i

ABSTRAK

KONSTRUKSI DAN EKSPRESI HETEROLOG

KLON REKOMBINAN LEVANSUKRASE DARI

BAKTERI HALOFILIK Bacillus licheniformis BK1 dan BK2

UNTUK DIGUNAKAN SEBAGAI BIOKATALIS

DALAM PRODUKSI LEVAN SECARA IN VITRO

Oleh

Nur Umriani Permatasari

NIM: 30514003

(Program Studi Doktor Kimia)

Bakteri halofilik adalah salah satu jenis bakteri ekstremofil yang mampu bertahan

hidup dan berkembang dalam lingkungan dengan tingkat salinitas tinggi walau

dalam kondisi nutrisi yang rendah. Bakteri halofilik banyak dimanfaatkan di

bidang bioteknologi antara lain karena bakteri ini diketahui memiliki potensi

sebagai penghasil biomolekul bernilai ekonomi tinggi seperti biosurfaktan,

bioplastik, levan, inulin, dan bahan aktif kosmetik seperti ektoin. Sebagai negara

kepulauan, Indonesia banyak memiliki habitat halofil laut. Disamping itu,

Indonesia juga memiliki habitat halofil darat yang potensial, seperti danau air asin

di beberapa wilayah Indonesia dan satu habitat unik, yaitu kawah lumpur asin di

desa Bledug Kuwu, Purwodadi, Jawa Tengah. Hasil eksplorasi potensi bakteri

halofilik asal kawah lumpur asin Bledug Kuwu diketahui bahwa sebagian bakteri

halofilik alaminya memiliki potensi sebagai produsen levan, yaitu kelompok

fruktan atau polimer fruktosa yang banyak dimanfaatkan untuk antioksidan,

antibakteri, bahan pembuat nanopartikel, dan suplemen makanan penderita

diabetes. Levan dihasilkan dari biokonversi sukrosa melalui peran levansukrase

sebagai biokatalis. Hasil studi pada beberapa bakteri halofilik isolat Bledug Kuwu

diketahui bahwa levansukrase dapat dihasilkan secara ekstrasel ataupun intrasel.

Penelitian ini bertujuan untuk melakukan peningkatan entitas levansukrase bakteri

halofilik asal kawah lumpur Bleduk Kuwu dengan memanfaatkan teknologi DNA

rekombinan agar dapat dimanfaatkan sebagai biokatalis untuk produksi levan

secara in vitro.

Pada penelitian ini, enam isolat bakteri asal Bledug Kuwu telah diidentifikasi

sebagai bakteri halofilik potensial penghasil levansukrase dan dapat menghasilkan

levan. Keenam isolat tersebut adalah Halomonas salina, Halomonas symrnensis,

Halomonas elongata BK1, Halomonas elongata BK2, Bacillus licheniformis

BK1, dan Bacillus licheniformis BK2. Berdasarkan profil pertumbuhan dan

aktivitas levansukrase yang ditunjukkan oleh keenam isolat tersebut, dua isolat B.

licheniformis mempunyai aktivitas levansukrase paling tinggi dibandingkan

keempat isolat yang lain yaitu 111,14-116,47 U/mg. Kedua strain ini, dipilih

untuk penelitian selanjutnya.

ii

Isolasi gen levansukrase dari B. licheniformis BK1 dan B. licheniformis BK2 telah

berhasil dilakukan menggunakan pendekatan PCR. Amplifikasi gen pengkode

levansukrase dilakukan menggunakan primer spesifik

5’GGATCCATGAACATCAAAAACATYGCT-3’ sebagai primer maju dan 5’-

GAATTCTTATTWGTTTACCGTTARTTG-3’ sebagai primer mundur. Kloning

awal dilakukan menggunakan vektor pGEM-T Easy dengan sel inang E. coli

TOP10 untuk memperbanyak molekul DNA target dan konfirmasi melalui

sekuensing. Ekspresi klon rekombinan dilakukan dengan memindahkan fragmen

gen levansukrase ke vektor ekspresi pET-30a(+) dengan sel inang E. coli

BL21(DE3)pLysS. Penambahan sisi restriksi BamHI pada primer maju dan EcoRI

pada primer mundur dimaksudkan untuk mengarahkan orientasi kloning dalam

vektor pET-30a(+).

