Embed Size (px)
Citation preview
AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT
KAPANG ENDOFIT DAUN SIRSAK
(Annona muricata L.)
MINARNI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Aktivitas Antikanker
Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Daun Sirsak (Annona muricata L.) adalah benar
karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam
bentuk apapun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal
atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir
tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Februari 2016
Minarni
NRP G851140181
RINGKASAN
MINARNI. Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Daun Sirsak
(Annona Muricata L.) Dibimbing oleh I MADE ARTIKA, AKHMAD ENDANG
ZAINAL HASAN dan HEDDY JULISTIONO.
Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan di dunia. Salah satu jenis
kanker yang sering diderita oleh penduduk dunia adalah kanker payudara.
Pengobatan biasanya dilakukan dengan menggabungkan beberapa perlakuan
seperti kemoterapi, operasi, radioterapi, imunoterapi dan terapi fotodinamik.
Namun, risiko munculnya efek samping yang berbahaya terjadi apabila perlakuan-
perlakuan di dalam terapi kanker mempengaruhi metabolisme sel normal. Oleh
karena itu, pemanfaatan tanaman herbal telah dijadikan sebagai salah satu
pengobatan alternatif yang tidak menimbulkan efek samping dan menghambat jalur
anti apoptosis dengan dosis yang relatif rendah. Salah satu bahan alami yang
berpotensi sebagai antikanker adalah sirsak, terutama bagian daunnya. Tanaman
tingkat tinggi seperti sirsak diduga memiliki mikroba endofit yang berpotensi
sebagai obat. Mikroba endofit bersimbiosis secara mutualisme dengan jaringan-
jaringan tanaman.
Tujuan penelitian ini adalah menguji secara in-vitro aktivitas antikanker
ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) sebagai
bahan antikanker payudara. Penelitian ini terdiri atas empat langkah: (1) ekstraksi
metabolit kapang endofit, (2) uji aktivitas sitotoksik ekstrak etil asetat kapang
endofit daun sirsak terhadap sel kanker payudara Michigan Cancer Foundation-7
(MCF-7) dengan metode Methyl Thiazol Tetrazolium (MTT), (3) identifikasi
kualitatif senyawa kimia ekstrak daun sirsak menggunakan instrument Gas
Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS) pirolisis, dan (4) identifikasi
kapang endofit berbasis amplifikasi sekuen nukleotida gen Internal Transcribed
Spacer (ITS).
Hasil penelitian menunjukkan bahwa dua belas ekstrak etil asetat kapang
endofit daun sirsak memiliki aktivitas sitotoksik yang berbeda-beda. Hasil
pengujian sitotoksik beberapa ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak
terhadap sel kanker MCF-7 menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat kapang endofit
daun sirsak nomor 5 asal Garut merupakan ekstrak teraktif dengan nilai IC50 sebesar
19.20 µg/mL, sedangkan pada sel normal (sel Chang) tidak menunjukkan efek
sitotoksik ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak nomor 5 asal Garut dengan
nilai IC50 sebesar 1258.92 µg/mL. Analisis GC-MS menunjukkan adanya senyawa-
senyawa alkaloid (piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile) yang dilaporkan
berperan sebagai antikanker. Kesimpulan penelitian ini adalah ekstrak etil asetat
kapang endofit daun sirsak memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara
dengan menghambat proliferasi sel kanker payudara secara in-vitro. Sedangkan
identifikasi molekuler berbasis daerah gen ITS menunjukkan bahwa kapang endofit
daun sirsak memiliki kemiripan dengan genus Phomopsis sp. dengan nilai homolog
mencapai 99,998%.
Kata kunci: Annona muricata L., Antikanker MCF-7, daun sirsak, kapang endofit.
SUMMARY
MINARNI. Anticancer Activity of Ethyl Acetate Extract of Endophytic Fungi
Isolated from Soursop Leaves (Annona muricata L.). Supersived by I MADE
ARTIKA, AKHMAD ENDANG ZAINAL HASAN and HEDDY JULISTIONO.
Cancer is a leading cause of death in the world. One of the most frequent
cancer incident in the world is breast cancer. Common medicines come from
combining some treatments such as chemotherapy, operation, radiotherapy,
immunotherapy and photodynamics therapy. However, the cancer treatment could
induce dangerous side effects which affect normal cell metabolism. Therefore,
herbal plant use has existed as one of the alternative medicine without impacting
side effects and it inhibits anti apoptotic pathway by low doses. Plant that has been
used as anticancer agent is soursop (Annona muricata L.), especially its leaves.
High level plant like soursop is predicted to have endophytic microbes with potency
as sources of medicine. Endophytic microbe usually creates symbiosis interaction
with plant tissues.
The purpose of this study was to test in vitro anticancer activity of ethyl
acetate extracts of endophytic fungi of the soursop leaves as an anti-breast cancer
agent. This study consisted of four steps: (1) extracting metabolites from
endophytic fungi, (2) testing cytotoxic activity of ethyl acetate extracts of
endophyte fungi against Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) breast cancer cell
line with Methyl Thiazole Tetrazolium (MTT) assay, (3) Identifying chemical
compounds of endophytic fungi extracts using Gas Chromatography–Mass
Spectrometry (GC-MS) pyrolysis instrument, and (4) Identifying endophytic fungi
species by amplifying nucleotide sequences of Internal transcribed spacer (ITS)
gene.
Results showed that the twelve ethyl acetate extracts of endophytic fungi
have different cytotoxic activity on MCF-7 cancer cells. The cytotoxic test
indicated that extract of endophytic fungi of soursop leaves (Garut number 5) is the
most active to inhibit the proliferation of MCF-7 cancer cells with IC50 value of
19.20 mg/mL. In the other hand, the extract did not show inhibitory activity on
normal cell (Chang cell) with the IC50 value of 1258.92 mg/mL. GC-MS analysis
showed that piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile (alkaloid compound) acts
as an anticancer agent. The conclusion of this study is ethyl acetate extracts have
cytotoxic effect against breast cancer cells by inhibiting the proliferation of breast
cancer cells based on in vitro test. In addition, molecular identification based on
ITS gene showed that the endophytic fungi of soursop leaves have similarities to
Phomopsis sp. with the homology value of 99.998%.
Keywords: Annona muricata L., anticancer MCF-7, endophytic fungi, soursop
leaves.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau
menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
AKTIVITAS ANTIKANKER EKSTRAK ETIL ASETAT
KAPANG ENDOFIT DAUN SIRSAK
(Annona muricata L.)
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
MINARNI
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof drh Dr Maria Bintang, MS
PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim
Puji dan syukur kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-
Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Aktivitas Antikanker
Ekstrak Etil Asetat dari Kapang Endofit Daun Sirsak (Annona muricata L.)”. Penelitian
ini dilaksanakan dari bulan April hingga Oktober 2015, di Laboratorium Mikrobiologi
Proses Pusat Penelitian Biologi, Bidang Mikrobiologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan
Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat
Studi Satwa dan Primata IPB, dan Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan
Bogor.
Penulis mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya
kepada Bapak Dr Ir I Made Artika MAppSc sebagai pembimbing utama, Bapak Dr Ir
Akhmad Endang Zainal Hasan, MSi sebagai pembimbing kedua dan Bapak Dr Heddy
Julistiono, DEA sebagai pembimbing ketiga yang telah banyak memberikan bimbingan,
pengarahan, saran, motivasi, semangat serta waktunya sejak penyusunan usulan
penelitian hingga selesai penelitian. Penghargaan penulis sampaikan kepada Lembaga
Pengelolaan Dana Pendidikan Kementerian Keuangan RI (LPDP) atas beasiswa yang
telah diberikan. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada ayah, ibu, dan seluruh
keluarga atas segala do’a, dukungan dan kasih sayang yang telah diberikan.
Terimakasih kepada pengelola pascasarjana, seluruh dosen dan staf akademik
Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor, teman-teman angkatan 51 dan seluruh
teman-teman Laboratorium LIPI sebagai teman berdiskusi penulis selama penelitian ini.
Penulis menyadari masih banyak terdapat kekurangan dalam penyusunan tesis ini. Oleh
karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun untuk perbaikan
dalam penulisan selanjutnya. Semoga penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi penulis
maupun pembaca.
Bogor, Februari 2016
Minarni
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL vii
DAFTAR GAMBAR vii
DAFTAR LAMPIRAN vii
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
Ruang Lingkup Penelitian 2
2 TINJAUAN PUSTAKA 2
Kanker 2
Kanker Payudara 5
Daun Sirsak 6
Kapang Endofit 7
Sel Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7) 7
Polymerase Chain Reaction (PCR) 8
Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS) 9
Identifikasi Kapang Berdasarkan Daerah Internal Transcribed Spacer
(ITS) DNA Ribosom 10
2 METODE 11
Waktu dan Tempat Penelitian 11
Bahan 11
Alat 11
Prosedur Penelitian 11
Analisis Data 14
4 HASIL 14
Kapang Endofit Daun Sirsak Hasil Kultivasi 14
Ekstrak Kapang Endofit Daun Sirsak 16
Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit 17
Kandungan Senyawa Aktif dengan GC-MS pyrolysis 19
Identitas Kapang Endofit Daun Sirsak berbasis Amplikasi ITS 19
5 PEMBAHASAN 20
Kultivasi Kapang Endofit Daun Sirsak 20
Ekstraksi Senyawa Aktif Kapang Endofit Daun Sirsak 21
Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit 21
Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif dengan GC-MS pyrolysis 24
Identifikasi Kapang Endofit Daun Sirsak berbasis Amplikasi ITS 26
6 SIMPULAN DAN SARAN 28
Simpulan 28
Saran 28
DAFTAR PUSTAKA 28
LAMPIRAN 37
RIWAYAT HIDUP 65
DAFTAR TABEL
1 Hasil ekstrak yang diperoleh dari kapang endofit daun sirsak 17
2 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel MCF-7 18
3 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel Chang 18
DAFTAR GAMBAR
1. Struktur kimia doksorubisin 3
2. Struktur ACGs 4
3. Karakteristik sel kanker 4
4. Anatomi payudara 5
5. Daun sirsak (Annona muricata L.) 6
6. Tahapan-tahapan dalam PCR 8
7. Sebagian kapang endofit dari daun sirsak dalam media YMA pada cawan
petri 15
8. Kapang endofit daun sirsak dalam media YMB 16
9. Hasil ekstrak kapang endofit daun sirsak 16
10. Aktivitas antikanker ekstrak kapang endofit dari daun sirsak melalui sel
MCF-7 pada konsentrasi 100 µg/mL 17
11. Sel kanker payudara MCF-7 hasil perlakuan ekstrak kapang endofit
daun sirsak (Garut nomor 5) 18
12. Sel normal Chang hasil perlakuan ekstrak kapang endofit daun sirsak
(Garut nomor 5) 18
13. Kromatogram ekstrak etil asetat 19
14. Hasil PCR kapang endofit daun sirsak 19
15. Pohon filogenetik kapang endofit daun sirsak dengan K2+G (kimura 2-
parameter + gamma distributed) 20
DAFTAR LAMPIRAN
1 Bagan alir penelitian 37
2 Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit
daun sirsak dengan menggunakan sel kanker (MCF-7) 38
3 Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit
daun sirsak dengan menggunakan sel normal (Chang) 39
4 Analisis metabolit kapang endofit daun sirsak dengan GC-MS Pyrolisis 40
5 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi
100 µg/ml pada perbesaran 10x 41
6 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan
dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol)
dengan perbesaran 10x 42
7 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400
µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL pada
perbesaran 10x 42
8 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan
dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol)
dengan perbesaran 10x 44
9 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan
dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol
positif) dengan perbesaran 10x 44
10 Foto mikroskopis sel normal Chang yang diberi perlakuan dengan ekstrak
etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400 µg/mL,
200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL pada perbesaran 10x 45
11 Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan
dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol)
dengan perbesaran 10x 45
12 Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol positif)
dengan perbesaran 10x 46
13 Pohon filogenetik 46
14 Hasil BLAST 47
15 Sequences producing significant alignments 47
16 Urutan nukleotida hasil sekuen yang sudah dipilih 48
17 Pensejajaran sequence hasil BLAST 48
18 Keterangan kromatogram Gambar 13 51
19 Klasifikasi senyawa metabolit sekunder 53
20 Data spektra massa senyawa-senyawa yang dilaporkan bersifat antikanker 57
21 Analisis statistik 63
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kanker merupakan salah satu penyakit mematikan di dunia. Menurut IARC
(2013) jumlah kematian penduduk dunia yang disebabkan oleh kanker mencapai
7.6 juta jiwa, 70% penderita mengalami kematian, sedangkan 30% penderita
lainnya dapat disembuhkan. Jumlah tersebut diperkirakan mengalami peningkatan
hingga 13.1 juta jiwa pada tahun 2030 (WHO 2013). Salah satu jenis kanker yang
sering diderita oleh penduduk dunia adalah kanker payudara (WHO 2013). Kanker
payudara merupakan kanker yang berasal dari kelenjar susu, saluran kelenjar dan
jaringan penunjang payudara (Purwatiningsih et al. 2008) Berdasarkan data dari
Hospital Information System (HIS) di tahun 2010 (KemenKes 2013), kanker
payudara merupakan peringkat pertama dalam jumlah pasien yang dirawat di
seluruh Indonesia (28%), diikuti oleh kanker serviks (12%). Selain itu, kanker
payudara berada pada urutan kedua dari sejumlah kanker yang diderita wanita pada
umumnya (Veta et al. 2014).
Pengobatan yang biasa dilakukan adalah dengan menggabungkan beberapa
perlakuan seperti kemoterapi, operasi, radioterapi, imunoterapi dan terapi
fotodinamik (Adamson & Longo 2005). Namun, risiko munculnya efek samping
yang berbahaya terjadi apabila perlakuan-perlakuan di dalam terapi kanker
mempengaruhi metabolisme sel normal (Uzuner 2012). Selain itu, resistensi
terhadap obat antikanker bisa terjadi sebagai akibat dari peningkatan jalur anti
apoptosis terhadap obat-obatan yang digunakan dalam terapi (Creixell & Peppas
2012). Oleh karena itu, pemanfaatan tanaman herbal telah dijadikan sebagai salah
satu pengobatan alternatif yang tidak menimbulkan efek samping dan tidak
menghambat jalur anti apoptosis dengan dosis yang relatif rendah (Debbie et al.
2012).
Salah satu bahan alami yang memiliki potensi sebagai antikanker adalah
sirsak, terutama bagian daunnya. Zat aktif dalam tanaman sirsak yang mampu
berperan sebagai antikanker adalah Annonaceous acetogenins (ACGs) (Retnani
2011). Senyawa ACGs yang terdapat dalam daun sirsak berperan sebagai inhibitor
sumber energi untuk pertumbuhan sel kanker. Kekurangan energi menyebabkan sel
tidak bisa membelah dengan baik. ACGs akan menganggu aktivitas reseptor pada
sel dan menghambat metabolisme energi pada sel tersebut. Akibatnya produksi
energi didalam sel kanker terhenti dan akhirnya sel kanker akan mati (Nursafitri et
al. 2013).
Hasil penelitian Rishika dan Sharma (2012) menunjukkan bahwa daun
sirsak sangat berpotensi sebagai antikanker karena mampu mencegah ataupun
menghambat pertumbuhan sel kanker. Selain itu, pengobatan penyakit kanker
menggunakan daun sirsak lebih baik dan tidak memberikan efek samping
dibandingkan dengan kemoterapi atau radiasi (Itharat & Ooraikul 2007). Daun
sirsak juga dapat digunakan dalam perawatan pengidap kanker dan dapat mencegah
pertumbuhan kanker pada pengujian tikus yang diinduksi bahan karsinogen yang
berasal dari tumbuhan Cycas (Rodriguez et al. 2010).
Tanaman tingkat tinggi seperti sirsak diduga memiliki mikroba endofit yang
berpotensi sebagai tanaman obat. Mikroba endofit bersimbiosis secara mutualisme
2
dengan jaringan-jaringan tanaman. Ekstrak daun sirsak pada penelitian Riswanto et
al. (2011), menunjukkan aktivitas antikanker, tetapi belum ada informasi tentang
isolat mikroba endofit dari daun sirsak yang menghasilkan metabolit sekunder
sebagai antikanker. Mikroba endofit pada penelitian ini merupakan kapang endofit
dilihat dari bentuk morfologinya. Penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas
antikanker yang berasal dari ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun sirsak
(Annona muricata L.) ini perlu dilakukan.
Perumusan Masalah
Pemanfaatan daun sirsak sebagai agen antikanker dapat mengakibatkan
kompetisi fungsi sirsak sebagai flora penghasil buah. Eksplorasi kapang endofit
pada daun sirsak sebagai agen baru antikanker masih terbatas dan diharapkan dapat
berjalan tanpa mengurangi kuantitas buah sirsak sebagai pangan konsumtif.
Tujuan
Penelitian ini bertujuan menguji aktivitas antikanker ekstrak etil asetat dari
kapang endofit daun sirsak (Annona muricata L.) yang aktif sebagai bahan
antikanker payudara secara in-vitro.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang bahan aktif
dari kapang endofit yang berada di dalam daun sirsak sebagai bahan obat penyakit
kanker.
Ruang Lingkup Penelitian
Lingkup kegiatan penelitian ini mencakup ekstraksi etil asetat kapang
endofit dari daun sirsak (Annona muricata L.), pengujian Methly Thyazol
Tetrazolium (MTT) sel kanker payudara Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7),
identifikasi menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrometer (GC-MS)
pirolisis dan identifikasi kapang endofit berbasis amplifikasi Internal Transcribed
Spacer (ITS).
2 TINJAUAN PUSTAKA
Kanker
Kanker merupakan penyakit tidak menular yang terjadi akibat adanya
pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh secara tidak normal. Sel ini dapat menyerang
jaringan tubuh lain dari penderita, sehingga bila tidak segera ditangani dapat
menyebabkan kematian (Raymond 2007). Ada tiga ciri utama keberadaan kanker,
yakni kontrol pertumbuhan yang menurun, invasi pada jaringan setempat dan
3
penyebaran ke bagian tubuh lain (Murray et al. 2009). Penyebaran sel kanker dapat
dilakukan melalui aliran darah dan kelenjar getah bening (Winarto 2007). Kanker
dapat menimbulkan gejala berbeda, bergantung pada lokasi, keganasan dan ada atau
tidaknya metastasis. Metastasis merupakan penyebab utama kematian akibat kanker
(WHO 2010). Diagnosis kanker biasanya dilakukan melalui pemeriksaan
makroskopik jaringan yang diperoleh dengan biopsi. Setelah didiagnosis penderita
kanker biasanya mendapatkan perawatan seperti operasi, kemoterapi, atau radiasi
(Winarto 2007).
