AH1N1-”Gripa Porcina”Morfologia Virală

Viruşii din familia Orthomyxoviridae sunt reprezentaţi de particule în principal ovoide, dar având un pleiomorfism foarte accentuat, ele pot apărea atât sub formă sferică cât şi globuloasă sau chiar filamentoasă. Aceste particule sunt de dimensiuni medii, cuprinse între 80-120 nm şi sunt protejate de o capsidă şi o pericapsidă.

Pericapsida este alcătuită dintr-un bistrat lipidic dispus central, derivat din membrana plasmatică a celulei gazdă, şi un strat proteic la interior (proteina M1). Aceasta are rolul de a împacheta noile segmente de ARN produse în celulele infectate şi de a le transporta la periferia celulei, în vecinătatea membranei, pentru a forma un nou virus ce va fi eliberat în organism.

Anvelopa virală prezintă 500 de spiculi de 2 tipuri: HA (hemaglutinina) şi NA (neuraminidaza), distribuiţi uniform spre exterior. Aceştia sunt prezenţi la suprafaţă într-o proporţie de 4-5:1. Ca şi lipidele, o parte din proteinele prezente în pericapsidă sunt provenite din celula gazdă, dar mai ales cele din învelişul extern sunt virus-specifice. Homeopeplosul este constituit din componentele virus-specifice, iar heteropeplosul este reprezentat de către elementele derivate din structura chimică a celulei gazdă. Spiculii de la suprafaţa pericapsidei fac parte din homeopeplos, fiind structuri virus-specifice. Aceştia sunt implantaţi cu terminaţia hidrofobă în bistratul lipidic prin legături necovalente, astfel încât să fie posibilă reorientarea acestora la suprafaţa pericapsidei în funcţie de interacţiunile cu celula ţintă.

Hemaglutinina este o structură glicoproteică de formă liniară ce agregă pentru a forma un trimer cu lungimea de 135A de la punctul său de inserţie în pericapsidă până la vârf. Privit la microscopul electronic acesta apare sub forma unui baston prismatic cu baza triunghiulară. Hemaglutinina are proprietatea de a fixa molecule de acid sialic (N-acetil-neuraminic) la extremitatea sa distală. Hemaglutinina (HA) este descompusă prin clivaj proteolitic în două porţiuni: HA1 (47kd) şi HA2 (29kd) care sunt legate între ele prin punţi bisulfidice; cum fiecare dintre cei trei monomeri sunt alcătuiţi dintr-un lanţ HA1 şi un lanţ HA2, în urma clivajului vor rezulta un număr de 6 molecule, 3 de HA1 şi încă 3 de HA2.

În prima etapă a atacului viral, hemaglutinina leagă reziduuri de acid sialic din receptorii proteici glicozilaţi de pe suprafaţa celulei ţintă, legându-se de aceasta şi declanşând procesul de endocitoză.

Fragmentul HA1 este implicat în fuziunea veziculară mediată prin valoarea pH-ului endozomal. Rolul acestei particule este acela de a produce fuziunea membranelor virale cu cele ale celulei gazdă după endocitoză. Această etapă poate fi realizată datorită valorii scăzute a pH-ului endozomal, cuprins între 5 şi 6, ce determină modificări conformaţionale în molecula de HA. Consecinţa funcţională a acestor modificări este translocarea unor grupări terminale din molecula de HA2 (porţiune denumită extremitatea N – de la “new” sau “nou” deoarece aceasta este exact extremitatea nou obţinută prin clivajul moleculei de HA) pe membrana endosomală, formând o structură stabilă, cu forma electronomicroscopică de alfa-helix, având o lungime de 110A, una dintre cele mai lungi întâlnite în orice proteină. Acest alfa-helix este puntea de legătură formată între virus şi membrana endozomală.

Pe fiecare monomer hemaglutininic sunt localizate 4 situsuri antigenice. Datele experimentale sugerează că până şi simpla substituire a unui singur aminoacid la nivelul oricăruia dintre aceste situsuri duce la transformarea antigenică a particulei virale, şi, în consecinţă, nerecunoaşterea acesteia de către sistemul imunitar.

Neuraminidaza este o enzimă de natură glicoproteică ce are la rândul ei şi un rol antigenic. Multe dintre cele 9 subtipuri apar mai ales la păsări, dar N1 şi N2 au fost implicate în pandemii de gripă umană. Chiar şi N3-N7 au fost legate de câteva decese sporadice în rândul populaţiei.

