Upload
belden
View
144
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Alkoholdehydrogenas – ADH labb. Biokemi 1 – HT-11. Linda Helmfors [email protected] ( [email protected] ). Dehydrogenaser. Enzymer som katalyserar överföring av väte kallas med ett samlingsnamn för dehydrogenaser - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
2
Dehydrogenaser
• Enzymer som katalyserar överföring av väte kallas med ett samlingsnamn för dehydrogenaser
• Alkoholdehydrogenas (ADH) katalyserar oxidation av alkoholer -> aldehyder
• ADH kräver närvaro av koenzymet NAD+ för aktivitet• ADH är ett gruppspecifikt enzym. Snabbast reaktion med etanol men
även andra alkoholer fungerar
ADH NAD+
3
Labben
• Blanda olika alkoholer med ADH och NAD+ • Mäta absorbansändringen• Beräkna reaktionshastigheten
4
Reaktionen vi studerar
ADH-NAD+ + R-CH2OH ADH-NADH + R-CHO + H⇌ +
5
Hur kan vi mäta reaktionshastigheten?
• Vi kan mäta reaktionshastigheten genom att mäta spektrofotometriskt vid 340nm
• NADH absorberar ljus till skillnad från NAD+
• 1 mol NADH 1 mol alkohol• Absorbansökningen per tidsenhet är ett mått på
reaktionshastigheten
6
Reaktionshastighet
• E mättat på [S]• Allt E förekommer som [ES]
• [E]Tot = [ES]
• VMax beror av [E]
Under dessa beting mäter vi
7
Absorbans jämfört med reaktionshastighet
Konstant hastighet
Överskottet substrat är slut => Reaktionen har nått jämvikt
Ger oss hastigheten i min-1 men vi vill ha µmol/min
8
Beräkningar
• Lambert-Beers lag:
• A absorbansenhet
• ε ämnesspecifik konstant, här för NADH 6,22 ∙ 103 M-1 cm-1
• l strålens väg genom kyvetten i cm• c koncentration av NADH i kyvetten i M• Kan skrivas om:
9
Beräkningar forts.
M/min
Detta vill vi göra om till mol/min
Skriv sedan i µmol/min i tabellen
10
Laborationsredogörelse:
• Rubrik: Laborationens namn• Resultat:
• Rådata (invägda mängder, spädningar, direkta mätresultat ) tydligt redovisade, gärna i tabellform:
• Redovisade uträknade resultat baserade på mätdata – Tydligt!• Graf över reaktionshastigheten som funktion av enzymmängden
Alkohol Mängd ADH
Absorbans 1
Absorbans 2
Tid 1 Tid 2
11
Laborationsredogörelse forts:
• Ifylld tabell över resultat
• Resultattolkning/Diskussion: Värdering av resultat och egna slutsatser samt svar på eventuella frågor ställda i laborationshandledningen.
• Lathund över vanliga returer kommer att sitta uppe på labb
Substrat ADH(µl)
ADH(mg)
∆A/∆t(min-1)
v(µmol/min)
v100/vetanol
Kommentarer till returer - ADH
1. Beräkningarna behöver justeras
2. Grafen saknar enheter/fel enhet3. Uppdatera tabellen och grafen4. Utvecka diskussionen över resultatet
5. Redovisa beräkningarna med exempel från egna värden6. Graf saknas7. Tabell över rådata saknas
8. Diskussion saknas
13
Förberedelser
• Läs labbhandledningen innan labben• Fundera över:
• Vilka data behöver vi samla in för att beräkna V?• Vad förväntar vi oss för resultat?
14
Labben i korthet
1. Reaktionen utan enzym: NAD+ + EtOH, blanda -> mät2. Reaktionen med enzym: NAD+ + EtOH + ADH, blanda snabbt -
> mät3. Upprepa för reproducerbarhet4. Upprepa (2) med olika volym ADH5. Upprepa med olika alkoholer
Vi ses på labb!