Pengobatan kanker dapat dibagi menjadi tiga, yakni terapi radiasi, operasi,
dan terapi adjuvant (pendamping). Terapi adjuvant dapat dibagi menjadi terapi
hormonal, kemoterapi dan imunoterapi (Hahn & Payne 2003). Efek samping yang
ditimbulkan akibat pengobatan kanker beragam, mulai dari kerontokan rambut,
pusing, mual, penurunan daya tahan tubuh, hingga kematian. Pengobatan
kemoterapi bertujuan menghancurkan sel kanker agar ukuran sel kanker mengecil
dan mencegah pertumbuhan kembali setelah pengobatan. Obat kemoterapi yang
umum digunakan untuk menangani berbagai jenis kanker adalah doksorubisin
(Gambar 1). Doksorubisin merupakan antitumor sitotoksik yang paling banyak
digunakan dalam praktik klinis. Obat lain yang digunakan untuk mengobati kanker
adalah herceptin (trastuzumab). Herceptin merupakan obat imunoterapi yang umum
digunakan dengan target spesifik, yakni memblokade protein Her2/neu. Protein
Her2/neu merupakan reseptor yang berfungsi mendorong pembelahan sel (ER+)
(Katzung et al. 2013).
Gambar 1 Struktur kimia doksorubisin (Agudelo et al. 2014)
Mekanisme penghambatan ataupun penyembuhan kanker sangat kompleks.
Akhir-akhir ini, telah banyak penelitian yang mengungkap mekanisme
penghambatan terjadinya tumor ataupun penyembuhannya, salah satunya melalui
mekanisme antikanker (Rahayu et al. 2012) Proses karsinogen merupakan proses
terjadinya kanker yang diawali dengan adanya kerusakan DNA atau mutasi pada
gen-gen pengatur pertumbuhan, seperti gen p53 dan ras (Hanahan & Weinberg
2000). Proses menuju terjadinya kanker yang progresif umumnya berjalan lama dan
melibatkan perubahan-perubahan genetik lanjut serta perubahan ekspresi gen yang
dapat mempengaruhi sifat pertumbuhan sel. Secara keseluruhan proses karsinogen
tersebut dapat dibagi menjadi dua fase, yaitu fase inisiasi, yakni fase aktivasi
senyawa karsinogen hingga terjadinya mutasi awal dan fase post inisiasi yang
meliputi tahap promosi dan progresi (Hanahan & Weinberg 2000).
Metabolit sekunder yang dijadikan bahan antikanker adalah senyawa
golongan fenol, salah satunya adalah ACGs (Champy et al. 2005; Pomper 2009).
McLaughlin (2008) melaporkan bahwa tanaman famili Annonaceae mengandung
4
banyak senyawa ACGs, di antaranya ditunjukkan pada Gambar 2. Asetogenin
merupakan senyawa metabolit sekunder yang secara alami terbentuk dalam
tumbuhan, yang secara spesifik menyerang sel kanker tanpa mempengaruhi sel
normal pada makhluk hidup.
Gambar 2 Struktur ACGs (Souza et al. 2008)
Menurut Zeng et al. (1996) terdapat lima bentuk monotetrahidrofuran
dalam ACGs yang berperan sebagai komponen aktif antikanker. Selain itu
Consolacion et al. (2012) menemukan bahwa senyawa ACGs dalam daun sirsak
dapat berfungsi sebagai antikanker. Menurut Hanahan dan Weinberg (2011), sel
kanker mempunyai enam karakter khusus yang ditunjukkan oleh Gambar 3.
Gambar 3 Karakteristik sel kanker (Hanahan & Wemberg 2011)
Karakter pertama dari sel kanker adalah mampu menjaga sinyal untuk
melakukan proliferasi terus menerus dimana sel normal memerlukan sinyal
eksternal untuk pertumbuhan dan pembelahannya, sedangkan sel kanker mampu
memproduksi growth factors dan growth factor receptor sendiri. Kedua, sel kanker
mampu menghindari faktor inhibisi pertumbuhan (growth factor inhibition),
sedangkan sel normal merespon sinyal penghambatan pertumbuhan untuk
mencapai homeostasis. Sehingga ada waktu tertentu bagi sel normal untuk
proliferasi dan istirahat. Sel kanker tidak mengenal dan tidak merespon sinyal
penghambatan pertumbuhan. Keadaan ini banyak disebabkan adanya mutasi pada
beberapa gen (proto-onkogen) pada sel kanker. Ketiga, sel normal memiliki
kepatuhan untuk tidak berpindah ke lokasi lain di dalam tubuh. Perpindahan sel
kanker dari lokasi primernya ke lokasi sekunder atau tertiernya merupakan faktor
utama adanya kematian yang disebabkan karena kanker. Mutasi memungkinkan
peningkatan aktivitas enzim-enzim yang terlibat invasi sel kanker Matrix
metalloproteinases (MMPs). Mutasi juga memungkinkan berkurangnya atau
5
hilang adhesi sehingga akan meningkatkan attachment, degradasi, migrasi dan
invasi sel kanker ke sel normal (Hanahan & Weinberg 2011).
Keempat, sel kanker memiliki mekanisme tertentu untuk tetap menjaga
telomer tetap panjang, hingga memungkinkan untuk tetap membelah diri. Apabila
terjadi kecacatan dalam regulasi pemendekan telomer memungkinkan sel kanker
memiliki potensi replikasi yang tidak terbatas. Kelima, sel kanker mampu
menginduksi angiogenesis, yaitu pertumbuhan pembuluh darah baru ini disekitar
jaringan kanker. Pembentukan pembuluh darah baru ini diperlukan untuk survival
sel kanker dan ekspansi ke bagian lain dari tubuh. Keenam, sel kanker tidak peka
terhadap sinyal apoptosis. Kegagalan sel kanker dalam merespon sinyal apoptosis
lebih disebabkan karena mutasinya gen-gen regulator apoptosis dan gen-gen sinyal
apoptosis (Hanahan & Weinberg 2011).
Kanker Payudara
Kanker payudara adalah pertumbuhan sel yang abnormal pada jaringan
payudara seseorang. Payudara wanita terdiri atas lobulus (kelenjar susu), duktus
(saluran susu), jaringan lemak dan jaringan ikat, pembuluh darah dan limfe
(Novianti & Purnami 2012). Anatomi payudara seperti Gambar 4. Pada tahap awal,
kanker payudara hanya membentuk benjolan pada jaringan mamae dan kemudian
pada tahap berikutnya akan terjadi luka pada jaringan mamae tersebut. Cara
mengobati kanker ini dilakukan dengan pembuangan bagian jaringan yang terkena
kanker, terapi radiasi dan kemoterapi. Terapi radiasi dan kemoterapi bertujuan
menghancurkan sel kanker dan mengendalikan pertumbuhan tumor pada jaringan
mamae yang terkena kanker utama dan mengendalikan pertumbuhan tumor pada
jaringan lain yang awalnya tidak terkena kanker. Terapi radiasi adalah pengobatan
yang menggunakan gelombang elektromagnetik dan partikel yang berenergi tinggi
(Woodward & Cox 2008). Terapi radiasi sampai saat ini masih digunakan sebagai
salah satu modalitas untuk pengobatan penyakit kanker payudara (Polgar & Major
2009).
Salah satu mekanisme terapi radiasi pada kanker adalah merusak sel secara
tidak langsung sehingga terjadi apoptosis, melalui pembentukan radikal bebas.
Radikal bebas selain merusak sel kanker, juga merusak sel normal yang dikenal
sebagai efek samping terapi radiasi (Eriksson & Stigbrand 2010). Adanya efek
samping radiasi yang berat dapat mengakibatkan tertunda atau gagalnya terapi
radiasi (Kentjono 2001). Oleh karena itu, perlu dipikirkan upaya untuk mengurangi
efek samping terapi radiasi tersebut.
Gambar 4 Anatomi payudara (Tim CancerHelps 2010)
6
Proses terbentuknya tumor payudara dapat terjadi karena kerusakan
(mutasi) pada gen yang meregulasi proliferasi sel. Kerusakan ini menyebabkan
proliferasi sel tidak dapat dikontrol. Pada beberapa kasus kerusakan lebih lanjut
dapat menyebabkan sel tumor menjalar pada bagian tubuh lainnya. Estrogen dan
progesteron merupakan hormon yang sering melekat pada reseptor beberapa sel
kanker payudara sebagai bahan bakar pertumbuhan sel tersebut. Sekitar satu dari
lima kasus kanker payudara disebabkan peningkatan protein HER-2 yang
menyebabkan sel tumor tumbuh dan menyebar lebih cepat (Tim CancerHelps
2010).
Faktor resiko kanker payudara diklasifikasikan dalam beberapa kategori
yaitu: (1) Faktor histori keluarga atau genetik, rata-rata 15% dari semua kasus
kanker payudara (2) Efek berbahaya dari hormon (3) Kategori densitas tinggi
payudara yang dikenal sebagai satu dari banyak penanda signifikan dari resiko
kanker payudara (4) Sejarah penyakit proliferatif payudara (Al-amri et al. 2015).
(5) Faktor lingkungan dan gaya hidup, pengaruh lingkungan diduga karena faktor
antara lain: alkohol, diet tinggi lemak, dan infeksi virus. Hal tersebut
mempengaruhi onkogen dan gen supresi dari kanker payudara (Wunderlich &
Restifo 2006).
Daun Sirsak (Annona muricata L.)
Sirsak (Annona muricata L.) merupakan salah satu tanaman buah yang
berasal dari Karibia, Amerika Tengah dan Amerika Selatan (Hermawan & Laksono
2013). Daun sirsak (Gambar 5) banyak digunakan sebagai obat herbal untuk
mengobati berbagai penyakit. Seperti Andes Peru Radang selaput lendir karena
penyakit asma, Amazonia Peru mengobati diabetes serta penenang dan antikejang
(Zuhud 2011).
Gambar 5 Daun sirsak
Sistematika Tanaman Sirsak:
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super Divis : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Magnoliidae
Ordo : Magnoliales
Famili : Annonaceae
Genus : Annona
Spesies : Annona muricata L.
Daun sirsak mengandung flavonoid, tanin, alkaloid, saponin, kalsium,
fosfor, karbohidrat, vitamin (A, B dan C), fitosterol, kalsium oksalat dan beberapa
kandungan kimia lainnya termasuk ACGs (Mangan 2009). Daun tanaman ini secara
tradisional digunakan untuk mencegah dan mengobati abses, artritis, asma,
bronkitis, gangguan empedu, diabetes, jantung, hipertensi, cacingan, gangguan hati,
malaria, rematik, obat penenang, tumor dan kanker (Wicaksono 2011).
7
Kapang Endofit
Endofit secara bahasa berasal dari kata endon yang berarti di dalam dan
phyton yang berarti tanaman (Schulz & Boyle 2005). Secara umum, endofit adalah
makhluk hidup yang berada di dalam tanaman dapat bersifat parasitik atau
simbiotik. Kapang endofit adalah fungi yang menginfeksi jaringan tanaman yang
sehat tanpa menyebabkan sakit (Clay 2004).
Kapang endofit merupakan mikroorganisme yang terdapat di dalam suatu
sistem jaringan tumbuhan seperti biji, daun, bunga, ranting, batang, dan akar.
Berbagai senyawa fungsional dapat dihasilkan oleh kapang endofit. Senyawa yang
dihasilkan oleh kapang endofit tersebut dapat berupa senyawa antikanker, antivirus,
antibakteri, antifungi, hormon pertumbuhan tanaman, insektisida dan lain-lain
(Strobel 2004). Kapang endofit merupakan salah satu golongan mikrob endofit
yang paling banyak ditemukan di alam (Strobel 2003) dan sumber yang kaya akan
metabolit sekunder bioaktif (Tan & Zou 2001). Kapang ini hidup berasosiasi secara
simbiosis mutualisme dengan tumbuhan inangnya. Kapang endofit menginfeksi
tumbuhan sehat pada jaringan tertentu tanpa menimbulkan tanda-tanda adanya
infeksi (Bacon & White 2000).
Kapang endofit berperan penting dalam industri farmasi karena
kemampuannya dalam memproduksi senyawa metabolit yang bervariasi, baik dari
struktur maupun fungsinya. Berbagai golongan senyawa metabolit sekunder seperti
alkaloid, flavonoid, kuinon, terpenoid, antrakuinon, fenil propanoid, turunan
isokumarin, peptida, dan senyawa alifatik, telah diisolasi dan dicirikan dari kultur
kapang endofit (Agusta 2009).
Pemanfaatan kapang endofit bisa menjadi cara inovatif untuk
mengefisienkan sumber senyawa bioaktif. Kapang endofit yang diisolasi dari
tumbuhan obat akan memiliki aktivitas senyawa bioaktif yang sama atau bahkan
lebih baik dibandingkan dengan tumbuhan inangnya, karena mekanisme perubahan
kimia oleh mikroorganisme sangat mirip dengan yang terjadi pada organisme
tingkat tinggi. Hal ini menguntungkan karena siklus hidup kapang endofit lebih
singkat daripada tumbuhan inangnya dan dapat diproduksi dalam skala besar
dengan menggunakan proses fermentasi (Setyowati & Wardah 2007).
Sel Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7)
Sel MCF-7 merupakan salah satu model sel kanker payudara yang banyak
digunakan dalam penelitian. Sel kanker payudara MCF-7 pertama kali dibiakkan
dan dikulturkan di Michigan Cancer Foundation pada tahun 1973 (Holliday &
Speirs 2011). Sel ini pertama kali diperoleh dari jaringan epitel payudara dengan
titik metastasis pleural effusion breast adenocarcinoma seorang wanita kaukasian
berumur 69 tahun bergolongan darah O dengan RH positif. Karakteristik sel ini
antara lain resisten terhadap agen kemoterapi, mengekspresikan reseptor estrogen
(ER+), ekspresi BCl-2, dan tidak mengekspresikan caspase-3. Sel MCF-7
merupakan cell line adherent, yang tumbuh melekat. Sel ini dapat ditumbuhkan
pada media yang mengandung RPMI (Roswell Park Memorial Institute) atau
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), FBS (Fetal Bovine Serum) dan
antibiotik antimikotik (Dwitarhayani 2012).
8
Popularitas MCF-7 ini terutama disebabkan sensitivitas hormon yang sangat
indah melalui ekspresi reseptor estrogen (ER), sehingga model yang ideal untuk
mempelajari respon hormon (Holliday & Speirs 2011).
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah metode amplifikasi atau
penggandaan DNA menggunakan oligonukleotida (primer) yang diarahkan secara
enzimatik berdasarkan urutan sekuen DNA spesifik. Teknik ini mampu
memperbanyak sekuen DNA hingga mencapai 105-106 kali sekuen DNA cetakan
(template). Tahapan awal (pre-treatment) yang perlu dilakukan sebelum proses
PCR adalah mencari informasi sekuen DNA yang diamplifikasi, dilanjutkan dengan
desain primer. Tahapan PCR dapat dilakukan setelah diperoleh primer yang ideal.
Produk PCR diamplifikasi dari DNA template menggunakan enzim DNA
polimerase yang termostabil dari Thermus aquaticus (Taq polimerase) dan
menggunakan pengatur siklus termal otomatis (Perkin-Elmer/Cetus) untuk
menempatkan reaksi sampai 30 atau lebih siklus denaturasi (pemisahan), annealing
(penempelan) dan extension (pemanjangan). Setelah amplifikasi dengan PCR,
produk ini dipisahkan dengan elektroforesis gel poliakrilamida dan secara langsung
divisualisasikan setelah pewarnaan dengan etidium bromida (Ali 2009).
Gambar 6 Tahapan-tahapan dalam PCR (Bacon & White 2000)
PCR merupakan suatu teknik amplifikasi (perbanyakan) potongan DNA
secara in-vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang
diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA
templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses replikasi DNA secara in-vivo yang
bersifat semi konservatif (Bacon & White 2000). PCR memungkinkan adanya
perbanyakan DNA antara dua primer, di dalam tabung reaksi. Proses PCR
9
membutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai cetakan (templat) yang
mengandung DNA target (yang akan diamplifikasi) untuk pembentukan molekul
DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleotida trifosfat (dNTP), dan
sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan
mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada
awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan
menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’. Setelah kedua primer
menempel pada DNA templat, DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan
kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan
nukleotida templat. DNA polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan gugus 5’ fosfat dNTP yang
ditambahkan, sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA
polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan disebut reaksi polimerisasi.
Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan
nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat (Boyer 2010).
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing terdiri atas tiga tahap
berurutan, yaitu pemisahan rantai DNA templat, penempelan pasangan primer pada
DNA target dan pemanjangan primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh
DNA polimerase (Bintang 2010). Tujuan PCR adalah untuk mempercepat isolasi
DNA spesifik tanpa membuat dan melakukan pustaka genom. Contoh penggunaan
PCR dilakukan pada pengidentifikasian hasil forensik, pengidentifikasi orang tua
anak dan perbanyakan molekul DNA dalam jumlah yang banyak dan waktu yang
singkat.
Gas Chromatography - Mass Spectrometer (GC-MS)
Gas Chromatography - Mass Spectrometer (GC-MS) adalah metode yang
mengkombinasikan kromatografi gas dan spektrometri massa untuk
mengidentifikasi senyawa yang berbeda dalam analisis sampel. GC-MS terdiri dari
dua blok bangunan utama: kromatografi gas dan kromatografi massa. Kromatografi
gas menggunakan kolom kapiler yang tergantung pada dimensi kolom itu (panjang,
diameter, ketebalan film) serta sifat fase (misalnya 5% fenil polisiloksan).
Perbedaan sifat kimia antara molekul-molekul yang berbeda dalam suatu campuran
dipisahkan dari molekul dengan melewatkan sampel sepanjang kolom. Molekul-
molekul memerlukan jumlah waktu yang berbeda yang disebut waktu retensi untuk
keluar dari kromatografi gas dan ini memungkinkan spektrometer massa untuk
menangkap, ionisasi, mempercepat, membelokkan dan mendeteksi molekul
terionisasi secara terpisah. Spektrometer massa melakukan hal ini dengan memecah
masing-masing molekul menjadi terionisasi mendeteksi fragmen menggunakan
massa untuk mengisi rasio (Skoog et al. 1996).
GC-MS mempunyai bagian-bagian yang berperan penting dalam proses
analisis sampel. Dapat ditinjau dari instrumennya, kromatografi gas dan
spektroskopi massa mempunyai bagian-bagian yang berbeda. Kromatografi gas
terdiri atas beberapa bagian, yaitu: kolom pengisi sampel, bagian microwave dan
detektor (Hajslova & Cajka 2007). Kolom pengisi merupakan tempat yang
disediakan untuk sampel yang dianalisis. Selanjutnya, proses separasi berlangsung
selama sampel berinteraksi dengan komponen yang berperan sebagai fase diam.
Fraksi-fraksi yang terbentuk kemudian dipanaskan pada titik didih analat untuk
10
mengubah analat ke fase gas. Analat tersebut kemudian membawa sinyal kimia
menjadi sinyal listrik dengan kekuatan intensitas berdasarkan konsentrasi analat.