Analisis sekuen gen levansukrase dilakukan baik dalam pGEM-T Easy maupun

dalam pET-30a(+). Hasil analisis menunjukkan bahwa gen lsbl-bk1 dan lsbl-bk2

yang diintegrasikan ke pET-30a(+) telah memiliki orieantasi yang benar dan

disebut sebagai pET-lsbl-bk1 dan pET-lsbl-bk2. Hasil identifikasi pada level DNA

menunjukkan bahwa sekuen gen levansukrase lsbl-bk1 (kode akses MF774877.1)

dan lsbl-bk2 (kode akses MF774878.1) memiliki keidentikan homologi 99%

dengan gen levansukrase lain dari B. licheniformis. Hasil identifikasi pada level

protein menunjukkan bahwa gen lsbl-bk1 menyandi 483 asam amino (kode akses

ATJ00090.1) dan gen lsbl-bk2 menyandi 481 asam amino (kode akses

ATJ00091.1). Hasil penyejajaran dari kedua protein tersebut menunjukkan bahwa

Lsbl-bk1 memiliki homologi identitas 96% dan Lsbl-bk2 memiliki homologi

identitas 99% dengan protein famili glycoside hydrolase 68 dari spesies

B. licheniformis. Analisis prediksi sisi katalitik menggunakan program online

Sequence Annotated by Structure (SAS) menunjukkan bahwa kedua protein

mempunyai tiga residu lestari aktif yang sama yaitu Asp93 dan Asp256 pada

kedua protein, dan Glu352 pada Lsbl-bk1 serta Glu351 pada Lsbl-bk2. Perbedaan

satu asam amino pada Lsbl-bk1 disebabkan oleh adanya insersi tiga basa DNA

pada posisi di antara ke 834 dan 835, 849 dan 850, 881 dan 882. Prediksi struktur

tiga dimensi menggunakan program Swiss model menunjukkan motif pelipatan β

dengan ketiga residu aktif terikat pada β-strand.

Hasil analisis RSM untuk ekspresi gen levansukrase berdasarkan aktivitas

spesifiknya sebagai luaran menunjukkan bahwa pET-lsbl-bk1 dan pET-lsbl-bk2

mengalami overekspresi pada jam keempat setelah induksi IPTG. Kondisi

optimum produksi Lsbl-bk1 dalam sistem heterolog ini terjadi pada konsentrasi

NaCl 0,6% (b/v), induser IPTG 0,6 mM dan temperatur inkubasi 42oC.

Sementara, kondisi optimum produksi Lsbl-bk2 dicapai pada konsentrasi NaCl

1,1% (b/v), induser IPTG 0,7 mM, dan temperatur inkubasi 40oC. Analisis RSM

mengindikasikan bahwa faktor yang pengaruhnya sangat siginifikan dalam sistem

ekspresi adalah temperatur inkubasi.

Analisis SDS-PAGE dan zimografi menunjukkan bahwa levansukrase yang telah

dimurnikan dengan kromatografi penukar anion memiliki ukuran molekul sekitar

50 kDa. Karakterisasi biokimia levansukrase Lsbl-bk1 memiliki aktivitas tertinggi

pada 56oC dan pH 7,5 sedangkan Lsbl-bk2 mempunyai aktivitas spesifik tertinggi

iii

pada 50oC dan pH 7,5. Aktivitas spesifik levansukrase tetap berada pada level

87-100% dengan penambahan 10 mM EDTA atau PMSF. Penambahan ion logam

Co2+

terhadap kedua levansukrase dapat meningkatkan aktivitas spesifiknya

sebesar 14%, oleh sebab itu ion Co2+

dapat diperkirakan sebagai aktivator

levansukrase. Ion-ion logam lain seperti Ti2+

, Mg2+

, Ba2+

, Zn2+

, Fe3+

, Ca2+

tidak

mempengaruhi aktivitas spesifik levansukrase. Aktivitas spesifik levansukrase

tidak berubah dengan penambahan 1-25% (b/v) NaCl. Hasil plot aktivitas spesifik

terhadap konsentrasi sukrosa menunjukkan bahwa kedua levansukrase mengikuti

profil Michaelis-Menten dengan nilai Vmax, KM, Kcat, kcat/KM berturut-turut adalah

22,7 dan 23,8 mM/menit, 272 dan 293,9 mM, 1052 dan 1044 s-1

, 3,9 dan

3,6 s-1

/mM. Data ini mengindikasikan bahwa levansukrase rekombinan dari

bakteri halofilik B. licheniformis BK1 dan B. licheniformis BK2 merupakan

levansukrase non metaloenzim dengan kemampuan afinitas dan laju pengikatan

substrat sukrosa yang cukup tinggi, dengan efisiensi katalitik hidrolisis yang

cukup rendah.

