larutan kromogen DAB

A B C

Universitas Sumatera Utara

66

5a. Pembuatan sediaan mikroskopis dari blok parafin.

1. Pemotongan Blok Parafin dengan Mikrotom

2. Potongan tipis parafin diambil menggunakan spuit

3. Potongan tipis parafin dimasukkan ke dalam waterbath

LAMPIRAN 5

Universitas Sumatera Utara

67

4. Potongan tipis parafin ditempelkan ke kaca objek

5. Slide diletakkan diatas hotplate

6. Slide yang telah dikeringkan diatas hotplate

dicelupkan ke dalam cairan xylol sebanyak 3

kali masing-masing 5 menit

Universitas Sumatera Utara

68

7. Slide dicelupkan ke dalam cairan alkohol 96%,80%,

8. Slide disusun di rak untuk dimasukkan ke PT Link DACO

9. Setelah slide disusun di rak. Rak tersebut dimasukkan ke dalam Deparafinazitaion

and target retrieval. kemudian waktu diatur.

Universitas Sumatera Utara

69

5b. Proses Pemulasan Imunohisokimia antibodi Lmp-1

1. Pap Pen daerah disekeliling jaringan

2. Blocking dengan Peroksidase block selama 10 menit

3. Cuci dengan Tris Buffered saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit.

Universitas Sumatera Utara

70

4. Blocking dengan Normal Horse serum (NHS) 3% selama 15 menit

5. Cuci dengan Tris Buffered saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit.

6. Blocking dengan antibodi primer Lmp-1 (Ready to use) kemudian inkubasi selama 1 jam.

7. Cuci dengan Tris Buffered saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit.

Universitas Sumatera Utara

71

8. Dako real Envision Rabbit 30 menit

9. Cuci dengan Tris Buffered saline (TBS) pH 7,4 selama 5 menit.

10. Blocking dengan DAB+ substrat kromogen solution dengan pengenceran 20 µ DAB:1000 µ substrat selama 5 menit

Universitas Sumatera Utara

72

11. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit

12. Counterstrain dengan Hematoxylin selama 5 menit

13. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit

14. Cuci dengan air mengalir selama 5 menit

Universitas Sumatera Utara

73

15. Dehidrasi dengan Alkohol 80%,96%,Abs selama masing-masing 5 menit

16. Clearing dengan Xylol 1,2,3 selama masing-masing 5 menit

17. Mounting kemudian ditutup cover glass

Universitas Sumatera Utara

74

LAMPIRAN 6

Universitas Sumatera Utara

75

Universitas Sumatera Utara