Detektor kemudian menunjukkan hasil analisis berupa kromatogram. Berbeda
dengan kormatografi gas, perangkat spektroskopi massa terdiri atas tiga bagian
penting, yaitu tempat pengionan sampel, pemisahan ion, dan deteksi ion yang
terbentuk (Hajslova & Cajka 2007). Spektroskopi massa bekerja dengan mengubah
senyawa analat menjadi ion-ion yang ditempatkan pada medan magnet, kemudian
dideteksi oleh detektor dan dilanjutkan dengan transmisi emisi elektron untuk
menentukan ukuran molekul. Prinsip kerja GC-MS adalah pemisahan senyawa
berdasarkan perbedaan berat molekul (massa) setelah terionisasi menjadi ion yang
lebih kecil (Harvey 2000).
GC-MS telah diaplikasikan dalam banyak bidang, seperti industri obat-
obatan, kedokteran, penelitian obat-obatan dan penelitian lingkungan. GC-MS
banyak digunakan karena akurasi dan presisinya sebagai alat analisis cukup tinggi.
Selain itu, GC-MS mampu menganalisis sampel dengan waktu yang lebih singkat
dibandingkan analisis unsur secara tepisah (yang dilakukan secara konvensional)
(Hajslova & Cajka 2007).
Identifikasi Kapang Berdasarkan Daerah Internal Transcribed Spacer (ITS)
DNA Ribosom
Identifikasi secara morfologi mungkin hanya dapat menentukan genus dari
isolat-isolat kapang. Untuk penentuan hingga sampai pada tingkat spesies,
diperlukan identifikasi molekuler. Salah satu cara identifikasi spesies kapang secara
molekuler adalah menggunakan sekuens DNA ribosomal (rDNA) pada daerah ITS
(Internal Transcribed Spacer region). ITS adalah suatu urutan RNA dari proses
transkripsi utama yang berada antar prekusor ribosomal subunit dan dihilangkan
pada proses splicing ketika RNA precursor tanda molekul yang struktural diproses
ke dalam suatu ribosom (Mulyatni et al. 2011). Daerah ITS rDNA yang baik untuk
diagnostik identifikasi spesies dan analisis filogenetik adalah daerah ITS1 dan ITS2
yang bersama-sama mengapit daerah 5.8S rDNA fungi. Keberhasilan isolasi dan
amplifikasi DNA dengan PCR bergantung pada konsentrasi isolat DNA templat
yang cukup, primer, dan temperatur annealing. Terdapat beberapa primer untuk ITS
rDNA, diantaranya yaitu 2 pasang yang mencakup keseluruhan daerah ITS1, ITS2
dan 5,8S rDNA, dan masing masing satu pasang primer yang mencakup hanya
daerah ITS1 atau ITS2 (Seifert et al. 2007). Keberhasilan identifikasi secara
molekuler menggunakan sekuens ITS rDNA, diperlukan hasil amplifikasi yang
setidaknya memungkinkan sekuensing ITS1 dan ITS2 dari rDNA. Pemilihan
pasangan primer yang tepat dengan kondisi temperatur annealing akan sangat
mempengaruhi keberhasilan PCR (Nugroho et al. 2013). Isolasi DNA dan
amplifikasi PCR pada daerah ITS rDNA merupakan tahap awal yang perlu
dilakukan dalam identifikasi molekuler. Sekuens DNA pada daerah ITS rDNA
berevolusi lebih cepat dibandingkan daerah gen lainnya sehingga akan bervariasi
pada setiap spesies (White et al. 1990). Hal ini akan mempermudah dalam
identifikasi spesies dengan membandingkan tingkat kemiripan (homologi) sekuens
DNA daerah ITS yang dimiliki suatu fungi dengan fungi lainnya.
Daerah ITS rDNA ini bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada
seluruh organisme. Daerah ITS rRNA memiliki beberapa daerah yang memiliki
11
urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya variatif.
Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi pohon
filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan
mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat
variatif dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur
dalam satu spesies (Pangastuti 2006).
3 METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Proses Pusat
Penelitian Biologi, Bidang Mikrobiologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
(LIPI) Cibinong-Bogor, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi Pusat Studi
Satwa dan Primata IPB, dan Badan Penelitian dan Pengembangan Kehutanan
Bogor. Penelitian dilaksanakan dari bulan April hingga Oktober 2015.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan meliputi 12 isolat kapang endofit daun sirsak dari
Rahman (2015), yaitu 3 isolat berasal dari Sukabumi (Sir-SM1, Sir-SM2, Sir-SM3),
3 isolat berasal dari Cianjur (Sir-CA1, Sir-CA2, Sir-CA3) dan 6 isolat berasal dari
Garut (Sir-G1, Sir-G2, Sir-G3, Sir-G4, Sir-G5, Sir-G6), glukosa, Yeast Malt Agar
(YMA), pepton, Yeast Malt Broth (YMB), etil asetat, pelarut DMSO (dimetil
sulfoksida), media pertumbuhan sel kanker RPMI-1640 (Roswell Park Memorial
Institute), FBS (Fetal Bovine Serum), PBS (Phosphat Bufferd Saline), tripan blue,
tripsin, 100 µl sel kanker MCF-7, 100 µl sel normal Chang, doksorubisin,
antibiotik, larutan kloroform-fenol, alkohol absolut, etanol 70%, bubuk agarosa,
etidium bromide (EtBr), loading dye, marker 1 kb plus DNA ladder dan 2 primer
yaitu ITS 4 dan ITS 5.
Alat yang digunakan adalah Erlenmeyer 100 mL, bunsen, laminar,
inkubator, pipet mikro, autoklaf, lemari es dan freezer, rotary evaporator, Shaker,
pemanas gelombang mikro, flask, plate 96 well, sentrifus, mikroskop, inkubator,
pipette tips (200 µl dan 1000 µl), hemasitometer, tabung sentrifus 15 ml, GC-MS
pyrolysis, spektrofotometer, ELISA reader, waterbath, vortex mixer, elektroforesis,
KIT bioner, tube eppendorf, mesin PCR (Esco), perangkat elektroforesis (Bio-Rad),
sarung tangan, kertas saring, alumunium foil dan stopwatch.
Prosedur Penelitian
Pembuatan Media
1. Yeast Malt Agar (YMA)
Media yang digunakan adalah media YMA (3 g Yeast extract, 3 g Malt
extract, 10 g glukosa, 5 g pepton dan 5.5 g agar dilarutkan dalam 1 liter akuades),
ditambahkan antibiotik. Semua bahan dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer
12
dengan masing-masing labu Erlenmeyer berisi 100 mL dan ditutup menggunakan
kapas yang telah dimodifikasi untuk selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama
15 menit dan tekanan 1 atm pada suhu 121oC.
2. Yeast Malt Broth (YMB)
Sebanyak 3 g Yeast extract, 3 g Malt extract, 10 g glukosa dan 5 g pepton
dilarutkan dalam 1 liter akuades kemudian ditambahkan antibiotik. Semua bahan
dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dengan masing-masing labu Erlenmeyer
berisi 100 mL dan ditutup menggunakan kapas yang telah dimodifikasi untuk
selanjutnya disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dan tekanan 1 atm pada
suhu 121oC.
Peremajaan Kapang Endofit Daun Sirsak (Pelczar & Chan 1996). Inokulasi isolat kapang endofit dilakukan secara aseptis di dalam laminar.
Laminar terlebih dahulu disterilkan dengan penyinaran sinar ultraviolet selama 1
jam, dan kemudian seluruh bagian dalam laminar dan bagian luar kaca disemprot
dengan etanol 70%. Isolat kapang endofit dari agar miring diinokulasi ke dalam
media PDA kemudian diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar.
Kultivasi Isolat (Agusta 2013)
Pada proses ini masing-masing isolat kapang endofit diambil menggunakan
jarum ose. Masing-masing isolat kemudian diinokulasikan ke dalam 200 mL media
YMB dan media agar miring untuk digunakan sebagai cadangan atau simpanan
isolat kapang endofit. Kultur dibuat dalam Erlenmeyer yang berukuran 500 mL dan
proses inokulasi dilakukan pada laminar air flow khusus kapang. Total isolat
kapang endofit ada 12 maka kultivasi juga dilakukan pada YMB dalam Erlenmeyer
sebanyak 12 buah, kemudian diinkubasi pada suhu 27oC, digoyang dengan
kecepatan 120 rpm selama 21 hari.
Ekstraksi Senyawa Aktif Kapang Endofit Daun Sirsak (Yeo et al. 2014)
Isolat kapang endofit daun sirsak setelah dikultivasi selama 21 hari
kemudian diekstraksi untuk mendapatkan senyawa utama kapang endofit. Isolat
kapang endofit yang tumbuh dalam media YMB 200 mL ditambahkan pelarut etil
asetat yang sudah didestilasi 300 mL, kemudian dikocok manual selama 15 menit.
Larutan atas fraksi dituangkan dalam labu didih, lapisan kedua fraksi tidak boleh
sampai ikut masuk dalam labu didih. Lapisan atas fraksi dievaporasi menggunakan
rotary vacum evaporator pada suhu 40°C kemudian dikeringkan dengan pengaliran
nitrogen. Berat ekstrak didapatkan dari berat bobot wadah dan ekstrak dikurangi
berat bobot kosong.
Aktivitas Sitotoksik terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 dengan Indikator
MTT (Methly Thyazol Tetrazolium) (Li et al. 2013; Hasan et al. 2014).
Persiapan sampel. Pada pengujian aktivitas dua belas ekstrak kapang
endofit daun sirsak terhadap sel kanker MCF-7 ekstrak dilarutkan dengan media
RPMI-1640 dengan konsentrasi 100 µg/mL. Empat ekstrak dengan aktivitas terbaik
menurut %inhibisinya kemudian diuji kembali aktivitasnya terhadap sel MCF-7
pada rangkaian konsentrasi uji dengan tingkatan konsentrasi mulai 25 µg/mL, 50
µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL dan 400 µg/mL. Selanjutnya diambil satu ekstrak
13
terbaik dan diuji kembali dengan menggunakan sel normal Chang pada konsentrasi
yang sama untuk mengetahui kemampuan ekstrak dalam menghambat
pertumbuhan sel kanker payudara MCF-7. DMSO digunakan sebagai kontrol
negatif dan doksorubisin sebagai kontrol positif.
Sel MCF-7 yang telah ditumbuhkan pada flask T25 dilakukan subkultur ke
96 wells tissue culture plate selama 24 jam pada kondisi 5% CO2 dan suhu 37oC
dengan jumlah 5000 sel/well. Ekstrak dimasukkan sebanyak 100 µL/well dan
diinkubasi selama 48 jam. Kemudian ditambahkan dengan MTT (3-(4,5-
Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) sebanyak 100 µL/well dan
diinkubasi kembali selama 4 jam pada pada kondisi 5% CO2 dan suhu 37oC.
Supernatan dibuang dan ditambahkan etanol-HCl. HCl berfungsi untuk memecah
sel, karena formazan merupakan produk intraseluler dari reaksi enzimatik MTT,
sedangkan etanol berfungsi untuk melarutkan formazan (kristal garam).
Selanjutnya dilakukan pembacaan Optical Density (OD) menggunakan microplate
reader pada panjang gelombang 595 nm. Data absorbansi dari hasil pembacaan
ELISA dikonversikan dalam persen inhibisi sel menurut persamaan rumus:
% inhibisi = (𝐴𝑏𝑠. 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 −𝐴𝑏𝑠. 𝑆𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑏𝑠. 𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙) × 100 %
Hubungan kematian sel dan konsentrasi selanjutnya dianalisis dengan
menggunakan uji regresi linier. Kemudian dihitung konsentrasi ekstrak yang
diperlukan untuk menghambat 50% pertumbuhan sel kanker (IC50).
Identifikasi Kandungan Senyawa Kimia dengan menggunakan GC-MS
pyrolysis (Collin et al. 2009; Mutunzi et al. 2013; Abubacker & Deeplakshmi
2013)
Identifikasi senyawa aktif yang berperan sebagai antikanker dilakukan
dengan menggunakan GC-MS pirolisis (py-GC-MS). Jumlah senyawa yang
terdapat dalam ekstrak ditunjukkan oleh jumlah puncak (peak) pada kromatogram,
sedangkan nama/jenis senyawa yang ada diinterpretasikan berdasarkan data spektra
dari setiap puncak tersebut dengan menggunakan metode pendekatan pustaka pada
database py-GC-MS dan data spektra massa.
Sampel yang diidentifikasi senyawa kimianya adalah sampel yang
mempunyai aktivitas antikanker. Sebanyak 2 µl sampel dimasukan kedalam
pirolisis, lalu diidentifikasi dengan py-GC-MS. py-GC-MS yang digunakan dalam
analisis ini adalah GCMS-QP2010S Shimadzu, jenis kolom Rtx-5MS, panjang
kolom 60 m, diameter kolom 0.25 mmID, temperature limit dari 80oC – 300oC
dengan kenaikan suhu 10oC/menit, laju alir 1 mL/menit, suhu oven 70oC – 290oC,
suhu interface 280oC, Split Ratio sebesar 50.0, ion source 200 oC dan gas pembawa
Helium. Data yang dihasilkan dicocokkan dengan senyawa yang terdapat pada
database py-GC-MS. Prosedur penggunaan py-GC-MS dapat dilihat pada lampiran
3.
Identifikasi Kapang Endofit Daun Sirsak Berbasis Amplifikasi Internal
Transcribed Spacer (ITS) (Muzuni et al. 2014) Identifikasi isolat kapang dilakukan secara molekuler berdasarkan analisis
genetika secara parsial pada lokus Internal Transcribed Spacer (ITS) ribosomal
DNA kapang. Isolasi DNA diawali dengan menumbuhkan isolat kapang dalam
14
media cair Potato Dextrose Broth (PDB) dan diinkubasi selama 72 jam. Biomassa
berupa miselia kapang dipanen untuk proses ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA
kapang dilakukan dengan menggunakan reagen nucleon PHYTOpure (Amersham
LIFE SCIENCE). Amplifikasi PCR pada ITS menggunakan Primer ITS 4 (reverse):
5`--TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC–3` dan Primer ITS 5 (forward): 5`--GGA
AGT AAA AGT CGT AAC AAG G–3` (White et al. 1990; O`Donnell 1996).
Purifikasi produk PCR dilakukan dengan PEG precipitation method
(Hiraishi et al. 1995) dan dilanjutkan dengan siklus sekuensing. Produk PCR dan
produk restriksi disekuensing di Macrogen, Inc., Korea Selatan dengan penggunaan
metode Sanger. Sekuensing produk PCR dilakukan dengan primer yang sama pada
saat amplifikasinya. Hasil siklus sekuensing dipurifikasi kembali dengan Ethanol
purification method. Analisis pembacaan urutan basa nitrogen menggunakan
automated DNA sequencer (ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer) (Applied
Biosystems). Sekuensing dalam bentuk format AB1 diolah dengan software
BioEdit 7.2.0, kemudian disimpan dalam format fasta dan diidentifikasi
menggunakan program BLAST pada situs NCBI (National Center for
Biotechnology Information) melalui http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast. Setelah
itu, dipilih beberapa organisme untuk disertakan dalam pembuatan pohon
filogenetik menggunakan software MEGA 5. Persen homologi juga ditentukan
dengan menggunakan MEGA 5.
DNA hasil dianalisis PCR menggunakan teknik elektroforesis menurut
Sambrook dan Russel (2001). Sebanyak 1 g agarosa dicampurkan dengan 100 mL
TAE kemudian dipanaskan dengan microwave selama 2 menit. Gel agarosa
didiamkan hingga hangat lalu dituangkan ke dalam cetakan elektroforesis hingga
mengeras. Gel agarosa diletakkan pada alat elektroforesis yang telah diberi buffer
TAE. Sebanyak 1 µL loading dye dicampurkan dengan 1 µL sampel DNA lalu
dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa. Setelah semua sampel dimasukkan dalam
sumur-sumur gel, ladder 1 kb sebagai marker sebanyak 2 µL dimasukkan ke dalam
sumur. Sampel dielektroforesis dengan tegangan 100 V selama 30 menit. Gel
direndam dalam larutan EtBr selama 30 menit kemudian dicuci dengan akuades
selama 5 menit. Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan dengan UV
transluminator untuk melihat pita DNA yang terbentuk.
Analisis Data (Matjik & Sumertajaya 2013)
Rancangan percobaan yang digunakan dalam menganalisis hasil penelitian
ini adalah Rancangan Acak Lengkap Faktorial (RAL Faktorial). Faktor yang
digunakan adalah jenis ekstrak (Sir-G5, Sir-SM2, Sir-G6 dan Sir-G2) dan konsentrasi
ekstrak yang berbeda. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan analisis
ragam (two-way ANOVA). Jika terdapat perbedaan yang nyata, maka analisis
dilanjutkan dengan uji Duncan dengan tingkat kepercayaan 95%. Uji statistik
menggunakan perangkat lunak komputer MS Excel 2013, SAS 1.9.3 dan Minitab
15.
15
4 HASIL PENELITIAN
Kapang Endofit Daun Sirsak Hasil Kultivasi
Hasil kultivasi kapang endofit pada media YMA disajikan pada Gambar 7,
yang menunjukkan adanya variasi bentuk koloni kapang endofit. Koloni tersebut
tumbuh pada media YMA yang merupakan media padat.
Gambar 7 Sebagian kapang endofit dari daun sirsak dalam media YMA pada
cawan petri. (a) Sirsak Cianjur 1, (b) Sirsak Cianjur 2, (c) Sirsak Garut
1, (d) Sirsak Cianjur 3, (e) Sirsak Garut 4, (f) Sirsak Garut 3, (g) Sirsak
Sukabumi 1, (h) Sirsak Sukabumi 3, (i) Sirsak Garut 2, (j) Sirsak
Sukabumi 2, (k) Sirsak Garut 5, (l) Sirsak Garut 6.
Media YMB (Gambar 8) cukup umum digunakan untuk kultivasi kapang,
jamur, dan khamir. Media ini mengandung sumber nutrisi kaya gizi yang
mendorong sporulasi dan pertumbuhan jamur secara subur.
Sir-CA1 Sir-CA2 Sir-G1 Sir-CA3
Sir-G4 Sir-G3 Sir-SM1 Sir-SM3
Sir-G2 Sir-SM2 Sir-G5 Sir-G6
Sir-CA1 Sir-CA2 Sir-CA3 Sir-G1 Sir-G2 Sir-G3
e
i l
h f g
k j
a
b d a c
e d c b f
16
Gambar 8 Kapang endofit daun sirsak dalam media YMB. (a) Sirsak Cianjur 1, (b)
Sirsak Cianjur 2, (c) Sirsak Cianjur 3, (d) Sirsak Garut 1, (e) Sirsak Garut
2, (f) Sirsak Garut 3, (g) Sirsak Garut 4, (h) Sirsak Garut 5, (i) Sirsak
Garut 6, (j) Sirsak Sukabumi 1, (k) Sirsak Sukabumi 2, (l) Sirsak
Sukabumi 3.
