VOŠZ a SZŠ Praha 1, Alšovo nábřeží 6

ABSOLVENTSKÁ PRÁCE

Praha 2018 Nikola Nováková

Klinický a biochemický obraz karcinomu pankreatu

Absolventská práce

Nikola Nováková

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola

Praha 1, Alšovo nábřeží 6

Studijní obor: Diplomovaný zdravotnický laborant

Vedoucí práce: RNDr. Vávrová Lucie, Ph.D.

Datum odevzdání práce: 23. 4. 2018

Datum obhajoby: červen 2018

Praha 2018

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracoval (a) samostatně a všechny použité prameny

jsem uvedl (a) podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů

informací.

Praha 23. dubna 2018

Děkuji RNDr. Lucii Vávrové, Ph.D. za odborné vedení absolventské práce. Děkuji také všem,

kteří mi poskytli pomoc při zpracování této práce.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné

školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6.

Podpis

ABSTRAKT

Jméno: Nikola Nováková

Název práce: Klinický a biochemický obraz karcinomu pankreatu

Název anglicky: The Clinical and Biochemical Picture of the Pancreatic Carcinoma

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6

Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D.

Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2018, 52

Karcinom pankreatu (KP) je zrádné onemocnění, které pacientům v jeho počátku nezpůsobuje žádné

potíže, je tedy asymptomatické, což vede k pozdní diagnóze. Nemoc je často odhalena až

v pokročilých stádiích onemocnění a má tedy velmi špatnou prognózu a vysokou mortalitu.

Problematická je i volba vhodných markerů, které by přesně odrážely stádium onemocnění a přispěly

k včasné diagnóze. Patogeneze onemocnění je multifaktoriální a podílí se na ni mimo jiné i oxidační

stres.

Cílem této práce bylo porovnat hladiny lipidových markerů oxidačního stresu (oxidované LDL – ox-

LDL a konjugované dieny - KD) a s lipidy spojeného antioxidačního enzymu paraoxonasy (PON) u

pacientů s KP a zdravých kontrol (KON). Dalším cílem bylo srovnat různé dnes užívané nádorové

markery (CEA, CA 19-9, CA 72-4) u pacientů v různém stádiu KP, porovnat, do jaké míry odrážejí

stádium onemocnění. Sledován byl i nově navrhovaný marker KP – sérový amyloid A (SAA).

Do studie bylo zařazeno celkem 52 pacientů (M/Ž = 31/21) s KP a 52 KON spárovaných se skupinou

KP na základě věku a pohlaví. Z 52 pacientů s KP bylo 12 pacientů ve stádiu 2, 20 pacientů ve stádiu

3 a 20 pacientů ve 4. stádiu onemocnění. Aktivita PON a koncentrace KD byly měřeny

spektrofotometrickými metodami, hladiny SAA a ox-LDL byly stanovovány metodou ELISA.

U pacientů s KP byly pozorovány snížené aktivity jak arylesterázové tak laktonázové aktivity PON (p

0,0001), zvýšené koncentrace SAA (p 0,0001), KD (p 0,05) a ox-LDL (p 0,01) a též všech

sledovaných tumorových markerů (p 0,001) v porovnání s KON. Tumorové markery CEA a CA72-4

byly signifikantně nižší u pacientů ve stádiu 2 a 3 ve srovnání s pacienty ve finálním stádiu 4. U

markeru CA 19-9 nebyl pozorován signifikantní rozdíl mezi pacienty v různých stádiích. Nejlépe

stádium onemocnění odrážely koncentrace nově navrhovaného markeru pro karcinom pankreatu

(SAA) a stejně tak arylesterázová aktivita PON.

Získané výsledky potvrzují zvýšený oxidační stres u pacientů s KP spojený se sníženou aktivitou

antioxidačního enzymu PON1. Dále bylo zjištěno, že dosud užívané tumorové markery nekorelují se

stádiem onemocnění a že nově navrhovaný marker SAA by potenciálně mohl být markerem

odrážejícím pokročilost onemocnění KP.

Klíčová slova: karcinom pankreatu, stádium onemocnění, tumorové markery, paraoxonasa, sérový

amyloid A

ABSTRACT

Jméno: Nikola Nováková

Název práce: Klinický a biochemický obraz karcinomu pankreatu

Název anglicky: The Clinical and Biochemical Picture of the Pancreatic Carcinoma

Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola, Praha 1, Alšovo nábřeží 6

Vedoucí práce: RNDr. Lucie Vávrová, Ph.D.

Absolventská práce, Praha: VOŠZ a SZŠ, 2018, 52 Carcinoma of pancreas (KP) is treacherous disease that doesn’t cause any problems in early stages, so

it is asymptomatic and it leads to the late diagnosis. The disease is discovered in its late stages and

thus the prognosis is not good and the mortality is very high. Questionable is also the suitable option

of tumor markers that would be reflective of disease stage and would contribute to the early diagnosis.

The pathogenesis of KP is multifactorial. Important role in the pathogenesis of KP plays oxidative

stress.

The aim of this study was to compare the levels of lipid markers of oxidative stress (oxidized LDL –

ox-LDL, conjugated dienes – KD) and with lipid connected antioxidant enzyme paraoxonase (PON) in

patient with KP and healthy controls (KON). Next aim was to compare different tumor markers (CEA,

CA 19-9, CA 72-4) in patients in different stages of the KP, to compare, how these markers correlate

with the stage of the disease. Analyzed were also the levels of serum amyloid A (SAA) – newly

proposed marker of KP.

52 patients (M/F = 31/21) with KP and 52 sex- and age-matched KON were included into the study. In

the KP group, there were 12 patients in grade 2, 20 in grade 3 and 20 in grade 4 of KP. Activity of

PON and concentration of KD were measured spectrophotometrically, the levels of SAA and ox-LDL

were estimated with ELISA.

Decreased activities of arylesterase as well as lactonase activities of PON (p 0.0001), and increased

levels of SAA (p 0.0001), KD (p 0.05), ox-LDL (p 0.01) and also all observed tumor markers (p

0.001) were observed in patients with KP in comparison with KON. Tumor markers CEA and CA

72-4 were significantly decreased in patients in stage 2 and 3 compared to those in the final grade 4.

No significant differences were observed in the levels of tumor marker CA 19-9. Best correlation with

the grade of KP has shown the newly proposed KP marker SAA and the arylesterase activity of PON.

The obtained results confirm increased oxidative stress in connection with depressed activity of PON

in KP patients. Furthermore were find out that up to now used tumor markers don’t correlate with the

disease stage and that the newly proposed KP marker SAA could be good predictive marker of KP.

