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“AÇÃO FOTOTÓXICA DO LASER EM BAIXA INTENSIDADE E DIODO DE … · fizeram desenvolver um raciocínio mais lógico das questões do dia a dia ... 4.2.3 Cálculo da área e volume

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  • AO FOTOTXICA DO LASER EM BAIXA

    INTENSIDADE E DIODO DE EMISSO DE LUZ (LED) NA

    VIABILIDADE DO FUNGO Trichophyton rubrum: ESTUDO IN

    VITRO

    JOS CLUDIO FARIA AMORIM

    Belo Horizonte, 04 de julho de 2007.

    UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

    PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM

    ENGENHARIA MECNICA

  • Jos Cludio Faria Amorim

    AO FOTOTXICA DO LASER EM BAIXA

    INTENSIDADE E DIODO DE EMISSO DE LUZ (LED)

    NA VIABILIDADE DO FUNGO Trichophyton rubrum:

    ESTUDO IN VITRO

    Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em

    Engenharia Mecnica da Universidade Federal de Minas

    Gerais, como requisito parcial obteno do ttulo de Doutor

    em Engenharia Mecnica.

    rea de concentrao: Calor e Fluidos

    Linha de Pesquisa: Bioengenharia

    Orientador: Prof. Dr. Marcos Pinotti Barbosa

    Departamento de Engenharia Mecnica

    Belo Horizonte

    Escola de Engenharia da UFMG

    2007

  • COLABORADORES

    Laboratrio de Bioengenharia da UFMG

    Laboratrio de Micologia da UFMG (Departamento de Microbiologia)

    Laboratrio de Fsica da UFMG

    Centro de Lasers e suas Aplicaes IPEN-SP

  • A Deus, sempre presente em minha vida.

    Ao meu pai embora longe de minha vida

    terrena sempre presente nela espiritualmente.

    A minha me exemplo de f, fora e amor.

    A minha esposa Marina e filha Sabrina pelo

    incentivo, dedicao e apoio

  • AGRADECIMENTOS

    Ao Professor Dr. Marcos Pinotti pela oportunidade de poder interagir em

    uma rea abrangente como a Bioengenharia. As suas interpretaes objetivas me

    fizeram desenvolver um raciocnio mais lgico das questes do dia a dia contribuindo

    para meu desenvolvimento profissional.

    Ao Professor Dr. Roberto Mrcio de Andrade pelo incentivo e amizade

    durante o transcorrer do curso de doutorado. Ensinou conceitos que colaboraram para o

    desenvolvimento e trmino deste trabalho.

    A Betnia Maria Soares por me ajudar em todas as fases deste trabalho e

    compartilhar seus conhecimentos de forma simples e objetiva.

    Aos colegas Gerdal Roberto de Sousa, Lvio de Barros Silveira e Marcus

    Vincius Lucas Ferreira pelo engrandecimento de nossa amizade e companherismo.

    Ao Reitor da Universidade de Itana, Dr. Faial David Freire Chequer, pelo

    incentivo e ajuda que me permitiram realizar o doutorado.

    Aos colegas da Clnica Integrada da FOUI pelo apoio dispensado em minha

    ausncia.

    Ao colega Renato Prates pela colaborao nos pilotos deste trabalho.

    A Walquria Lopes Borges no preparo dos materiais para os experimentos.

    Ao Danilo Nagem e Cludio Henrique Gerken Dias pelo auxlio nas

    fotografias

    Ao Fabrcio Carvalho, Ivan Rodrigues de Andrade Loureno, Claysson

    Vimieiro e Sara Del Vecchio pelo auxlio na realizao dos clculos envolvidos no

    trabalho.

    A Maria Ceclia Berger pela ajuda na confeco das tabelas e fotos.

    A ECCO FIBRAS (So Paulo-Brasil) pelo laser cedido.

    A MMOPTICS (So Paulo-Brasil) pelo LED cedido.

  • SUMRIO

    Lista de Figuras 7

    Lista de Quadros 9

    Lista de Grficos 10

    Lista de Tabelas 11

    Lista de Smbolos e Unidades 12

    Resumo 14

    1.Introduo 15

    2. Objetivos 21

    3. Reviso de Literatura 22

    3.1. Base Cientfica da Terapia Fotodinmica 22

    3.1.1. Histrico 22

    3.1.2. Mecanismos de interao 24

    3.1.3. Efeitos fototxicos da PDT 26

    3.1.4. Fotossensibilizadores 28

    3.1.5. Efeitos fungicidas da terapia fotodinmica 30

    3.2. Dermatfitos e dermatofitose 36

    3.2.1. Trichophyton rubrum 37

    3.2.2. Manisfestaes clnicas 37

    3.2.3. Onicomicose 38

    3.2.4. Tratamento das onicomicoses 38

    3.2.5. Tratamento tpico 39

    3.2.6. Tratamento sistmico 39

    3.2.7. Falhas teraputicas 40

    4. Materiais e Mtodos 42

    4.1 Detalhamento dos materiais 44

    4.2 Detalhamento dos mtodos 49

    4.2.1 Preparo do inculo 50

    4.2.2 Procedimento de teste 52

    4.2.3 Clculo da rea e volume de suspenso irradiada 54

    4.2.4 Anlise esttistica 59

  • 5. Resultados e Discusso 61

    6. Concluses 68

    Abstract 69

    Referncias Bibliogrficas 70

    Anexo A A.1

    A.1 Laser A.1

    A.2 Laser de baixa intensidade A.2

    Anexo B B.1

    B.1 LED B.1

    Anexo C C.1

    C.1 Clculo da rea e do volume das imagens dos grupos 5 e 6 C.1

  • LISTA DE FIGURAS

    FIGURA 3.1- Diagrama de Jablonski modificado de Wainwright 25

    FIGURA 3.2- Estrutura molecular do Azul de Metileno e do Azul de Toluidina 29

    FIGURA 4.1- Diagrama da metodologia 43

    FIGURA 4.2- Equipamento laser de baixa intensidade 44

    FIGURA 4.3- Equipamento LED 45

    FIGURA 4.4- Unidade de Leitura de Potncia Luminosa 45

    FIGURA 4.5- Espectrofotmetro - MICRONAL B542 46

    FIGURA 4.6- Vrtex Biomatic 46

    FIGURA 4.7- Fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO) 47

    FIGURA 4.8- Amostra de referncia ATCC 40051 de T. rubrum 47

    FIGURA 4.9-Transferncia dos condios e fragmentos de hifas para o tubo de

    ensaio

    51

    FIGURA 4.10- Microscopia ptica da absoro do corante pelas clulas fngicas

    aps a TPI

    53

    FIGURA 4.11- Irradiao pelas fontes de luz do fundo para a abertura do tubo 53

    FIGURA 4.12- Colnias de T. rubrum repicadas em placas de Petri 54

    FIGURA 4.13- Dados dimensionais do tubo de ensaio 55

    FIGURA 4.14- Baseline da gua sendo irradiada pelo LED e laser 55

    FIGURA 4.15- (a) Amostra do grupo 6 sendo irradiada pelo laser e (b) Amostra

    do grupo 5 sendo irradiada pelo LED

    56

    FIGURA 4.16- (a) Converso da imagem para tons de cinza do grupo 6 e (b)

    Converso da imagem para tons de cinza do grupo 5

    57

    FIGURA 4.17- Imagem processada onde a rea irradiada pelo laser foi de 15,1

    mm sendo que a escala de cores representa a intensidade de luz em cada regio

    irradiada

    57

    FIGURA 4.18- Imagem processada onde a rea irradiada pelo LED foi de 52,2

    mm sendo que a escala de cores representa a intensidade de luz em cada regio

    irradiada

    58

    FIGURA 4.19- (a) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo Laser e

    (b) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo LED

    58

  • FIGURA 4.20- Slido gerado pela revoluo da curva para o laser 59

    FIGURA 4.21- Slido gerado pela revoluo da curva para o LED 59

    FIGURA 5.1- Placas de Petri com colnias de T.rubrun dos grupos 1 (a) e 4 (b) 61

    FIGURA 5.2- Placas de Petri dos grupos 2 (a) e 3(b) 61

    FIGURA 5.3- Placas de Petri dos grupos 5 (a) e 6 (b) 62

    FIGURA B.1- Modelo de formao de um LED B.1

    FIGURA C.1- (a) rea/laser=15,1 mm2 e (b) rea/LED=52,2 mm2 C.1

    FIGURA C.2- Imagens originais do tubo sendo irradiado pelo laser esquerda

    (a) e pelo LED direita (b). Em destaque a rea de corte

    C.2

    FIGURA C.3- Esquema do procedimento para criao do slido que forneceu o

    valor numrico do volume

    C.3

  • LISTA DE QUADROS

    QUADRO 3.1- Caminhos fototxicos da PDT 27 QUADRO 3.2- Principais fotossensibilizadores utilizados em PDT com suas

    bandas de absoro 29

    QUADRO 4.1- Grupos do experimento 52

  • LISTA DE GRFICOS

    GRFICO 4.1- Espectroscopia de absoro ptica do fotossensibilizador, Azul

    de Toluidina 25g/mL No eixo Y encontra-se a absoro normalizada do corante

    em unidades arbitrrias e no eixo X a poro visvel do espectro eletromagntico

    em nanmetros.

    49

    GRFICO 4.2- Espectroscopia de absoro ptica da suspenso de Trichophyton

    rubrum em salina. No eixo Y encontra-se a absoro normalizada do corante em

    unidades arbitrrias e no eixo X a poro visvel do espectro eletromagntico em

    nanmetros.

    50

    GRFICO 4.3- Espectroscopias do fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO)

    na concentrao de 25g/ mL, de Trichophyton rubrum isoladamente e de

    Trichophyton rubrum associado ao Azul de Toluidina (TBO) 25g/ mL. No eixo

    Y encontra-se a absoro normalizada do corante em unidades arbitrrias e no

    eixo X a poro visvel do espectro eletromagntico em nanmetros.