Dalam penelitian ini, media produksi dipertahankan pada suhu kamar, fase
pertumbuhan dari kapang endofit pertama dilakukan pada media YMA, kapang
mulai tumbuh pada hari kedua setelah inokulasi. Kemudian dipindahkan pada
media YMB selama 21 hari seluruh isolatnya diinkubasi pada suhu 27oC, digoyang
dengan kecepatan 120 rpm selama 21 hari.
Ekstrak Kapang Endofit Daun Sirsak
Ekstrak yang diperoleh berwarna kuning pekat kemudian diuapkan dengan
menggunakan vacum rotary evaporator untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak
kental yang diperoleh menyerupai serbuk kuning kemudian dibekukan dengan gas
nitrogen (Gambar 9) sebanyak 2 mL-4 mL.
Sir-SM2 Sir-G3 Sir-CA1 Sir-G6 Sir-SM1 Sir-G2
Sir-G5 Sir-CA2 Sir-G4 Sir-G1 Sir-SM3 Sir-CA3
Gambar 9 Hasil ekstrak kapang endofit daun sirsak. (1) Sirsak Sukabumi 2, (2)
Sirsak Garut 3, (3) Sirsak Cianjur 1, (4) Sirsak Garut 6, (5) Sirsak
Sukabumi 1, (6) Sirsak Garut 2, (7) Sirsak Garut 5, (8) Sirsak Cianjur
2, (9) Sirsak Garut 4, (10) Sirsak Garut 1, (11) Sirsak Sukabumi 3, (l2)
Sirsak Cianjur 3.
Sir-G4 Sir-G5 Sir-G6 Sir-SM1 Sir-SM2 Sir-SM3
1
h g k j i l
11 10
6 5
9
1 8 7
4 3 2
12
17
Ekstrak yang diperoleh (Tabel 1) menunjukkan bahwa terdapat variasi
bobot yang menandakan ada variasi rendemen, ekstrak kemudian disimpan dalam
lemari pendingin untuk kemudian digunakan pada pengujian berikutnya.
Tabel 1 Hasil ekstrak yang diperoleh dari kapang endofit daun sirsak No Sampel Bobot Ekstrak Etil Asetat yang diperoleh
(mg)
1 Sir-SM2 30
2 Sir-G3 10
3 Sir-CA1 20
4 Sir-G6 30
5 Sir-SM1 30
6 Sir-G2 40
7 Sir-G5 20
8 Sir-CA2 20
9 Sir-G4 30
10 Sir-G1 20
11 Sir-SM3 20
12 Sir-CA3 20
Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit
Hasil penelitian menunjukkan bahwa secara umum, 12 ekstrak kapang
endofit daun sirsak mampu menghambat pertumbuhan sel kanker MCF-7 (Gambar
10) dan diperoleh empat ekstrak dengan aktivitas terbaik, yaitu Sirsak Sukabumi 2
(Sir-SM2), Sirsak Garut 6 (Sir-G6), Sirsak Garut 2 (Sir-G2) dan Sirsak Garut 5 (Sir-
G5).
Gambar 10 Aktivitas antikanker ekstrak kapang endofit dari daun sirsak
terhadap sel MCF-7 pada konsentrasi 100 µg/mL.
-20
0
20
40
60
80
100
Pen
gh
am
bata
n (
%)
Sampel
18
Keempat ekstrak tersebut kemudian diuji kembali untuk memperoleh
aktivitas terbaik, hasil pengujian aktivitas antikanker keempat ekstrak tersebut
disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel MCF-7 Sampel IC50 (µg/mL)
Ekstrak Sir-G5 19.20 ± 7.71b
Ekstrak Sir-SM2 262.00 ± 116.99a
Ekstrak Sir-G6 397.44 ± 11.62a
Ekstrak Sir-G2 411.54 ±176.48a
arata-rata ± SD; Angka-angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji
5% (uji selang berganda Duncan).
Tabel 3 Nilai IC50 ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak pada sel Chang
Sampel Konsentrasi
µg/mL
Ulangan Rata2 %inhibisi
IC50
(µg/mL) ODI ODII ODIII
Sampel 7
(Sir-G5)
400 0.359 0.326 0.313 0.333 40.382
1258.925
200 0.344 0.378 0.351 0.358 35.902
100 0.37 0.374 0.372 0.372 33.333
50 0.366 0.418 0.398 0.394 29.391
25 0.396 0.367 0.418 0.394 29.450
Kontrol 0.558 0.559 0.557 0.558 0
‘
Gambar 11 Sel kanker payudara MCF-7 hasil perlakuan ekstrak kapang
endofit daun sirsak (Garut nomor 5). Deskripsi: a=kontrol tanpa
perlakuan, b= konsentrasi 400 µg/mL, c=konsentrasi 25 µg/mL,
dan d=doksorubisin 0.5 µg/mL (mikroskop canon inferted, camera
Dino Eye Ukuran 1280 x 1024 unit: inch) pada pembesaran 10x.
Gambar 12 Sel normal Chang hasil perlakuan ekstrak kapang endofit daun
sirsak (Garut nomor 5). Deskripsi: a=kontrol tanpa perlakuan,
b=konsentrasi 400 µg/mL, c=konsentrasi 25 µg/mL, dan
d=doksorubisin 0.5 µg/mL (mikroskop canon inferted, camera Dino
Eye Ukuran 1280 x 1024 unit: inch) pada pembesaran 10x.
a b d c
a d c b
19
Kandungan Senyawa Aktif Ekstrak Kapang Endofit
Hasil identifikasi senyawa dengan menggunakan Py-GC-MS, satu persatu
semua senyawa dibandingkan dengan pustaka di beberapa website untuk mencari
senyawa apa yang aktif sebagai antikanker. Hasil analisis dari GC dapat dilihat pada
Gambar 13.
Waktu (menit)
Gambar 13 Kromatogram ekstrak etil asetat
Keterangan rinci Gambar 13 disajikan pada Lampiran 18 sedangkan
klasifikasi senyawa metabolit sekunder disajikan pada Lampiran 19.
Identitas Kapang Endofit Daun Sirsak berbasis Amplikasi ITS
DNA hasil isolasi Annona muricata L. yang diperoleh memiliki jumlah
yang cukup baik, hal ini terlihat dari hasil PCR pada Gambar 14 pada elektroforesis
gel agarosa 1 %. Hasil elektroforesis horizontal dengan gel agarosa 1 %
memperlihatkan gambaran pita yang jelas pada daerah 550 pasang basa.
Gambar 14 Hasil PCR kapang endofit daun sirsak Sir-G5
Inte
nsi
tas
punca
k d
asar
20
Selanjutnya dilakukan analisis melalui konstruksi pohon filogenetik
(Gambar 15) untuk melihat kekerabatan kapang endofit dari daun sirsak. Dari hasil
perhitungan matriks jarak berdasarkan kimura-2 parameter, terlihat bahwa jarak
kapang endofit dari daun sirsak memiliki kekerabatan yang cukup dekat dengan
Phomopsis sp.
Gambar 15 Pohon filogenetik kapang endofit daun sirsak dengan model K2+G
(kimura 2-parameter+ gamma distributed)
5 PEMBAHASAN
Kultivasi Kapang Endofit Daun Sirsak
Kultivasi isolat kapang endofit dari daun sirsak dilakukan untuk
meremajakan isolat. Stok isolat kapang endofit dari daun sirsak ditumbuhkan pada
media Yeast Malt Agar (YMA) miring kemudian isolat dipindahkan ke media Yeast
Malt Broth (YMB). Media YMA merupakan media umum yang digunakan untuk
menumbuhkan kapang dan sebagai media isolasi (Kumala et al. 2006). Media ini
digunakan sebagai media kultivasi karena media tersebut merupakan media umum
kaya nutrisi, yang mudah dicernakan sehingga memudahkan kapang endofit yang
berhasil diisolasi untuk tumbuh. Peremajaan kapang endofit perlu dilakukan secara
teratur untuk menjamin kapang endofit tidak berada pada fase kematian dipercepat
dimana lebih banyak sel-sel yang mati daripada sel yang masih hidup (Gandjar et
al. 2006).
Pertumbuhan kapang pada media YMA dapat dilihat dari munculnya
benang-benang putih (miselium) yang mengelilingi keping inokulan. Miselium
gb|AF001021.2|_Diaporthe_phaseolorum_strain_473-4
gb|HQ533143.1| Diaporthe eres strain Phk2
gb|HQ533144.1| Diaporthe eres strain Phk1
gb|HQ832815.1|_Phomopsis_sp._LH157
gb|KC357558.1|_Diaporthe_sp._FH-2013b
gb|JQ954648.1|_Phomopsis_sp._FH-2012b
gb|FJ375142.1|_Ascomycota_sp._H-12
gb|GQ139521.1| Alternaria mali strain PF0905
gb|HQ832826.1|_Phomopsis_sp._LH243
Kapang Endofit Daun sirsak (Annona muricata L.)
dbj|LC056934.1|_Diaporthe_sp._CLS-33
dbj|LC056935.1|_Diaporthe_sp._CLS-44
gb|EU571102.1|_Phomopsis_sp._VAAT-PZ15
gb|KC145847.1|_Diaporthe_sp._3_PRJ-2013
gb|FJ176469.1| Phomopsis sp. ML15
gb|KC145869.1| Diaporthe sp. 3 PRJ-2013
gb|HQ185335.1| Scedosporium apiospermum strain CBS 117407
21
akan bertambah banyak dan mengikat keping-keping tersebut menjadi suatu bentuk
yang padat dan terjalin kuat (Gandjar et al. 2006). Media YMA digunakan sebagai
media pertumbuhan untuk identifikasi morfologi kapang sedangkan media YMB
digunakan sebagai media ekstraksi senyawa aktif pada kapang. Kondisi lingkungan
sangat dibutuhkan untuk menjadi faktor penentu terbentuknya metabolit sekunder.
Media YMA dan YMB mengandung komponen yang sama, namun di media YMA
ada penambahan agar setelah selesai disterilisasi. Pepton mengandung campuran
asam amino bebas, peptida dan protease merupakan sumber utama nitrogen bagi
mikroorganisme.
Dari dua belas kapang endofit yang di kultivasi masing-masing mempunyai
bentuk dan tekstur penampakan kultur kapang yang berbeda, hal ini menunjukkan
bahwa dua belas kapang endofit yang didapatkan masing-masing berbeda. Selain
itu pada hasil kultivasi hanya ada satu kultur yang terbentuk dalam setiap media,
hal ini juga menunjukkan bahwa isolat kapang yang dikultivasi sudah monokultur
(Rahman 2015).
Ekstraksi Senyawa Aktif Kapang Endofit Daun Sirsak
Proses ekstraksi senyawa aktif kapang endofit diawali dengan proses
evaporasi menggunakan etil asetat. Ekstraksi diperlukan untuk mendapatkan
senyawa yang diinginkan dalam endofit daun sirsak, pemilihan pelarut yang tepat
dapat meningkatkan efisiensi ekstraksi. Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam
pemilihan pelarut diantaranya adalah selektivitas, toksisitas, kepolaran, kemudahan
untuk diuapkan dan harga pelarut (Akbar & Hendra 2010). Etil asetat merupakan
pelarut dengan toksisitas rendah yang bersifat semi polar sehingga diharapkan dapat
menarik senyawa yang bersifat polar maupun nonpolar dari endofit daun sirsak
tersebut (Putri et al. 2013). Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah etil
asetat. Etil asetat merupakan pelarut yang baik digunakan untuk ekstraksi karena
dapat dengan mudah diuapkan, tidak higroskopis dan memiliki toksisitas rendah
(Rowe et al. 2009; Wardhani & Sulistyani 2012). Etil asetat bersifat semi polar
sehingga mampu menarik senyawa aktif yang terdapat dalam endofit daun sirsak
(Tensiska & Yudiastuti. 2007).
Adapun metode ekstraksi yang digunakan pada penelitian ini adalah metode
maserasi dengan cara merendamkan bahan alam yang dikeringkan (simplisia)
dalam suatu pelarut. Metode ini dapat menghasilkan ekstrak dalam jumlah banyak,
serta terhindar dari perubahan kimia senyawa-senyawa tertentu karena pemanasan
(Pratiwi & Sylvia 2008). Maserasi dilakukan berulang kali, masing-masing selama
15 menit pada suhu kamar, sampai filtrat dari kultur jamur endofit tidak berwarna
lagi, yang menandakan semua senyawa yang berbobot molekul rendah sudah
terekstraksi (Harborne 2006).
Aktivitas Sitotoksik Senyawa Aktif Kapang Endofit
Aktivitas sitotoksik ekstrak kapang endofit daun sirsak dilakukan dengan
Uji MTT (uji 3-(4-5 dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromide). Prinsip
kerja metoda ini adalah dengan mengukur aktivitas dehidrogenase mitokondria
pada sel-sel hidup yang memiliki kemampuan untuk mengkonversi MTT menjadi
formazan. Konsentrasi formazan yang berwarna biru dapat ditentukan secara
22
spektrofotometri visibel dan berbanding lurus dengan jumlah sel hidup karena
reduksi hanya terjadi ketika enzim reduktase yang terdapat di dalam jalur respirasi
sel pada mitokondria aktif (Chapdelaine 2001). Pengujian dilakukan untuk
menentukan aktivitas sitotoksik ekstrak senyawa aktif kapang endofit daun sirsak
dengan dosis efektifnya (IC50) pada sel kanker payudara (Rajbhandari et al. 2001).
Pengujian sitotoksisitas secara in-vitro dilakukan sebagai langkah awal dalam
penapisan senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antikanker. Metode uji
sitotoksik yang dipilih adalah metode MTT. Metoda MTT memberikan hasil
pengujian yang akurat karena dapat memberikan hubungan antara jumlah sel yang
aktif dengan absorban yang diperoleh dari pengukuran yang digunakan untuk
menentukan nilai IC50 (Inhibitory Concentration 50). IC50 merupakan konsentrasi
yang dibutuhkan suatu senyawa untuk menginhibisi sebesar 50% (Behera et al.
2003).
Metode MTT dilakukan pada microplate (96 sumur) dengan mengukur
viabilitas sel berdasarkan prinsip kolorimetri dengan menggunakan microplate
reader. Kontrol positif yang digunakan pada penelitian ini yaitu doksorubisin.
Doksorubisin merupakan obat yang digunakan untuk kemoterapi. Kemoterapi
merupakan terapi sistemik yang dapat digunakan untuk menghambat pertumbuhan
kanker atau untuk membunuh sel kanker dengan obat-obat antikanker yang disebut
sitostatika (Sukardja 2000). Untuk mengetahui kepadatan sel dilakukan perhitungan
menggunakan haemocytometer dibawah mikroskop inverted pembesaran 10x. Sel
yang dihitung adalah sel yang hidup, dimana sebelumnya telah dilakukan
pewarnaan dengan tripan blue untuk membedakan antara sel yang hidup dan sel
yang mati. Sel hidup berbentuk bulat dan bening dengan inti berbentuk bulat utuh
ditengahnya, sedangkan sel mati memiliki bentuk yang tidak beraturan dan
berwarna biru serta tidak memiliki inti. Pada preparasi sampel, ekstrak kapang
endofit daun sirsak dilarutkan dalam DMSO. Pengenceran larutan induk sampel
dalam DMSO dilakukan menggunakan medium (CCRC 2008). Pada pengujian
pertama dilakukan dengan menggunakan satu konsentrasi yaitu 100 µg/mL dari 12
isolat setelah mendapat hasil %inhibisinya.
Berdasarkan hasil yang ditunjukkan pada Gambar 10 terlihat bahwa 12
ekstrak kapang endofit daun sirsak yang diuji dengan menggunakan satu
konsentrasi yang sama yaitu 100 µg/mL memiliki potensi yang baik untuk
menghambat sel kanker MCF-7. Diantara dua belas ekstrak, di ambil empat ekstrak
yang terbaik berdasarkan %inhibisinya yaitu: Sir-SM2, Sir-G6, Sir-G2 dan Sir-G5.
Kemudian empat ekstrak yang terbaik tersebut di uji kembali menggunakan lima
variasi konsentrasi yaitu dimulai 400 µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL
dan 25 µg/mL. Hasil uji pada penghambatan aktivitas etil asetat kapang endofit
daun sirsak tersebut kemudian dilakukan perhitungan untuk mencari nilai IC50. Foto
mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat
kapang endofit dari daun sirsak pada perbesaran 10x dapat di lihat pada Lampiran
7, kontrol sel MCF-7 (Lampiran 8) sedangkan kontrol positif menggunakan
doksorubisin 0,5 dan 1 (Lampiran 9).
Hasil uji statistika (Lampiran 18) memperlihatkan bahwa semua sampel
memiliki aktivitas antikanker yang berbeda nyata (p<0.05) (Tabel 2). Aktivitas
antikanker semakin baik apabila nilai IC50 semakin rendah. Sampel dari dua belas
lokasi menunjukkan hasil yang baik untuk setiap pengujian. Ekstrak yang berasal
dari Garut nomor 5 menjadi ekstrak dengan rata-rata hasil pengujian lebih baik
23
dibandingkan dengan ekstrak dari lokasi lainnya sebagai antikanker. Hal ini diduga
karena pengaruh perbedaan habitat dan tempat tumbuh yang menyebabkan
kandungan metabolit sekunder berbeda. Menurut Bourgaud et al. (2001) metabolit
sekunder tiap tanaman akan berbeda menurut tempat hidupnya.
Penelitian ini menggunakan jumlah sel kanker hidup dalam suspensi kultur
adalah 7.75 x 106 sel/mL. Suspensi sel untuk setiap sumuran adalah 1.55 x 106/mL.
Pada jumlah sel tersebut diharapkan sel kanker dapat bertahan hidup melewati
siklus hidupnya dengan baik dalam waktu inkubasi 24-48 jam. Penentuan waktu
inkubasi 24-48 jam adalah untuk mencegah berkurangnya ketersediaan nutrisi yang
dikonsumsi oleh sel. Pada preparasi sampel, ekstrak kapang endofit daun sirsak
dilarutkan dalam DMSO. Pengenceran larutan induk sampel dalam DMSO
dilakukan menggunakan medium (CCRC 2008). Medium RPMI-1640 akan
berfungsi maksimal dalam mengkultur sel kanker selama dua hari (Zarisman 2006).
Sel yang digunakan adalah sel hidup yang dihitung dengan menggunakan
hemasitometer dan untuk membedakan antara sel yang hidup dan sel yang mati
digunakan pewarnaan dengan tripan blue. Sel hidup berbentuk bulat dan bening
dengan inti berbentuk bulat utuh ditengahnya, sedangkan sel mati memiliki bentuk
yang tidak beraturan dan berwarna biru serta tidak memiliki inti. Kontrol sel
memperlihatkan keadaan morfologi sel yang masih normal. Perlakuan ekstrak
kapang endofit daun sirsak dengan berbagai konsentrasi terhadap sel kanker
payudara MCF-7 menunjukkan adanya pengaruh terhadap sel kanker MCF-7
dibandingkan dengan kontrol negatif secara morfologi.
