AGES-Webribo Systematik in Clostridium difficile AGES-Webribo 2 Clostridium difficile Clostridium difficile

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  • AGES-Webribo

    Systematik in Clostridium difficile PCR-Ribotyping

    Alexander Indra

    AGES-Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien

    Nationale Referenzzentrale für Clostridium difficile

  • AGES-Webribo 2

    Clostridium difficile

    Clostridium difficile ist auch in Österreich ein bedeutender nosokomialer

    Erreger

    • im Jahr 2003 wurden 777 Fälle registriert

    – 53 davon mit tödlichem Ausgang

    • Im Jahr 2010 wurden von Spitälern 2.186 Clostridium-difficile-Infektionen

    gemeldet

    – 181 davon mit tödlichem Ausgang

    Das ist nur die Spitze des Eisbergs!

  • AGES-Webribo 3

    Clostridium-difficile-Diagnostik in der österreichischen Referenzzentrale

    •C. difficile Antigen Nachweis aus Stuhlproben

    •C. difficile Toxinnachweis aus Stuhl (Tox A/B)

    •C. difficile Kulturdiagnostik

    – direkte Anzucht

    – Flüssig-Anreicherung mit Alkoholschock

    – Resistenztestung mittels E-Test

    •Molekularbiologischer Nachweis von tcdA, tcdB, tcdC-Deletionen, cdtA und cdtB

    •PCR-Ribotyping mittels Kapillar-Gel-Elektrophorese

    • Im Bedarfsfall

    – MLVA-Typisierung zur Subtypisierung im Ausbruchsfall

    – tcdC Sequenzierung

  • AGES-Webribo 4

    PCR-Ribotyping

  • AGES-Webribo 5

    PCR-Ribotyping

    • im Clostridium-difficile-Genom befinden sich bis zu 15 Kopien des

    ribosomalen RNA-Operons

    – in diesem Operon finden sich Gene für 16s, 23s und 5s RNA

    – die Gene der 5s, 16s und 23s-RNA sind durch kurze DNA-

    Abschnitte, die Intergenic-Spacer-Regions (ISR), getrennt

    – die Abschnitte zwischen 16s und 23s können unterschiedlich

    lang sein (zw. 200 und 650bp)

    •durch PCR-Amplifikation der 16s-23s-ISR und die Bestimmung der

    Fragmentlängen ist eine Typisierung möglich

  • AGES-Webribo 6

    PCR-Ribotyping

  • AGES-Webribo 7 7

    PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter

     Verantwortlich für die für die Unterschiede zwischen verschiednenen PCR Ribotypen sind 9bp langer Repeat im ISR

    Dieser Repeat trennt

     33 bp

     53 bp lange variable DNA Sequenzen

     Innerhalb einiger ISR findet man auch eine 172 bp lange spacer sequence die eine tRNA-Ala codiert

     Dies ist zeigt eine eine hoch strukturierte Organisation des 16S–23S ISR von C. difficile

  • AGES-Webribo 8 8

    182 bp ISRstart-v1 IB 0 bp IB ISRend-v2

    215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v4

    215 bp ISRstart-v2 IB 33 bp v2 IB ISRend-v1

    215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v1

    214 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v5

    215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1

    215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v6

    215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1

    375 bp ISRstart-v4 IB 33 bp v5 IB ISRend-v1

    259 bp ISRstart-v5 IB 33 bp v11 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3

    277 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v14 IB IB ISRend-v1

    277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v1 IB ISRend-v1

    277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v1 IB ISRend-v1

    279 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v4 IB ISRend-v3

    276 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v5 IB ISRend-v5

    277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v5 IB ISRend-v1

    498 bp ISRstart-v4 IB IB IB-T:C 33 bp v6 IB ISRend-v1

    318 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v11 IB 33 bp v7 IB ISRend-v5

    500 bp ISRstart-v4 IB IB IB 33 bp v8 IB ISRend-v7

    321 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v12 IB 33 bp v9 IB ISRend-v3

    363 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3

    361 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB-C:T 33 bp v10 IB ISRend-v8

    319 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v13 IB 33 bp v10 IB ISRend-v9

    397 bp ISRstart-v4 IB IB ISRend-v3172 bp v2

    172 bp v1

    171 bp v1

    172 bp v1

    53 bp v2

    53 bp v1

    53 bp v6

    53 bp v6

    53bp v8

    53bp v8

    53bp v8

    53bp v9

    53 bp v3

    53 bp v4

    53 bp v5

    53 bp v1

    53 bp v7

    53 bp v1

    53 bp v7

    53 bp v7

    Indra & Blaschitz et al .2010

    PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter

    • slipped-strand mispairing • Homologe intra-chromosomal Rekombination • Homologe inter-chromosomal Rekombination?