    51

    GRFICO 5.1- Avaliao descritiva da mdia percentual de crescimento em

    relao ao controle considerando-se os 3 experimentos

    64

  • LISTA DE TABELAS

    TABELA 5.1- Avaliao descritiva do percentual de colnias viveis em relao

    ao controle considerando-se cada experimento

    63

    TABELA 5.2- Resultado da anlise de varincia da influncia dos fatores de

    interesse na avaliao do percentual de colnias viveis em relao ao controle

    64

  • LISTA DE SMBOLOS E UNIDADES

    LASER = amplificaco da luz por emisso estimulada de radiao

    LED =diodo emissor de luz

    TBO = azul de toluidina

    MB = azul de metileno

    nm = nanmetro

    mW = miliwatt

    mW/cm = miliwatt por cm

    HeNe = hlio-neonio

    CO2 = dixido de carbono

    I = intensidade

    W = watt

    s = segundo

    J = joules

    g = grama

    L = litro oC = graus celsius

    J/ cm 2 = joules por centmetro quadrado

    m = micrometro = comprimento de onda

    PDT = terapia fotodinmica

    EROs = espcies reativas de oxignio

    DNA = cido desoxiribonuclico

    ATP = trifosfato de adenosina

    HIV = imunodeficincia adquirida

    HPD = derivado de hemato-porfirina

    PpIX = protoporfirina IX

    FDA = administrao americana de alimentos e drogas

    HO = hidroxila

    H2O2 = perxido de hidrognio

    g/ mL = microgramas por mililitro

  • TPI = tempo de pr-irradiao

    ALA = cido 5 amino-levulnico = formulao comercial

    M = micromolar

    Ab-TBO = conjugado anticorpo-azul de toluidina

    LPS =lipopolissacardeos

    AsGa = arseneto de glio

    AsGaAl = arseneto de glio alumnio

    p/v = por volume

    CLSI = instituto de padronizaes clnicas e laboratoriais

    = dimetro

    d.p = desvio padro

  • RESUMO

    O efeito do laser em baixa intensidade emitindo no vermelho do espectro

    eletromagntico com comprimento de onda de 660nm, 100mW de potncia mdia de

    sada e tempo de 3 minutos foi comparado com LED em baixa intensidade emitindo no

    vermelho com comprimento de onda de 630nm, 100mW de potncia mdia de sada e

    tempo de 3 minutos, associado ao fotossensibilizador Azul de Toluidina com uma

    concentrao de 25g/mL em uma amostra do fungo Trichophyton rubrum sendo

    realizado em triplicata. As espectroscopias do corante azul de toluidina (TBO), do fungo

    Trichophyton rubrum, assim como o clculo do volume e da rea de suspenso do

    inculo associado ao fotossensibilizador e irradiada pelo laser e LED nos tubos de

    ensaio foram analisados. O corante TBO (25g/mL) foi o escolhido devido a sua

    ressonncia com os comprimentos de onda do laser e LED e por ser bem absorvido

    pelas clulas fngicas mostrando-se promissor para sua utilizao in vivo. Foi obtido

    um volume final de suspenso de 1000L sendo analisados seis grupos: grupo 1

    (controle de crescimento sem tratamento), grupo 2 (suspenso do inculo submetida

    irradiao com LED), grupo 3 (suspenso do inculo submetida irradiao com

    laser), grupo 4 (100 L de TBO acrescentados a 900 L do inculo), grupo 5 (100 L

    de TBO foram acrescentados a 900 L do inculo e realizada irradiao com LED) e

    grupo 6 (100 L de TBO foram acrescentados a 900 L do inculo e realizada

    irradiao com laser). Com exceo do grupo 1, todos os outros grupos foram

    irradiados por trs minutos sendo para os grupos 4, 5 e 6, estabelecido o tempo de pr-

    irradiao (TPI) de 5 minutos para absoro do corante pelas clulas fngicas. Os

    resultados mostraram diferenas significativas entre os grupos 5 e 6 (PDT) com reduo

    de 68,1% e 56% respectivamente, quanto ao nmero de colnias viveis sendo que o

    LED por apresentar uma divergncia maior que a luz laser, abrangeu um volume maior

    de suspenso do inculo mostrando-se mais eficiente na sua ao fototxica.

    Palavras chaves: Trichophyton rubrum, PDT, LASER, LED.

  • 1. INTRODUO

    O Trichophyton rubrum um fungo cosmopolita, sendo o mais implicado em

    quadros de dermatofitose humana segundo a literatura cientfica. Sua transmisso

    principalmente inter-humana ou por fmites contaminados. Clinicamente responsvel

    por quase todos os tipos de infeco dermatoftica humana, estando muitas vezes

    correlacionados com o fato de serem refratrios ao tratamento estabelecido, em razo de

    sua maior facilidade de burlar as defesas inatas do hospedeiro e permanecer como uma

    infeco residual, com exacerbaes clnicas eventuais. um fungo ubiqitrio, no

    havendo rea ou grupo de pessoas que se encontrem totalmente isolados de tal

    microrganismo. Tm a capacidade de invadir tecidos ceratinizados (pele, plos e unhas)

    de homens e animais, produzindo condies patolgicas (COSTA et al., 2002).

    A onicomicose uma doena multifatorial. A faixa etria do paciente tem

    exercido importante efeito em sua ocorrncia, com correlao entre o aumento da idade

    e da infeco. Estudos observaram que a gentica um fator que governa a

    epidemiologia da onicomicose e a doena causada pelo T. rubrum apresenta um padro

    familiar. Tem sido observada a associao entre a ocorrncia de onicomicose e o estilo

    de vida do paciente. Diabetes, Sndrome da Imunodeficincia Adquirida e doenas

    arteriais perifricas so fatores predisponentes para a instalao desta infeco fngica.

    Como qualquer doena infecciosa, um diagnstico correto e precoce imprescindvel

    para a escolha do tratamento adequado. Estudos revelam que as espcies Trichophyton

    rubrum e Trichophyton mentagrophytes esto envolvidos em mais de 90% das

    onicomicoses (FAERGEMANN E BARAN, 2003).

    O tratamento das onicomicoses representa uma das principais dificuldades

    teraputicas encontradas na prtica clnica, em razo de algumas particularidades: as

    unhas so estruturas no-vascularizadas o que explica a pequena penetrao dos

    medicamentos utilizados por via sistmica e o crescimento das unhas se faz de maneira

    lenta (5 a 6 meses nas unhas das mos e 12 a 18 meses nas unhas dos ps). Portanto, as

    dermatofitoses das unhas dos ps so mais rebeldes ao tratamento que as das mos

    (SIDRIM E MOREIRA, 1999).

    O tratamento tpico com amorolfina e ciclopiroxolamina produz poucos

    efeitos adversos sistmicos e no faz interao com outras drogas sistmicas utilizadas

  • 16

    pelo paciente, porm, em monoterapia, est indicada apenas para onicomicoses

    superficiais com comprometimento inferior a 50% da lmina ungueal e para pacientes

    nos quais a medicao sistmica est contra-indicada (LECHA, 2001; BALLEST et

    al., 2003).

    Os antifngicos sistmicos classicamente empregados no tratamento das

    onicomicoses so a griseofulvina e o cetoconazol que apresentam efeitos adversos

    como: cefalia, hipersensibilidade e eritema. Interagem com outras drogas

    (anticoagulantes orais e fenobarbital) acelerando seu metabolismo e diminuindo sua

    biodisponibilidade (LLAMBRICH E LECHA, 2002; BALLEST et al., 2003). Por

    volta de 1990 foram substitudos por itraconazol, fluconazol e terbinafina, que

    apresentam melhores resultados em menor tempo, maior segurana para o paciente

    embora apresentando ainda efeitos colaterais (BALLEST et al., 2003).

    De acordo com Ribeiro e Zezell (2004), o tratamento fotodinmico (PDT)

    estudado pela Medicina em vrias modalidades teraputicas. Na Oncologia, o

    tratamento dos tumores malignos com o uso do laser tem mostrado bons resultados. As

    primeiras experincias com o tratamento fotodinmico datam de aproximadamente 100

    anos, relatadas por Raab, que observou que a exposio ao corante alaranjado de

    acridina associado luz pode ser letal para protozorios como o paramcio. Alm disso,

    sugeriu que este efeito era causado pela transferncia de energia da luz para a substncia

    qumica, similarmente ao que ocorre nas plantas, com a absoro da luz pela clorofila.

    Nem a luz nem o corante isoladamente tiveram qualquer efeito aparente sobre os

    paramcios, mas, associados, foram altamente citotxicos. Os dois autores citados

    anteriormente afirmaram que outros pesquisadores tentaram destruir clulas tumorais,

    pela exposio radiao X, associada ao corante hematoporfirina. Entretanto, esse

    procedimento no obteve sucesso, demonstrando que a fonte de luz deve interagir com o

    corante.

    A PDT representa um complexo sistema de fototerapia que requer a presena

    de trs fatores que interagem concomitantemente: corante (agente fotossensibilizador),

    uma fonte de luz e o oxignio. Isoladamente, nem o fotossensibilizador, nem a luz tem a

    capacidade de produzir efeito deletrio ao sistema biolgico alvo. O mecanismo de ao

    se d por dois tipos de reaes fsico-qumicas: Reao do tipo I e reao do tipo II

    (MELLO et al., 2001; ALLISON et al., 2004).

    Segundo Konan et al 2002, o efeito fotodinmico tem seu incio quando a

    molcula do corante absorve a luz irradiada saindo do seu estado de repouso

  • 17

    (fundamental) assumindo um estado mais energtico, porm, menos estvel chamado

    estado singleto. Devido grande instabilidade deste nvel de energia, a molcula tem

    um tempo de vida muito curto (em gua cerca de 4,0s, MACHADO, 2000) e tende a

    voltar para um nvel de energia mais baixo ou mesmo retornando ao seu estado de

    repouso (reao do tipo I). Nesta transio, o excesso de energia pode ser transferido ao

    substrato de vrias maneiras: por meio de fluorescncia (espontneo), onde o

    fotossensibilizador emite energia em forma de ftons, por converso interna ou tambm

    pode passar a um nvel intermedirio (reao do tipo II), chamado estado tripleto,

    situado entre o estado de repouso e o estado singleto apresentando um tempo de vida

    um pouco mais longo. A curta meia vida do oxignio singleto, mais uma vez, assegura a

    reao localizada. Os processos do tipo II so geralmente aceitos como os maiores

    caminhos na leso da clula microbiana. Como na reao do tipo I discutida acima, o

    oxignio singleto tambm reagir com as molculas envolvidas na manuteno e

    estrutura da parede da clula/membrana, tais como os fosfolipdeos, os peptdeos e os

    esteris.

    Como a maioria das bactrias e fungos em geral no absorvem a luz visvel

    de alguns lasers que operam com baixa potncia e LEDs (Diodos de emisso de luz), a

    utilizao de um agente de absoro ptica que se fixe parede celular atraindo para si a

    luz laser / LED no momento da irradiao essencial para que ambos tenham ao

    antimicrobiana. Portanto, o fotossensibilizador funciona como um agente de absoro

    ptica, devendo ser ressonante com o comprimento de onda da fonte de luz utilizada

    bem como, no apresentar efeitos txicos aos tecidos (ZANIN et al., 2002; ZANIN E

    GONALVES., 2003). Ao selecionar-se um determinado fotossensibilizador para uso

    em terapia fotodinmica, o espectro de absoro ptica, ou seja, os comprimentos de

    onda nos quais este fotossensibilizador capaz de absorver uma das primeiras

    caractersticas que devem ser analisadas, pois, conforme mencionado anteriormente,

    necessrio que o cromforo (qualquer substncia capaz de absorver luz) absorva a

    energia da fonte de luz para poder ento passar pelo processo de transio eletrnica que

    possibilita sua ao fotodinmica. Sendo assim, conhecendo-se a faixa do espectro

    eletromagntico na qual este composto absorve luz, possvel escolher a fonte de

    ativao adequada para obteno do efeito fotodinmico (RIBEIRO E GROTH, 2005).

    Allison et al. (2004) formularam as diretrizes e caractersticas ideais que o

    fotossensibilizador deve apresentar para maximizar o efeito fotodinmico da terapia.

    Devem apresentar eficincia fotoqumica, ser biologicamente estvel, provocar

  • 18

    toxicidade mnima aos tecidos, ser de fcil eliminao, no provocar mutagenicidade,

    ser de fcil ativao, administrao e ter ao localizada.

    Os corantes Azul de Toluidina (TBO) e Azul de Metileno (MB) associado ao

    laser de He-Ne apresentaram bons resultados na reduo microbiana de diversas

    culturas de bactrias e fungos demonstrando a importncia da ressonncia entre os

    corantes e o comprimento de onda () emitido pela fonte de luz (DOBSON E WILSON

    1992).

    A concentrao do corante outro fator de relevncia para o sucesso da

    reao fotodinmica. Devem ser utilizadas concentraes no txicas, ou seja, a

    concentrao escolhida no dever produzir danos ao alvo antes da ativao pela fonte

    de luz (toxicidade no escuro). As concentraes utilizadas variam de um

    fotossensibilizador para outro de acordo com as caractersticas qumicas de cada

    composto e de sua toxicidade. As concentraes tpicas utilizadas em PDT

    antimicrobiana so da ordem de g/ml (REYS, 2004).