Key words: pancreatic carcinoma, stage, tumor markers, paraoxonase, serum amyloid A

Obsah

1 Úvod ........................................................................................................................... 10

2 Fyziologie pankreatu ................................................................................................ 11

2.1 Anatomie pankreatu ................................................................................................... 11

2.2 Histologie pankreatu .................................................................................................. 12

2.2.1 Stavba Langerhansových ostrůvků ............................................................................ 12

3 Vyšetřovací metody .................................................................................................. 14

4 Druhy onemocnění ................................................................................................... 16

4.1 Zánětlivé léze pankreatu ............................................................................................ 16

4.1.1 Akutní pankreatitida-akutní nekróza pankreatu ......................................................... 16

4.1.2 Chronická pankreatitida ............................................................................................. 16

4.1.3 Autoimunitní pankreatitida ........................................................................................ 16

4.2 Nenádorové cystické léze pankreatu .......................................................................... 17

4.2.1 Pseudocystické léze pankreatu ................................................................................... 17

4.2.2 Kongenitální cysty a cysty střevní duplikatury .......................................................... 17

4.2.3 Vaskulární tumory ...................................................................................................... 17

4.3 Duktální adenokarcinom pankreatu ........................................................................... 17

4.3.1 Duktální adenokarcinom ............................................................................................ 18

4.4 Varianty duktálního adenokarcinomu pankreatu ....................................................... 21

4.4.1 Adenoskvamózmí karcinom pankreatu ...................................................................... 22

4.4.2 Nediferencovaný karcinom ........................................................................................ 22

5 Nádorové markery ................................................................................................... 23

5.1 Tumorový marker CA 19-9 ........................................................................................ 24

5.2 Tumorový marker CEA.............................................................................................. 25

5.3 Tumorový marker CA 72-4 ........................................................................................ 25

6 Paraoxonáza ............................................................................................................. 26

6.1 Struktura paraoxonázy ............................................................................................... 26

6.2 Funkce paraoxonázy................................................................................................... 26

6.3 Stanovení paraoxonázy .............................................................................................. 27

7 Metodika ................................................................................................................... 28

7.1 Soubor vyšetřovaných pacientů ................................................................................. 28

7.2 Odběr a zpracování vzorků ........................................................................................ 28

7.3 Stanovení Paraoxonázy .............................................................................................. 29

7.3.1 Arylesterázová aktivita PON...................................................................................... 29

7.3.2 Laktonázová aktivita PON ......................................................................................... 31

7.4 Stanovení SAA ........................................................................................................... 31

7.5 Stanovení koncentrace konjugovaných dienů ............................................................ 31

7.6 Stanovení koncentrace oxidovaného LDL ................................................................. 32

7.7 Výpočet HOMA-IR .................................................................................................... 32

7.8 Statistické zpracování dat ........................................................................................... 32

8 Výsledky .................................................................................................................... 33

9 Diskuze a závěr ......................................................................................................... 40

10 Seznam použité literatury a zdrojů informací....................................................... 43

11 Seznam zkratek ........................................................................................................ 48

12 Seznam tabulek ........................................................................................................ 51

13 Seznam grafů ............................................................................................................ 52

10

1 Úvod

Tato absolventská práce se zaměřuje na karcinom pankreatu (KP) a jeho stanovení. Pankreas

neboli slinivka břišní je retroperitoneální orgán, který se nachází pod brániční klenbou mezi

žaludkem a velkými břišními cévami. Má společný vývod se žlučníkem, který ústí do části

dvanáctníku, kam se dostává natrávená potrava ze žaludku. Tím se uplatňuje jedna z funkcí

slinivky břišní, schopnost trávení potravy a její přeměny v důležité živiny jako je štěpení tuků,

složitých cukrů a bílkovin. To umožňují trávicí enzymy (trypsin, lipáza a amyláza). Pankreas

je také orgán, který je důležitou žlázou s vnitřní sekrecí, a to hlavně díky sekreci inzulínu, ale

i jiných hormonů jako jsou glukagon a somatostatin. Inzulín je pro náš lidský život

nepostradatelný, napomáhá totiž snižovat hladinu glykémie. Nedostatek i nadbytek inzulínu

může způsobit vážné komplikace zdravotního stavu až smrt pacienta. Proto se slinivka břišní

řadí k nejdůležitějším orgánům v těle.

Karcinomy jsou zhoubné nádory mající svůj původ v epitelových buňkách. Jsou to nádory

postihující nejčastěji dospělé, u dětí se vyskytují jen ojediněle. Karcinom pankreatu má u nás

incidenci okolo 12 - 20 případů na 100 000 obyvatel a rok. V posledních letech pacientů

přibývá. Karcinom pankreatu se řadí na třetí místo v žebříčku příčin smrti na nádorová

onemocnění u mužů mezi 35. až 54. rokem.

Tuto práci jsem si vybrala, protože karcinom pankreatu je velice zrádné onemocnění, které ze

začátku nezpůsobuje žádné potíže. Jedná se o asymptomatické onemocnění, což většinou vede

k pozdní diagnóze. Nemoc je často odhalena až v pokročilých stádiích onemocnění a má tedy

velmi špatnou prognózu a vysokou mortalitu.

Cílem této práce bylo porovnat jednak hladiny lipidových markerů oxidačního stresu –

oxidované LDL (ox-LDL) a konjugované dieny (KD) jednak aktivity s lipidy spojeného

antioxidačního enzymu paraoxonázy (PON) u pacientů s KP a zdravých kontrol (KON).

Dalším cílem bylo srovnat různé dnes užívané nádorové markery (CEA, CA 19-9, CA 72-4) u

pacientů v různém stádiu KP, porovnat, do jaké míry odrážejí stádium onemocnění. Sledován

byl i nově navrhovaný marker KP – sérový amyloid A (SAA).

11

2 Fyziologie pankreatu

2.1 Anatomie pankreatu

Slinivka břišní (pankreas) se nachází v dutině břišní, za pobřišnicí. Je označován jako

retroperitoneální orgán. Pankreas se rozděluje na tři části: hlava, tělo a ocas. Rozkládá se přes

celou dutinu břišní pod bránicí a játry, před aortou a dolní dutou žílou, dále pak za žaludkem a

malou předstěrou, nad příčným tračníkem, mezi dvanáctníkem a slezinou (1).

Části slinivky břišní

Hlava (caput pancreatis): Největší část pankreatu, která je umístěna v pravé polovině

trupu ve výši druhého bederního obratle. Hlava se spojuje s plochou dvanáctníku, do

kterého ústí vývody slinivky břišní (ductus pancreaticus major et minor). Velký vývod

shromažďuje pankreatickou šťávu z pankreatu. Než se vyústí do dvanáctníku, tak se

spojí se žlučovými cestami (ductus choledochus). Oba tyto vývody mají vlastní

kruhové svěrače a jeden společný, který se otevírá pouze v případě tráveniny ve

dvanáctníku (duodenum). Ústí vývodu v duodenu tvoří papilu (papilla duodeni major),

která se nazývá papilla Vateri. Malý vývod shromažďuje pankreatickou šťávu jen

z horní části hlavy pankreatu a ústí do papilla duodeni minor duodena, která je výše

než papilla Vateri. Mezi hlavou a tělem na spodině pankreatu se nachází zářez incisura

pancreatis a prochází přes něj cévy (vasa mesenterica superiora). Tyto cévy zásobují

střevo krví. Z vasa mesenterica superiora vychází malá část hlavy zvaná processus

uncinatus.

Tělo (corpus pancreatis): Užší část pankreatu, která spojuje hlavu s ocasem. Dosahuje

k levé ledvině.

Ocas (cauda pancreatis): Výběžek těla pankreatu, který je zúžený a směřuje směrem

ke slezině (1; 2).

12

2.2 Histologie pankreatu

Hlavní exokrinní složkou pankreatu je alveolární žláza, která se rozčleňuje do lalůčků, neboli

acinů. Stěny acinů vytváří acinární sekrečně aktivní buňky. Mají tmavší cytoplazmu, obsahují

větší množství zymogenních a sekrečních granul s proenzymy, ty jsou umístěné ve vrcholové

části buněk a jsou otočené do lumina lalůčku. Vznikající pankreatické šťávy se odvádějí

vsunutým vývodem. V luminu lalůčku jsou rozesety buňky toho vsunutého vývodu, tam

vytváří takzvané centroacinózní buňky se světlou cytoplazmou, které neobsahují zymogenní

granula. Z vazivového pouzdra, které obaluje pankreas, vybíhají septa, která od sebe oddělují

jednotlivé lalůčky. Podél sept proniká k lalůčkům hustá síť kapilár. Endokrinní složkou

pankreatu jsou Langerhansovy ostrůvky (3).