Perubahan morfologi (Gambar 11) seluler bisa disebabkan oleh apoptosis
yang terjadi pada sel. Mekanisme apoptosis ini sering digunakan untuk menjelaskan
mekanisme antikanker yang ditimbulkan oleh berbagai senyawa obat. Sel MCF-7
yang mengalami inhibisi karena diinduksi oleh ekstrak kapang endofit daun sirsak
ini mungkin mengalami mekanisme apoptosis yang mengakibatkan terjadinya
perubahan pada morfologi selnya. Perubahan morfologi seluler akibat mekanisme
apoptosis ini dapat terjadi dalam beberapa tahapan, yaitu penyusutan densitas sel,
kondensasi dan fragmentasi kromatin sel, serta fragmentasi inti sel (Wyllie 2010).
Ekstrak kapang endofit daun sirsak melindungi sel-sel normal dari sel kanker
dengan mengikat protein pada mitokondria sel kanker untuk memicu apoptosis
tanpa merusak sel-sel disekitarnya (Selvendiran et al. 2003).
Kontrol sel memperlihatkan keadaan morfologi sel yang masih normal dan
pada konsentrasi 25 µg/mL terlihat morfologi sel sudah mengalami perubahan. Sel
yang mengalami perubahan morfologi sel pada uji MTT tetap di hitung sebagai sel
hidup. Pada konsentrasi 400 µg/mL terlihat morfologi sel sudah rusak, sehingga
tidak dapat di hitung sebagai sel hidup karena sel sudah mati. Morfologi sel yang
berbeda antara sel yang diberi perlakuan dengan ekstrak uji dengan konsentrasi 400
μg/mL dan 25 μg/mL dibandingkan dengan sel kontrol. Sebagian besar ekstrak
daun sirsak memiliki kemampuan menghambat sel MCF-7 yang hampir sama
dengan konsentrasi doksorubisin 0.5 µg/mL. Kondisi sel kanker MCF-7 pada
konsentrasi ekstrak 25 µg/mL menunjukkan penghambatan nyata sel karena
destruksi sel kanker yang banyak. Penghambatan sel kanker dari ekstrak sesuai
dengan (Moghadamtousi et al. 2015) yang menggunakan ekstrak daun sirsak
sebagai antikanker sehingga tidak menyebabkan efek samping yang buruk.
Penelitian lainnya juga menguatkan pendapat jika ekstrak daun sirsak memiliki
nilai IC50 sangat aktif (Fidianingsih & Handayani 2014).
24
Ekstrak terbaik (Garut nomor 5) diuji kembali dengan sel normal Chang.
Antikanker diharapkan mempunyai toksisitas selektif artinya dapat menghancurkan
sel kanker tanpa merusak jaringan normal (Nafrialdi 1995). Terbukti bahwa kapang
endofit daun sirsak tidak memiliki toksisitas terhadap sel normal Chang dengan
nilai IC50 sebesar 1258.925 µg/mL. Terlihat pada morfologi (Gambar 12) dimana
sel normal Chang pertumbuhannya sangat baik, morfologi tidak berubah dan
menempati seluruh permukaan well. Foto mikroskopis sel normal Chang yang
diberi perlakuan dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak pada
perbesaran 10x dapat di lihat pada Lampiran 10, kontrol sel MCF-7 (Lampiran 11)
sedangkan kontrol positif menggunakan doksorubisin 0,5 dan 1 (Lampiran 12).
Penelitian Harun et al. (2010) menyebutkan ekstrak etil asetat memiliki
potensi sitotoksisitas terhadap sel MCF-7 melalui peningkatkan ekspresi protein
LC3-A yang mengindikasikan kematian sel. The American National Cancer
Institute menyatakan bahwa suatu ekstrak dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik
yang kuat sebagai agen antikanker jika nilai IC50 < 30 µg/mL (Itharat & Ooraikul
2007). Dari hasil uji MTT, diketahui bahwa ekstrak etil asetat kapang endofit daun
sirsak yang berasal dari Garut nomor 5 memiliki nilai IC50 sebesar 19.20 µg/mL.
Dengan demikian, ekstrak etil asetat kapang endofit daun sirsak dikatakan memiliki
aktivitas sitotoksik dibandingkan dengan ekstrak dari isolat yang lain.
Aktivitas sitotoksik pada sel MCF-7 kemungkinan disebabkan oleh
kemampuan induksi apoptosis pada sel tersebut. Apoptosis merupakan kematian sel
secara terprogram pada kondisi fisiologis maupun patologis (Xue et al. 2014).
Kemampuan induksi apoptosis diduga berasal metabolit sekunder yang dihasilkan
oleh kapang endofit. Pengamatan viabilitas sel dan pengujian MTT menunjukkan
bahwa ekstrak kapang endofit daun sirsak mampu menginduksi apoptosis yang
diindikasikan oleh penurunan viabilitas dan proliferasi sel. Mekanisme apoptosis
pada sel MCF-7 kemungkinan berlangsung melalui jalur intrinsik yang berikatan
dengan migrasi sitokrom C ke sitosol dan menghilangnya membran mitokondria
(Xue et al. 2014 & Gogvadze et al. 2006). Apoptosis jalur intrinsik diawali dengan
ekspresi gen penyandi protein Bax. Protein ini akan berinteraksi dengan
mitokondria untuk melepas sitokrom C ke sitosol yang juga berhubungan dengan
peningkatan migrasi ion Ca2+ ke sitoplasma (Gogvadze et al. 2006). Pada tahapan
ini, fosfolipid anionik (Cardiolipin) terdisosiasi dari sitokrom C akibat pengikatan
protein Bax (Gogvadze et al. 2006). Pada saat sitokrom C dilepas, aktivitas caspase-
3 berlangsung oleh caspase-9, yang diawali dengan fermentasi poli-ADP-ribose
polymerase (PARP) (Gogvadze et al. 2006).
Identifikasi Kandungan Senyawa Aktif dengan GC-MS pyrolysis
Gass chromatography Mass Spectroscopy Pyrolisis (Py-GC-MS)
merupakan perpaduan kromatografi gas dan spektroskopi massa. Py-GC-MS adalah
alat yang digunakan untuk mengindentifikasi sampel secara kualitatif, sehingga
hanya dapat diketahui senyawa-senyawa aktif yang terkandung di dalamnya dan
dapat ditentukan strukturnya, belum dapat ditentukan dengan pasti konsentrasi
masing-masing senyawa. Prinsip kerja Py-GC-MS adalah pemisahan senyawa
berdasarkan perbedaan berat molekul (massa) setelah terionisasi menjadi ion yang
lebih kecil (Harvey 2000).
25
Menurut Tri-Panji (2012) Py-GC-MS adalah suatu alat untuk penentuan
struktur molekul senyawa organik, khususnya untuk senyawa organik yang cukup
volatile. Perangkat Py-GC-MS dilengkapi dengan vakum hingga 10-6 torr yang
sangat membantu dalam proses penguapan cuplikan dibandingkan dengan GC. Py-
GC-MS tidak memerlukan senyawa standar pembanding sudah ada didalam
memory bank (basis data computer). Dengan demikian analisis dengan Py-GC-MS
menjadi lebih murah.
Analisis Py-GC-MS dilakukan pada ekstrak terbaik yang mampu
menghambat sel MCF-7 yaitu ekstrak etil asetat. Analisis Py-GC-MS dalam
penelitian ini spesifikasinya adalah GC-MS pirolisis QP2010 Shimadzu. Kolom
yang digunakan Rtx-5MS (Fused Silica) dengan menggunakan gas pembawa
Helium, pengaturan temperatur pada alat GC-MS pirolisis (colom, injection, ion
source dan interface) agar diperoleh pemisahan yang baik sehingga senyawa yang
terdapat dalam isolat nomor 5 asal Garut kapang endofit daun sirsak dapat
diindentifikasi dengan MS dan hasil spektra massanya dibandingkan dengan
database National Institute Standar and Tecnology (NIST) yaitu NIST 27 dan NIST
147 selain itu dibandingkan juga dengan database WILEY 7.
Py-GC-MS digunakan untuk menganalisis kandungan kimia metabolit
sekunder Sir-G5 kapang endofit daun sirsak (Tabel 4). Kapang endofit
menghasilkan metabolit yang berbeda dengan kapang endofit lainnya. Metabolit
kapang endofit umumnya tidak hanya mengandung satu jenis komponen kimia
tetapi bisa lebih yang dapat bersifat sebagai antioksidan, antikanker, antidiabetes,
antibakteri, antijamur dan antisepsis. Py-GC-MS mempunyai kelebihan yaitu
sampel bisa dalam bentuk padatan atau cairan, sampel padatan tidak perlu
diencerkan terlebih dahulu tapi langsung diinjeksikan saja pada kolom sampel.
Hasil analisis terdeteksi tiga puluh puncak pada kromatogram yang keluar pada
waktu retensi 7.178 sampai 21.542 menit dengan konsentrasi relatif (kemiripan)
yang berbeda-beda. Namun, diantara senyawa-senyawa tersebut terdapat senyawa
kimia yang teridentifikasi dengan konsentrasi tertinggi sehingga diduga senyawa
tersebut merupakan senyawa aktif yang terkandung pada ekstrak. Hasil analisis
dapat dilihat pada Lampiran 18 dan Lampiran 19.
Komponen kimia yang terkandung pada metabolit sangat menentukan sifat
antikanker metabolit kapang endofit. Beberapa komponen kimia tersebut telah
dilaporkan memiliki peran sebagai antidiabetes, antikanker dan antimikrobal.
Senyawa yang teridentifikasi (Lampiran 18) dapat di golongan menjadi beberapa
kelompok senyawa, diantaranya: 1) alkaloid yaitu 2-Piperidinone (CAS) 2-
Piperidone, 5H-1-Pyrindine, 1H-Azepin-1-amine, N-ethylidenehexahydro- (CAS)
Hexamethylenehydrazonen, Aziridine, 2-(1,1-dimethylethyl)-1-ethyl-3-methyl-,
trans- (CAS) Trans-1-Ethyl-2,Methyl-3, Piperidine, 1-(cyanoacetyl)- (CAS) 1-
Cyanoacetylpiperidine, 2-Imidazolidinone, 1,3-Diethenyl-, 1,4-diaza-2,5-
dioxobicyclo[4.3.0]nonane, 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl bicyclo[4.3.0]nonane,
Hexadecanenitrile (CAS) Palmitonitrile, 1,4-diaza-2,5-dioxo-3-isobutyl
bicyclo[4.3.0]nonane, 9-Octadecenamide, (Z)- (CAS) Oleoamide, Pyridinium, 1-
hexadecyl-, chloride, monohydrate (CAS) Cetylpyridinium chlori, 2) Fenolik yaitu
Phenol (CAS) Izal (Benzen), Phenol, 4-methyl- (CAS) p-Cresol (Benzen),
Benzeneacetonitrile (Cas) Benzyl Cyanide (Benzen), 3,5-Heptadien-2-Ol, 2,6-
Dimethyl (Benzen), Benzenepropanenitrile (CAS) 3-Phenylpropionitrile (Benzen),
26
1,4-Cyclohexanedione (CAS) Tetrahydroquinone, 3) golongan asam lemak seperti
Decanal (CAS) n-Decanal dan 9-Octadecenal (CAS) Octadecenyl aldehyde.
Fenol adalah kandungan kimia yang ditemukan pada metabolit sir-G5 yang
diduga berfungsi sebagai senyawa antidiabetes (Devi & Singh 2013). Alkaloid
merupakan senyawa yang mengandung nitrogen yang bersifat basa dan mempunyai
aktifitas farmakologis (Lumbanraja 2009). Bagi tumbuhan, alkaloid berfungsi
sebagai senyawa racun yang melindungi tumbuhan dari serangga atau herbivore
(hama dan penyakit), pengatur tumbuh atau sebagai basa mineral untuk
mempertahankan keseimbanagan ion (Rohyani et al. 2015). Alkaloid bereaksi
dengan asam membentuk kristal garam tanpa menghasilkan air. Mayoritas alkaloid
ada dalam bentuk padat seperti atropin, beberapa dalam bentuk cairan yang
mengandung karbon, hidrogen, dan nitrogen (Firn dalam Doughari 2012).
Senyawa antrakuinon mempunyai beberapa macam fungsi yaitu antiseptik,
antibakteri, antikanker (Gunawan & Mulyani 2004; Samuelsson 1999).
Antrakuinon terhidroksilasi tidak sering terdapat dalam tumbuhan secara bebas
tetapi sebagai glikosida. Banyak antrakuinon yang terdapat sebagai glikosida
dengan bagian gula terikat dengan salah satu gugus hidroksil fenolik (Robinson
1995). Semua antrakuinon berupa senyawa kristal bertitik leleh tinggi, larut dalam
pelarut organik basa. Antrakuinon bersifat lexsan, pada penggunaan yang berlebih
dapat menimbulkan iritasi pada dinding intestinal. Antrakuinon dapat
mempermudah buang air besar.
Golongan senyawa alkaloid yang diduga dapat menghambat sel kanker
yaitu piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile. Menurut Bezerra et al. (2006) &
Nishiumi et al. (2014) Senyawa aktif piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile
merupakan komponen aktif dalam penghambatan kanker yang terkandung pada
ekstrak daun sirsak yang diduga memiliki efek sitotoksik yang baik terhadap sel
kanker payudara MCF-7 dengan melihat nilai IC50 pada ekstrak. Penghambatan sel
kanker ini diduga dipengaruhi oleh kerusakan DNA dan efek sitotoksik.
Identifikasi Kapang Endofit Daun Sirsak Berbasis Amplifikasi ITS
Ekstraksi DNA Sir-G5 kapang endofit daun sirsak menggunakan reagen
nucleon PHYTOpure (Amersham LIFE SCIENCE) menghasilkan fragmen tunggal
genom. Hal ini menunjukkan bahwa metode ekstraksi DNA yang telah
dikembangkan untuk kapang atau tanaman dapat diaplikasikan, pita genom DNA
yang bersih tanpa latar belakang mengindikasikan tingkat kemurnian DNA yang
baik (DNA tidak terdegradasi dan terkontaminasi). RNAse digunakan untuk
menghilangkan komponen RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh (Rozi
2012). Penentuan ukuran DNA total dilakukan dengan membandingkan pita sampel
DNA total dan marker yang digunakan. Penentuan diperoleh dari hubungan yang
linier antara jarak migrasi DNA dan ukuran logaritmik dari bobot molekul DNA
(Perceka et al. 2014). Ukuran DNA berada pada ukuran diatas 10000 bp karena
DNA memiliki bobot lebih besar daripada bobot marker terbesar. Adanya pita pada
bagian awal proses migrasi menunjukkan bahwa DNA yang dihasilkan termasuk
DNA total (Meryalita 2012) Data urutan DNA Internal Transcribed Spacer
disejajarkan dengan program Clustal X (Hidayat et al. 2008). Konstruksi pohon
filogenetik dengan metode neighbour-joining menggunakan program Phydit pohon
27
pilogenik (Sembiring et al. 2008). Analisis situs restriksi menggunakan program
NEBcutter 2.0 (Muzuni et al. 2010).
PCR merupakan suatu reaksi in-vitro untuk menggandakan jumlah molekul
DNA dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan
molekul DNA cetakan dengan bantuan enzim DNA polymerase dan primer dalam
suatu thermocycler. Ada empat komponen utama yang dibutuhkan untuk
melakukan proses PCR yaitu DNA template (cetakan), primer, DNA polymerase
dan dNTPs. Proses PCR memiliki tiga tahapan utama, yaitu pemisahan
(denaturasi), penempelan primer (annealing), dan pemanjangan sekuen (extension)
(Zulfahmi 2013). Gambar 14 menunjukkan bahwa ukuran gen ITS kapang endofit
daun sirsak telah berhasil diamplifikasi menggunakan primer ITS 4 dan ITS 5
sebesar 550 pb. Ukuran basa tersebut juga didapatkan pada penelitian Yunianto et
al. (2012) yang mengisolasi DNA kapang endofit dari tanaman genus Annona.
Berdasarkan pohon filogenetik (Gambar 15) dapat diketahui bahwa isolat
kapang endofit dari daun sirsak memiliki kekerabatan dekat dengan genus
Phomopsis sp. Jarak kekerabatan antara kapang endofit dengan Phomopsis sp.
sangat dekat. Phomopsis sp. merupakan kapang endofit yang biasanya berada pada
tubuh tumbuhan (Slaninova et al. 2001). Secara identifikasi morfologi, ternyata
kapang endofit dari daun sirsak memiliki kesamaan dengan Phomopsis sp. Adanya
kesamaan tersebut memungkinkan kedua kapang tersebut memiliki perjalanan
evolusi yang sama sehingga secara molekuler daerah gen ITS kedua kapang
tersebut banyak memiliki kesamaan. Dengan demikian hasil identifikasi molekuler
berbasis daerah gen ITS pada kapang endofit daun sirsak mengindikasikan genus
Phomopsis sp.
Hasil sekuensing gen ITS produk PCR menunjukkan kekerabatan yang
tinggi dengan Phomopsis sp. LH243 dengan nilai bootstrap dari keduanya
mencapai 97%, dan memiliki persen homologi sebesar 99,998% dan nilai indeks
similaritas 99%. Hal ini sesuai karena gen ITS yang digunakan untuk sekuensing
berasal dari kapang endofit daun sirsak.
Daerah ITS dapat digunakan sebagai penanda keragaman genetika kapang
yang dapat membedakan individu-individu dalam spesies yang sama (Purnamasari
et al. 2012). Amplifikasi daerah ITS menggunakan primer umum yaitu ITS4/ITS5.
Menurut Schoch et al. (2012) primer ITS4/ITS5 merupakan primer yang sering
digunakan untuk mengidentifikasi fungi atau kapang yang telah teruji sebelumnya,
ITS4/ITS5 spesifik untuk fungi dan basidiomycetes open reading frame dari rRNA
yang merupakan sekuen yang siap untuk diekspresikan. ITS4/ITS5 juga bisa
mengamplifikasi daerah ITS jamur karena bersifat komplemen satu sama lain.
Selain itu ITS4/ITS5, mempunyai susunan basa untuk primer yang ideal serta
variasi yang beragam.