    O tempo de pr-irradiao (TPI), que significa o tempo decorrido entre a

    aplicao do corante no alvo e sua ativao pela fonte de luz, varia de acordo com a

    interao desejada. A morfologia microbiana pode variar com as espcies levando as

    diferenas na localizao do fotossensibilizador. Alm disso, o tempo necessrio para a

    absoro do corante antes da iluminao pode ser importante (WAINWRIGHT, 1998).

    Para a PDT anti-neoplsica, o fotossensibilizador aplicado por via endovenosa e o

    tempo de pr-irradiao pode chegar a 48 horas. Nas aplicaes tpicas da PDT,

    principalmente a antimicrobiana, espera-se que o corante una-se ao microorganismo ou

    mesmo chegue a ultrapassar a barreira da membrana celular, localizando-se no

    citoplasma da clula num tempo de 1 a 10 minutos. Espera-se tambm que durante esse

    perodo, antes da ativao pela fonte de luz, que o fotossensibilizador no sofra

    degradao (RIBEIRO E GROTH, 2005).

    O fato de a fotossensibilizao ser localizada vantajoso em um aspecto:

    possvel matar bactrias e fungos presentes numa infeco mista. No entanto, as

    bactrias comensais e os tecidos do hospedeiro podem ser afetados. Algumas receitas

    teraputicas usadas para infeces orais (antibiticos sistmicos) eliminam tanto os

    microorganismos patognicos quanto os comensais indiscriminadamente rompendo o

    ecossistema natural da cavidade oral. Portanto, importante desenvolver um tratamento

    que possa especificamente atingir o microorganismo patognico sem provocar qualquer

    efeito colateral no tecido do hospedeiro (BHATTI et al., 2000). De acordo com Chan e

  • 19

    Lai (2003), a PDT aplicada clinicamente apenas em reas teciduais com doena

    porque a ao fotodinmica se d apenas onde o corante foi aplicado juntamente com a

    incidncia da irradiao luminosa, portanto, tendo o seu efeito bem localizado evitando-

    se desta maneira, as super dosagens e tambm a probabilidade dos efeitos colaterais

    associados administrao sistmica de agentes antimicrobianos.

    As primeiras fontes de energia utilizadas na PDT eram lmpadas

    convencionais emitindo luz no coerente e policromtica (luz branca) nas quais podiam

    ser acoplados filtros coloridos para obteno de determinados comprimentos de onda.

    As lmpadas convencionais apresentam um forte componente trmico associado e

    devido s caractersticas de luz no coerente, o clculo da dose era difcil tendo como

    maior vantagem o baixo custo das lmpadas. Com o advento dos lasers de diodo de

    baixa intensidade (anexo A), estes passaram a ser utilizados devido s suas prprias

    caractersticas como a monocromaticidade e a coerncia, facilitando a associao com

    um corante de banda de absoro ressonante ao comprimento de onda emitido pelo

    laser. Por emitirem em baixas intensidades de potncia, esses lasers no apresentam

    componente trmico mensurvel associado. A dose de radiao facilmente calculada,

    a rea de irradiao pode ser bem controlada focalizando o tratamento. A luz pode ser

    transmitida por fibra ptica e estas fibras podem receber adaptaes para melhor acessar

    a rea alvo, como microlentes e difusores (ACKROYD et al., 2001; GARCEZ, 2006;

    RIBEIRO E ZEZELL, 2004).

    Diversos tipos de lasers com diferentes meios ativos como o de argnio, de

    corantes, de vapores de metais, hlio-nenio e os de diodos semi-condutores foram

    utilizados ao longo dos anos. O importante na terapia fotodinmica a capacidade de

    excitar o fotossensibilizador em seu alvo com um foto-efeito mnimo sobre o tecido

    adjacente. Na PDT utilizado o laser e o LED em baixa intensidade emitindo no

    espectro do vermelho por serem bem absorvidos pelos tecidos biolgicos do que lasers

    em alta intensidade. A fotodestruio microbiana mais alcanada com potncias da

    ordem de W/cm2, do que por dezenas de watts. Vale destacar que os efeitos obtidos por

    esta terapia no so por incrementos de temperatura, e sim por reaes fotoqumicas

    entre fotossensibilizador, luz e o substrato. Mantendo-se a mesma dose (fluncia

    J/cm2), pode-se variar a densidade de potncia (W/cm2) ou o tempo de exposio (s), no

    entanto, uma potncia alta sobre um curto perodo de tempo (s) pode oferecer resultados

    diferentes em termos de destruio microbiana, do que com potncia baixa aplicado por

  • 20

    um perodo mais longo, embora a dosagem de luz (J/cm2) tenha sido a mesma em cada

    caso (KONIG et al., 2000; RIBEIRO E GROTH, 2005).

    Uma fonte de luz alternativa para a PDT so os LEDs (Anexo B), que

    tambm podem ser utilizados com sucesso como fontes de ativao em terapia

    fotodinmica, apresentando um baixo componente trmico e luz monocromtica, com

    banda estreita de comprimentos de onda (WALSH, 2003). LEDs so diodos especiais

    que emitem luz quando conectados a um circuito. A diferena bsica entre laser e LED

    que nestes predomina o mecanismo da emisso espontnea de radiao e nos lasers, a

    emisso estimulada. Dessa distino bsica decorrem as diferenas estruturais entre os

    dois dispositivos e que nem sempre so acentuadas, decorrendo diferenas funcionais

    que do aos lasers um desempenho geralmente superior, porm, mais caro. Os lasers

    precisam de grande quantidade de energia para sua gerao, enquanto os LEDs

    necessitam de pouca energia para a gerao de luz. Entre os dispositivos utilizados

    como fonte de luz, os LEDs so os mais simples. Apresentam um largo espectro de luz

    no coerente e apresentam uma divergncia maior, diferentemente dos lasers. Embora

    seja uma fonte de luz divergente e no coerente semelhante luz halgena, apresentam

    um espectro de emisso bem mais estreito, tendo um aproveitamento bem melhor que

    luz halgena (STHAL et al., 2000).

    Fatores tais como: interaes farmacolgicas, resistncia fngica e a no

    adeso do paciente ao tratamento das onicomicoses tambm so razes que podem

    explicar as possveis falhas teraputicas utilizando drogas antifngicas (SIDRIM E

    MOREIRA, 1999). Portanto, os estudos relacionados terapia fotodinmica devem ser

    incentivados devido extrema importncia do estabelecimento de novos mtodos que

    possam reduzir o nmero de pessoas acometidas por onicomicose, representando

    melhora sade pblica e qualidade de vida destes pacientes.

  • 2. OBJETIVOS

    1. Analisar a susceptibilidade in vitro do Trichophyton rubrum frente terapia

    fotodinmica (PDT).

    2. Comparar os resultados obtidos pela PDT utilizando-se laser em baixa

    intensidade emitindo no vermelho do espectro eletromagntico com

    comprimento de onda de 660nm, 100mW de potncia mdia de sada e tempo de

    3 minutos, com LED em baixa intensidade emitindo no vermelho com

    comprimento de onda de 630nm, 100mW de potncia mdia de sada e tempo de

    3 minutos.

    3. Avaliar, por meio de espectroscopia, se a banda de absoro do Azul de

    Toluidina (25g/mL), do fungo Trichophyton rubrum e da suspenso do fungo

    associada ao corante Azul de Toluidina so ressonantes com o comprimento de

    onda dos equipamentos utilizados na pesquisa.

    4. Calcular a rea e o volume de suspenso irradiada pelo laser e LED nos tubos de

    ensaio referentes aos grupos da PDT.

  • 3. REVISO DE LITERATURA

    3.1 Base cientfica da terapia fotodinmica

    Por ser ainda uma terapia no muito conhecida, oportuno esclarecer aos

    leitores sobre o seu complexo mecanismo de interao com os microorganismos. Deve-

    se ressaltar que a PDT moderna teve incio em 1970 para tratamento de neoplasias. A

    partir da dcada de 90 os estudos em bactrias comearam a se intensificar

    principalmente com Dobson e Wilson (1992) e mais recentemente trabalhos em fungos

    comearam a ser realizados.

    3.1.1 Histrico

    O uso da luz como agente teraputico vem desde a antiguidade. Ela foi usada

    no Egito, ndia e China para tratar doenas da pele, como psorase, vitiligo e o cncer

    com a exposio do paciente ao sol. Os gregos antigos empregavam a exposio total do

    corpo ao sol para a restaurao da sade, terapia essa denominada pelo filsofo grego

    Herdoto como Helioterapia (ACKROYD et al., 2001).

    As primeiras experincias com a terapia fotodinmica datam de

    aproximadamente, 100 anos atrs, sendo o primeiro artigo cientifico publicado por

    Marcacci em 1888, mas ainda com poucos dados de observao. J no ano de 1900,

    Oscar Raab e Von Tappeiner estudaram a ao do corante acridina sobre culturas de

    paramcios. Eles verificaram o aumento da toxicidade deste corante laranja no

    paramcio provocado pelo aumento da intensidade luminosa durante uma tempestade de

    raios, levando-os a concluir que as condies de luz no ambiente durante os

    experimentos poderiam alterar o resultado das pesquisas. Eles postularam que este

    efeito era causado pela transferncia da energia luminosa dos raios para a substncia

    qumica (corante), similar ao que ocorre nas plantas com a absoro da luz pela clorofila

    (ACKROYD et al., 2001; SCHABERLE, 2002).

    O primeiro relato da administrao sistmica de fotossensibilizadores em

    humanos foi realizado em 1900, por Prime, um neurologista francs, que usou

    oralmente a eosina utilizada no tratamento de epilepsia induzindo dermatite nas reas

  • 23

    da pele expostas ao sol. Esta descoberta levou primeira aplicao tpica da eosina com

    exposio luz branca para tratar tumores cutneos, realizada por Von Tappeiner e o

    dermatologista Jesionek. O prmio Nobel de 1903 foi designado ao fsico dinamarqus

    Niels Finsen, devido ao seu trabalho de fototerapia. Finsen descobriu que o tratamento

    com luz poderia controlar manifestaes de tuberculose cutnea, uma doena muito

    comum na ocasio. Obteve, tambm, sucesso no tratamento da varola, usando a luz

    vermelha, o que preveniu a supurao das pstulas (ACKROYD et al., 2001; ALLISON

    et al., 2004).

    Em 1907, Von Tappeiner juntamente com Jodlbauer, demonstraram a

    necessidade do oxignio nas reaes fotossensibilizantes, introduzindo o termo ao

    fotodinmica para descrever este fenmeno (ACKROYD et al., 2001). Tambm, na

    virada do sculo XX, aps dcadas de experimentaes sobre os efeitos da pigmentao

    dos corantes de anilina sobre clulas animais e microbianas, Paul Ehrlich formulou o

    princpio da seletividade, trabalho no qual estabeleceu os fundamentos da quimioterapia

    moderna (WAINWRIGHT, 1998).

    Estes estudos continuaram a partir da metade do sculo XX quando

    Schwartz, Winkelman e Lipson publicaram uma srie de artigos demonstrando que

    fotossensibilizadores derivados de hematoporfirinas (HPD) poderiam ser usados para

    detectar tumores por fluorescncia. A PDT moderna iniciou em meados de 1970 tendo

    como grande nome o cientista Thomas J. Dougherty, que descobriu o potencial das

    hematoporfirinas para tratamento de neoplasias (SCHABERLE, 2002).

    Em 1972, Lancet e Diamond tentaram destruir clulas tumorais com

    associao de hematoporfirinas com o raio X, entretanto, o uso do raio X como fonte de

    energia para ativao no foi capaz de provocar nenhum efeito deletrio sobre as clulas

    tumorais, demonstrando que a fonte de luz deve ser ressonante com a absoro do

    corante (ACKROYD et al., 2001).