Ea mai este cunoscută şi ca sialidaza sau acetil-neuraminil hidrolaza. Această enzimă catalizează hidroliza terminaţiilor reprezentate de către molecule de acid N-acetil-neuraminic legat α 2-3, α 2-6 sau α 2-8 la molecule glicoproteice sau oligozaharidice. S-a observat o afinitate mai redusă pentru acidul sialic legat în poziţie α 2-8 faţă de primele două poziţii.

Imaginea electronomicroscopică a neuraminidazei este asemănătoare ca formă cu o ciupercă, capul acesteia fiind format din 4 subunităţi coplanare şi relativ sferice, iar piciorul este reprezentat de o regiune hidrofobă implantată în bistratul lipidic al pericapsidei virale. Pentru această moleculă, regiunea hidrofobă este reprezentată de către o terminaţie amino. Neuraminidaza este alcătuită dintr-un singur lanţ polipeptidic ce este răsucit în sens invers faţă de moleculele de hemaglutinină. Din punct de vedere chimic lanţul polipeptidic este alcătuit dintr- un număr de 6 aminoacizi polari fixi, urmaţi de variaţii de aminoacizi hidrofili.

Funcţia acesteia este legată de eliberarea particulelor virale nou formate din celulele infectate, prin scindarea acidului sialic terminal prezent pe unele dintre catenele glucidice de la suprafaţa acestor celule. Totodată, aceasta are şi rol protector pentru celula gazdă o dată ce aceasta a fost invadată. Molecula de neuraminidază este una din primele proteine virus specifice produse de către celula gazdă în timpul multiplicării intracelulare a virusului. Ca şi celelalte molecule ea se îndreaptă spre membrana celulară, unde se acumulează, împiedicând ataşarea altor particule virale la aceeaşi celulă.

Particula virală prezintă de asemenea canale ionice, sau proteina M2. Aceste canale străbat pericapsida şi capsida, principalul lor rol fiind acela de

a permite creşterea acidităţii la interiorul virionului în perioada în care acesta este contenţionat în endozom. ARN-ul viral poate fi eliberat din matricea proteică virală ( proces denumit ‘uncoating’, ‘decapsulare’) doar dacă pH-ul creşte anterior fuziunii membranei virale la membrana endozomală. Eliberarea ARN-ului este datorată minimalizării interacţiunilor dintre proteinele ribonucleice (de exemplu polimeraza ARN- dependentă care nu este codată de către genomul celulei gazdă) şi cele matriceale. De asemenea, aceste canale ionice funcţioneaza şi în timpul exocitozei echilibrând gradientul de pH dintre lumenul acid al aparatului Golgi şi citoplasma cu pH neutru.

Un alt rol îndeplinit de către proteina M2 doar la unele subtipuri virale este prevenirea unor modificări conformaţionale premature ale moleculei de hemaglutinina HA, tot prin modificarea pH-ului complexului Golgi.

Canalele ionice acţioneaza prin proprietatea lor de a conduce ioni de H+, iar ca mecanism de control conductibilitatea canalelor este redusă de valori scăzute ale pH-ului din virion (feed-back negativ).

Proteina M2 pare să aibe şi un rol complet distinct, acela de ligant pentru asocierea proteinei M1 la structurile pericapsidei în cursul asamblării noilor particule virale.

Structura proteinei M2 codificată prin secvenţa primară de aminoacizi este reprezentată de un polipeptid cu 97 de radicali, având în domeniul transmembranar un număr de 19 aminoacizi iar în cel intracitoplasmatic 54 de aminoacizi. Terminaţiile cisteinice se întâlnesc la radicalii 17 şi 19, aceştia fiind responsabili de formarea dimerilor şi tetramerilor. Totuşi, simplul fapt că un tetramer se formează nu înseamna şi că acesta este forma activă oligomerică a substanţei, dar în urma cercetărilor de laborator s-a dovedit că într-adevăr forma tetramerică a moleculei este responsabilă pentru activitatea acesteia.

Una din grupele principale de medicamente antivirale este reprezentată de cele din familia amantadinelor. Amantadina acţionează asupra proteinei M2, inhibând funcţionarea acesteia şi blocând astfel ciclul replicativ al virusului. Din acest punct de vedere proteina M2 este foarte importantă pentru cercetători şi medici, antiviralele din această grupă fiind una din puţinele soluţii terapeutice pe care le avem momentan la dispoziţie în lupta cu virusul gripal. Totuşi, nici acesta nu se lasă mai prejos decât cei mai prestigiosi cercetători ai momentului, în Asia existând deja un procent îngrijorător de ridicat (31 % din tulpinile H5 si 11% dintre tulpinile H9) de tulpini rezistente la amantadină. Noua tulpină H1N1 responsabilă pentru pandemia din acest an este şi ea rezistentă la amantadină.