2.2.1 Stavba Langerhansových ostrůvků

Ostrůvky jsou obalené vazivovým obalem, který obsahuje retikulární a kolagenní vlákna. Jsou

ohrazeny sítí krevních kapilár, které mají charakter sinusoid. Sinusoidy přechází k ostrůvku

od okolních acinů. Propojují se do sítě a dále pokračují dovnitř ostrůvku mezi buňky, které

jsou sestaveny do nepravidelných trámců (4).

Buňky se dělí na tři typy, podle granul, které obsahují:

A buňky (-buňky): Větší buňky uloženy na periferii ostrůvku. Tvoří asi 20% buněk

ostrůvku. Obsahují malá kulatá uniformní granula, která se barví červeně, při Gomoriho

metodě. Produkují polypeptidový hormon-glukagon, který zvyšuje hladinu glukosy

v krvi a to stimulací glykogenolýzy v játrech.

B buňky (- buňky): Menší buňky, tvoří jádro (dřeň) Langerhansových ostrůvků. Jsou

nejpočetnější skupinou, zaujímají asi 60-80% buněk. Obsahují granula, která jsou menší

než granula A-buněk. Gomoriho metodou se barví modře. Granula jsou kulatá nebo

oválná o různé velikosti. Produkují polypeptidový hormon- insulin, který snižuje

glykémii. Hladinu glukosy snižuje tím, že zvyšuje přísun glukosy do jater a syntézu

glykogenu. Dále taky insulin zvyšuje vychytávání vstřebané glukosy z cirkulace tkáně a

orgánů (kosterní svalstvo, srdeční sval, tuková tkáň aj.).

13

D-buňky (-buňky): Podobné A- buňkám a B-buňkám. Obsahují jemná granula, která se

impregnují solemi stříbra. Mají nejmenší populaci, asi 5%. Produkují polypeptidové

hormony- gastrin, somatostatin. Gastrin ovlivňuje zvýšenou sekreci žláz žaludečního

fundu. Somatostatin je peptid, který působí inhibičně na sekreci polypeptidových

hormonů. Proto může v Langerhansově ostrůvku působit jako lokální regulátor sekrece

insulinu a glukogenu.

V Langerhansových ostrůvcích se vyskytují i další buňky, které jsou zastoupeny v malé míře

(méně než 1%). Jsou to buňky D1 a PP-buňky (4).

14

3 Vyšetřovací metody

Včasná a správná diagnostika nemocí slinivky břišní představuje i v dnešní době velký

problém. Podkladem pro diagnózu je vždy anamnéza pacienta a pečlivé fyzikální vyšetření

klinickým lékařem, doplněné klinicko-biochemickými metodami. Pomocí těchto metod se

stanovují hladiny pankreatických enzymů v krvi, které jsou vyplavovány při poškození

slinivky břišní (1).

Zásadní roli hrají neinvazivní metody. Převládající zobrazovací metodou pankreatu je

ultrasonografie (ultrazvuk), dále pak díky své nenáročnosti a neinvazivnosti endoskopická

ultrasonografie (EUS). Dále se pak využívá počítačová tomografie (CT), magnetická

rezonance (MR), nebo i endoskopická retrográdní cholangiopankreatografie (ERCP),

případně intraduktální sonografie (IDUS); (5).

Vyšetření pomocí EUS se využívá hlavně: (1)

k diferenciální diagnostice ultrasonografií solidních i cystických lézí pankreatu,

k diagnostice malých lézí pankreatu,

k časné diagnostice chronické pankreatitidy,

při hodnocení postupu léčby u pacientů s akutní pankreatitidou a idiopatickou

recidivující pankreatitidou,

ke stanovení genetického statutu nádorů, zvl. mutační analýzy K-ras, p53,p16 a LOH

chromozomu 18q (lokace genu DPC4) a dalších.

Endosonografie s použitím tenkojehlové aspirace (Fine needle aspiration, FNA) je poměrně

nová metoda, kterou v roce 1984 popsal japonský lékař Tio. Ve výzkumu ho následovala

řada dalších lékařů. V roce 1992 pan Vilmann uveřejnil jako první případ EUS-FNA odběru

léze v hlavě pankreatu pomocí lineárního echoendoskopu. EUS-FNA byla rozšířena pro

různé druhy orgánů a lézí (1; 5).

Další možnost představují cytologická vyšetření. V cytologické laboratoři se vzorky

získávají z několika různých zdrojů: z tkáně podezřelé z pankreatické masy, z obsahu

cystické léze, z regionálních lymfatických uzlin a z ložisek v játrech. Cytologické a

15

bioptické vyšetření se může provádět ze vzorku, který se získá perkutánní cestou,

retrográdně z vývodného biliárního a pankreatického systému (1).

16

4 Druhy onemocnění

4.1 Zánětlivé léze pankreatu

Záněty pankreatu probíhají buď jako akutní nebo chronické. Výskyt těchto onemocnění v naší

populaci stoupá díky zvýšené spotřebě alkoholu, kouření, špatným stravovacím návykům

spojených s obezitou aj.

4.1.1 Akutní pankreatitida-akutní nekróza pankreatu

Zánětlivé onemocnění pankreatu, které může mít od lehké až po těžkou formu se znaky

multiorgánového selhání nebo abscesy, pseudocystami a nekrózou pankreatu a přilehlé tkáně.

Akutní pankreatitida patří k nejzávaznějším a i prognosticky nejhorším náhlým příhodám

břišním. Pokud se akutní pankreatitidy opakují, může se stát z akutní pankreatitidy chronická.

Výskyt se udává mezi 20-50 případy na 100 000 obyvatel, nejčastěji postihuje osoby ve věku

50-55 let (1).

4.1.2 Chronická pankreatitida

Chronická pankreatitida je onemocnění pankreatu s poruchou zevní a později i vnitřní

sekrece. Fibrotická tkáň potupně nahradí funkční tkáň. V poslední době incidence tohoto

onemocnění neustále narůstá, v České republice je největší výskyt na jižní Moravě a je

srovnatelný s Německem nebo Maďarskem. Činí téměř 8 nově diagnostikovaných případů na

100 000 obyvatel za rok (1; 6).

4.1.3 Autoimunitní pankreatitida

Toto onemocnění tvoří 4-6% všech chronických pankreatitid. Je typické, že se krom

pankreatitidy objevuje postižení jiných i dalších orgánů, hlavně žlučových cest a jater,

slinných žláz nebo ledvin (5).

17

4.2 Nenádorové cystické léze pankreatu

Cystické léze pankreatu představují skupinu patologických změn. Dají se rozdělit na dvě

základní skupiny: netumorózní etiologie a tumorózní etiologie. Dále se taky dají rozdělit

podle typu epitelu, který je vystýlá (6).

4.2.1 Pseudocystické léze pankreatu

Pseudocysty se vyskytují častěji než cystické tumory. Uvádí se poměr 9 : 1. Pseudocysty

bývají tlustostěnné a obalené vazivem, často bývají mimo vlastní tkáň pankreatu. Ve velkém

procentu komunikují s vývodným systémem pankreatu. Jen výjimečně tato cysta vznikne

z obstrukce vývodu v důsledku karcinomu (7).

4.2.2 Kongenitální cysty a cysty střevní duplikatury

Vrozené cysty se vyskytují v pankreatické tkáni většinou samostatně, ale výskyt může být i

mnohočetný. Zvláště mají-li vzájemný vztah s jinými vrozenými cystickými vadami (např.

polycystické onemocnění ledvin); (6; 7).

4.2.3 Vaskulární tumory

Vaskulární tumory jsou v pankreatu velmi vzácné. V roce 1991 byl popsán Kabayashim

raritní nález kavernózního hemangiomu v pankreatu. V pankreatu se spíše vyskytují

lymfangiomy (8).