Optimasi produksi levan secara in vitro dengan metode RSM, menggunakan

levansukrase rekombinan Lsbl-bk1 memberikan kondisi optimum pada

konsentrasi sukrosa 12% (b/v) dengan inkubasi pada 36oC dan pH 7 dimana

konsentrasi levan mencapai 96,117 mg/mL. Selain itu, kondisi optimum untuk

Lsbl-bk2 adalah pada konsentrasi sukrosa 12% (b/v) dengan inkubasi 32oC pada

pH 8 dimana konsentrasi levan adalah 94,134 mg/mL. Analisis RSM

menunjukkan bahwa faktor yang paling berpengaruh terhadap produksi levan

adalah kadar sukrosa dalam medium.

Karakterisasi FTIR terhadap levan yang diproduksi secara in vitro menunjukkan

adanya serapan di daerah 925,83-1271,09 cm-1

yang merupakan daerah sidik jari

molekul karbohidrat. Spektrum 1H-NMR levan ini menunjukkan karakteristik

sinyal dengan nilai geseran kimia di antara 3,4 dan 4,3 ppm, yang berkorelasi

dengan proton golongan monosakarida. Perolehan spektrum 13

C-NMR

memperlihatkan 6 puncak pada 104,1 (C2), 80,2 (C5), 76,2 (C3), 75,1 (C4),

63,3 (C6), 59,8 (C1) ppm yang berkaitan dengan posisi sinyal karbon

β-fruktofuranosa. Data ini mengindikasikan bahwa levan yang disintesis secara

in vitro dengan katalis levansukrase rekombinan menunjukkan karakteristik

tertentu.

Analisis SEM memperlihatkan morfologi padatan putih bulat-bulat membentuk

pori untuk levan yang disintesis dengan katalis Lsbl-bk1 dan morfologi padatan

kuning berbentuk seperti lembaran tanpa adanya pori untuk levan yang disintesis

dengan katalis Lsbl-bk2. Analisis TGA menunjukkan bahwa kedua levan tetap

stabil pada 100-200oC dan mulai terdegradasi pada 208-211

oC. Pada 200-300

oC

kedua levan mengalami penurunan massa sekitar 46- 51% dari massa awal. Hasil

ini menunjukkan bahwa Lsbl-bk1 berbeda dengan Lsbl-bk2, namun keduanya

dapat menghasilkan levan yang cukup stabil secara termal. Adanya pori pada

levan hasil sintesis dengan levansukrase Lsbl-bk1 berpotensi untuk aplikasinya

sebagai resin.

iv

Pengujian levan sebagai antimikroba menunjukkan bahwa levan hasil sintesis

in vitro dengan konsentrasi 10-20% (b/v) memiliki fungsi bioaktif sebagai

antibakteri terhadap S. aureus, E. coli, P. aeruginosa. Selain itu, levan memiliki

fungsi bioaktif sebagai antioksidan dengan kemampuan inhibisi sebesar 75%

dibandingkan inhibisi oleh asam askorbat. Nilai IC50 untuk levan yang disintesis

dengan katalis Lsbl-bk1 adalah 91,73 μg/mL, sedangkan untuk Lsbl-bk2 adalah

76,15 μg/mL, mengindikasikan bahwa kedua levan mampu meredam radikal

bebas dari DPPH sebesar 50%. Hasil ini menunjukkan bahwa levan yang

disintesis secara in vitro memiliki kemampuan bioaktivitas sebagai antibakteri dan

antioksidan.

Kata kunci: Levansukrase, sintesis in vitro levan, bakteri halofilik, kawah lumpur

Bledug Kuwu, Bacillus licheniformis, analisis RSM.

v

ABSTRACT

CONSTRUCTION AND HETEROLOGOUS EXPRESSION OF

LEVANSUCRASE RECOMBINANT CLONED FROM

HALOPHILIC BACTERIA Bacillus licheniformis BK1 AND BK2

TO BE USED AS BIOCATALYST FOR IN VITRO

LEVAN PRODUCTION

By

Nur Umriani Permatasari

NIM: 30514003

(Doctoral Program of Chemistry)