Rezistenţa la amantadină este cauzată de substituirea unui aminoacid din domeniul transmembranar al proteinei. Această mutaţie poate surveni în oricare din cele 5 situsuri implicate, efectul fiind acelaşi, mutaţia apărută la

unul singur dintre cele 5 situsuri (diferiţi aminoacizi) fiind suficientă pentru instaurarea rezistenţei la aceste antivirale.

Protonii transportaţi prin aceste canale trebuie sa treacă printr-un por hidrofil ce are selectivitate pentru protoni. Din moment ce această proteină are o structură tetramerică în forma sa activă, singura locaţie posibilă pentru acest por este reprezentată de spaţiul dintre domeniile transmembranare ale monomerilor proteinei M2. In urma cercetărilor s-a stabilit că aceste domenii transmembranare au cel mai probabil forma helicoidală. Concluzia a fost acceptată pe baza mai multor dovezi: în primul rând, mutaţiile rezistenţei la amantadină apar la distanţă de 3-4 radicali de-a lungul proteinei; în al doilea rând, spectrul cristalografic circular este potrivit unei structuri α-helicoidale; în cel de-al treilea rând, când s-a realizat scanarea mutagena cu cisteină s-a observat că înlocuirea fiecărui al treilea sau al patrulea radical din moleculă duce la mari perturbări în proprietăţile canalului (radicalii care au dus la cele mai grave alterări după preschimbarea lor în terminaţii cisteinice au fost V27, A30, S31, G34, H37 şi W41).

A fost testată şi ipoteza conform căreia tocmai radicalii aceia ar fi orientaţi spre lumenul canalului ionic, cu ajutorul unor reagenţi disulfidici specifici solubili în apă: metan-tiosulfonat-metilamoniu (MTSEA) şi metan-tiosulfonat-tetraetilamoniu (MTSET). Aceşti reagenţi au fost aplicati pe oocite care prezentau fiecare dintre cele 19 mutaţii substitutive cu cisteină în domeniul transmembranar. Când aceşti reagenţi au fost aplicaţi extracelular (porţiunea N-terminală a proteinei) s-a observat că A30C (Ala30-alanina, aminoacid situat în poziţia 30) şi G34C (Gly34) au fost inhibate la aplicarea MTSEA. [Shuck et al., 2000].

Modificările înregistrate nu sunt reversibile, faptul că ele se

pastrează şi după spălarea reagenţilor ducând cu gândul la nişte modificări covalente. Fenomenele de inhibiţie nu au fost detectate la radicalii aflaţi mai aproape de capătul extracelular al canalului decât Ala30, indicând un diametru mai mare al porului la deschiderea exterioară a acestuia.

Când reagenţii au fost aplicaţi intracelular prin injecţie în oocite s-a observat că mutanţii W41C (Trp41) au fost inhibaţi, dar nu si cei G34C. Astfel s-a confirmat ipoteza potrivit căreia 4 dintre radicali se găsesc la interiorul lumenului canalelor ionice, tapetându-le ca o mucoasă. Faptul că G34C a putut fi inhibat prin aplicarea extracelulară a reagentului dar nu şi prin aplicarea intracelulară a indicat că trebuie să existe o strictură pe lungimea porului între radicalii 34 şi 41 care determină imposibilitatea pătrunderii reagentului. Se bănuieşte că strictura canalelor ionice transmembranare este localizată la nivelul histaminei din poziţia 37 (His37), dar această ipoteză nu a putut fi transformată în certitudine deoarece mutanţii de tip H37C (în care histidina este substituită de cisteină) nu prezintă activitate ionică. Totuşi His37 este considerat filtrul selectiv al canalelor ionice virale. [Shuck et al., 2000].

Histidina prezintă o catenă secundară de imidazol ce este capabilă să coordoneze anumite metale tranziţionale. Acest fapt nu este numai un avantaj pentru particula virală ci poate fi o veritabilă armă împotriva sa, de când cercetătorii au observat că tulpinile sălbatice (fără mutaţii de rezistenţă la antivirale) sunt puternic inhibate de ionii de Cu 2+ (însă nu şi de cei Cu 1+). Totuşi tulpinile mutante de tip M2H37A sunt inhibate doar slab şi rapid reversibil. [Gandhi et al., 1999].