  • AGES-Webribo 9

    PCR-Ribotyping

    • ist derzeit die wichtigste Methode zur Clostridium-difficile-Typisierung

    •derzeit sind mehr als 250 PCR-Ribotypen in der Referenzzentrale in

    Wales bekannt

    •weltweit die wichtigsten PCR-Ribotypen sind 001, 014, 017,078 und

    027

    – neben dem ersten Nachweis eines Ribotyps 027 in Österreich

    konnten auch ca. 350 verschiedene Ribotypen bestimmt werden

  • AGES-Webribo 10

    konventionelles PCR-Ribotyping: Probleme

    •problematischer Datenaustausch

    – keine einheitliche Nomenklatur

    •schwer zu beeinflussende Laufbedingungen beeinflussen die Analyse

    – DNA Konzentration

    – verwendete Agarose

    – Temperatur

    – Spannung

    •schwierige Interpretation von Bandenmustern

    – z.B. PCR-Ribotyp 066

    – in Literatur mit Toxinotyp V und VI beschrieben

  • AGES-Webribo 11

    PCR-Ribotyping

    Ribotyping

    1 0 0

    9 8

    9 6

    9 4

    9 2

    9 0

    8 8

    8 6

    PCR-Ribotyping

    Probe 118

    Probe 195

    Probe 124

    Probe 182

    Probe 32

    Probe 41

    Probe 160

    Probe 104

    Probe 350

    Probe 143

    Probe 100

    Probe 129

    Probe 342

    Probe 349

    Probe 212

    Probe 112

    Probe 156

    Probe 123

    Probe 132

    Probe 101

    Probe 159

    Probe 201

    Probe 202

    Probe 30

    Probe 40

    053

    AI-52

    078

    078

    027

    AI-14

    AI-29

    AI-23

    AI-50

    AI-19

    014

    014

    014

    014

    AI-9

    017

    AI-20

    AI-27

    AI-12

    001

    001

    001

    001

    001

    001

  • AGES-Webribo 12

    konventionelles PCR-Ribotyping

    • was muss verbessert werden?

    – Vergleichbarkeit von Ergebnissen

    – Datenzuverlässigkeit

    – jedes Labor produziert vergleichbare Daten

    – eine Datenbank zur Dateninterpretation

    » Unabhängigkeit von Stammsammlungen

    – einheitliche Nomenklatur

  • AGES-Webribo 13

  • AGES-Webribo 14

    Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping

  • AGES-Webribo 15

    Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping

    • hohe Reproduzierbarkeit durch Verwendung

    – eines Flureszenz markierten Primers

    – eines vorgegebenen Größenstandards, der gleichzeitig mit jeder Probe

    mitläuft

    – reproduzierbare Laufbedingungen

    • höherer Proben-Durchsatz bei

    niedrigeren Kosten

    • Vergleichbarkeit der Ergebnisse

    • einfache Datenanalyse

    • höhere Diskreminationsfähigkeit

    – Fragmente mit 1.5 Basen Abstand

    und mehr können

    unterschieden werden

  • AGES-Webribo 16

    Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Diskreminationsfähigkeit

    6 verschiedene 014 Subtypen

  • AGES-Webribo 17

    Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping

  • AGES-Webribo 18

    Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Reproduzierbarkeit

  • AGES-Webribo 19

    AGES-WEBRIBO

    •AGES-Webribo

    – ist eine kostenlose Web-Datenbank zur Interpretation von

    Clostridium-difficile-Typisierungsergebnissen, die mittels Kapillar-

    Gel-Elektrophorese basierenden PCR-Ribotyping gewonnen wurden

    – Die Fragmentlängen und die dazugehörenden Peakhöhen der

    Proben können direkt durch AGES-WEBRIBO oder mittels

    GENESCANNER-, GENEMAPPER- oder PEAKSCANNER-Software

    bestimmt werden

    – Der Datenimport erfolgt mittels FSA, CSV- oder Excel-Files

  • AGES-Webribo 20

    AGES-WEBRIBO

    •Aufgrund vorgegebener Analysekriterien wird ein Qualitätscheck der Ergebnisse durch die AGES-Webribo-Software durchgeführt

    – z.B. eine maximal erlaubte Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von „Split-peaks“

    – Eine minimale Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von „Pull-Ups“

    – Ergebnisse werden sofort als E-Mail versandt

    – Informationen zu jedem PCR-Ribotyp sind online verfügbar

    – neue PCR-Ribotypen müssen durch erneute Analyse bestätigt werden

  • AGES-Webribo 21

    AGES-WEBRIBO

    AGES-WEBRIBO verwendet einen neu entwickelten Algorithmus

    zum Vergleich von neuen Proben mit der Datenbank

    •dies erlaubt den Vergleich

    von Daten unabhängig von

    – Größenstandard

    – dieser muss den Analysebereich (150-650Basen) umfassen