    Em 1976, Weishaupt e colaboradores postularam que o oxignio singleto,

    gerado a partir da transferncia de energia do agente fototeraputico no estado tripleto

    excitado para o oxignio molecular no estado fundamental, era o agente citotxico

    responsvel pela desativao de clulas tumorais. Embora a PDT tenha sido

    originalmente desenvolvida visando a terapia do cncer em suas diversas formas claro

    seu grande potencial no que concerne a outras molstias. Nesse contexto incluem-se a

    psorase, onde se tem atingido resultados bastante promissores, degenerao macular da

    retina, condies autoimunes, arteriosclerose, remoo de verrugas na laringe,

  • 24

    tratamento de micoses fungides e destruio de bactrias resistentes a tratamentos

    tradicionais base de antibiticos (MACHADO, 2000).

    Nas ltimas dcadas, diversos autores se voltaram para o primeiro estudo de

    Raab, investigando a eliminao de microorganismos pela terapia fotodinmica. A PDT

    com finalidade antimicrobiana encontra-se bem estabelecida na literatura, com sua ao

    sobre diferentes bactrias e vrus, principalmente em casos de infeces localizadas

    (RIBEIRO E GROTH, 2005).

    3.1.2 Mecanismos de interao

    A PDT representa um complexo sistema de fototerapia que requer a presena

    de trs fatores que interagem concomitantemente: corante (agente fotossensibilizador),

    uma fonte de luz e o oxignio. Isoladamente, nem o fotossensibilizador, nem a luz, tem

    a capacidade de produzir efeito deletrio ao sistema biolgico alvo. O mecanismo de

    ao se d por dois tipos de reaes fsico-qumicas: Reao do tipo I e reao do tipo II

    (MELLO et al., 2001; ALLISON et al., 2004).

    Reao do tipo I:

    Nesta reao, o fotossensibilizador sofre degradao, levando-o a uma

    transformao qumica, que resulta na formao de espcies reativas de oxignio (EROs

    Perxido de hidrognio, ons hidroxila, radicais hidroxila, nion superxido entre

    outros), que so txicas ao microorganismo.

    Segundo Konan et al 2002, o efeito fotodinmico tem seu incio quando a

    molcula do corante absorve a luz irradiada saindo do seu estado de repouso

    (fundamental), assumindo um estado mais energtico, porm menos estvel chamado

    estado singleto. Devido a grande instabilidade deste nvel de energia, a molcula tem

    um tempo de vida muito curto e tende a voltar para um nvel de energia mais baixo ou

    mesmo retornando ao seu estado de repouso (reao do tipo I). Nesta transio, o

    excesso de energia pode ser transferido ao substrato por meio de fluorescncia

    (espontneo), onde o fotossensibilizador emite energia em forma de ftons. Pode-se

    passar tambm a um nvel intermedirio (reao do tipo II), chamado estado tripleto,

    situado entre o estado de repouso e o estado singleto, apresentando um tempo de vida

    um pouco mais longo (fosforecncia) (FIG. 1).

  • 25

    FIGURA 3.1 - Diagrama de Jablonski modificado de Wainwright.

    FONTE - RIBEIRO E ZEZELL, 2004.

    Para fotossensibilizadores, importante que o estado tripleto seja bem

    povoado (presena de muitos eltrons/ftons) e relativamente de longa durao. Se isto

    ocorrer, o corante excitado tem tempo de reagir com o seu ambiente (por transferncia

    eletrnica/reaes redox) ou transferir sua energia de excitao a uma molcula de

    oxignio do meio e produzir o altamente reativo oxignio singleto. Se estas reaes so

    iniciadas no meio biolgico, por exemplo, dentro de um tumor ou na parede celular

    bacteriana e fngica provocar efeito deletrio celular e biolgico (REYS, 2004).

    Alguns estudos demonstram que a maioria das bactrias e fungos, apresentam uma

    membrana celular / parede especial e resistente terapia fotodinmica. Esforos tm

    sido feitos para se desenvolver fotossensibilizadores que aumentem a permeabilidade da

    membrana celular microbiana, facilitando sua lise (PFITZNER et al., 2004).

    De acordo com Meisel e Kocher (2005), o mecanismo da terapia

    fotodinmica obedece a trs princpios fotobiolgicos:

    1. A lei GROTTHUS - DRAPER: a luz usada deve ter um comprimento de onda

    adequado (ressonante) ao fotossensibilizador, uma vez que apenas a luz

    absorvida pode desencadear uma reao fotoqumica.

    2. A lei STARK -_EINSTEIN : cada molcula do fotossensibilizador envolvida na

    reao induzida pela luz, absorve um quantum da irradiao eletromagntica

    emitida.

  • 26

    3. A lei de BUNSEN ROSCOE: o efeito fotoqumico uma funo do produto da

    intensidade da luz e do tempo de exposio (dosagem da luz).

    Segundo Ribeiro e Zezell (2004) a eficcia da terapia fotodinmica , essencialmente,

    dependente de trs fatores:

    1. Biolgicos

    Seletividade e reteno do fotossensibilizador na rea alvo.

    2. Fsicos

    Intensidade da radiao eletromagntica que chega regio de tratamento

    (propriedades pticas do tecido).

    Eficincia da absoro dos ftons ativadores.

    Eficincia da transferncia de energia de excitao da molcula

    fotossensibilizadora para o substrato.

    3. Qumicos

    Efeito oxidante na molcula.

    Tempos de vida razoavelmente longo dos estados excitados para permitir a

    transferncia de energia.

    3.1.3 Efeitos fototxicos da PDT

    A morte da clula bacteriana induzida pela ao fotodinmica no nvel

    molecular , em alguns casos, bem estabelecida. A ao fototxica provocada pela

    reao do tipo I com a gua em meio microbiano pode elevar os radicais de hidroxila

    (HO), que podem tambm reagir ou combinar com as biomolculas para proporcionar a

    formao de perxido de hidrognio (H2O2) in situ com resultados citotxicos, levando

    por exemplo, a remoo do hidrognio da membrana citoplasmtica bacteriana. Pode

    causar tambm, possvel inativao das enzimas das membranas e dos receptores. Na

    reao do tipo II, o fotossensibilizador em estado tripleto transfere sua energia para o

    oxignio molecular (do meio), formando oxignio singleto que reage, rapidamente, com

    os constituintes celulares (parede celular, os cidos nuclicos, os peptdeos, dentre

    outros). A curta meia vida do oxignio singleto mais uma vez assegura a reao

    localizada. Como na reao do tipo I discutida acima, o oxignio singleto tambm

    reagir com as molculas envolvidas na manuteno e estrutura da parede da

  • 27

    clula/membrana, tais como os fosfolipdeos, os peptdeos e os esteris

    (WAINWRIGHT, 1998), conforme QUA. 3.1).

    QUADRO 3.1

    Caminhos fototxicos da PDT

    Lugar

    de ao Ao Resultado Consequncia

    Evento

    Citotxico

    gua Reduo de

    H+

    Formao de radical

    hidroxila (HO)

    Formao de

    perxido de

    hidrognio,

    superxido (O2)

    Posterior

    processos

    oxidativos

    Parede

    celular/membrana

    lipdios

    insaturados/

    esteris

    Peroxidao Peroxidao Formao de

    hidroperxido

    Aumentada

    permeabilidade a

    ons (passagem

    de Na+/K+)

    Peptdeos Reduo de

    hidrognio

    Ligao cruzada nos

    peptdeos

    Inativao de

    enzimas

    Perda da

    facilidade de

    reparao; lise

    Camada de

    protena viral

    Oxidao de

    resduos de

    aminocidos

    Degradao de

    protenas

    Perda de

    infectividade

    viral

    Cadeia respiratria Reaes

    redox

    Inibio da

    respirao

    Enzimas

    citoplasmticas/en

    zimas virais

    Oxidao ou

    ligaes

    cruzadas

    Inibio do corpo

    de ribossomos;

    Inibio de

    replicao/infecti

    vidade

    Resduos de cidos

    nuclicos

    (tipicamente

    guanosina)

    Oxidao da

    base ou

    acar

    8-hidroxiguanosina

    Degradao de

    nucleotdeos;

    Degradao de

    acar/quebra

    Substituio de

    base; Quebra de

    fitas; Mutao;

    Inibio de

    replicao

    FONTE - WAINWRIGHT, 1998; Adaptado por Ribeiro e Zezell, 2004.

  • 28

    3.1.4 Fotossensibilizadores

    Entre as caractersticas importantes do fotossensibilizador esto sua banda de

    absoro de energia e a intensidade de absoro, bem como sua eficincia na produo

    de espcies reativas de oxignio. Tem sido enfatizada tambm a importncia do meio

    em que o fotossensibilizador empregado, bem como as diferentes formulaes

    possveis. A aplicao tpica, principalmente para o tratamento de infeces

    superficiais, tem forte apelo por se tratar de uma terapia no invasiva, sem complicaes

    sistmicas, porm, a estabilidade do agente fotossensibilizador deve ser mantida at a

    sua ativao pela fonte de luz, bem como a penetrao atravs da pele e mucosa deve

    ocorrer de forma eficiente. Alm destes fatores, de grande importncia a remoo do

    fotossensibilizador do local de ao aps a sua aplicao. No caso da odontologia e

    infeces de pele, o manchamento da superfcie torna invivel o uso de certos agentes

    corantes. O corante azul (TBO) do grupo das fenotiazinas utilizado neste estudo, em

    baixas concentraes no produz ao citotxica e a dose necessria para a morte

    bacteriana menor que a dose necessria para provocar danos clula do hospedeiro

    (queratincitos e fibroblastos) (WAINWRIGHT, 1998). Os determinantes da eficcia

    fototeraputica so o alto coeficiente de absoro do corante, o tempo de pr-irradiao,

    a concentrao do corante no alvo e o fluxo de energia da luz incidente. Os corantes

    azuis (FIG 2) tm uma especificidade restrita, podendo provocar danos s protenas

    plasmticas. Candida albicans, o agente causador da candidase, em sua forma de

    levedura ou hifa, tambm sensvel a PDT com os corantes azuis. Os corantes azuis

    absorvem luz entre = 620 nm a 700 nm, conforme QUA. 3.2. Sua principal aplicao

    na PDT antimicrobiana (RIBEIRO E GROTH, 2005; PRATES et al., 2006).

    Dobson e Wilson (1992), Wilson (1993), Sarkar e Wilson (1993) utilizaram

    os fotossensibilizadores Azul de Metileno (MB) e Azul de Toluidina (TBO), associado

    ao laser He-Ne (632,8 nm) com tempos de 30 e 80 e com diferentes concentraes de

    TBO e MB. Foram testadas as bactrias presentes em amostras de placa subgengival da

    cavidade oral, formada pelas espcies S. sanguis, P. gingivalis, F. nucleatum e A.

    actinomycetemcomitans em placas de Petri. Os autores concluram que os corantes

    derivados de fenotiazinas (MB TBO) foram eficientes em eliminar as quatro espcies

    bacterianas. Os autores sugerem que a tcnica de terapia fotodinmica pode ser efetiva

    em eliminar bactrias patognicas encontradas na inflamao gengival.

  • 29

    FIGURA 3.2 - Estrutura molecular do Azul de metileno e do Azul de toluidina.

    FONTE - WAINWRIGHT, 1998.

    QUADRO 3.2

    Principais fotossensibilizadores utilizados em PDT com suas respectivas bandas de

    absoro.