Halophilic bacteria are one type of extremophilic bacteria that survive and evolve

in high salinity environment under low nutritional level. Halophilic bacteria have

been widely employed in many biotechnological fields due to its potential

characteristic in producing commercial biomolecules such as biosurfactants,

bioplastics, levan, inulin, and cosmetics active compound as ectoine. As

archipelagos country, Indonesia owns many potential marine habitats for

halophiles. In addition, Indonesia also has potential terrestrial halophilic habitats

such as salt lakes in several regions and unique salty mud craters such as Bledug

Kuwu in Purwodadi, Central Java. The result of previous studies showed that

several wildtype halophilic bacteria from Bledug Kuwu are able to produce levan,

which is a fructant or fructose polymer used as antioxidant, antibacterial,

material for nanoparticle, and as food supplement for diabetics. Levan is

produced by sucrose bioconversion using levansucrase biocatalyst. Studies on

several halophilic bacterial isolates from Bledug Kuwu have shown that

levansucrase can be produced either extracellularly or intracellularly. The

present study is aimed to enhance the entity of levansucrase produced by

halophilic bacteria indigenous from Bledug Kuwu’s mud crater through the

application of recombinant DNA technology and utilized the recombinant

levansucrase for in vitro production of levan.

In this research, six bacterial isolates from Bledug Kuwu were identified as

potential halophilic bacteria to produce levan. These six bacterial isolates were

Halomonas salina, Halomonas symrnensis, Halomonas elongata BK1,

Halomonas elongata BK2, Bacillus licheniformis BK1, and Bacillus licheniformis

BK2. Based on the growth profile and levansucrase activity shown by these six

isolates, two bacterial isolates of B. licheniformis have the highest levansucrase

activity compared to other that are 111,14-116,47 U/mg. These two strains were

then chosen for further studies.

vi

Levansucrase gene from B. licheniformis BK1 and B. licheniformis BK2 have

been successfully isolated using PCR approach. Amplification of levansucrase

genes from these two strains were performed using spesific forward primer

5'-GGATCCATGAACATCAAAAACATYGCT-3' and spesific reverse primer

5'-GAATTCTTATTWGTTTACCGTTARTTG-3'. Initial cloning was carried out

using pGEM-T vectors with E. coli TOP10 host cells to multiply the target DNA

molecules and to confirm them through squencing. Expression of recombinant

cloned were carried out by transferring the confirmed levansucrase gene

fragment to pET-30a(+) expression vector with E. coli BL21(DE3)pLysS host cell.

Addition of BamHI and EcoRI restriction sites at forward and reverse primers

was aimed to direct the cloning orientation in the pET-30a(+) vector.

Sequence analysis of the levansucrase gene were carried out both in pGEM-T

Easy and in pET-30a(+). The analysis showed that the lsbl-bk1 and lsbl-bk2

genes have been integrated in pET-30a(+) vectors with correct cloning direction

resulting recombinant plasmid expression systems of pET-lsbl-bk1 and

pET-lsbl-bk2. Identification at DNA levels showed that the sequence of

levansucrase lsbl-bk1 gene (accession number MF774877.1) and lsbl-bk2 gene

(accession number MF774878.1) had 99% identity with other levansucrase genes

from B. licheniformis. Identification at the protein level showed that the lsbl-bk1

gene encoded for 483 amino acids (accession number ATJ00090.1) and the

lsbl-bk2 gene encoded for 481 amino acids (accession number ATJ00091.1). The

alignment of the two proteins showed that Lsbl-bk1 had 96% identity and

Lsbl-bk2 had 99% identity with glycoside hydrolase 68 family protein from

B. licheniformis species. Prediction of catalytic site using Sequence Annotated by

Structure (SAS) online program showed three conserved residues on its active

sites, namely Asp93 and Asp256 of the two proteins, and Glu352 of Lsbl-bk1 and

Glu351 of Lsbl-bk2. The shifting of one amino acid in Lsbl-bk1 is probably due to

the insertion of three bases in the lsbl-bk1 gene at the position between 834 and

835, 849 and 850, as well as between 881 and 882. Prediction of protein three-

dimensional structure using Swiss model program showed the presences of β-

folding motive with the three active residues bound to the β-strand.

RSM analysis on levansucrase gene expression, based on its specific activity as

output, indicated that pET-lsbl-bk1 and pET-lsbl-bk2 were overexpressed at four

hours after IPTG induction. The optimum conditions of Lsbl-bk1 production in

this heterologous expression system was occur at 0.6% (w/v) NaCl, 0.6 mM IPTG

inducer, and 42oC incubation temperature. On the other hand, the optimum

conditions of Lsbl-bk2 production were achieved at 1.1% (w/v) NaCl, 0.7 mM

IPTG inducer, and 40oC incubation temperature.