Examinarea secvenţei de aminoacizi din domeniul transmembranar al canalului ionic relevă că exista un singur radical cu abilitatea de oxido-reducere (cedare şi acceptare de electroni sau H+) între

valorile pH-ului la care canalul este activ. Acest radical este tot His37. Mai mult decât atât, acest radical a fost indicat ca fiind poziţionat la interiorul lumenului canalului ionic şi este situat chiar la nivelul stricturii acestuia. La înlocuirea acestui radical (M2 WT – molecula nemodificata) cu glicina (M2 H37G), alanina (M2 H37A) şi acid glutamic încarcat negativ (M2 H37E) s-a constatat că activitatea canalelor mutante este relativ independentă de pH (intensitatea curenţilor transmişi prin por nu a fost modificată semnificativ de variaţiile ph-ului). [Wang et al., 1995].

Mai mult decât atât, s-a evidenţiat faptul că mutantele substituite cu acid glutamic nu au abilitatea de a fi proton-selective, cum sunt canalele ionice nemodificate. Acest fapt a dus la concluzia că His37 este implicată în activarea canalului ionic la valori scăzute ale pH-ului.

Faptul că protonii nu sunt doar transportaţi pasiv ci interacţionează cu canalele ionice (sau cel puţin cu unul dintre radicalii care le tapetează) a fost dovedit prin compararea conductibilităţii canalului cu un solvent normal apos şi cu deuteriu ca solvent. Rezultatele au depăşit gradientul de vâscozitate dintre deuteriu şi apă. [Mould et al., 2000].

Din aceste rezultate experimentale s- au obţinut datele necesare pentru a valida modelul molecular al domeniului transmembranar (TM) calculat până atunci doar pe baza principiului de minim energetic. Conform acestui model Ala30, Gly34, His37 şi Trp41 tapetează lumenul canalelor ionice. [Shuck et al., 2000].

Viruşii de tip Influenza B necesită şi ei etapa de acidifiere înaintea decapsulării (uncoating). Acest fapt a fost demonstrat pentru prima oară în 1991 de către Zhirov. Virionii de tip B lizaţi cu o soluţie de tip detergent nu eliberează ARN în soluţie la pH neutru dar ARN-ul este eliberat la valori scăzute ale pH-ului mediului.

Ca şi proteina M2 a tulpinilor de tip A, proteina BM2 este şi ea capabilă de acidifiere. Oocitele sau celulele de mamifere care au fost expuse în soluţii cu valori scăzute ale pH-ului s-au acidifiat mai rapid când exprimau proteina BM2 decât celulele martor sau celulele ce exprimau o proteină mutantă în care radicalul histidină din domeniul transmembranar era înlocuit cu cisteina.

Din nefericire, amantadina nu inhibă proteina BM2 deoarece lumenul acesteia este tapetat cu alţi radicali decât aceia ai proteinei AM2. Histidina (H) şi Triptofanul (W) au acelaşi locus în ambele catene, acest fapt

corespunzând cu teoriile înaintate până acum despre rolul esenţial jucat de acestea în funcţionarea acestor canale.

Genomul viral este reprezentat printr-un complex ribonucleoproteic (RNP) alcătuit din 8 segmente distincte de ARN cu polaritate negativă (complementar cu ARN-ul mesager) şi 3 polimeraze PA, PB1 şi PB2, asociate fiecărui segment. Genomul este alcătuit din 8 segmente doar în cazul tipurilor A şi B, unde acestea codifică 10 proteine, dar în cazul virionilor de tip C, ARN-ul este reprezentat de doar 7 segmente ce codifică 9 proteine.

Segment Mărime (nt)

Polipeptide Funcţie

1 2341 PB2 Transcriptază: legarea la extremitatea liberă a ARN-ului celulei gazdă. (87

kd)

2 2341 PB1 Transcriptază: elongaţie. (96 kd)

3 2233 PA Transcriptază: activitate catalitică. (85 kd)

4 1778 HA Hemaglutinina

5 1565 NP Nucleoproteină: transportă intranuclear şi intracitoplasmatic fragmente de ARN, învelindu-le. (60 kd)

6 1413 NA Neuraminidaza

7 1027 M1 Proteină de membrana

M2 Canale ionice

8 890 NS1 Proteină Non-Structurală: transportul celular al ARN-ului, translaţie. Proteina anti-interferon.