    Fotossensibilizador Banda de Absoro

    Derivados da Hematoporfirina (HpD) 620 650 nm

    Ftalocianinas 660 700 nm

    Fenotiazinas (TBO e MB) 620 700 nm

    Fitoterpicos (Azuleno) 550 700 nm

    Verde Malaquita 400 700 nm

    Soukos et al. (1996), estudaram in vitro, a ao fotodinmica da

    irradiao da luz vermelha de um laser associada ao corante Azul de Toluidina (TBO)

    sobre queratincitos, fibroblastos e o Streptococcus sanguis. Os autores concluram que

    o uso de baixa concentrao do corante TBO e da baixa densidade de energia do laser,

    provocava somente a morte da bactria no afetando as clulas orais humanas.

    Wilson et al. (1995), Zampieri et al. (2003) e Matevski et al. (2003), em

    estudos in vitro e in vivo obtiveram xito na reduo das bactrias, Streptococcus

    mitis, Streptococcus sanguis, Porphyromonas gingivalis e Actinomices utilizando um

    laser de He-Ne ( = 632,8 nm), dois de diodo semi-condutor AsGaAl (

    = 680 nm e

    670 nm) e uma fonte de luz convencional com lmpada de xennio associada a filtros

    na regio do vermelho e com cinco diferentes densidades de energia: 1,31 J/cm2,

    2,2 J/cm2, 3 J/cm2, 6 J/cm2 e 9 J/cm2. Foram coradas pelo Azul de Toluidina na

    concentrao de 75 g/mL e 50 g/mL. O percentual maior de morte bacteriana foi

  • 30

    obtido utilizando-se o laser de He-Ne para a espcie S. sanguis e Porphyromonas

    gingivalis alcanado com a fluncia de 3 J/cm2, enquanto que para a espcie S. mitis e

    Actinomices foi obtida com a fluncia de 6 J/cm2. Isso provavelmente ocorreu devido ao

    comprimento de onda do laser de He-Ne ser coincidente com o pico mximo de

    absoro de energia do corante TBO, que em torno de 632 nm.

    Rovaldi et al. (2000) e Lauro et al. (2002) conjugaram a porfirina com uma

    substncia fotoreativa catinica, chamada pentalisina (polilisina), o que facilitou a

    aglutinao desse conjugado-fotossensibilizador membrana celular bacteriana gram-

    negativa, aumentando o espectro de atividade contra essas bactrias, mantendo um forte

    efeito destruidor. Nesse estudo in vitro, foram testados o fotossensibilizador puro

    (porfirina), e o conjugado pentalysina-porfirina. Enquanto a porfirina pura apresentou

    alguma atividade apenas contra bactrias gram-positivas e tambm contra clulas

    eucariticas, a molcula conjugada pentalysina-porfirina destruiu consistentemente

    tanto as gram-negativas e gram-positivas, demonstando pouca atividade contra clulas

    eucariticas. Apenas 20% do corante aglutinado foram preservados na superfcie das

    clulas sobreviventes, demonstrando aparente falta de induo de resistncia PDT.

    Walsh (1997) e Walsh (2003) relataram que a PDT mostrou-se eficaz na

    destruio de bactrias em placas bacterianas orais, que so resistentes ao de agentes

    antimicrobianos, portanto, tendo sua ao eficaz em bactrias gram-positivas e gram-

    negativas, alm de ser ativa contra fungos e vrus. Os autores afirmam tambm que a

    ao fotodinmica uma terapia mais segura e sem efeitos colaterais, devido s espcies

    de oxignio reativas residuais serem rapidamente conduzidas pela catalase enzimtica,

    presente em todos os tecidos e na circulao perifrica. Concluram tambm que a PDT

    no provoca aumento de temperatura mensurvel.

    3.1.5 Efeitos fungicidas da terapia fotodinmica

    Jackson et al. (1999) estudaram trs parmetros: a concentrao do

    fotossensibilizador, a dose de luz do laser e o tempo de pr-irradiao. O

    fotossensibilizador utilizado foi o Azul de Toluidina (TBO), testado nas concentraes

    de 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 g/mL. O laser utilizado foi o de Hlio-Neonio (He-

    Ne) com potncia de 35 mW e rea do spot com 2 mm2 . Ambas as formas de Candida

    albicans (pseudohifas e leveduras) foram expostas a 4,2; 10,5; 21 e 42 J/cm2. Antes da

    irradiao, ambos os morfotipos foram incubados durante vrios perodos de tempo

  • 31

    (TPI). O resultado com relao concentrao do TBO, a mais eficaz para a forma de

    levedura foi a 25 g/mL, e para a forma de hifa foi a de 12,5 g/mL. O tempo de pr-

    irradiao considerado timo para as leveduras foi de 5 minutos, enquanto que a morte

    das hifas no foi afetada pelo TPI. Com relao fluncia, verificou-se que com o

    aumento da dosagem de energia da luz aumentava-se o ndice de morte dos dois

    morfotipos, sendo a fluncia de 42 J/cm2 a mais eficaz. Os resultados deste estudo

    indicam que ambas as formas de Candida albicans so susceptveis a terapia

    fotodinmica, sugerindo que essa abordagem poder ser til na eliminao dos fungos

    das leses in vivo.

    Friedberg et al (2001) utilizaram o fotosensibilizador Green 2W sobre

    isolados de Aspergillus fumigatus, fungo presente no ar, mas que pode produzir graves

    infeces em pacientes imunossuprimidos. Observaram uma atividade fungicida ao

    utilizarem 5 W de luz com = 630 nm, fluncia varivel (5 440 J/ cm2), por um

    intervalo de 12 h. O Green 2W demonstrou ser um agente bem tolerado, aps aplicao

    intravenosa.

    Zeina et al (2001) observaram que isolados de Candida albicans foram

    susceptveis PDT in vitro utilizando o azul de metileno, apesar de apresentarem

    uma boa resistncia ao tratamento. Foi utilizada uma fonte de luz policromtica

    produzida por uma lmpada de 250 W com filtros para obter = 400 700nm e

    intensidade de 1,6 4,2 W/ cm2.

    Teichert et al (2002) realizaram um estudo in vivo num modelo animal,

    que foram induzidos imunodeficincia e inoculados com o fungo da Candida albicans

    com o intuito de reproduzirem a candidase oral relacionada Aids em seres humanos.

    Foi utilizado como fotossensibilizador o Azul de Metileno (MB) nas seguintes

    concentraes: 250, 275, 300, 350, 400, 450 e 500 g/ml. O tempo de pr-irradiao

    (TPI) foi de 10 minutos. A fonte de ativao empregada foi um laser diodo com 664 nm

    de comprimento de onda, potncia de 400 mW e dose de 275 J/cm2 por um difusor

    cilndrico com 1 cm de dimetro, durante 687,5s. Aps a PDT, as amostras dos animais

    foram coletadas para determinar as unidades formadoras de colnias (UFC) e os animais

    sacrificados para avaliao histopatolgica. Os resultados indicaram um efeito letal

    dependente da concentrao do fotossensibilizador, que foi maior medida que

    aumentava a concentrao do corante MB, sendo o ndice 100% letal a 450 e 500 g/ml.

    Os autores concluram que a PDT uma alternativa em potencial de tratamento terapia

  • 32

    com drogas anti-fngicas tradicionais (fluconazol, cetoconazol) que esto tornando-se

    ineficazes devido a crescente resistncia adquirida pelos fungos.

    Bliss et al (2004) avaliaram in vitro a ao fotodinmica sobre trs

    espcies de Candida: C. albicans, C. krusei e C. glabrata. Os autores utilizaram um

    derivado da hematoporfirina, o Photofrin como fotossensibilizador nas seguintes

    concentraes: 0,1; 0,3; 1; 3 e 10 g/ml, ativada por uma luz azul com 450 nm de

    comprimento de onda, 15 mW de potncia distribuindo 9 J/cm2 de densidade de energia.

    O percentual de morte foi crescente de acordo com o aumento da concentrao do

    fotossensibilizador observado nas espcies C. albicans e C. krusei respectivamente. J a

    espcie C. glabrata foi resistente PDT, provavelmente, devido baixa adeso do

    Photofrin sua parede celular. Os resultados indicam que a PDT poder ser uma

    abordagem alternativa para as atuais modalidades teraputicas anti-candida no

    estabelecimento da resistncia aos anti-fngicos convencionais.

    Smijs et al (2004) utilizaram uma luz policromtica produzida por uma

    lmpada de 500W - 230 V e filtros, capazes de absorver o infravermelho e obter a parte

    vermelha do espectro, para testar amostras de porfirinas (Sylsens B, DPmme e QDD)

    em isolados de Trichophyton rubrum in vitro. Utilizaram um tempo de irradiao por

    uma hora a 30 W/ cm2. A PDT foi realizada em hifas e microcondios de T. rubrum. A

    importncia dos experimentos utilizando microcondias devido sua maior resistncia

    ao tratamento que as hifas. Utilizando luz vermelha com o fotosensibilizador Sylsens B

    foi obtida completa inibio do crescimento a partir de uma concentrao de 10 M.

    Para o DPmme houve inibio do crescimento a partir de uma concentrao de 40 M.

    O QDD apresentou-se fungisttico em todas as concentraes testadas (0 50 M).

    Calvazara-Pinton et al (2004a) utilizaram o cido aminolevulinico-5 (ALA)

    como agente fotossensibilizador em creme nas leses cutneas de nove pacientes com

    evidncia clinica e microbiolgica de micose interdigital dos ps. Aps quatro horas

    (TPI), as leses foram irradiadas com 75 J/cm de luz vermelha aplicada com um

    aparato Penta-PTL (Teclas, Sorengo, Sua), consistindo de uma lmpada de halgeno

    (Osram 250 V-Osram, Munique, Alemanha) equipada com um filtro vermelho (Filtro

    R61, Teclas) e um dispositivo de fibra ptica. As leses interdigitais de um dos ps foi

    tratada com PDT e a do outro p serviram de controle (tratadas apenas com luz ou

    apenas com ALA). Quatro semanas aps o ltimo tratamento, os pacientes passaram

    por um acompanhamento clnico e um exame laboratorial. A recuperao clnica e

  • 33

    microbiolgica foi observada em seis dos nove pacientes. Porm, aps 4 semanas, foi

    observada recorrncia em quatro pacientes. No total, a tolerncia foi sempre boa.

    Durante e logo aps as exposies, foram observados eritema localizado e edema. Sete

    pacientes experimentaram um desconforto brando (ameno) e dois pacientes

    apresentaram dor que foi controlada com um fracionamento do tempo de irradiao e a

    reduo dela. Foi observada descamao aps 3-5 dias. Nas condies empregadas

    neste estudo, a ALA-PDT apresentou bons efeitos teraputicos sobre micoses

    interdigitais dos ps. Porm, as recorrncias foram rpidas. Em condies ambientais

    in vivo, exemplo, a temperatura, umidade e pH da pele interdigital, podem induzir

    uma fraca captao celular de ALA e a uma biossntese deficiente da fotosensibilizao

    da protoporfirina IX.