28
6 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak memiliki efek sitotoksik
terhadap sel kanker payudara dengan menghambat proliferasi sel kanker payudara
secara in-vitro. Perolehan 12 kapang endofit menunjukkan aktivitas teraktif
terhadap sel kanker MCF-7 yang berasal dari isolat Garut nomor 5 dengan nilai IC50
sebesar 19.20 µg/mL. Adapun pengujian pada sel normal (sel Chang) tidak
menunjukkan efek sitotoksik dengan nilai IC50 sebesar 1258.92 µg/mL. Hasil uji
analisis GC-MS pyrolysis pada ekstrak etil asetat kapang endofit teraktif (Garut
nomor 5) mengandung senyawa-senyawa yang dilaporkan bersifat antikanker,
diantaranya piperidinone, piperidine, hexadecanenitrile. Kapang endofit asal Garut
nomor 5 tersebut berdasarkan identifikasi molekuler berbasis daerah gen ITS
memiliki kemiripan dengan genus Phomopsis sp. dengan nilai homolog mencapai
99,998%.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh pemberian
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak terhadap sel kanker secara in-vivo
dan uji klinik agar dapat digunakan sebagai landasan penggunaan endofit daun
sirsak sebagai antikanker. Pada penelitian ini digunakan ekstrak etil asetat kapang
endofit dari daun sirsak yang mengandung berbagai senyawa aktif. Oleh karena itu
perlu dilakukan isolasi senyawa aktif yang berperan sebagai antikanker.
DAFTAR PUSTAKA
Abubacker MN, Deepalakshmi T. 2013. In-vitro antifungal potentials of bioactive
compound methyl ester of hexadecanoic acid isolated from Annona
muricata Linn. (Annonaceae) leaves. Biosci Biotech Res Asia. 10(2):879-
884.doi:10.13005/bbra/1211.
Adamson JW, Longo DL. 2005. Anemia and Polycethemia. Harisson’s Prin of Int
Med. 16th
ed. New York (USA): McGraw-Hill Companies.
Agudelo D, Philippe B, Gervais B, Heidar ATR. 2014. Intercalation of antitumor
drug doxorubicin and its analogue by DNA duplex: structural features and
biological implications. IJBioMac. 66:144-
150.doi:10.1016/j.ijbiomac.2014.02.028.
Agusta A. 2009. Biologi dan Kimia Kapang Endofit. Bandung (ID): ITB Pr.
Agusta A. 2013. Nerolidol, komponen kimia aromatik tanaman teh yang juga
diproduksi oleh jamur endofit Schizophyllum sp. D. J Ber Biol. 12 (2):77-
181.
Akbar, Hendra R. 2010. Isolasi dan identifikasi golongan flavonoid daun dandang
gendis (Clinacanthus nutans) berpotensi sebagai antioksidan [skripsi].
Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
29
Alam M, Alandis Nm, Shaik Mr, Khan S, Alomar Sy. 2014. Synthesis,
spectroscopic and biological activities of aromatic Schiff base. AJCHEM.
26(21):7377-7380.doi:10.14233/Ajchem.2014.17036.
Al-Amri FA, Saeedi MY, Al-Tahan FM, Ali AM, Alomary SA, Arafa M, Ibrahim
AK, Kassim KA. 2015. Breast cancer correlates in a cohort of breast
screening program participants inriyadh, KSA. JNCI. 27:77-
82.doi:10.1016/j.jnci.2015.04.002.
Ali SH. 2009. The world of β-glucan: a review of biological roles, applications and
potential areas of research [tesis]. TromsØ: Institute of Medical Biology,
Faculty of Medicine: University of Tromsø, Norway.
Amudha M, Rani S. 2014. GC-MS Analysis of bioactive components of Cordia
retusa (Boraginaceae). Hygeia J D Med. 6(1):12-
19.doi:10.15254/H.J.D.Med.6.2014.117.
Aourahoun A, Fazouane F, Benayad T, Bettache Z, Denni N. 2014. The synthetic
antioxidant butylated hydroxytoluene, a naturally occurring constituent of
the broom Cytisus triflorus L’Hérit. J Nat Prod.7:58-64.
Bacon CW, White JF. 2000. Microbial Endophytes. New York (US): Marcel
Dekker.
Beena, Kumar D, Kumbukgolla W, Jayaweera S, Bailey M, Alling T, Ollinger J,
Parishc T, Rawat DS. 2014. Antibacterial activity of adamantyl substituted
cyclohexane diamine derivatives against methicillin resistant
Staphylococcus aureus and Mycobacterium tuberculosis. RSC Adv.
4:11962-11966.doi:10.1039/c4ra00224e.
Behera BC, Adawadkar B, Makhija U. 2003. Inhibitory activity of xanthine oxidase
and superoxide-scavenging activity in some taxa of the lichen family
Graphidaceae. Phytomed. 10:536-543.doi:10.1078/094471103322331511.
Bezerra DP, Castro FO, Alves AP, Pessoa C, Moraes MO, Silveira ER, Lima MA,
Elmiro FJ, Costa-Lotufo LV. 2006. In vivo growth-inhibition of Sarcoma
180 by piplartine and piperine, two alkaloid amides from Piper. Braz J Med
Biol Res. 39(6):801-806.doi:10.1590/S0100-879X2006000600014.
Bharat N, Irshad Md, Rizki MA, Fatma T. 2013. Antimicrobial and Cytotoxic
Activities of Cyanobacteria. IJIRSET. (2)9:1-16.
Bintang M. 2010. Biokimia: Teknik Penelitian. Jakarta (ID): Erlangga.
Bintang M, Purwanto UMS, Kusumawati DE, Yang JJ. 2015. Study of endophytic
bacteria as novel source of antioxidant agent based on GC-MS analysis.
IJCEBS. (3)5:368-369.
Bourgaud F, Gravol A, Milesi S, Gontier E. 2001. Production of plant secondary
metabolites: a historical perspective. Plant sci. 161:839-
851.doi:10.1016/S0168-9452(01)00490-3.
Boyer R. 2010. Modern Experimental Biochemistry. San Francisco (US):
Benjamin-Cummings.
[CCRC] Cancer Chemoprevention Research Center. 2008. Protokol in-vitro CCRC.
Yogyakarta (ID): Fakultas Farmasi UGM.
Champy P, Melot A, Guérineau V, Gleye C, Fall D, Gunter U, Höglinger MD,
Ruberg M, Lannuzel A, Laprévote O et al. 2005. Quantification of
acetogenins in Annona muricata linked to atypical Parkinsonism in
Guadeloupe. MDS. 20(12):1629–1633.doi:10.1002/mds.20632.
30
Chapdelaine JM. 2001. MTT Reduction-A Tetrazolium-Based Colorimetric Assay
for Cell Survival and Proliferation, Aplication Note 5, MAXlineTm
Microplate Readers.
Clay K. 2004. Fungi and the food of the gods. Nature. 427:401-402.
Collin OL, Zimmermann CM, Jackson GP. 2009. Fast gas chromatography
negative chemical ionization tandem mass spectrometry of explosive
compounds using dynamic collision-induced dissociation. IJMS. 279(2-
3):93–99. doi:10.1016/j.ijms.2008.10.009.
Consolacion R, Geneveve S, Oscar T, Ming-Jaw D, Chien-Chang S. 2012.
Acetogenesis from Annona muricata. J PHCOG. 4(32):32-
37.doi:10.5530/pj.2012.32.7.
Creixell M, Peppas NA. 2012. Co-delivery of siRNA dan Therapeutic Agents Using
Nanocarriers to Overcome Cancer Resistance. J nanotoday. 7:367-
379.doi:10.1016/j.nantod.2012.06.013.
Debbie S, Graeme L, Pierre D, Elizabeth W, Kelvin C. 2012. Pharmacovigilance of
herbal medicine. JJEP. 140:513-518.doi:10.1016/j.jep.2012.01.051.
Devi NN, Singh MS. 2013. GC-MS analysis of metabolites from endophytic fungus
colletotrichum gloeosporioides isolated from phlogacanthus thyrsiflorus
nees. Int J Pharm Sci Rev Res. 23(2):392-395.
Doughari JH. 2012. Phytochemicals: Extraction Methods, Basic Structures and
Mode of Action as Potential Chemotherapeutic Agents. Nigeria:
Departement of Microbiology, School of Pure and Applied Science, Federal
University of Technology, Yola.
Dwitarhayani M. 2012. Nanopropolis sebagai penghambat proliferasi sel kanker
payudara MCF-7 [skripsi]. Bogor: Departemen Biokimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Emling RC. 2011. Evidence of the Efficacy of an Alcohol-Free Mouthwash
Containing Cetylpyridinium Chloride. J ClinDent. 22(6):179-204.
Eriksson D, Stigbrand T. 2010. Radiation-induced cell death mechanisms. Tumor
Biol. 31(4):363-372.doi:10.1007/s13277-010-0042-8.
Fidianingsih I, Handayani ES. 2014. Annona muricata aqueous extract suppresses
T47D breast cancer cell proliferation. Univ Med. 33(1):19-26.
Firn R. 2010. Nature’s Chemicals. Oxford: Oxford University Press.
Gandjar I, Syamsuridzal W, Oetari A. 2006. Mikologi Dasar dan Terapan. Jakarta
(ID): Yayasan Obor Indonesia.
Gangadhara S, Prasad C, Venkateswarlu P. 2015. Synthesis, antimicrobial and
antioxidant activity of piperidine analog containing trans cinnamamides.
IAJPR. 5(3):1280-1287.
Gogvadze V, Orrenius S, Zhivotovsky B. 2006. Multiple pathways of cytochrome
C release from mitochondria in apoptosis. BBA. 1757:639-
647.doi:10.1016/j.bbabio.2006.03.016.
Gunawan D, Mulyani S. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi). Jakarta (ID):
Penebar Swadaya.
Hahn DB, Payne WA. 2003. Focus on Health. New York: Mc-Graww Hill.
Hajslova J, Cajka T. 2007. Gas chromatography–mass spectrometry (GC–MS).
Prague: Institute of Chemical Technology, Inc
Hanahan, D, Weinberg RA. 2000. The hallmarks of cancer review. Cell. 100(1):57–
70.doi:10.1016/S0092-8674(00)81683-9.
31
_________________________. 2011. Hallmarks of cancer: the next generation.
Cell.doi:10.1016/j.cell.2011.02.013.
Harborne. 2006. Metode Fitokimia. Ed ke-2. Padmawinata K, Soediro I,
penerjemah; Bandung (ID): ITB Pr. Terjemahan dari: phytochemical
Methods.
Harun F, Jamalullail SM, Yin KB, Othman Z, Tilwari A, Balaram P. 2010.
Autophagic cell death is induced by acetone and ethyl acetate extracts from
eupatorium odoratum in-vitro: effects on MCF-7 and vero cell lines.
kelantan: institute for research in molecular medicine (INFORMM).
Scientific World J.doi:10.1100/2012/439479.
Harvey D. 2000. Modern analytical chemistry. The McGraw-Hill Companies, Inc.
Columbus, OH
Hasan AEZ, Mangunwidjaja D, Sunarti TC, Suparno O, Setiyono A. 2014.
Investigating the antioxidant and anticytotoxic activities of propolis
collected from five regions of Indonesia and their abilities to induce
apoptosis. EJFA. 26(5):390-398.doi:10.9755/ejfa.v26i5.16549.
Hermawan GP, Laksono H. 2013. Ekstraksi daun sirsak (Annona muricata L.)
menggunakan pelarut etanol. JTKI. 2(2):111-115.
Hidayat T, Kusumawaty D, Yati D D, Muchtar A, Mariana D. 2008. Analisis
filogenetik molekuler pada phyllanthus niruri l. (euphorbiaceae)
menggunakan urutan basa DNA Internal Transcribed Spacer (ITS).
Bandung: Jurusan Biologi Fakultas Matemateka dan Ilmu Pengetahuan
(ITB).
Hiraishi A, Kamagata Y, Nakamura K. 1995. Polymerase chain reaction
amplification and restriction fragment length polymorphism analysis of 16S
rRNA genes from methanogens. J Ferment Bioeng. 79(6):523-
529.doi:10.1016/0922-338X(95)94742-A.
Holliday D, Speirs V. 2011. Choosing the right cell line for breast cancer research.
Leeds Institute of Molecular Medicine, University of Leeds. UK
[IARC] International Agency for Research on Cancer. 2013. Latest World Cancer
Statistics. Lyon (FRA): International Agency for Research on Cancer.
Itharat A, Ooraikul B. 2007. Research on thai medicinal plants for cancer treatment.
Med Plant Res. 1(2):287-317.
Jasim H, Hussein AO, Hameed IH, Kareem MA. 2015. Characterization of alkaloid
constitution and evaluation of antimicrobial activity of Solanum nigrum
using gas chromatography mass spectrometry (GC-MS). J Pharma
Phytother. 7(4):57-73.doi:10.5897/JPP2015.0346.
Kankeaw U, Masong E. 2015. The antioxidant activity from hydroquinone
derivatives by the synthesis of cinnamomium verum j.presl bark’s extracted.
IJCEA. 6(2):1-4.doi:10.7763/IJCEA.2015.V6.458.
Katzung BG, Susan BM, Anthony JT. 2013. Farmakologi dasar dan klinik. Jakarta
(ID): Electrocardiogram (EGC).
Keerthiga M, Anand SP. 2015. Bioactive compound evaluation of ethanol extract
from geodorum densiflorum (lam.) schltr. by GC-MS analysis. IJPR.
5(6).doi:10.7439/ijpr.
[KEMENKES] Kementerian Kesehatan Republik Indonesia. 2013. Seminar sehari
dalam rangka memperingati hari kanker sedunia 2013.
http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release/2233-seminar-
32
sehari-dalam-rangka-memperingati-hari-kanker-sedunia-2013.htmL [14
Juni 2013].
Kentjono AW. 2001. Pengaruh vaksinasi BCG dalam meningkatkan respon Th1
dan respon terhadap radiasi pada karsinoma nasofaring [disertasi].
Surabaya: Universitas Airlangga.
Kumala S, Syarmalina, Handayani AR. 2006. Isolasi dan uji antimikroba substansi
bioaktif mikroba endofit ranting tanaman johar (Cassia siamea Lamk). JIKI.
4(1):8-14.
Kumar V, Bhatnagar AK, Srivastava JN. 2011. Antibacterial activity of crude
extracts of Spirulina platensis and its structural elucidation of bioactive
compound. J Med Plants Res. 5(32):7043-7048.
Kuppuswamy KM, Jonnalagadda B, Arockiasamy S. 2013. GC-MS Analysis of
Chloroform Extract of Croton Bonplandianum. Int J Pharm Bio Sci.
4(4):613–617.
Li N, Hua QH, Gen SZ, Wei C. 2013. Effect of 5- AZn-2 '-deoxycytidine on
proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549 in-vitro.
APJTM.982-985.
[LLC] Gaylord Chemical Company. Technical Bulletin Reaction Solvent Dimethyl
Sulfoxide (DMSO), pp 649-5464.
Lumbanraja LB. 2009. Skrining fitokimia dan uji efek antiinflamasi ekstak etanol
daun tempuyang (Sonchus arvenis L.) terhadap radang pada tikus. Medan:
Universitas Sumatera Utara.
Mahboubi M, Feizabadi MM. 2009. Antimicrobial activity of ducrosia anethifolia
essential oil and main component, decanal against methicillin resistant and
methicillin-susceptible staphylococcus aureus. JEOBP. 12(5):574-
579.doi:10.1080/0972060X.2009.10643760.
Mangan Y. 2009. Solusi Sehat Mencegah dan Mengatasi Kanker. Jakarta (ID):
Agromedia Pustaka.
Mathur M, Kamal R. 2011. Studies on trigonelline from Moringa oleifera and ITS
in-vitro regulation by feeding precursor in cell cultures. Rev Bras
Farmacogn/Braz J Pharmacogn.1-8.
Matjik A, Sumertajaya IM. 2013 Research Design. Bogor (ID): IPB Pr.
McLaughlin JL. 2008. Paw paw and cancer: Annonaceous acetogenins from
discovery to commercial products. J Nat Prod. (71):1311-1321.
Meryalita R. 2012. Analisis keragaman genetik kunyit (Curcuma longa Linn) dan
temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) budidaya tanah jawa berdasarkan
penanda molekuler RAPD [tesis]. Bogor (ID): Insitut Pertanian Bogor.
Moghadamtousi SZ, Rouhollahi E, Karimian H, Fadaeinasab M, Firoozinia M,
Abdulla MA, Kadir HA. 2015. The chemopotential effect of Annona
muricata leaves against azoxymethane-induced colonic aberrant crypt foci
in rats dan the apoptotic effect of acetogenin annomuricin e in ht-29 cells: a
bioassay-guided approach. J Pone.doi:10.1371/journal.pone.0122288.
Mulyatni AS, Priyatmojo A, Purwantara A. 2011. Sekuen Internal Transcribed
Spacer (ITS) DNA ribosomal Oncobasidium theobromae dan jamur
sekerabat pembanding. Menara Perkebunan. 79(1):1-5.
Murray RK, Daryl KG, Victor WR. 2009. Biokimia Harper Edisi 27. Jakarta: GC.
Mutunzi F, Dikio D, Makhwaje A, SipamLa, Modise SJ. 2013. GC-MS analysis of
hexane extract of bolusanthus speciosus stem bark. Asian Plant. 3(2):27-30.
33
Muzuni SD, Suharsono UW, Suharsono. 2010. Isolasi dan pengklonan fragmen
cdna gen penydani h+-atpase membran plasma dari Melastoma
malabathricum L. J Agro Indo. 38(1):67-74.
Muzuni, Adi DA, Syari S. 2014. Karakterisasi fragmen gen 18S rRNA pokea
(batissa violacea celebensis martens, 1897) di sungai pohara kecamatan
sampara kabupaten konawe. Biowallacea. 1(1):25-38.
Nafrialdi GS. 1995. Pharmacology and therapy. Ed ke-4. Medical Faculty of
Indonesian University: Jakarta.
Nishiumi S, Suzuki M, Kobayashi T, Matsubara A, Azuma T, Yoshida M. 2014.
Metabolomics for biomarker discovery in gastroenterological cancer
review. J Metabolites. 4:547-571.doi:10.3390/metabo4030547.
Novianti FA, Purnami SW. 2012. Analisis diagnosis pasien kanker payudara
menggunakan regresi logistik dan support vector machine (svm)
berdasarkan hasil mamografi. J Sains dan Seni ITS. 1(1):147-152.
Nugroho TT, Rambae E, Dewi A, Fitri RM, Sepriyani H, Restuhadi F, Haryani Y.
2013. Optimasi isolasi dan amplifikasi ITS DNA ribosomal fungi karbolitik
isolat zona inti cagar biosfer giam siak kecil-bukit batu. Prosiding Semirata
FMIPA Universitas Lampung: Universitas Lampung.
Nursafitri K, Sari I, Sari R, Winda AK, Harti A. 2013. Kegunaan daun sirsak
(Annona muricata L.) untuk membunuh sel kanker dan pengganti
kemoterapi. J Kesmadaska. Keperawatan STIKes Kusuma Husada
Surakarta: Surakarta.100-115.
O`Donnell K. 1996. Progress towards a phylogenetic classification of Fusarium.