NS2 Non- Structurală: funcţie necunoscută

Lungimea totală a genomului viral este de 12.000 -15.000 de nucleotide, iar masa moleculară a acestuia fiind proporţională cu dimensiunile şi masa virionului, aceasta mai depinzând şi de cantitatea de informaţie stocată.

Secvenţa genomului prezintă o repetiţie a capetelor terminale,

identice între ele. La secvenţa terminală 5’ această porţiune repetitivă este lungă de 13 nt, ea fiind identică cu porţiunea repetitivă întâlnită la secvenţa 3’, deşi aici poate fi mai scurtă. Aceasta este considerată a fi o secvenţă de încapsidare şi ea lipseşte din ARN-ul mesager (UTR – untranslated region). Secvenţele repetitive sunt alcătuite pe lângă nucleotidele terminale cu o conservabilitate ridicată (nu se întâlnesc modificări la acest nivel) şi din nucleotide specifice segmentului, neconservate. Aceste secvenţe repetitive sunt identice în cadrul aceluiaşi tip viral, şi asemănătoare chiar şi între diferitele tipuri de influenza, sugerând că viruşii de tip A, B şi C au o origine comună.

Cele 3 polimeraze (PB1, PB2 si PA) se regrupează împreună în citoplasmă şi migrează spre nucleu pe măsură ce sunt produse. Toate trei prezintă semnale cariofilice şi se găsesc în număr de 30-60 în fiecare virion.

Polimeraza PB2 îndeplineşte şi un rol de barieră interspecifică, radicalul 627 din structura acesteia fiind mereu glutamat în tulpinile cu patogenitate pentru speciile aviare şi lizina în cele cu patogenitate pentru om. Totuşi, în urma cercetărilor efectuate în acest sens, înlocuirea acestui radical nu face tulpinile aviare patogene şi pentru alte specii în afara de om, deci se impune teoria existenţei mai multor astfel de radicali ce determina patogenitatea pentru o anumita specie gazdă.

Cel mai mic fragment al genomului viral, segmentul 8, este responsabil de sintetizarea celor 2 proteine non-structurale NS1 şi NS2, codificate fiecare prin segmente diferite de ARN mesager.

Proteina NS1 acţioneaza ca supresor al sintezei de interferon B, iar deleţia acesteia duce la exprimarea unui fenotip atenuat.

Plecând de la calcule legate de masa moleculară redusă a segmentului s-a demonstrat că nu este loc suficient pentru cele 2 secvenţe decât dacă acestea sunt suprapuse. După ce bănuiala a fost confirmată pe modele virtuale, secvenţierea completă a segmentului 8 a dovedit suprapunerea celor două codoane dincolo de orice speculaţie.

Codoanele sunt suprapuse pe o distanţă de la 43 la 60 de aminoacizi, în funcţie de care locus metioninic (dintre cele 4 posibilităţi viabile) iniţiază începerea sintezei de NS2. Sinteza de NS1 este iniţiată de nucleotidele A U G din poziţiile 27-29 (din totalul de 890 ce alcătuiesc întregul segment 8) şi este încheiată de secvenţa U G A din poziţiile 717-719. Pe baza greutăţii moleculare de aproximativ 11kd pentru NS2, metionina care iniţiază sinteza acesteia ar putea fi localizată pe poziţia 1, 3, 6 sau 18 şi este prezentată în

chenar în harta genomului. Suprapunerea la acest nivel poate fi descrisă şi ca fiind de lungimea a 127-179 de nucleotide (cele care codifică cei 43-60 de aminoacizi menţionaţi anterior). [Porter et al., 1990].

Mecanismul intern de iniţiere a transcripţiei pentru ARN-ul mesager al NS2 se bazează pe recunoaşterea de către transcriptază a unei secvenţe similare cu secvenţa 3’ conservată la toate cele 8 segmente virale. Exista 2 secvenţe similare dar în urma cercetărilor şi mai ales a calculelor privind mărimea necesară a secvenţei ce codifică NS2 s-a concluzionat că secvenţa repetitivă cu valoare de recunoaştere pentru transcriptază este localizată de la nucleotida 488 la 499, 8 din cele 12 nucleotide fiind identice cu cele prezente în secvenţa repetitivă terminală 3’.

Pe harta genomului segmentului 8 (prezentată pe urmatoarea pagină) este expus şi ARN-ul complementar.

Pentru mai multe detalii intra pe:

www.magazinveterinar.rowww.cdc.gov17

www.cyf-medical-distribution.ro