4.3 Duktální adenokarcinom pankreatu

Zhoubné nádory pankreatu patří k prognosticky nejhorším nádorům. V České republice je

diagnostikováno asi 1700 pacientů s tímto onemocněním. Je to pátá nejčastější příčina úmrtí

18

na nádorové onemocnění v ČR. Celosvětově je pozorován pomalý nárůst počtu případů.

Evropa a severní Amerika vykazují vyšší nárůst než ostatní kontinenty (1).

4.3.1 Duktální adenokarcinom

Duktální adenokarcinom (Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA), mucinózní

cystadenokarcinom (MCC) a intraduktální papilární mucinózní neoplazie (IPMN) vznikají

z duktálních buněk a tvoří společně zhruba 90% všech exokrinních pankreatických neoplázií.

Ostatní nádory vychází z lalůčkové tkáně nebo jejich histogeneze není úplně jasná. V 75-81%

případů se jedná o PDA, z toho 61% je lokalizováno v hlavě pankreatu, v těle cca 15% a

v poslední části pankreatu – ocasu kolem 5%. Podle statistických údajů onemocnění postihuje

častěji muže než ženy, s výrazným nárůstem počtu zjištěných případů u mužů i žen ve věku

nad 70 let. Až jedna pětina nádorů vytváří v pankreatu mnohočetná ložiska.

Karcinom je pomocí endoskopické ultrasonografie zobrazován jako ložisko heterogenní

solidní masy nepravidelných hypoechogenních (místo se slabší odezvou při ultra zvukovém

vyšetření) hranic. Zobrazovací metody nám mohou pomoci vytvořit si představu o vztazích

k vaskulárním strukturám, zjistit přítomnost zvětšených uzlin a metastáz v játrech.

Největším problémem se stává rozlišení PDA od chronické pankreatitidy. Diferenciálně-

diagnostické rysy adenokarcinomu ve srovnání s reaktivní hyperplazií u chronické

pankreatitidy jsou shrnuty v tabulce 1. Karcinom hlavy pankreatu se projevuje progresivní

žloutenkou spojenou s bolestí vyplývající z neoplastické invaze stěny společného žlučového

vývodu. Karcinom těla a ocasu pankreatu nemá výrazné příznaky, a proto může dorůstat

větších velikostí (1; 8).

19

Tabulka 1: Diferenciálně diagnostické rysy adenokarcinomu a reaktivní hyperplazie u

chronické pankreatitidy (1)

Chronická pankreatitida

s reaktivní atypií

Adenokarcinom pankreatu

Architektonické rysy Kohezivní trsy duktálních

epitélií, jednovrstevné

plachtovité formace, místy se

zmačkanými jádry

Nepravidelné shluky duktálních

epitélií a jednotlivé nádorové buňky

Plachtovité a trojrozměrné trsy

s výraznými nakupenými stlačenými

buňkami, které se i překrývají

(drunken honeycomb pattern)

Jaderná membrána Hladká jaderná membrána Jaderná membrána s rýhami, záhyby,

nepravidelnostmi, konzistentně

neostrá

Jaderný chromatin Euchromazie až lehká jaderná

hyperchromazie

Výrazná jaderná hyperchromazie

Nukleoplasmatický

poměr (N/P)

Normální, místy lehce zvýšený

N/P

N/P poměr ve prospěch jádra

(minimálně 2x větší jádro než červená

krvinka)

Morfologie jádra Minimální jaderný

pleomorfismus

Výrazný jaderný pleomorfismus

Mitotická aktivita Minimální Zvýšený počet mitóz

Přítomnost nekrózy Bez přítomnosti nekrózy Nekrózy časté

Přítomnost stromatu Fibrotizovaná stromální tkáň

Kalcifikace

Nádorové stroma sklerotického

vzhledu

Acinární buňky Skupinky acinárních buněk

prostoupené vazivovými

buňkami

Nečetné acinární buňky bez

patologických změn

Pozadí Granulovaná drť na pozadí se

zánětlivými elementy

Čisté nebo „špinavé“ pozadí

s mucinem, zánětlivými elementy a

buněčnou nekrotickou drtí

20

4.3.1.1 Histologický obraz duktálního adenokarcinomu

Mikroskopicky se jedná o struktury různě diferencovaného adenokarcinomu s epitelem, který

připomíná struktury duktů pankreatu (1).

4.3.1.2 Cytologické nátěry z EUS-FNA

Cytologické nátěry z FNAB (tenkojehlová aspirační biopsie pod sonografickou navigací),

které se získávají punkcí PDA, jsou buněčně bohaté a obsahují shluky atypických duktálních

epitélií. Morfologie atypických buněk se mění od izolovaných buněk, tubulek až po

trojrozměrné klastry. Ve větším množství by přítomnost jiných typů buněk měla upozornit na

možnost jiné léze. Nádorové buňky jsou anizonukleózní (významná variace jaderné velikosti),

mají nepravidelnou jadernou membránu a zvětšené jádro. Cytoplazma je bazofilní

s vakuolizací a jádra mají zářezy tzv. molding, což znamená pomačkaná jádra. Stupeň atypie

souvisí s diferenciací adenokarcinomu. Ten může být popsán jako dobře diferencovaný typ

nebo může mít obraz anaplastického karcinomu. Dobře diferencovaný PDA je velmi těžké

odlišit od chronické pankreatitidy, ale také od intraepiteální neoplazie high grade. V praxi se

setkáváme se dvěma variantami cytologického obrazu:

1. známky změněných atypických epitélií, které se jeví jako maligní

2. obraz odpovídá dobře diferencovanému adenokarconimu - benigní nález

Je nutné znát klinický průběh onemocnění a výsledky dalších vyšetření (4). Typické

cytologické rysy adenokarcinomu pankreatu podle míry jeho diferenciace shrnuje tabulka 2.

21

Tabulka 2: Typické cytologické rysy adenokarcinomu pankreatu podle stupně diferenciace

(1)

Obecný nález

malignit PDA

Dobře diferencovaný

adenokarcinom

Středně a nízce

diferencovaný

adenokarcinom

Buněčné nátěry s čistým nebo

se špinavým pozadím

s hlenem, nekrózou,

zánětlivými elementy

Velký počet dvojrozměrných

trsů epitélií duktálního typu

Trojrozměrné buněčné trsy a

shluky atypických buněk

Predominantní buněčná

populace-atypické duktální

epitélie

„Opilé“ voštinovité struktury

s přítomností holých jader mezi

shluky

Jaderné stlačení a překrývání

buněk, prominující

makronukleoly

Nepravidelná jaderná hranice Minimálně změněná jaderná

hranice

Jaderná membrána

s nepravidelnostmi

Zvětšená jádra větší než

dvojnásobek erytrocytu

V některých buňkách nízký

nukleoplasmatický poměr

Vzestup nukleární atypie

Roztroušené, izolované, silně

atypické buňky

Zhrubělý chromatin Roztroušené izolované

atypické buňky

Buňky vzhledu náhrobního

kamene

Velké, kolumnární buňky

s výraznou atypií

Nekrózy v různém množství Nekrózy ojediněle Bohaté nekrotické elementy

Mitózy v různém množství Mitózy jsou zachyceny Četné mitózy

Dvojjaderné až mnohojaderné

buňky

Pyramidální až mrkvovitá jádra Přítomnost cytoplasmatického

mucinu střední až slabá

4.4 Varianty duktálního adenokarcinomu pankreatu

Signifikantní podklady pro odhad a managment neoplazie jsou jen u karcinomů z buněk

pečetního prstenu a u malobuněčných nediferencovaných karcinomů. Zde je velmi špatná

22

prognóza a přežití se počítá často na týdny. Při brzkém zahájení chemoterapie u

malobuněčného karcinomu může dojít k úplné nádorové remisi (8).