Sydowia. 48 (1):57-70.
Pangastuti A. 2006. Definisi Spesies prokaryota berdasarkan urutan basa gen
penyandi 16s rRNA dan gen penyandi protein. Bio. 7(3):292-296.
Pelczar JR, Chan ES. 1996. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta (ID): UI Pr.
Perceka, ML, Nurhayati T, Nurilmala M. 2014. Karakterisasi ekstrak kasar
polifenoloksidase dari udang vaname (characterization of crude
polyphenoloxidase from white shrimp). Bogor (ID): Institut Pertanian
Bogor.
Polgar C, Major T. 2009. Current status and perspectives of brachytherapy forbreast
cancer. Int J Clin Oncol. 14(1):7–24.doi:10.1007/s10147-008-0867-y.
Pomper KW. 2009. Acetogenin Update. www.pawpaw.kysu.edu/PDF/AcetoUp
date3.pdf (Januari 2013).
Pratiwi, Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Jakarta (ID): Penerbit Erlangga.
Priya V, Jananie RK, Vijayalaksmi K. 2011. GC/MS determination of bioactive
components of Trigonella foenum grecum. J Chem Pharm Res. 3(5):35-40.
Purnamasari MI, Prihatna C, Gunawan AW, Suwanto A. 2012. Isolation and
molecular identification of Ganoderma spp. associated with basal stem rot
disease in oil palm. JFI. 8(1):9-15.doi:10.14692/jfi.8.1.9.
Purwatiningsih T, Alamudin A, Noorwati S. 2008. Deskripsi data rekam medis
penyakit kanker payudara rumah sakit kanker dharmais pada bulan oktober
tahun 1993 sampai dengan bulan maren tahun 2003 [tesis]. Bogor (ID):
Insitut Pertanian Bogor.
Putri WS, Warditiani NK, Larasanty LPF. 2013. Skrining fitokimia ekstrak etil
asetat kulit buah manggiS (Garcinia mangostana L.). Jurusan Farmasi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam: Universitas Udayana.
34
Rahman F. 2015. Uji aktivitas ekstrak jamur endofit dari daun sirsak (Annona
muricata L.) terhadap viabilitas khamir Saccharomyces cerevisiae dan
Candida tropicalis [skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam: Institut Pertanian Bogor.
Rajbhdanari M, Wegner U, Julich M, Schopke T, Mentel R. 2001. Screening of
nepalese medicinal plants for antiviral activity. JETHPHARM. 74:251-
255.doi:10.1016/S0378-8741(00)00374-3.
Raymond WR. 2007. Cancer Biology. Edisi ke-4. Michigan (US): Oxford
University Pr.
Retnani V. 2011. Pengaruh suplementasi ekstrak daun Annona muricata terhadap
kejadi dan isplasia epitel kelenjar payudara tikus sprague dawley yang
diinduksi 7,12-dimetilbenz(a)antrasena (DMBA [skripsi]. Semarang:
Universitas Diponegoro.
Rishika D, Sharma R. 2012. An update of Pharmacological Activity of Psidium
guajava in the management of various disorder. Int J Pharm Sci Res.
3(10):3577-3584.
Riswanto K, Julian AR, Megawati S. 2011. Pengembangan dessert lezat pembunuh
sel kanker: sherbet sirsak. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Robinson T. 1995. Kandungan organik tumbuhan tinggi. Terjemahan:
Koensoemardiyah. IKIP Semarang Press, Semarang.
Rodriguez FJM, Pinedo DM, Nodarse M. 2010. Assessment of scientific evidence
recommending Annona muricata L. (soursop tree) for cancer prevention or
treatment. Rev Cu Plant Med. 15(3):169-181.
Rohyani IS, Aryanti E, Suripto. 2015. Kandungan fitokimia beberapa jenis
tumbuhan lokal yang sering dimanfaatkan sebagai bahan baku obat di Pulau
Lombok. PSNMBI. 1(2):388-391.doi:10.13057/psnmbi/m010237.
Rowe RC, Sheskey PJ, Quinn ME. 2009. Handbook of Pharmaceutical Excipients.
Lexi-Comp: American Pharmaceutical Association.
Rozi. 2012. Manfaat Kacang Hijau bagi Kesehatan. [Online]. [diunduh 2012 okt
18]. Tersedia pada: http//rozi.wordpress.Com/2011/08/15/manfaat-
kacanghijau-bagi-kesehatan/.
Sambrook J, Russel DW. 2001. MoIecular Cloning – A Laboratory Manual 3th
edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Samuelsson G. 1999. Drugs of natural or igin. 4th ed. Apotekar Societeten:
Stockholm.
Schoch CL, Seifertb KA, Huhndorfc S, Robertd V, Spougea JL, Levesqueb CA,
Chenb W, Consortiuma FB. 2012. Nuclear ribosomal internal transcribed
spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Fungi. PNAS.
109(16):6241-6246.doi:10.1073/pnas.1117018109.
Schulz B, Boyle C. 2005. The endophytic continuum. Mycol Res. 109(6):661-686.
doi:10.1017/S095375620500273X.
Seifert KA, Samson RA, Dewaard JR, Houbraken J, Levesque CA, Moncalvo JM,
Louis-Seize G, Hebert PDN. 2007. Prospects for fungus identification using
CO1 DNA barcodes, with Penicillium as a test case. Proc Natl Acad Sci.
104(10):3901-3906.doi:10.1073/pnas.0611691104.
Selvendiren KJP, Sigh KB, Krishnan D, Sakthisekaran. 2003. Cytoprotective effect
of piperine against benzo[a]pyrene induced lung cancer with reference to
35
lipid peroxidation and antioxidant system in swiss albino mice. J Fitote.
(74):109-115.doi:10.1016/S0367-326X(02)00304-0.
Sembiring L, Susilawati L, Suhartanti D. 2008. Seleksi, karakterisasi dan
identifikasi bakteri Ppndegradasi 2-(thiocyanomethylthio) benzothiazole
(TCMTB). Biota. 13(3):126-131.
Setyowati FM, Wardah. 2007. Keanekaragaman tumbuhan obat masyarakat Talang
mamak di sekitar taman nasional bukit tigapuluh, Riau. Biodiversitas.
8:228-232.
Sivagurunathan A, Innocent XB. 2014. GC-MS Evaluation of bioactive compounds
of Marsilea quadrifolia Linn (Aquatic Fern). IJPRS. (3):I-1.
Skoog, Douglas AW, Donald M, Holler FJ. 1996. Analytical Chemistry. Saunders
College Publishing: Amerika.
Slaninova I, Taborska E, Bochorakova H, Slanina J. 2001. Interaction of
benzo[c]phenanthridine and protoberberine alkaloids with animal and yeast
cells. Cell Biol Toxicol. 17(1):51-63.doi:10.1023/A:1010907231602.
Souza M, Bevilaqua C, Morais S, Costa C, Silva A, Braz-Filho R. 2008.
Anthelmintic acetogenin from Annona squamosa L. seeds. An Acad Bras
Cienc. 80(2):271-277.doi:10.1590/S0001-37652008000200005.
Strobel GA. 2004. Natural product from endophytic microorganisme. J Nat Prod.
67(2):257-268.doi:10.1021/np030397v.
Strobel GD. 2003. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural
product. Microbiol Mol Biol Rev. 67(4):491-
502.doi:10.1128/MMBR.67.4.491-502.2003.
Sukardja IDG. 2000. Onkologi Klinik. Surabaya (ID): Airlangga Universitas Press.
Tan RX, Zou WX. 2001. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat
Prod Rep. 18(4): 448-459.
Tensiska M, Yudiastuti. SON 2007. Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap Aktivitas
Antioksidan Ekstrak Kasar Isoflavon dari Ampas Tahu. Laporan Penelitian.
Tim CancerHelps 2010. Stop Kanker (Kanker Bukan Lagi Vonis Mati) Panduan
Deteksi Dini dan Pengobatan Menyeluruh berbagai jenis kanker. Jakarta
(ID): Agro Media Pustaka.
Toyosi D, Olu M, Alamu EA. 2013. Preliminary antibacterial and phytochemical
screening of three medicinal plants used in the folkloric treatment of skin
infection. Int J Res Ayurveda Pharm. 4(4):547-550.doi:10.789/2277-
4343.04419.
Tri-Panji. 2012. Teknik Spektroskopi untuk Elusidasi Struktur Molekul. Yogyakarta
(ID): Graha Ilmu
Uzuner H. 2012. Traditional chinese medicine research in the post-genomic era:
good practice, priorities, challenges and opportunities. JETHPHARM.
140:458-468.doi:10.1016/j.jep.2012.02.028.
Veta M, Van DPJ, Willems SM, Wang H, Madabhushi A, Cruz-Roa A, Gonzalez
F, Larsen ABL, Vestergaard JS, Dahl AB et al. 2014. Assessment of
algorithms for mitosis detection in breast cancer histopathology images.
Med Ima Anal.doi:10.1016/j.media.2014.11.010.
Wardhani LK, Sulistyani N. 2012. Uji aktivitas antibakteri ekstrak etil asetat daun
binahong (Anredera scandens (L.) Moq.) terhadap Shigella Flexneri beserta
profil kromatografi lapis tipis. J Ilmiah Kefarmasian. 2(1):1-16.
36
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and Direct Sequencing of
Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. PCR Protocols: A Guide
to Methods and Applications.
[WHO] World Health Organization. 2013. World Cancer Day 2013. [terhubung
berkala]. http://www.who.int/cancer/en/index.htmL. [15 April 2013].
Wicaksono. 2011. Anticancer and antimicrobial potential of plantderived natural
products.In: Rasooli I, editor. Phy bio. Croatia: InTech.doi:10.5772/26077.
Winarto WP. 2007. Pengobatan Herbal untuk Kanker Payudara. Jakarta (ID):
Karyasari Herbal Media.
Woodward WA, Cox JD. 2008. Molecular basis of radiation therapy. In:
Mendelsohn J (Ed). The Molecular Basis of cancer. Philadelphia. Saunders
Elsevier. Pp 593-604.
Rahayu WP, Achmad A, Ekowati H. 2012. Aktivitas antiproliferatif jintan hitam
(Nigell Sativa) pada sel paru tikus yang diinduksi 7,12-Dimetilbenz-
[a]Antrasena (Dmba). Mekara Kesehatan. 16(2):51-56.
Wunderlich JR, Restifo NP. 2006. Cancer: principles and practice of oncology, fifth
edition vincent T. Philadelphia. 3:47-75.
Wyllie AH. 2010. Apoptosis, Cell Death, and Cell Proliferation. 3rd Ed. Roche
Applied Science.
Xue X, Yu JL, Sun DQ, Kong F, Qu XJ, Zou W, Wu J, Wang RM. 2014. Curcumin
induces apoptosis in SGC-7901 gastric adenocarcinoma cells via regulation
of mitochondrial signaling pathways. APJCP. 15(9):3987-
3992.doi:10.7314/APJCP.2014.15.9.3987.
Yeo YL, Chia YY, Lee CH, Sow HS, Yap WS. 2014. Effectiveness of maceration
periods with different extraction solvents on in-vitro antimicrobial activity
from fruit of Momordica charantia L. JAPS. 4(10):016-
023.doi:10.7324/JAPS.2014.40104.
Yunianto P, Rosmalawati S, Rachmawati I, Suwarso WP, Sumaryono W. 2012.
Isolation and identification of endophytic fungi from Srikaya plants
(Annona squamosa) having potential secondary metabolites as anti-breast
cancer activity. J Microbiol Indones. 6(1):23-29.
Zairisman SZ. 2006. Potensi ilmu nomodulator bubuk kakao bebas lemak sebagai
produk substdanard secara in-vitro pada sel limfosit manusia [tesis]. Bogor
(ID): Institut Pertanian Bogor.
Zeng L, Wu FE, Oberlies NH, Mc Laughlin JL, Sastrodihardjo S. 1996. Five new
monotetrahydrofuran ring acetogenins from the leaves of Annona muricata.
J Nat Prod. 59(11):1035-1042.
Zuhud E. 2011. Bukti Kedahsyatan Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta (ID):
Agromedia Pustaka.
Zulfahmi. 2013. Penanda DNA untuk analisis genetic tanaman. J Agrotek. (3)2:41-
52.
37
Lampiran 1 Bagan Alir Penelitian
Isolat terpilih
(Sir-G5)
Skrining Antikanker MCF-7
Sel Normal Chang
4 isolat terpilih (Sir-G5, Sir-SM2, Sir-G6, Sir-G2) berdasarkan %inhibisi
Peremajaan Isolat
Kultivasi Isolat
Skrining Antikanker MCF-7
Identifikasi Molekuler
(ITS)
Uji Aktivitas
(Uji IC50)
Sequencing
Identifikasi Molekul
(GC-MS) pirolisis
PCR
Genebank
Jenis Kapang
Data
Ekstrak
si
Data
Data
38
Lampiran 2 Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit
daun sirsak dengan menggunakan sel kanker (MCF-7)
Persentase penghambatan pada konsentrasi 100 µg/mL
Absorbansi kontrol – Absorbansi sampel
% Inhibisi = x 100%
Absorbansi kontrol
0.454 - 0.097
% Inhibisi = x 100%
0.454
% Inhibisi = 78.634 %
4003002001000
100
90
80
70
60
50
Konsentrasi Ekstrak µg/mL
Pe
rse
n In
hib
isi
S 5.21660
R-Sq 98.2%
R-Sq(adj) 93.0%
Ekstrak Sir-G5 Ulangan 1Y = 27.56 + 1.010 X
- 0.004735 X**2 + 0.000007 X**3
4003002001000
100
90
80
70
60
50
Konsentrasi Ekstrak µg/mL
Pe
rse
n In
hib
isi
S 1.29663
R-Sq 99.8%
R-Sq(adj) 99.5%
Ekstrak Sir-G5 Ulangan 2Y = 46.51 + 0.3399 X
- 0.000529 X**2
4003002001000
100
90
80
70
60
50
Konsentrasi Ekstrak µg/mL
Pe
rse
n I
nh
ibis
i
S 5.32127
R-Sq 96.6%
R-Sq(adj) 93.3%
Ekstrak Sir-G5 Ulangan 3Y = 42.14 + 0.3678 X
- 0.000576 X**2
39
Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun
sirsak (Annona muricata L.) terhadap persentase penghambatan sel MCF-7 dari
masing-masing ulangan dapat dilihat pada table dibawah ini:
Sampel Ulangan Konsentrasi IC50
perulangan
IC50
keseluru
han 400 200 100 50 25
Ekstrak
Sir-G5
1 95.154 104.392 105.463 82.145 58.797 25.000 19.20
µg/mL 2 97.783 104.126 96.053 71.754 66.432 10.450
3 96.930 104.421 94.342 64.070 66.263 22.150
Lampiran 3 Contoh perhitungan nilai IC50 ekstrak etil asetat dari kapang endofit
daun sirsak dengan menggunakan sel normal (Chang)
Persentase penghambatan pada konsentrasi 100 µg/mL
Absorbansi kontrol – Absorbansi sampel
% Inhibisi = x 100%
Absorbansi kontrol
0.558 - 0.372
% Inhibisi = x 100%
0.558
% Inhibisi = 33.333 %
y = 15.26x + 2.6436
R² = 0.9564
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Inh
ibis
i (%
)
Log Konsentrasi ekstrak µg/mL
40
Kurva hubungan konsentrasi ekstrak etil asetat dari kapang endofit daun
sirsak (Annona muricata L.) terhadap persentase penghambatan sel normal
(Chang).
IC50 = x saat y = 50
Rumus persamaan garis:
y = ax + b
y = 15.26x + 2.6436
50 = 15.26x + 2.6436
x = 50 - 2.6436
15.26
x = 3.10
IC50 = 103.10
IC50 = 1258.925412 µg/mL
Lampiran 4 Analisis metabolit kapang endofit daun sirsak GC-MS Pyrolisis
Prosedur penggunaan GC-MS sebagai berikut:
1. Buka tabung gas helium ke kiri setengah putaran
2. Sambungkan colokan dari stabilizer ke listrik dan on-kan stabilizer
3. On-kan instrument (GC, MS dan pyrolisis), kemudian PC dan printer
4. Pada display PC pilih icon GC-MS Real Time Analysis
5. Klik TOP - pilih icon vacuum control - klik auto startup sampai ada tulisan
complete – close.
6. Klik icon tuning – klik icon detail - atur suhu sesuai kondisi analysis - OK,
tunggu sampai GC, MS ready.
7. Untuk mengaktifkan pyrolizer pada display PC klik icon PY-2020iS control –
atur suhu furnace dan interface - v, upper temp 2800C dan pyrolisis 6000C.
enter
8. Kembali ke menu GC-MS klik icon peak monitor view - lihat kondisi low
vacuum harus <15 pascal dan high vacuum <1.5 x 10-3 pascal (minimal ± 2
jam). Min 0.20
9. Klik icon start auto tuning - file-save tuning file as – beri nama – save
10. Klik TOP - pilih icon data acquisition - atur parameter analysis, klik menu GC
atur suhu kolom dan programnya, suhu injector, pressure, split ratio-klik menu
MS atur suhu ion source dan intreface, solvent cut time.
11. Klik file - save method file as - beri nama method – save
12. Untuk memulai injeksi klik icon sample login - isis sample name, sample ID,
dan data file – OK
13. Klik icon standby tunggu sampai icon start aktif jadi hijau
14. Masukkan sampel pada pyrolizer – klik start – tekan tombol sampel pyrolizer
– enter
15. Tunggu sampai analisis selesai.
41
Lampiran 5 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 100
µg/mL pada perbesaran 10x. (a) Sirsak Sukabumi 2, (b) Sirsak Garut 3,
(c) Sirsak Cianjur 1, (d) Sirsak Garut 6, (e) Sirsak Sukabumi 1, (f) Sirsak
Garut 3, (g) Sirsak Garut 5, (h) Sirsak Cianjur 2, (i) Sirsak Garut 4, (j)
Sirsak Garut 1, (k) Sirsak Sukabumi 3, (l) Sirsak Cianjur 3.