    Szpringer et al (2004) enfoca a terapia fotodinmica (PDT) como uma nova

    modalidade de tratamento para uma ampla variedade de malignidades e displasias pr-

    malignas, assim como para algumas indicaes no cancerosas. A reao teraputica a

    PDT obtida por meio da ativao de fotossensibilizador no-txico localizado dentro

    do tecido neoplsico, usando uma luz visvel focalizada numa banda de absoro

    apropriada da molcula fotossensibilizadora. Isto produz radical livre citotxico como

    oxigno singleto, que resulta numa foto-oxidao local, danos celulares e destruio das

    clulas do tumor. A administrao sistmica de fotossensibilizadores foi usada com

    exposio da luz endoscpica para tratar uma variedade de malignidades internas. A

    distribuio de uma droga tpica usada no tratamento de doenas cutneas. A

    distribuio seletiva da fotossensibilizao no tecido alvo o fundamento do processo

    da PDT. A fotossensibilizao especfica do tecido e a conservao do tecido normal

    resultam numa boa cicatrizao e em bons resultados estticos. A PDT pode ser usada

    para o tratamento de vrias leses cutneas como: micoses fngicas, eritroplasia de

    Queyrat, Sndrome de Gorin, queratose actnica, tumores gastrointestinais dentre outras,

    assim como indicaes no oncolgicas como: pele, lquen plano, psorase, vitiligo e

    verrugas.

    Segundo Calvazara-Pinton P. G et al (2004b) at os dias de hoje existem

    poucas publicaes com relao aplicao da PDT em fungos, provavelmente devido

    ao fato das pesquisas serem direcionadas principalmente para a desinfeco sangunea e

    esses patgenos apresentarem um baixo risco de transmisso por transfuso. No entanto,

    os achados preliminares demonstraram que os fungos podem ser efetivamente

    sensibilizados in vitro administrando-se fotossensibilizadores que pertencem

  • 34

    principalmente a quatro grupos qumicos: corantes base de fenotiazinas, porfirinas e

    ftalocianinas, assim como cido aminolevulnico que, enquanto no um

    fotossensibilizador propriamente dito, efetivamente metabolizado dentro da

    protoporfirina IX. Alm da eficcia, a PDT demonstrou outros benefcios. Primeiro, os

    sensibilizadores usados so altamente seletivos demonstrando que alguns fungos podem

    ser mortos em combinaes de droga e dosagens de luz muito menores do que as

    necessrias para o efeito semelhante sobre os queratincitos. Esses fotossensibilizadores

    investigados no apresentaram atividade mutagnica e o risco da seleo de cepas

    fngicas resistentes droga nunca foi relatado. Deve-se, portanto, incentivar estudos de

    PDT em micoses cutneas por apresentarem a vantagem de ser altamente seletiva

    evitando a ocorrncia de cepas resistentes droga.

    Kamp et al (2005) avaliaram in vitro se o fungo Trichophyton rubrum

    causador da onicomicose pode ser efetivamente inativado pela terapia fotodinmica, j

    que pela terapia convencional com antimicticos tradicionais o fungo altamente

    persistente. Os autores inocularam o T. Rubrum em meio de cultura lquido na presena

    de 0 (controle); 0,1; 1; 5; 10 e 100 M de ALA (cido-5 aminolevulnico). Somente

    entre o 10 e o 14 dia aps o incio do estudo, o Trichophyton rubrum conseguiu

    metabolizar o ALA para a protoporfirina IX (PpIX), devido ao crescimento lento deste

    fungo in vitro. Aps esse tempo (TPI), as placas foram irradiadas por uma lmpada

    halgena no filtrada emitindo luz branca com uma intensidade de 36,8 W/cm2, atravs

    de fibra ptica distante 5 cm. As placas com T. rubrum foram expostas durante 60

    minutos correspondendo a 128 J/cm2 de densidade de energia. A PDT reduziu tanto o

    nmero quanto o dimetro das colnias em aproximadamente 50%, comparada ao

    controle correspondente, sendo verificado nas concentraes de 1 a 10 M ficando o

    melhor resultado para a concentrao de 10 M. O ALA na concentrao mais forte

    (100 M) levou a um ndice de crescimento significativamente reduzido e a ausncia da

    formao de PpIX devido s condies altamente cidas. Os autores concluram que

    apesar do ndice de inativao do fungo no ter alcanado 100%, a PDT com ALA deve

    ser uma abordagem promissora na reduo da colonizao de T. rubrum em

    onicomicoses.

    Jori G (2006) salienta a importncia do uso dos fotossensibilizadores que

    absorvem luz como agentes antimicrobinanos fotodinmicos. Devem possuir

    caractersticas favorveis dentre elas: (a) o amplo espectro de ao antimicrobiana em

  • 35

    bactrias gram-negativas, fungos, e parasitas devendo seguir um protocolo foto-

    teraputico e condies favorveis de irradiao; (b) as porfirinas, ftalocianinas e as

    fenotiazinas no devem exibir toxicidade no escuro em dosagens ativadas

    fotoquimicamente; (c) a morte da clula microbiana uma conseqncia da foto-

    destruio da membrana atravs de um processo tpico de mltiplos alvos que minimiza

    o risco tanto do incio dos processos mutagnicos quanto da seleo de clulas

    fotorresistentes; (d) esses fotossensibilizadores so considerados eficientes enquanto

    no forem observados patgenos microbianos fotorresistentes; (e) possvel a

    combinao da terapia fotodinmica com a antibitica. Eles concluem que a terapia

    fotodinmica (PDT) est se tornando, com o passar dos tempos, um tratamento

    alternativo eficiente para as infeces microbianas, um problema atualmente agravado

    pela crescente difuso das cepas microbianas resistentes a antibiticos.

    Souza et al. (2006) avaliaram os efeitos da irradiao laser em baixa

    intensidade com comprimento de onda de 685nm, 28 J/cm2 associado com

    fotossensibilizadores na viabilidade de diferentes espcies de Candida. Suspenses de

    Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida krusei e Candida tropicalis, contendo

    106 clulas viveis por mililitros foram obtidas. De cada espcie, 10 amostras da

    suspenso de clula foram irradiadas na presena de Azul de Metileno (0,1 mg/mL), 10

    amostras foram somente tratadas com azul de Metileno, 10 amostras foram irradiadas

    com laser na ausncia do Azul de Metileno. De cada amostra, uma srie de diluies

    com 10-2 e 10-3 foram obtidas e concentraes de 0,1 mL de cada diluio foram

    plaqueadas em duplicata em agar Sabouraud dextrose. A irradiao com laser na

    presena de Azul de Metileno reduziu o nmero de UFC/mL em 88.6% para C.

    albicans, 84.8% para C. dubliniensis, 91.6% para C. krusei e 82.3% para C. tropicalis.

    Pode-se concluir que a fotoativao do Azul de Metileno pelo laser com 685nm

    apresentou um efeito fungicida nas espcies de Candida estudadas.

  • 36

    3.2 Dermatfitos e dermatofitose

    Dermatfitos so um grupo de fungos relacionados capazes de invadirem

    tecidos queratinizados (pele, plos e unhas) de homens e animais, para produzir

    infeco (dermatofitose). Esta infeco geralmente cutnea e restrita ao extrato crneo

    no vascularizado, devido inabilidade desses fungos de penetrar em tecidos mais

    profundos e rgos de um hospedeiro imunocompetente (WEITZMAN E

    SUMMERBELL, 1995).

    Apresentam uma predileo ecolgica, no que diz respeito sua adaptao

    ao meio ambiente. Assim, os dermatfitos podem ser divididos em trs grupos, em

    relao ao seu habitat: geoflicos, zooflicos e antropoflicos. Os geoflicos apresentam

    como caracterstica primria a habilidade de manter sua viabilidade em solos

    geralmente ricos em resduos de queratina e podem causar infeces em humanos e

    animais. Os zooflicos so adaptados s condies de parasitismo em espcies de

    animais (caninos, felinos, bovinos, eqinos, sunos, aves, dentre outros) mas,

    ocasionalmente causam infeces humanas. Muitas infeces por dermatfitos

    zooflicos so adquiridas indiretamente de materiais ceratinosos provenientes de

    animais em decomposio no solo. Os antropoflicos esto primariamente associados a

    infeces humanas e raramente infectam animais. Os grupos dos dermatfitos zooflicos

    e geoflicos, em geral, tendem a provocar, no homem, a formao de leses com

    caractersticas inflamatrias mais pronunciadas do que aquelas causadas por

    dermatfitos antropoflicos (WEITZMAN E SUMMERBELL, 1995; SIDRIM E

    MOREIRA, 1999).

    Os agentes etiolgicos das dermatofitoses esto classificados em trs

    gneros: Trichophyton spp. Microsporum spp. e Epidermophyton spp (WEITZMAN E

    SUMMERBELL, 1995).

    Quanto distribuio geogrfica, os dermatfitos so ubiquitrios, no

    havendo rea ou grupo de pessoas que se encontrem isoladas destes fungos (COSTA et

    al., 2002).

  • 37

    3.2.1 Trichophyton rubrum

    De crescimento intermedirio, as colnias do T. rubrum, em gar Sabouraud,

    mostram caractersticas de maturao de 12 a 16 dias aps a semeadura primria. Estas

    colnias caracterizam-se por uma textura algodonosa com pregas radias, formando uma

    pequena salincia no centro. Essa morfologia, que com freqncia se confunde com as

    colnias de T. tonsurans apresenta ainda tonalidade branca que com o passar do tempo,

    pode ficar avermelhada. Esta colorao pode ser observada tambm no bordo da colnia

    (SIDRIM E MOREIRA, 1999, LACAZ et al., 2002).

    A microscopia ptica revela uma grande quantidade de microcondios

    clavados com 2-3 m por 3-5m de tamanho, dispostos ao longo das hifas ou em

    cachos. Os macrocondios, quando presentes, podem apresentar - se como clavas

    alongadas, quase com um aspecto cilndrico e com duas a nove septaes (LACAZ et

    al., 2002).

    Na maioria dos laboratrios de rotina, a simples evidncia de algumas

    estruturas no diagnstico definitivo para micologistas mais experientes, necessitando-

    se nessas situaes lanar mo de testes complementares para o correto diagnstico

    (SIDRIM E MOREIRA, 1999).

    3.2.2 Manifestaes clnicas

    Tradicionalmente, as dermatofitoses ou tineas, so denominadas de acordo

    com sua localizao anatmica. Exemplo: Tinea pedis corresponde dermatofitose dos

    ps (WEITZMAN E SUMMERBELL, 1995). J a corrente francesa classifica como

    tineas as leses dermatofticas que acometem o couro cabeludo e/ ou regio de barba e

    bigode, como epidermoftides as leses dermatofticas encontradas na regio de pele

    glabra, como onicomicoses dermatofticas as leses encontradas nas unhas e

    dermatofitoses subcutneas e profundas s leses que acometem o espao celular

    subcutneo ou outros rgos profundos, sendo geralmente relacionadas a pacientes

    imunocomprometidos. Os aspectos clnicos das leses dermatofticas so bastante

    variados e resultam da combinao de destruio da queratina associada a uma resposta

    inflamatria, mais ou menos intensa, na dependncia do binmio microrganismo/

    hospedeiro. A variao clnica da leso, portanto, est correlacionada a trs fatores: a

  • 38

    espcie de dermatfito envolvida no processo infeccioso, o stio anatmico acometido e

    o status imunolgico do hospedeiro (SIDRIM E MOREIRA, 1999).

    3.2.3 Onicomicose

    Esta infeco a doena ungueal mais comumente encontrada, sendo

    responsvel por mais de 50% dos acometimentos das unhas.

    A etiologia destas micoses apresenta uma grande variabilidade nas diferentes

    regies do Brasil. As constantes correntes migratrias que ocorrem no pas tm sido

    citadas como uma das principais causas para a alterao desta etiologia (COSTA et al.,

    2002).

    A distribuio de diferentes patgenos no uniforme e depende de vrios

    fatores como o clima, a geografia e a migrao. Porm, estudos revelam que as espcies

    Trichophyton rubrum e T. mentagrophytes esto envolvidas em mais de 90% das

    onicomicoses (FAERGEMANN E BARAN, 2003).