4.4.1 Adenoskvamózní karcinom pankreatu

Tento karcinom tvoří necelých 5 % všech PDA. Typickým rysem je výskyt dvojí populace

nádorových struktur. Jsou to žlázové a dlaždicové komponenty.

4.4.2 Nediferencovaný karcinom

Nediferencovaný karcinom byl poprvé popsán v roce 1954 Sommersem a Meisnerem. Je to

vzácný a vysoce maligní nádor. Rozeznáváme celkem 3 varianty nediferencovaného

karcinomu: anaplastický karcinom, sarkomatoidní karcinom a karcinosarkom.

Nediferencovaný karcinom lze charakterizovat rozmanitou buněčnou populací s přítomností

bizarních a mnohojaderných buněk, a také pleomorfního a vřetenovitého vzhledu. Díky

svému polymorfismu zahrnuje rozsáhlou paletu diferenciálně diagnostických malignit od

melanomu, lymfomu, sarkomu až po mestatické postižení karcinomem (6; 8).

23

5 Nádorové markery

Nádorové markery představují skupinu látek, které jsou produkovány nádorovými buňkami,

nebo hostitelem jako odpověď na přítomnost tumoru a přitom nejsou přítomny, nebo jen v

omezeném množství, v normálních buňkách (9).

Mezi markery produkované tumorem se řadí enzymy (např. laktátdehydrogenáza-LD, neuron

specifická enoláza-NSE, prostatická kyselá fosfatasa-PSA), imunoglobuliny nebo jejich

fragmenty či podjednotky (monoklonální imunoglobuliny, tzv. "paraproteiny"), hormony

(např. lidský choriogonadotropin-hCG, parathormon, adrenokortikotropní hormon-ACTH,

kalcitonin, gastrin, prolaktin, norepinefrin, epinefrin), fragmenty komplexních glykoproteinů,

(např. glykolipidový nádorový marker-CA19-9, glykoproteinový nádorový marker-CA15-3,

sérový nádorový marker-CA125), fragmenty cytokeratinů (tkáňový polypeptidický antigen-

TPA, tkáňový specifický polypeptidový antigen-TPS, fragment cytokeratininu 19-

CYFRA21-1), onkofetální antigeny (alfa-fetoprotein-AFP, karcinoembryonální antigen-

CEA), molekuly receptorové povahy (estrogenový a progesteronový receptor, receptor pro

interleukin 2, transmembránový receptor- HER2/neu a epidermal growth factor receptor -

EGF) a cirkulující buněčné elementy (10).

Jejich přítomnost se testuje z odebrané krve a jde o rutinně prováděné vyšetření, které má

velký přínos pro další diagnostiku a léčebné postupy (11). Tumorové markery můžeme

stanovovat jak metodami kvalitativními (tedy pouze dokázat jejich přítomnost), tak

kvantitativními. Využít lze metody chemické, imunologické nebo metody molekulární

biologie.

Tumorové markery se v určité velmi nízké koncentraci vyskytují v těle každého z nás.

Zvýšená koncentrace tumorových markerů značí, že něco není v pořádku. Přesto většina

tumorových markerů není příliš spolehlivým ukazatelem – nezřídka se objevují případy, kdy

člověk s nádorem nemá zvýšenou koncentraci tumorového markeru, nebo naopak člověk bez

nádorového onemocnění má zvýšenou koncentraci některého z tumorových markerů. Příčinou

tohoto falešně pozitivního výsledku může být např. zánět nebo nezhoubný nádor. Náhodně

zjištěné zvýšení specifického tumor markeru nám ukazuje, že se v určité tělní soustavě může

odehrávat nějaký patologický děj a je nutné další vyšetření.

24

Zásadní význam mají tumor markery ve chvíli, kdy je nalezen určitý nádor. Zvýšení

koncentrace příslušného tumor markeru v krvi bývá velmi často přímo úměrné

počtu nádorových buněk v těle. Tumorové markery slouží též ke sledování úspěšnosti terapie

(chirurgie, ozařování, chemoterapie). Během terapie se sleduje koncentrace určitého

specifického tumorového markeru, a pokud je terapie úspěšná, jeho koncentrace by měla

klesat. Tumorové markery mohou být i dobrým ukazatelem relapsu nádorového onemocnění

(11).

5.1 Tumorový marker CA 19-9

Tumorový marker CA 19-9 je glykoprotein fetálního epitelu gastrointestinálního traktu

(GIT), pankreatu a jater, u dospělých je velice omezeně produkován epitelem bronchů a GIT.

Tento marker je spojen s nemocemi a nádory trávicího traktu, hlavně s onemocněními

slinivky břišní. Většinou se zjišťuje jeho koncentrace v krvi při normálním odběru žilní krve,

na specializovaných pracovištích. Může se hodnotit spolu s jinými markery (zejména CEA) i

v jiných tekutinách jako je tekutý obsah cyst slinivky získané odsátím tenkou jehlou.

Zvýšená hladina CA 19-9 může znamenat rakovinu slinivky břišní, ale také ji najdeme i u

některých nádorů tlustého střeva, u rakoviny jater a rakoviny jícnu. Samo o sobě však zvýšení

CA 19-9 není dostačující a nemůže vést k diagnóze. Musí být dále potvrzeno zobrazovacími

metodami (ultrazvuk, CT vyšetření), endoskopicky a biopsií (odběr podezřelé nádorové tkáně

a jeho vyšetření pod mikroskopem). Stanovení markeru CA 19-9 je pro diagnózu pouze

pomocná metoda, průběžné monitorování jeho hladin se hodí u již potvrzené rakoviny během

léčby. Kdy změny koncentrace CA 19-9 nám sdělují informace o její úspěšnosti. Koncentrace

CA 19-9 není zvýšená jen u nádorů, ale vysoké koncentrace mohou být i u pacientů

s akutním a chronickým zánětem slinivky břišní, při cirhóze a u lidí s poruchou odtoku žluči.

Naopak u některých lidí nedochází i u pokročilých forem nádorů ke zvýšení hladiny CA 19-9

a marker je falešně negativní (11).

25

5.2 Tumorový marker CEA

CEA je karcinoembryonální antigen, který se řadí mezi běžně používané tumorové markery.

Karcinoembryonální antigen se vytváří v těle plodu. Po porodu je jeho normální koncentrace

minimální. CEA je nejčastěji spojován s nádorovými onemocněními trávicí trubice, jeho

koncentraci v krvi vyšetřujeme z běžného krevního náběru.

Zvýšená hladina CEA bývá v případě rakoviny tlustého střeva a rakoviny žaludku, dále ji pak

můžeme najít i u rakoviny slinivky břišní, rakoviny plic, rakoviny štítné žlázy a rakoviny

prsu. Pravidelné měření hodnot CEA je vhodné u již prokázaného tumoru u pacienta

podstupujícího léčbu, kdy nám změny koncentrace CEA vypovídají o úspěšnosti léčby.

Pokles koncentrace CEA naznačuje úspěšnou a naopak zvýšení koncentrace neúspěšnou

léčbu.

CEA nemusí být zvýšené jen u nádorů, vysoké koncentrace mohou být i u pacientů s akutním

a chronickým zánětem slinivky břišní, při cirhóze, u ulcerózní kolitidy a u Crohnovy nemoci.

Zvýšení hladiny CEA je také u pravidelných kuřáků. U některých lidí nedochází i u

pokročilých forem výše zmíněných nádorů ke zvýšení hladiny CEA a marker je falešně

negativní (11).