Sampel 1 (Sir-SM2) Sampel 2 (Sir-G3) Sampel 3 (Sir-CA1)
Sampel 4 (Sir-G6) Sampel 5 (Sir-SM1) Sampel 6 (Sir-G3)
Sampel 7 (Sir-G5) Sampel 8 (Sir-CA2) Sampel 9 (Sir-G4)
Sampel 10 (Sir-G1) Sampel 11 (Sir-SM3) Sampel 12 (Sir-CA3)
a b c
d e f
g h i
j k l
42
Lampian 6 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan
perbesaran 10x
Kontrol sel MCF-7
Lampiran 7 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400
µg/mL, 200 µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25 µg/mL pada perbesaran
10x
Sampel 1-400 Sampel 1-200 Sampel 1-100
Sampel 1-50 Sampel 1-25 Sampel 4-400
1-400 1-200 1-100
1-50 1-25 4-400
43
Sampel 4-200 Sampel 4-100 Sampel 4-50
Sampel 4-25 Sampel 6-400 Sampel 6-200
Sampel 6-100 Sampel 6-50 Sampel 6-25
Sampel 7-400 Sampel 7-200 Sampel 7-100
4-200 4-50 4-100
4-25 6-400 6-200
7-400 7-200
6-100 6-50 6-25
6-100
44
Sampel 7-50 Sampel 7-25
Lampiran 8 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan
perbesaran 10x
Kontrol sel MCF-7
Lampiran 9 Foto mikroskopis sel kanker payudara yang tidak diberi perlakuan
dengan ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol
positif) dengan perbesaran 10x
Doksorubisin 0.5 Doksorubisin 1
7-50 7-25
45
Lampiran 10 Foto mikroskopis sel normal Chang yang diberi perlakuan dengan ekstrak etil
asetat kapang endofit dari daun sirsak dengan konsentrasi 400 µg/mL, 200
µg/mL, 100 µg/mL, 50 µg/mL dan 25µg/mL pada perbesaran 10x
Konsentrasi 25 µg/mL Konsentrasi 50 µg/mL Konsentrasi 100 µg/mL
Konsentrasi 200 µg/mL Konsentrasi 400 µg/mL
Lampiran 11 Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol) dengan
perbesaran 10x
Kontrol sel Normal Chang
46
Lampiran 12 Foto mikroskopis sel normal Chang yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak etil asetat kapang endofit dari daun sirsak (kontrol positif)
dengan perbesaran 10x
Doksorubisin 0.5 Doksorubisin 1
Lampiran 13 Pohon filogenetik
gb|AF001021.2|_Diaporthe_phaseolorum_strain_473-4
gb|HQ533143.1| Diaporthe eres strain Phk2
gb|HQ533144.1| Diaporthe eres strain Phk1
gb|HQ832815.1|_Phomopsis_sp._LH157
gb|KC357558.1|_Diaporthe_sp._FH-2013b
gb|JQ954648.1|_Phomopsis_sp._FH-2012b
gb|FJ375142.1|_Ascomycota_sp._H-12
gb|GQ139521.1| Alternaria mali strain PF0905
gb|HQ832826.1|_Phomopsis_sp._LH243
Kapang Endofit Daun sirsak (Annona muricata L.)
dbj|LC056934.1|_Diaporthe_sp._CLS-33
dbj|LC056935.1|_Diaporthe_sp._CLS-44
gb|EU571102.1|_Phomopsis_sp._VAAT-PZ15
gb|KC145847.1|_Diaporthe_sp._3_PRJ-2013
gb|FJ176469.1| Phomopsis sp. ML15
gb|KC145869.1| Diaporthe sp. 3 PRJ-2013
gb|HQ185335.1| Scedosporium apiospermum strain CBS 117407
47
Lampiran 14 Hasil BLAST
Lampiran 15 Sequences producing significant alignments
48
Lampiran 16 Urutan nukleotida hasil sekuen yang sudah dipilih
>Kapang_endofit_daun_sirsak_Garut_Nomor_5
AGTTGGGGGTTTAACGGCAGGGCACCGCCAGGGCCTTCCAAAGC
GAGGGTTTAACTACTGCGCTCGGGGTCCTGGCGAGCTCGCCACTATAT
TTCAGGGCCTGCCCTTTTACAGGCAGTGCCCCATCACCAAGCCAGGCT
TGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCTCCGGAATACCAG
AGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAA
TTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACC
AAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTATGTTTTATTCTCAGA
GTTTCAGTGTAAAAACAAGAGTTAGGTTGGCCGCCGGCGTGCTCTCTC
AACACCCGCAGGCGGGTGAGGGGCCCCGGAGGACCAGCTGGCGCCGA
GGCAACAGTAAGGTATAAGTTCACAAAGGGTTTCTGGGTGCGCCTGGG
GCGCGT
Lampiran 17 Pensejajaran sequence hasil BLAST
49
50
51
Lampiran 18 Keterangan kromatogram Gambar 13
Puncak Waktu Retensi
(Menit) Area
Senyawa Yang
Teridentifikasi
Konsentrasi
(%)
Kemiripan
(%)
1 7.178 1787943
073
Methane,
Sulfinylbis-(CAS)
Dimethyl
Sulfoxide
31.61 81
2 9.817 6477479
5
Phenol (CAS) Izal 1.15 97
3 11.067 1024228
83
Phenol, 4-Methyl-
(CAS) P-Cresol
1.81 91
4 11.576 4840899
8
2-Butanol (CAS)
Sec-Butanol
0.86 74
5 11.767 3868173
2
Benzeneacetonitril
e (CAS) Benzyl
Cyanide
0.68 86
6 12.166 5073537
4
3,5-Heptadien-2-
Ol, 2,6-Dimethyl
0.90 77
7 12.467 3466737
7
2-Piperidinone
(CAS) 2-
Piperidone
0.61 80
8 12.867 6516697
0
Benzenepropaneni
trile (CAS) 3-
Phenylpropionitril
e
1.15 93
9 13.087 1231961
76
2,2-Dimethyl-3-
Vinyl-
Bicyclo[2.2.1]Hep
tane
2.18 72
10 13.492 8835451
8
5h-1-Pyrindine 1.56 86
11 14.069 1853217
86
1,4-
Cyclohexanedione
(CAS)
Tetrahydroquinon
e
3.28 84
12 14.407 6515084
2
1h-Azepin-1-
Amine, N-
Ethylidenehexahy
dro-(CAS)
Hexamethylenehy
drazonen
1.15 81
13 14.747 6652350
7
Aziridine, 2-(1,1-
Dimethylethyl)-1-
Ethyl-3-Methyl-,
Trans- (CAS)
Trans-1-Ethyl-
2,Methyl-3
1.18 73
52
14 14.965 1036251
32
Dodecane (CAS)
N-Dodecane
1.83 93
15 15.036 1306550
39
Piperidine, 1-
(Cyanoacetyl)-
(CAS) 1-
Cyanoacetylpiperi
dine
2.31 66
16 15.666 1972289
84
1-Tetradecene
(CAS) N-
Tetradec-1-Ene
3.49 83
17 15.914 1085338
59
5-(3'-Methyliden-
2'-Oxa-Butyliden)-
3,3-Dimethyl-
Cyclohexanone
1.92 72
18 16.164 6643948
3
5-(3'-Methyliden-
2'-Oxa-Butyliden)-
3,3-Dimethyl-
Cyclohexanone
$$ Cyclohexanone
, 3,3-Dimethyl
1.17 59
19 16.406 1704431
30
1-Pentadecene
(CAS) Pentadec-1-
Ene
3.01 87
20 16.848 1438277
12
2-Imidazolidinone,
1,3-Diethenyl-
2.54 74
21 17.142 1505675
21
Decanal (CAS) N-
Decanal
2.66 72
22 17.472 9528082
3
1,4-Diaza-2,5-
Dioxobicyclo[4.3.
0]Nonane
1.68 87
23 17.792 6131649
4
1,4-Diaza-2,5-
Dioxo-3-Isobutyl
Bicyclo[4.3.0]Non
ane
1.08 83
24 18.038 2476372
59
Hexadecanenitrile
(CAS)
Palmitonitrile
4.38 96
25 18.524 2108918
75
1,4-Diaza-2,5-
Dioxo-3-Isobutyl
Bicyclo[4.3.0]Non
ane
3.73 92
26 19.216 4322127
48
9-Octadecenal
(CAS)
Octadecenyl
Aldehyde
7.64 87
27 19.850 2845193
12
9-
Octadecenamide,
5.03 84
53
(Z)- (CAS)
Oleoamide
28 20.418 1323543
26
Octadecane, 1-
(Ethenyloxy)-
(CAS) Octadecyl
Vinyl Ether
2.34 82
29 20.934 3352880
69
9-
Octadecenamide,
(Z)- (CAS)
Oleoamide
5.93 93
30 21.542 6338372
3
Pyridinium, 1-
Hexadecyl-,
Chloride,
Monohydrate
(CAS)
Cetylpyridinium
Chlori
1.12 76
5655553
520
100.00
Lampiran 19 Klasifikasi senyawa metabolit sekunder
Senyawa yang
teridentifikasi Struktur
Klasifikasi
senyawa
metabolit
Aktivitas Sumber
Methane,
sulfinylbis-
(CAS) Dimethyl
sulfoxide
S
O
Methane, sulfinylbis-
Alkana (berasal dari
Pelarut
DMSO)
Gaylord
Chemical
Company,
L.L.C.
Phenol (CAS)
Izal HO
Phenol (CAS) Izal
Fenol Antibakteri Toyosi et
al. 2013
Phenol, 4-
methyl- (CAS)
p-Cresol
HO
Phenol, 4-methyl-
Fenol Antimikroba
dan
Antioksidan
Aourahoun
et al. 2014
Mathur &
Kamal 2011
2-Butanol
(CAS) sec-
Butanol
OH
2-Butanol (CAS) sec-Butanol
Alkohol - belum ada
aktivitas
dilaporkan
Benzeneacetonit
rile (CAS)
Benzyl cyanide
N
Benzeneacetonitrile (CAS) Benzyl cyanide
Benzen
(Fenolik)
- belum ada
aktivitas
dilaporkan
3,5-Heptadien-
2-Ol, 2,6-
Dimethyl
OH
3,5-HEPTADIEN-2-OL, 2,6-DIMETHYL
Benzen
(Fenolik)
- belum ada
aktivitas
dilaporkan
54
2-Piperidinone
(CAS) 2-
Piperidone
HN
O
2-Piperidinone (CAS) 2-Piperidone
Alkaloid
Antimikroba,
Antioksidan,
Antiinflamasi,
Antikanker.
Sivagurunat
han &
Innocent
2014
Keerthiga &
Anand 2015
Bezerra et
al. 2006
Benzenepropan
enitrile (CAS)
3-
Phenylpropionit
rile
N
Benzenepropanenitrile (CAS) 3-Phenylpropionitrile
Benzen
(Fenolik)
- belum ada
aktivitas
dilaporkan
2,2-Dimethyl-3-
Vinyl-
Bicyclo[2.2.1]H
eptane 2,2-DIMETHYL-3-VINYL-BICYCLO[2.2.1]HEPTANE
Alkana belum ada
aktivitas
dilaporkan
5H-1-
PYRINDINE NC
PYRIDINE,3-(1,2-PROPADIENYL)-
Alkaloid - belum ada
aktivitas
dilaporkan
1,4-
Cyclohexanedio
ne (CAS)
Tetrahydroquin
one
O O
1,4-Cyclohexanedione (CAS) Tetrahydroquinone
Hidrokuino
n (Fenolik)
Antioksidan Kankeaw &
Masong
2015
1H-Azepin-1-
amine, N-
ethylidenehexah
ydro- (CAS)
Hexamethylene
hydrazonen
N
N
1H-Azepin-1-amine, N-ethylidenehexahydro- (CAS) Hexamethylenehydrazonen
Alkaloid - belum ada
aktivitas
dilaporkan
Aziridine, 2-
(1,1-
dimethylethyl)-
1-ethyl-3-
methyl-, trans-
(CAS) Trans-1-
Ethyl-2,Methyl-
3
N
Aziridine, 2-(1,1-dimethylethyl)-1-ethyl-3-methyl-, trans-
Alkaloid Antimikroba Priya et al.
2011
Dodecane
(CAS) n-
Dodecane
Dodecane (CAS) n-Dodecane
Alkana - belum ada
aktivitas
dilaporkan
Piperidine, 1-
(cyanoacetyl)-
(CAS) 1-
Cyanoacetylpip
eridine
N
C
O
N
1-Cyanoacetylpiperidine
Caution: Valence appears to be exceeded
Alkaloid Antimikroba,
Antioksidan,
Antijamur,
Antikanker.
Gangadhara
et al. 2015
Bezerra et
al. 2006
55
1-Tetradecene
(CAS) n-
Tetradec-1-ene
1-Tetradecene (CAS) n-Tetradec-1-ene
Asam
lemak rantai
panjang
(Hidrokarbo
n)
Anti-
Tuberculosis
(Anti TBC)
Kuppuswa
my et al.
2013
5-(3'-
Methyliden-2'-
oxa-butyliden)-
3,3-dimethyl-
cyclohexanone
O
O
5-(3'-Methyliden-2'-oxa-butyliden)-3,3-dimethyl-cyclohexanone
Keton Antibakteri
dan
Antijamur
Alam et al.
2014
5-(3'-
Methyliden-2'-
oxa-butyliden)-
3,3-dimethyl-
cyclohexanone
$$ Cyclohexano
ne, 3,3-dimethyl
O
O
5-(3'-Methyliden-2'-oxa-butyliden)-3,3-dimethyl-cyclohexanone
Keton Antibakteri Beena et al.
2014
1-Pentadecene
(CAS)
Pentadec-1-ene
1-Pentadecene (CAS) Pentadec-1-ene
Asam
lemak
Antibakteri Kumar et al.
2011
2-
IMIDAZOLIDI
NONE, 1,3-
DIETHENYL-
NN
O
2-IMIDAZOLIDINONE, 1,3-DIETHENYL-
Alkaloid - belum ada
aktivitas
dilaporkan
Decanal (CAS)
n-Decanal O
Decanal (CAS) n-Decanal Aldehid Antimikroba Mahboubi
& Feizabadi
2009
1,4-diaza-2,5-
dioxobicyclo[4.
3.0]nonane Cyclopentane, 1,1,3,4-tetramethyl-, trans-
Alkaloid Antioksidan Bintang et
al. 2015
1,4-diaza-2,5-
dioxo-3-isobutyl
bicyclo[4.3.0]n
onane
Alkaloid Antioksidan Bintang et
al. 2015
Hexadecanenitr
ile (CAS)
Palmitonitrile
N
Hexadecanenitrile (CAS) Palmitonitrile
Alkaloid Antikanker
(kanker
lambung)
Nishiumi et
al. 2014
1,4-diaza-2,5-
dioxo-3-isobutyl
bicyclo[4.3.0]n
onane
Alkaloid Antioksidan Bintang et
al. 2015
9-Octadecenal
(CAS)
Octadecenyl
aldehyde
O
9-Octadecenal (CAS) Octadecenyl aldehyde
Aldehid Antibakteri Bharat et al.
2013
56
9-
Octadecenamid
e, (Z)- (CAS)
OLEOAMIDE
O
NH2
9-Octadecenamide, (Z)- (CAS) OLEOAMIDE
Alkaloid Antioksidan
dan
Antibakteri
Jasim et al.
2015
Octadecane, 1-
(ethenyloxy)-
(CAS)
Octadecyl vinyl
ether
O
Octadecane, 1-(ethenyloxy)- (CAS) Octadecyl vinyl ether
Eter Antisepsis Amudha &
Rani 2014
9-
Octadecenamid
e, (Z)- (CAS)
OLEOAMIDE
O
NH2
9-Octadecenamide, (Z)- (CAS) OLEOAMIDE
Alkaloid Antioksidan
dan
Antibakteri
Jasim et al.
2015
Pyridinium, 1-
hexadecyl-,
chloride,
monohydrate
(CAS)
Cetylpyridinium
chlori
N+
Cl-
H
O
H
Pyridinium, 1-hexadecyl-, chloride, monohydrate (CAS) Cetylpyridinium chlori
Alkaloid Antibakteri Emling
2011
57
Lampiran 20 Data spektra massa senyawa-senyawa yang dilaporkan bersifat
antikanker
58
59
60
61
62
63
Lampiran 21 Analisis statistik
Class Level Information
Class Levels Values
Sampel 4 G2 G5 G6 SM2
Source DF Sum of
Squares
Mean
Square
F Value Pr > F
Model 3 297634.7044 99211.5681 8.81 0.0065
Error 8 90054.7552 11256.8444
Corrected
Total
11 387689.4596
R-Square Coeff Var Root MSE IC50 Mean 0.767714 38.92908 106.0983 272.5425
Source DF Type I SS Mean
Square
F Value Pr > F
Sampel 3 297634.7044 99211.5681 8.81 0.0065
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
Sampel 3 297634.7044 99211.5681 8.81 0.0065
Level of
Sampel
N IC50
Mean Std Dev
G2 3 411.536667 176.483045
G5 3 19.200000 7.710545
G6 3 397.436667 11.624114
SM2 3 261.996667 116.989487
64
Duncan's Multiple Range Test for IC50
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 8
Error Mean Square 11256.84
Number of Means 2 3 4
Critical Range 199.8 208.2 212.9
Means with the same letter are not significantly different.
Duncan Grouping Mean N Sampel A 411.54 3 G2
A 397.44 3 G6
A 262.00 3 SM2
B 19.20 3 G5
65
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bernai, Jambi pada tanggal 14 Oktober 1992 sebagai
anak ketiga dari lima bersaudara dari Bapak M.Yunus (Alm) dan Ibu Hasnah.
Penulis menyelesaikan sekolah dasar di SDN 40 Sarolangun, Jambi pada tahun
2004 dan melanjutkan sekolah menengah pertama di MTSN Sarolangun, Jambi
sejak tahun 2004-2007. Sekolah menengah atas penulis selesaikan pada tahun 2010
di SMAN 7 Sarolangun, Jambi. Pendidikan Strata 1 ditempuh di Program Studi
Pendidikan Kimia, Fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Jambi,
lulus pada tahun 2014. Penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan seperti
Himpunan Mahasiswa Pendidikan Kimia (HIMAPEMIA) Universitas Jambi
sebagai Ketua Umum dan Mapala Siginjai sebagai Bendahara Umum, Himpunan
Mahasisawa Jurusan (HMJ) koordinator Danus, Ikatan mahasiswa kimia Indonesia
(IKAHIMKI) sebagai bendahara Umum dan Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM)
Universitas Jambi tahun 2011/2013. Selain itu juga penulis aktif sebagai asisten
dosen Kimia Organik, Kimia Fisik, Dasar-Dasar Kimia Analitik dan Dasar-Dasar
Pemisahan Analitik di Universitas Jambi dan pada tiga bulan terakhir sebelum
kuliah penulis sebagai guru Kimia SMA dan IPA terpadu Al-Azhar Jambi.
Pada tahun yang sama penulis diterima di Sekolah Pascasarjana Institut
Pertanian Bogor pada Program Studi Biokimia dengan sponsor beasiswa Lembaga
Pengelola Dana Pendidikan Kementrian Keuangan RI (LPDP Kemenkeu RI).
Penulis juga aktif berorganisasi menjadi salah satu anggota divisi PSDM Forum
Wacana tahun 2014-2015. Penulis juga pernah aktif di BSC, serta terlibat dalam
komunitas kongkrit. Aktivitas Antikanker Ekstrak Etil Asetat Kapang Endofit Daun
Sirsak (Annona muricata L.) merupakan judul tesis penulis dengan judul jurnal
yang sama dipublikasikan di International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences (Int J Pharm Pharm Sci).