    Santos et al. (1997) observaram em um estudo, em janeiro/ 1995 a

    novembro/ 1996, a predominncia de T. rubrum sobre outros dermatfitos, e sugeriram

    que este fungo provavelmente o principal agente etiolgico das dermatofitoses em

    Florianpolis (SC).

    Lopes et al. (1999) avaliaram em um estudo epidemiolgico de 1988 a 1997,

    na regio central do Rio Grande do Sul, a presena de fungos em 2.664 casos de

    micoses superficiais. Os autores isolaram com maior freqncia T. rubrum, que foi o

    fungo predominante nas leses das unhas.

    Costa et al. (2002) observaram em seu estudo epidemiolgico, de janeiro a

    dezembro de 1999, na regio de Goinia (GO.) que de 1.955 amostras coletadas de

    pacientes com suspeita de infeco fngica, o T. rubrum foi responsvel pelo maior

    nmero de leses nas unhas dos ps, perfazendo um total de 60,2% (47/78 casos) e

    fazendo-se a correlao do agente etiolgico com a faixa etria, verificou-se que T.

    rubrum e T. mentagrophytes prevaleceram na fase adulta.

    3.2.4 Tratamento das onicomicoses

    O tratamento das onicomicoses dermatofticas representa uma das principais

    dificuldades teraputicas encontradas na prtica clnica, em razo de algumas

  • 39

    particularidades: as unhas so estruturas no-vascularizadas o que explica a pequena

    penetrao dos medicamentos utilizados por via sistmica. Portanto, as dermatofitoses

    das unhas dos ps so mais rebeldes ao tratamento que as das mos (SIDRIM E

    MOREIRA, 1999).

    O tratamento das onicomicoses ocorre a partir de trs medidas conjuntas:1-

    Tratamento sistmico, que pode durar de 4 a 8 meses; 2- Exciso qumica com uria a

    40% e 3- Tratamento tpico.

    Em muitos casos a exciso cirrgica total da unha uma medida severa,

    mas, necessria (SIDRIM E MOREIRA, 1999).

    3.2.5 Tratamento tpico

    Esta terapia produz poucos efeitos adversos sistmicos e no faz interao

    com outras drogas sistmicas utilizadas pelo paciente, porm, em monoterapia est

    indicada apenas para onicomicoses superficiais com comprometimento inferior a 50%

    da lmina ungueal e para pacientes cuja medicao sistmica est contra-indicada.

    Amorolfina antifngico de amplo espectro da classe das morfolinas,

    veiculado em verniz a 5% devendo ser aplicado de uma a duas vezes por semana

    durante seis meses para as onicomicoses das mos e nove a doze meses para as

    onicomicoses dos ps.

    Ciclopiroxolamina antifngico hidroxipiridmico de amplo espectro

    veiculado em verniz a 8%. Deve ser aplicado a cada 48 h durante o primeiro ms,

    diminuir as aplicaes para duas vezes por semana no segundo ms, e posteriormente,

    uma vez por semana, devendo ser aplicado por um perodo mnimo de 6 meses

    ( LECHA , 2002; BALLEST et al., 2003).

    3.2.6 Tratamento Sistmico

    Os antifngicos sistmicos classicamente empregados no tratamento das

    onicomicoses so a griseofulvina e o cetoconazol. Por volta de 1990, foram substitudos

    por itraconazol, fluconazol e terbinafina que apresentam melhores resultados em menor

    tempo e maior segurana para o paciente (BALLEST et al., 2003).

    Itraconazol sua administrao realizada exclusivamente por via oral

    sendo lipoflico e queratinoflico, o que confere grande afinidade por tecidos

  • 40

    superficiais como: pele, mucosas e unhas alcanando nestes tecidos nveis superiores

    aos plasmticos. Os nveis cutneos alcanados permanecem em concentraes altas

    aps sua administrao (pele e plos 3 a 4 semanas e unhas 4 a 6 meses). Esta

    farmacocintica permite seu uso em terapias de pulsos mensais, mantendo sua eficcia e

    diminuindo os efeitos colaterais. Seus efeitos adversos so leves e interage

    farmacologicamente com antihistamnicos, fenitona, anticoagulantes cumarnicos,

    hipoglicemiantes orais, digoxina, quinina e ciclosporina (BALLEST et al., 2003).

    Fluconazol apresenta-se mais hidroflico que os azlicos anteriores e se

    une menos queratina que o itraconazol. Pode ser administrado tanto por via oral como

    parenteral, alcanando bons nveis em pele e unhas. Penetra rapidamente nos tecidos e

    eliminado lentamente, o que permite uma administrao com menor freqncia e doses

    mais alta. Possue interaes medicamentosas como o aumento o tempo de vida das

    sulfonilureas causando hipoglicemias quando administrado com varfarina, aumentando

    o tempo de protrombina (BALLEST et al., 2003).

    Terbinafina antifngico da classe das alilaminas cujas concentraes nas

    unhas so similares s do plasma, chegando por difuso atravs da derme. Permanece

    depositada nas unhas por meses aps o tratamento, sendo esta caracterstica considerada

    uma proteo contra recidivas. Os efeitos colaterais so geralmente gastrointestinais e

    excepcionalmente cutneos apresentando escassas interaes medicamentosas. O

    tratamento utilizando a associao de antifngicos orais e tpicos tm demonstrado

    melhores resultados que o emprego das drogas em monoterapia (BALLEST et al.,

    2003).

    3.2.7 Falhas teraputicas

    O tratamento das onicomicoses apresenta geralmente taxas de fracasso teraputico

    prximas de 25% em experimentos e 10% a mais na prtica clnica. Santos e Hamdann

    (2007) analisaram trinta e dois isolados clnicos de Trichophyton rubrum resistentes a

    fluconazol [concentraes inibitrias mnimas (MIC) >/= 64 mug ml (-1)], que foram

    selecionados para testar a atividade antifngica de cetoconazol, itraconazol,

    griseofulvina e terbinafina. Foram seguidas as diretrizes do National Committee for

    Clinical Laboratory Standards para testar fungos filamentosos. Foram incluidas para

    controle de qualidade, cepas de Candida parapsilosis (ATCC 22019), Candida krusei

    (ATCC 6258); T. rubrum (ATCC 40051) e Trichophyton mentagrophytes (ATCC

  • 41

    40004). As placas com microdiluies foram incubadas a 28 C e lidas visualmente aps

    7 dias de incubao. As variaes de MIC para os quatro antifngicos foram: 0.0625-2

    mug ml(-1) para cetoconazol; 0.25-2.0 mug ml(-1) para griseofulvina;

  • 4. MATERIAIS E MTODOS

    No presente trabalho, foi observado a reduo do nmero de UFC/mL de

    Trichophyton rubrum aps o tratamento de suspenses do inculo com TBO a 25

    g/mL, laser e LED. O clculo da rea e do volume de suspenso do inculo submetido

    PDT e irradiados pelo laser e pelo LED nos tubos de ensaio foram tambm realizados.

    Os controles dos experimentos foram realizados atravs da exposio do fungo ao TBO,

    do fungo ao laser e LED na ausncia do corante e do fungo sem exposio luz e

    corante.

    Para os experimentos uma amostra de referncia (ATCC-40051) de

    T.rubrum foi utilizada e incubada a 28C durante 7 dias. A mistura resultante de

    condios e fragmentos de hifas foi transferida para um tubo de ensaio esterilizado e em

    seguida homogeneizada em vrtex. A densidade da suspenso foi analisada em

    espectrofotmetro levando a uma concentrao de 1-5 x 106 clulas/mL. Essa suspenso

    obtida foi transferida para seis tubos formando-se seis grupos:

    Grupo 1- Inculo sem nenhum tratamento (controle);

    Grupo 2- Suspenso do inculo submetida irradiao com LED por 3

    minutos;

    Grupo 3- Suspenso do inculo submetida irradiao com laser por 3

    minutos;

    Grupo 4- 100 L de TBO acrescentados a 900 L da suspenso do inculo

    sem a presena de luz;

    Grupo 5- 100 L de TBO acrescentados a 900 L da suspenso do inculo

    submetida irradiao com LED por 3 minutos. PDT-LED;

    Grupo 6- 100 L de TBO acrescentados a 900 L da suspenso do inculo

    submetida irradiao com Laser por 3 minutos. PDT-laser.

    Para os grupos 4, 5 e 6 foi estabelecido o tempo de pr-irradiao (TPI) de 5

    minutos para absoro do corante pelas clulas fngicas.

    Posteriormente, cada grupo sofreu diluio do inculo para 10 UFC/mL e

    repiques em placas de Petri contendo gar Sabouraud. As placas foram incubadas e aps

    UFC/ml Unidades formadoras de colnia por mL nmero de unidades celulares com capacidade de reproduo por ml.

  • 43

    o perodo de incubao foram realizadas as contagens das colnias por mtodo visual

    (FIG.4.1). Para garantir a reprodutibilidade dos dados, este experimento foi realizado

    em triplicata.

    FIGURA 4.1- Diagrama da metodologia.

  • 44

    4.1 Detalhamento dos materiais

    1 - Mquina fotogrfica Canon EOS - Digital Rebel Resoluo 3072 x 2048

    pixels - Tipo de sensor CMOS - Sistema de cor RGB - Distncia da mquina aos tubos

    de ensaio= 70 cm - Lente 105 mm - Cmara com fator de multiplicao focal= 1.6 -

    Abertura 18 -Total 6.3 mega pixels - Tempo de exposio 1/4 segundos - Fabricante:

    Canon Inc. - Japo

    2 - Estativa (fixao do laser e LED para irradiao)

    3 Equipamentos:

    (a)- Laser de baixa intensidade modelo QTUMOOB (Quantum) da Ecco

    Fibras (Brasil), com diodo de arsnio, glio e alumnio (AsGaAl), emitindo no

    vermelho com = 660nm, emisso contnua, 100mW de potncia mdia de sada, tempo

    de 3 minutos, intensidade de 2 W/cm, dimetro do spot de 8mm e dose de 360J/cm2

    (FIG. 6.2).

    FIGURA 4.2.- Equipamento laser de baixa intensidade

    (b) Diodo de Emisso de Luz (LED): modelo Fisioled da MMoptics (So

    Paulo-Brasil) com emisso de luz a = 630nm (10nm), 100mW de potncia mdia de

    sada, tempo de 3 minutos, intensidade de 0,5 W/cm, dose de 90J/cm2 , dimetro do

  • 45

    spot de 15,6 mm, em meio ativo de ndio, glio, alumnio e fsforo (InGaAlP) (FIG.

    6.3).

    FIGURA 4.3- Equipamento LED

    As potncias dos aparelhos de laser e LED foram aferidas pela unidade de leitura

    modelo NOVA- Analogic Performance Report, Laser Power/Energy Monitor.

    Fabricante: OPHIR OPTRONICS- Science Based Industry Park, Jerusalm- Israel (FIG.

    6.4).

    FIGURA 4.4- Unidade de Leitura de Potncia Luminosa

  • 46

    4-Espectrofotmetro: modelo - MICRONAL B542 (Micronal S/A-So

    Paulo-Brasil), com resoluo de leitura de 1nm, na regio espectral de 325 a 1000nm,

    com faixa de medio fotomtrica de 0200%T, e -0,33ABS. Exatido fotomtrica de

    0,018ABS com filtros padres. Lmpada Halgena de 6V x 10W com freqncia de

    60Hz e voltagem de 117 a 227V (FIG. 6.5)

    FIGURA 4.5- Espectrofotmetro - MICRONAL B542.