5.3 Tumorový marker CA 72-4

Tumorový marker CA 72-4 je glykoprotein mucinového typu, řadí se mezi onkofetální

nádorové markery. Fyziologicky CA 72-4 je intenzivně produkován u vyvíjejícího se plodu

povrchovými epiteliálními buňkami jícnu, žaludku a pankreatu. U zdravých dospělých

jedinců je produkován těmito buňkami ve velmi malé míře. Jeho fyziologická funkce není

zatím známa.

Marker CA 72-4 je hlavním ukazatelem u karcinomu žaludku, dále pak u karcinomu ovaria.

Zvýšená hladina CA 72-4 může být i u kolorektálního karcinomu (v 3-70% případů a to v

závislosti na stagi tumoru), dále u tumorů biliárních, pankreatických, esophageálních,

endometriálních a u tumorů prsu (12).

26

6 Paraoxonáza

Gen paraoxonázy je u lidí umístěn na 7 chromozomu a skládá se ze tří složek PON1, PON2 a

PON3 (13). Jednotlivé proteiny PON sdílí přibližně 60% sekvenční identity. Název

paraoxonasa je čistě historický, odvozený od její schopnosti katalyzovat přeměnu paraoxonu.

Paraoxonázy se řadí mezi hydrolázy (14). Paraoxonáza-1 je syntetizována v játrech a vylučuje

se do krve, kde se spojuje s částicemi HDL (high-density lipoprotein) prostřednictvím

Apolipoproteinu A-1 (apo A1); (15).

6.1 Struktura paraoxonázy

Lidská PON1 je glykoprotein o velikosti 43 000 kDa, složený z 354 aminokyselin (16) 3

polysacharidových jednotek a dvou atomů Ca2+

. Jeden atom Ca2+

plní s největší

pravděpodobností důležitou strukturní úlohu, proto je považován za tzv. „strukturní vápník",

jehož disociace vede k nevratné denaturaci proteinu (17). Druhý atom Ca2+

se označuje jako

"katalytický vápník" a nachází se v katalytickém centru molekuly PON1 spolu s fosfátovým

iontem. Celkem existují čtyři potenciální N-glykosylační místa na PON1: dva glykanové

řetězce jsou spojeny asparaginovými zbytky v polohách 253 a 324 na povrchu molekuly (18),

dvě další potenciální pozice jsou Asn224 a Asn270 v centrální části molekuly PON a jsou z

velké části nepřístupné (14). Glykosylace není důležitá pro hydrolytickou aktivitu PON (16),

ale může být důležitá pro zvýšení její rozpustnosti a pro její stabilitu (14).

6.2 Funkce paraoxonázy

Paraoxonáza plní řadu důležitých fyziologických rolí. Sérová PON1 katalyzuje hydrolýzu a

tím i inaktivaci oxonů, jako je například paraoxon (diethyl-4-nitrofenylfosfát), chlorpyrifoson

a diazoxon, což jsou toxické metabolity organofosfátových insekticidů jako je parathion (O,

O-diethyl-O- (4 nitrofenyl)-fosforothioát) a chlorpyrifos (O,O-diethyl O-3,5,6-trichlorpyridin-

2-ylfosforothioát). Paraoxonáza je schopna hydrolyzovat i nervové látky sarin ((RS) -propan-

2 ylmethylfosfonofluoridát) a soman (3,3 dimethylbutan-2-ylmethylfosfonofluoridát). Navíc

PON1 hydrolyzuje arylestery, jako je fenylacetát, thiofenylacetát a 2-naftylacetát (20, 21).

27

Dále je schopná hydrolyzovat různé aromatické a alifatické laktony, jako je lakton kyseliny

homogentisové, dihydrokumarin, γ butyrolakton a homocystein thiolakton (22; 23).

Vědci spekulují, že původní, přirozená aktivita PON, je laktonázová aktivita (24; 25), pro

kterou je zásadní volný cystein-284 ve struktuře PON1 (26). Z fyziologicky se vyskytujících

látek, by jejím substrátem mohl být nějaký derivát procesu oxidace mastných kyselin, jako je

5-hydroxy-6E, 8Z, 11Z, 14Z (5-HETE) lakton kyseliny eikosatetraenové, který se nachází

v částicích HDL. Dále bylo prokázáno, že homocysteinthiolakton je přirozeně se vyskytující

substrát PON1 (27). Homocysteinthiolakton je metabolitem homocysteinu a může způsobit

dysfunkci a poškození cév (28). Detoxikací homocysteinuthiolaktonu PON1 chrání proteiny

před homocysteinylací (27; 29).

In vitro testy ukázaly, že PON1 může inhibovat peroxidaci LDL (lipoprotein s nízkou

hustotou) částic a inaktivovat oxidované fosfolipidy odvozené od LDL (30; 31; 32). Bylo

prokázáno, že PON1 má také peroxidáze podobnou aktivitu - je schopna hydrolyzovat peroxid

vodíku, snížit koncentraci lipoproteinových peroxidů (až o 19%) a hydroperoxidů cholesteryl-

linoleátu (až o 90%); (13; 21).

6.3 Stanovení paraoxonázy

Aktivitu PON 1 je možno stanovovat ve vztahu k různým druhům jejích substrátů (tři druhy

aktivit – paraoxonázová, arylesterázová, laktonázová). K měření arylesterázové aktivity

PON1 se jako substrát využívá fenylacetát (33). Paroxonázová aktivita PON1 se stanoví s

pomocí paroxonu (33; 34; 35). Pro stanovení laktonázové aktivity PON1 se mohou použít

různé substráty, jsou vypracovány metodiky pro stanovení s 5-thiobutylbutyrolaktonem (36;

37), 2-kumaranonem (22) a laktonem kyseliny homogentisové (22).

28

7 Metodika

7.1 Soubor vyšetřovaných pacientů

Do studie bylo zařazeno celkem 52 pacientů (M/Ž = 31/21) s KP a 52 KON spárovaných se

skupinou KP na základě věku a pohlaví. Z 52 pacientů s KP bylo 12 pacientů ve stádiu 2, 20

pacientů ve stádiu 3 a 20 pacientů ve 4. stádiu onemocnění. Všichni pacienti byli obeznámeni

s podmínkami a průběhem studie a podepsali informovaný souhlas. Studie byla prováděna na

IV. interní klinice Všeobecné fakultní nemocnice (VFN) v Praze a byla schválena etickou

komisí.

Mezi vylučovací kritéria patřila manifestní kardiovaskulární, jaterní či renální onemocnění,

užívání antioxidantů, suplementů polynenasycených mastných kyselin či ethylalkoholu

v dávce vyšší než 20 g denně, prodělaný operační zákrok či infekční onemocnění. Pro

kontrolní skupinu pak bylo dalším vylučovacím kritériem jakékoli onemocnění.

7.2 Odběr a zpracování vzorků

Odběry krve byly prováděny po celonočním lačnění. Hodnoty všech zkoumaných tumorových

markerů (CA 19-9, CA 72-4, CEA, SAA), hladiny parametrů lipidového profilu (TC, TAG,

HDL-C, LDL-C, apo-AI, apo-b), stejně jako aktivita PON a koncentrace markerů oxidačního

stresu (konjugovaných dienů, oxidovaných LDL) byly stanoveny v séru. Vacutainery s

odebranou srážlivou krví necháme po odběru cca 30 minut stát při laboratorní teplotě a

následně centrifugujeme při 3000 rpm po dobu 10 minut, sérum následně rozpipetujeme na

jednotlivé vzorky. Všem vzorkům byly přiřazeny unikátní anonymizační kódy, vzorky byly

poté před analýzou skladovány při -80ºC. Rutinní analýzy byly provedeny v laboratoři Ústavu

lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN v Praze.