Zymography and SDS PAGE analysis showed that ion exchange chromatography

purified levansucrase has a molecular size of around 50 kDa. Biochemical

characterization of Lsbl-bk1 levansucrase showed the highest specific activity at

56oC and pH 7.5 whereas the Lsbl-bk2 levansucrase had the highest specific

activity at 50oC and pH 7.5. Specific activity of levansucrase remained in the level

87-100% with addition of 10 mM EDTA or PMSF. Addition of Co2+

metal ion to

both levansucrases increased its spesific activity by 14%, so that cobalt metal ion

vii

was considered as activator. Other metal ions such as Ti2+

, Mg2+

, Ba2+

, Zn2+

,

Fe3+

, Ca2+

did not show any effect on levansucrase specific activity. In addition,

specific activity of levansucrase was also not changed by the addition of 1-25%

(w/v) NaCl. The plot results of levansucrase specific activities toward sucrose

concentration showed that both levansucrases follow Michaelis-Menten profile

with Vm, Km, kcat, and kcat / Km values were 22.7 and 23.8 mM/min, 272 and

293.9 mM, 1052 and 1044 s-1

, and 3,8 and 3,6 s-1

/mM respectively. These data

indicated that the recombinant levansucrases from halophilic bacteria

B. licheniformis BK1 and B. licheniformis BK2 are a non metaloenzyme with high

affinity and binding rate to sucrose substrate, in which the catalytic efficiency on

hydrolysis reactions is quite low.

RSM optimation on in vitro levan production resulted that the optimum condition

for Lsbl-bk1 levansucrase catalysis was 12% (w/v) sucrose at pH 7 and 36oC

incubation temperature, where the levan concentration was 96.117 mg/mL. On

the other hand, the optimum condition of Lsbl-bk2 levansucrase catalysis

obtained at 12% (w/v) sucrose at pH 8 and 32oC incubation temperature, where

the concentration of levan was 94.134 mg/mL. This RSM analysis showed that the

most influential factor in levan production was sucrose concentration in medium.

FTIR characterization on in vitro produced levan showed clear absorption band

at 925.83-1271.09 cm-1

which corresponds to the finger print region of

carbohydrate molecules. The 1H-NMR spectrum of levan showed signal

characteristics at chemical shift between 3.4 and 4.3 ppm, which correlates to the

proton group of monosaccharide. The 13

C-NMR spectrum of levan showed six

peaks at 104.1 (C2), 80.2 (C5), 76.2 (C3), 75.1 (C4), 63.3 (C6), 59.8 (C1) ppm

which are related to the position of carbon signals from β-fructofuranose. These

data indicated that in vitro produced levan utilizing the recombinant levansucrase

as catalyst possesed normal levan characteristic.

SEM analysis on the in vitro produce levan showed round solid white pores

morphology for those synthesized using Lsbl-bk1 catalyst and yellow solids

shaped like sheets morphology without any pores for those synthesized using

Lsbl-bk2 catalyst. TGA analysis indicated that these levans were stable until 100-

200oC and degraded at 208-211

oC. At 200-300

oC, both levans were decreased in

mass at about 46-51.18% from its initial mass. These results showed that Lsbl-bk1

was difference with Lsbl-bk2, however both enzymes were able to produce

thermally stable levan. Porous levan synthesized with Lsbl-bk1 levansucrase has

potency to be applied as resin.

Levan testing as antimicrobial agent showed that the in vitro synthesized levan at

concentration of 10-20% (w/v) had a bioactive function towards S. aureus, E. coli,

and P. aeruginosa. Furthermore, the in vitro synthesized levan also has an

antioxidant activity with inhibition ability of 75% compared to ascorbic acid

inhibition. IC50 values of levan synthesized with Lsbl-bk1 catalyst was

91.73 μg/mL, while levan synthesized with Lsbl-bk2 catalyst had an IC50 of

76.15 μg/mL, indicating that both levans able to reduce free radical of DDPH by

viii

50%. These result suggested that the in vitro synthesis levans were potential to be

used as antimicrobes as well as antioxidant.

Keywords: Levansucrase,in vitro levan synthesis, halophilic bacteria, mud crater

Bledug Kuwu, Baciilus licheniformis, Response Surface Methodology

(RSM) Analysis.