    5- Vrtex - Biomatic-Porto Alegre- Brasil (FIG. 6.6)

    FIGURA 4.6- Vrtex

  • 47

    6- Fotossensibilizador: O fotossensibilizador azul de toluidina foi submetido

    espectroscopia e suas bandas de absoro determinadas entre os comprimentos de

    onda de 400 a 900nm. Foi utilizado o azul de toluidina (TBO) (Sigma, St. Louis, MO,

    USA) (FIG. 6.7) na concentrao final de 25g/mL diludo em gua.

    FIGURA 4.7 Fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO)

    7-Microorganismo: Neste estudo foi utilizada uma amostra de referncia

    (ATCC-40051) de T. rubrum obtida da coleo de culturas da Universidade da Gergia

    (Atlanta, GA, EUA), gentilmente cedida pelo Laboratrio de Micologia do

    Departamento de Microbiologia, ICB-UFMG (FIG. 6.8).

    FIGURA 4.8- Amostra de referncia (ATCC-40051) de T. rubrum

  • 48

    8- Meios de cultura

    gar Saboraud Dextrose:

    Glicose.............................................................................40,00 g

    Peptona............................................................................10,00 g

    Extrato de Levedura......................................................... 5,0 g

    Cloranfenicol.................................................................... 0,10 g

    gar..................................................................................15,00 g

    gua destilada.................................................................. 1000,00 ml

    O meio de cultura Sabouraud foi obtido comercialmente (GIBCO) e seu

    preparo procedeu de acordo com as orientaes do fabricante, com o acrscimo de 3 g/L

    de gar.

    gar Batata dextrose

    Infuso base de batatas..........................................200,00 g/L

    Dextrose ....................................................................20 g/L

    gar ...........................................................................15 g/L

    Para hidratar, foi suspenso 39 g em 1 L de H2O destilada e aquecido at

    ferver para dissolver completamente. Em seguida foi distribudo em tubos e esterilizado

    a 121oC por 15 minutos. Foi esfriado at 45 - 50 C e os tubos inclinados para

    solidificao do meio de cultura.

    Soluo Salina

    Cloreto de sdio..............................................................0,85 g

    gua destilada.................................................................100,00 mL

    9- Isolamento e manuteno da amostra. A amostra foi semeada e preservada

    em gar Sabouraud em cmara fria a 4 C. Durante os experimentos, foram realizados

    repiques em gar batata, para produo de esporos.

  • 49

    4.2 Detalhamento dos mtodos

    As espectroscopias do fotossensibilizador Azul de Toluidina na concentrao

    de 25 g/mL (GRA. 4.1 e 4.3), de Trichophyton rubrum (GRA. 4.2 e 4.3) e do TBO

    associado ao fungo (GRA. 4.3) foram realizadas com o objetivo de determinar se suas

    bandas de absoro foram ressonantes com o comprimento de onda das fontes de luz

    utilizadas.

    GRFICO 4.1-Espectroscopia de absoro ptica do fotossensibilizador, Azul de

    Toluidina 25g/mL que foi obtida utilizando-se uma cubeta de

    quartzo com caminho ptico de 1mm. No eixo Y encontra-se a

    absoro do corante em unidades arbitrrias (u.a) e no eixo X a

    poro visvel do espectro eletromagntico em nanmetros

  • 50

    GRFICO 4.2- Espectroscopia de absoro ptica da suspenso de Trichophyton

    rubrum em salina. No eixo Y encontra-se a absoro da

    suspenso do fungo em unidades arbitrrias (u.a) e no eixo X a

    poro visvel do espectro eletromagntico em nanmetros.

    4.2.1 Preparo do inculo

    Para o preparo do inculo foi utilizado o mtodo espectrofotomtrico

    proposto pelo M38-A (CLSI, 2002). A amostra de T. rubrum foi cultivada em tubos de

    ensaio contendo gar batata dextrose e incubada a 28 C durante 7 dias. A massa de

    miclio obtida foi coberta com aproximadamente 5,0 mL de salina 0,85% esterilizada e

    assepticamente com ala de platina foi feita uma raspagem da superfcie do gar. A

    mistura resultante de condios e fragmentos de hifas foi transferida para um tubo de

    ensaio esterilizado e ento deixada em repouso por 5 minutos para que as partculas

    mais pesadas se sedimentassem (FIG. 4.9). O sobrenadante foi coletado fazendo-se em

    seguida uma homogeneizao em vrtex por 15 segundos. A densidade da suspenso foi

    analisada em espectrofotmetro e ajustada para uma densidade tica de 0,15 a 0,17 (65

    a 70% de transmitncia a 530 nm), o que proporciona uma concentrao de 1-5 x 106

    clulas/mL. Essa suspenso obtida foi transferida para seis tubos formando-se seis

    grupos.

  • 51

    GRFICO 4.3- Espectroscopias do fotossensibilizador Azul de Toluidina (TBO)

    na concentrao de 25g/ mL, de Trichophyton rubrum e de

    Trichophyton rubrum associado ao Azul de Toluidina (TBO)

    25g/ mL. No eixo Y encontra-se a absoro do corante em

    unidades arbitrrias (u.a) e no eixo X a poro visvel do espectro

    eletromagntico em nanmetros.

    FIGURA 4.9- Transferncia dos condios e fragmentos de hifas para o

    tubo de ensaio

  • 52

    4.2.2 Procedimento de teste

    Foram utilizados tubos de 10 x 10 mm contendo um volume final de

    suspenso de 1000 L e separados em seis grupos. No primeiro grupo, correspondente

    ao controle de crescimento do fungo, a suspenso de 1000 L do inculo no foi

    submetida a qualquer tratamento. No segundo grupo, a suspenso do inculo foi

    submetida irradiao com LED por 3 minutos. No terceiro grupo, a suspenso do

    inculo foi submetida irradiao com laser por 3 minutos. No quarto grupo, 100 L de

    TBO foram acrescentados a 900 L da suspenso do inculo (diluio do

    fotossensibilizador de 1:10), sem a presena de luz. No quinto grupo, 100 L de TBO

    foram acrescentados a 900 L do inculo e realizada irradiao com LED por 3

    minutos. No sexto grupo, 100 L de fotossensibilizador foram acrescentados a 900 L

    do inculo e realizada irradiao com laser por 3 minutos, QUA. 4.1.

    QUADRO 4.1

    Grupos do experimento

    Grupos Procedimento Smbolo

    correspondente

    Grupo 1 1000 L de suspenso do inculo sem nenhum

    tratamento (controle) G1

    Grupo 2 1000 L de suspenso do inculo submetida

    irradiao com LED por 3 minutos G2

    Grupo 3 1000 L de suspenso do inculo submetida

    irradiao com laser por 3 minutos G3

    Grupo 4 100 L de TBO acrescentados a 900 L da

    suspenso do inculo sem a presena de luz G4

    Grupo 5

    100 L de TBO acrescentados a 900 L da

    suspenso do inculo submetida irradiao com

    LED por 3 minutos. PDT-LED

    G5

    Grupo 6

    100 L de TBO acrescentados a 900 L da

    suspenso do inculo submetida irradiao com

    laser por 3 minutos. PDT-laser

    G6

  • 53

    Para os grupos 4, 5 e 6, foi estabelecido o tempo de pr-irradiao (TPI) de 5

    minutos para absoro do corante pelas clulas fngicas (FIG. 4.10).

    FIGURA 4.10- Microscopia ptica da absoro do corante pelas

    clulas fngicas aps a TPI

    A irradiao pelas fontes de luz foi realizada do fundo para a abertura do

    tubo (FIG.4.11).

    FIGURA 4.11- Irradiao pelas fontes de luz do fundo para a abertura

    do tubo.

  • 54

    Posteriormente, cada grupo sofreu uma diluio do inculo para 10 UFC/mL

    repiques em placas de Petri contendo gar Sabouraud (FIG.4.12). As placas foram

    incubadas a 28C por 4 dias, de acordo com as necessidades da amostra, e aps o

    perodo de incubao foram realizadas as contagens das colnias por mtodo visual.

    Este experimento foi realizado em triplicata.

    FIGURA 4.12- Colnias de T. rubrum repicadas em placas de Petri.

    4.2.3 Clculo da rea e volume de suspenso irradiada

    Aps as irradiaes dos tubos referentes aos grupos 5 e 6 (PDT), clculos da

    rea e volume de suspenso do inculo absorvidos pelas luzes (laser/LED) foram

    realizadas observando-se os dados dimensionais do tubo de ensaio (FIG. 4.13):

    Dimetro externo = 12,28 0,02 mm

    Espessura do tubo = 0,82 0,02 mm

    Dimetro interno = 10,64 0,02 mm

    Comprimento cilndrico = 69,40 0,02 mm

    Comprimento total = 73,80 0,02 mm

    Volume da amostra irradiada = 1000,0 3,8L

    Volume da calota esfrica = 182,0 0,4 L

    Volume da parte cilndrica = 818,0 3,1 L

  • 55

    FIGURA 4.13- Dados dimensionais do tubo de ensaio

    A FIG. 4.14 ilustra a transmisso da luz LED e laser atravs da gua

    indicando a quase ausncia de absoro (baseline).

    Na FIG. 4.15a observada a suspenso do fungo associado ao TBO sendo

    irradiada pelo laser (grupo 6) e na FIG. 4.15b a suspenso do fungo associado ao TBO

    sendo irradiada pelo LED (grupo 5).

    FIGURA 4.14- Baseline da gua sendo irradiada pelo LED e laser

  • 56

    (a)

    (b)

    FIGURA 4.15- (a) Amostra do grupo 6 sendo irradiada pelo laser e (b) Amostra do

    grupo 5 sendo irradiada pelo LED.

    Para facilitar a compreenso da realizao dos clculos da rea e do volume

    irradiados pelo laser e LED (Anexo c), duas etapas foram realizadas. Na etapa 1 foram

    calculadas as reas fotografadas em que houve maior absoro da luz pelo corante

    (regio mais avermelhada) dos tubos de ensaio dos grupos 5 e 6. Na etapa 2, foram

    calculados os volumes de suspenso do inculo irradiados dos tubos de ensaio dos

    grupos 5 e 6.

    ETAPA 1

    Foi utilizado o software laser.exe para a obteno das medidas em pixels da

    regio dos tubos irradiados pelo laser e LED. O primeiro passo do software foi

    converter a escala de cores da imagem para tons de cinza (FIG 4.16a e 4.16b).

  • 57

    (a)

    (b)

    FIGURA 4.16- (a) Converso da imagem para tons de cinza do grupo 6 e (b)

    Converso da imagem para tons de cinza do grupo 5

    Em seguida foi realizada a converso das imagens em tons de cinza para em

    cores de acordo com a intensidade de luz (aumentando do azul para o vermelho),

    obtendo-se assim, as reas irradiadas (FIG. 4.17 e 4.18).

    FIGURA 4.17- Imagem processada onde a rea irradiada pelo laser foi

    de 15,1 mm sendo que a escala de cores representa a

    intensidade de luz em cada regio irradiada

  • 58

    FIGURA 4.18- Imagem processada onde a rea irradiada pelo LED foi

    de 52,2 mm sendo que a escala de cores representa a

    intensidade de luz em cada regio irradiada

    Foi obtida a relao entre as reas LED/laser obtendo-se um valor de 3,45.

    ETAPA 2

    Foi realizado o clculo e a comparao dos volumes irradiados pelo laser e

    LED (FIG. 4.19 a e FIG. 4.19b, respectivamente).

    (a)

    (b)

    FIGURA 4.19- (a) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo Laser

    e (b) Esquema do tubo de ensaio do volume irradiado pelo

    LED.

    O clculo dos volumes foi realizado focando a borda inferior do tubo onde

    h maior concentrao de suspenso do inculo e de energia do laser e LED absorvidos