29

7.3 Stanovení Paraoxonázy

7.3.1 Arylesterázová aktivita PON

Arylesterázová aktivita paraoxonázy (PON-A) se stanovuje v séru spektrofotometrickou

kinetickou metodou. Ke stanovení se využívá schopnosti paraoxonázy katalyzovat hydrolýzu

fenylacetátu na fenol a kyselinu octovou. Měří se nárůst absorbance při 270 nm, daný

narůstajícím množstvím vznikajícího fenolu. Měřeno modifikovanou metodou dle Eckerson a

kol. (33).

Použité chemikálie:

A. TRIS-HCl pufr (20mM) pH 8,0; s přídavkem CaCl2 (1mM)

Příprava 250ml pufru: Navážíme 0,6058g TRIS a 0,003675g CaCl2 a rozpustíme ve vodě,

pomocí 2M HCl upravíme pH na hodnotu 8,0 a doplníme do 250 ml. Pufr uchováváme při

teplotě +4°C maximálně 1 týden nebo zamražený při -20°C.

B. Fenylacetát (100mM) v pufru (startovací roztok)

Příprava 2ml roztoku: Ve skleněné zkumavce rozpustíme 0,0272g fenylacetátu v 0,8 ml

methanolu a během stálého míchání na třepačce po kapkách přidáme 1,2 ml TRIS pufru.

Z důvodu spontánní hydrolysy substrátu připravujeme roztok vždy čerstvý pro 4-5 analýz. Po

nárůstu absorobance blanku (slepého vzorku) o 0,100 připravíme nový startovací roztok.

Roztok fenylacetátu je nejstabilnější za laboratorní teploty.

C. Sérum

Sérum ředíme pufrem těsně před měřením a to podle předpokládané aktivity:

a) pacienti v kritickém stavu- ředění 40x a 60x

b) pacienti s méně závažnými onemocněními- ředění 80x a 60x

c) zdravé osoby- ředění 80x a 100x

30

Postup měření

Každé stanovení se provádí v tripletu. V tabulce 3 jsou uvedeny parametry provedení metody

a nastavení přístroje. V tabulce 4 je zobrazeno pipetovací schéma.

Tabulka 3: Parametry měření pro stanovení PON 1

Parametr Hodnota parametru

Vlnová délka 270nm

Počet kyvet 7

Délka měření 2 min

Interval 40 s

Teplota 25°C

Tabulka 4: Schéma pro stanovení aktivity PON 1

Roztoky Blank (l) Vzorek (l)

20mM TRIS-HCl pufr

pH 8,0

945 945

Ředěné sérum, plasma - 50

Voda/pufr 50 -

Promíchání reakční směsi v kyvetě

100mM fenylacetát 50 50

Výpočet aktivity paraoxonázy:

Výpočet aktivity PON-A provádíme s pomocí molárního extinkčního koeficientu pro fenol při

270 nm, kdy 270= 1310M-1

*cm-1

. Aktivitu PON-A vyjadřujeme v mezinárodních jednotkách

enzymové aktivity (U= mol/min) vztažené na ml séra (U/ml séra). Aktivita je dána

množstvím (počtem molů) vzniklého fenolu za jednotku času.

31

7.3.2 Laktonázová aktivita PON

Laktonázová aktivita PON (PON-L) byla měřena modifikovanou metodou, která byla dříve

popsána ve studii Draganov et al. (37). Jako substrát pro PON sloužil dihydrocoumarin o

konečné koncentraci 1mM. Po dobu 2 minut byl sledován nárůst absorbance při 270 nm.

Enzymová aktivita byla počítána na základě hodnoty molárního extinkčního koeficientu

výsledného produktu reakce 3-(2-hydroxy-fenyl)-propionát; (ε = 1295dm3mol

-1cm

-1); (38).

Aktivita PON-L byla vyjádřena v mezinárodních jednotkách enzymové aktivity (U=

mol/min) vztažené na ml séra (U/ml séra).

7.4 Stanovení SAA

Koncentrace sérového amyloidu A (SAA) byla stanovena za použití metody ELISA pomocí

kitu firmy Invitrogen (kat. č: KHA 0011).

7.5 Stanovení koncentrace konjugovaných dienů

Koncentrace konjugovaných dienů (KD) byla měřena modifikovanou metodou dle Wieland et

al. (39). Lipoproteiny s nízkou hustotou v séru byly izolovány srážecí metodou dle Ahotupa et

al. (40).

Postup měření:

K 1 ml 0,064 M citrátového pufru (pH = 5,05 s 50 000 U/I heparínu) bylo přidáno 110 μl

séra s přídavkem EDTA (10:1),

suspenze byla následně inkubována po dobu 10 minut při pokojové teplotě,

centrifugací při 2800 rpm po dobu 10 minut se poté oddělily vysrážené lipoproteiny,

sraženina se resuspendovala ve 100 μl fyziologického roztoku,

extrakce lipidů byla prováděna směsí dichlor-metan – methanol (2:1), a dále bylo k

separaci použito 250 μl redestilované vody,

poté byla směs centrifugována při 3000 rpm po dobu 5 minut,

32

800 μl dolní vrstvy (infranatant) bylo vysušeno pod dusíkem, a znovu rozpuštěno v 300 μl

cyklohexanu. Následně byla měřena absorbance při 234 nm.

Koncentrace KD byla vypočítána s použitím molárního absorpčního koeficientu (2,95 x

104

M-1

cm-1

).

7.6 Stanovení koncentrace oxidovaného LDL

Hladina oxidovaného LDL (ox-LDL) byla stanovena metodou ELISA prostřednictvím kitu

firmy Mercodia. Při stanovení se využívají myší monoklonální protilátky proti

konformačnímu epitopu v oxidovaném apo B-100.

7.7 Výpočet HOMA-IR

Index modelu homeostasy insulinové rezistence (HOMA-IR) byl vypočítán dle vzorce:

HOMA-IR =

7.8 Statistické zpracování dat

Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako průměr směrodatná odchylka (SD) u parametrických

a jako medián (25-75percentil) u neparametrických proměnných. Ke statistické analýze

parametrických veličin byl použit t-test pro srovnání 2 skupin (KP vs. KON) a one-way

ANOVA s Newman-Keuls post testy pro srovnání 3 skupin (pacienti dle stádia onemocnění),

u neparametrických veličin byl použit Man-Whitney U-test respektive Kruskal-Wallis

ANOVA. Data byla zpracována v programu Statistica verze 12.0 (Statsoft , 2017 CZ). Za

statisticky významné byly výsledky považovány při p 0,05.

33

8 Výsledky

Tato absolventská práce byla zaměřena na pacienty s karcinomem pankreatu. Celkem bylo

sledováno 52 pacientů (M/Ž = 31/21) s KP v porovnání se zdravými kontrolami, které byly se

skupinou KP spárovány na základě pohlaví a věku. Základní charakteristiky sledovaných

skupin jsou shrnuty v tabulce 5.

Tabulka 5: Charakteristika skupin

Parametr KP KON

N (M/Ž) 52 (31/21) 52 (31/21)

Věk (roky) 64,3 ± 10,1 60,9 ± 9,07

Kuřáci (N; %) 33; 63,5% 12; 23%

DM 2 (N; %) 19; 36,5% 0; 0%

Malnutrice (N; %) 26, 50% 0; 0%

Staging T2 (N; %) 12; 24% -

Staging T3 (N; %) 20; 38% -

Staging T4 (N; %) 20; 38% -

BMI (kg/m2) 25,5 ± 4,9 25,9 ± 3,67

NRI 96,7 ± 11,4 -

P-AMS (kat/l) 0,32 (0,135 – 0,733) 0,48 (0,39 – 0,57)

Lipasa (kat/l) 0,77 (0,37 – 1,81)** 0,6 (0,51 – 0,71)

CEA (g/l) 3,87 (1,88 – 7,70)*** 0,81 (0,5 – 1,9)

CA 72-4 (kU/l) 3,14 (1,76 – 23,84)** 1,79 (1,07 – 4,08)

CA 19-9 (kU/l) 314,75 (59,25 – 3837,9)*** 8,6 (5,8 – 11,2)

-fetoprotein (g/l) 2,7 (2,1 – 4,0)* 3,5 (2,7 – 4,4)

CRP (mg/l) 16,6 (7,4 – 55,15)*** 2,65 (1 – 5,08)

N:počet, DM: diabetes mellitus,BMI: Body mass index, WHCR: poměr pas/body, NRI- nutrition risk

index, P-AMS: pankreatická amyláza, CEA: karcinoembryonální antigen, CA72-4, CA19-9: tumorové

markery, CRP: C-reaktivní protein, KP:karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina; Data

prezentována jako průměr S.D. pro parametrické a medián (25-75 percentil) pro neparametrické

veličiny. Statistické zpracování bylo provedeno t-testem pro parametrické a Man-Whitney U-testem

pro neparametrické veličiny. * KP vs. KON; * p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001.

34

Pacienti s karcinomem byli dále rozděleni podle pokročilosti jejich onemocnění. Onemocnění

bývá většinou diagnostikováno až v jeho pozdějším stádiu, proto není ve studii žádný pacient

v 1. stádiu a do studie mohlo být zařazeno pouze 12 pacientů ve 2. stádiu. Dále bylo zařazeno

vždy 20 pacientů ve 3. a ve 4. stádiu.

Z tabulky 5 vyplývá, že polovina pacientů s KP trpělo těžkou malnutricí a 36,5% pacientů

mělo diabetes mellitus 2. typu. Dle předpokladu měla skupina KP oproti kontrolní skupině

signifikantně zvýšené hodnoty všech sledovaných nádorových markerů. Nejvyšší nárůst byl

pozorován u tumorového markeru CA 19-9, který bývá zvýšen nejvíce právě u nádorů

v dutině břišní a hlavně u nádoru pankreatu. Z výsledků dále vyplývá, že karcinom pankreatu

je provázen zánětlivými procesy, jak ukazují zvýšené hladiny CRP u KP ve srovnání s KON.

Tabulka 6: Markery lipidového a sacharidového metabolismu

Parametr KP KON

TC (mmol/l) 5,4±2,10 5,3±1,03

TAG (mmol/l) 1,9±0,93*** 0,98±0,36

HDL-C (mmol/l) 0,9±0,38*** 1,6±0,37

LDL-C (mmol/l) 3,6±0,39 3,3±0,85

APO-B (g/l) 1,3±0,45*** 0,9±0,25

NEMK 0,7±0,37*** 0,5±0,25

Glukóza (mmol/l) 7,4±3,59*** 5,1±0,46

HOMA-IR 2,31 (1,27 – 4,08)* 1,41 (1,07 – 1,89)

Insulin (mU/l) 7,07 (1,3 – 4,1) 6,45 (5,1 – 8,7)

C-peptid (nmol/l) 0,87 (0,59 – 1,12)** 0,65 (0,56 – 0,71)

Mikroalbuminurie (mg/l) 314,75 (59,25 – 3837,9)** 4,81 (2,8 – 7,4)

TC: celkový cholesterol, TAG: triacylglyceroly, HDL-C: lipoproteiny s vysokou hustotou (High

density lipoproteins), LDL-C: lipoproteiny s nízkou hustotou (Low density lipoproteins), APO-B:

Apolipoprotein B, NEMK: neesterifikované mastné kyseliny, HOMA-IR: Homeostatické modelové

hodnocení inzulínové rezistence (Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance; HOMA-IR =

insulin*glukóza/22,5); KP: karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina. Data prezentována jako

průměr S.D. pro parametrické a medián (25-75 percentil) pro neparametrické veličiny. Statistické

zpracování bylo provedeno t-testem pro parametrické a Man-Whitney U-testem pro neparametrické

veličiny. * KP vs. KON; * p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001.

35

V rámci studie byly sledovány základní lipidové parametry a některé parametry

diabetologického panelu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6. Více jak třetina pacientů s KP

trpěla onemocněním DM, což se projevilo ve zvýšených hodnotách glukózy, C-peptidu,

HOMA-IR a mikroalbuminurii. Z parametrů lipidového profilu byly zjištěny zvýšené hladiny

triacylglycerolů, Apo B a neesterifikovaných mastných kyselin a snížené hladiny HDL

cholesterolu.

Při srovnání pacientů s KP a kontrolní skupiny jsme se v této studii zaměřili na markery

oxidačního stresu, odrážející působení reaktivních forem kyslíku na lipidy. Vybrány byly dva

markery – konjugované dieny a oxidované LDL částice. Jak ukazuje Graf 1, byly koncentrace

obou sledovaných markerů zvýšeny u KP oproti KON.

0

20

40

60

80

100

KP KON

mm

ol/l

Konjugované dienyA

*

0

50

100

150

200

KP KON

U/l

Oxidované LDL

**

B

Graf 1: Koncentrace markerů oxidačního stresu u pacientů s karcinomem pankreatu

KP: karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina Data prezentována jako průměr S.D. Statistické

zpracování bylo provedeno t-testem pro parametrické. * KP vs. KON; * p 0,05; ** p 0,01.

36

Dalším sledovaným parametrem byla arylesterázová a laktonázová aktivita antioxidačního

enzymu paraoxonázy, jejímž úkolem je ochrana HDL a LDL částic proti reaktivním formám

kyslíku. Spolu s aktivitou PON byly dále sledovány koncentrace sérového amyloidu A a

apolipoproteinu A1. Výsledky ukazuje Graf 2. Pacienti s KP měli ve srovnání se zdravými

osobami sníženou aktivitu jak arylesterázové (Graf 2a), tak laktonázové (Graf 2b) aktivity

paraoxonázy, sníženou koncentraci apo-A1 (Graf 2c) a zvýšené koncentrace SAA (Graf 2d).

Skupina pacientů s KP byla rozdělena podle stádia onemocnění, ve kterém se pacienti

nacházeli, na 3 skupiny. Jednak byly sledovány rozdíly v hladinách tumorových markerů

v závislosti na stádiu onemocnění, jednak byly sledovány rozdíly v hladinách markerů

oxidačního stresu a aktivity antioxidačního enzymu paraoxonázy.

Žádný z dnes používaných tumorových markerů není dost specifický a citlivý pro odlišení a

včasnou diagnostiku karcinomu pankreatu. Sérový amyloid A je navrhován jako možný nový

diagnostický marker KP. Rozdíly v hladinách dnes užívaných tumorových markerů a nově

navrhovaného markeru SAA ukazuje Graf 3. Jak je z grafu patrné, nejvíce zvýšené hladiny

všech tumorových markerů mají pacienti ve 4. finálním stádiu nemoci. Nejjasněji jsou rozdíly

mezi jednotlivými stádii vyjádřeny u koncentrace SAA.

V hladinách markerů oxidačního stresu nebyly nalezeny žádné signifikantní rozdíly mezi

pacienty v různých stádiích nemoci. Ze dvou sledovaných aktivit PON, stádium nemoci

reflektovala pouze arylesterázová aktivita PON, kdežto u laktonázové aktivity PON nebyly

pozorovány žádné rozdíly mezi jednotlivými stádii (Graf 4).

37

0

50

100

150

200

250

KP KON

mU

/lPON-AA

***

0

10

20

30

40

50

KP KON

mU

/l

PON-LB

***

0

0,5

1

1,5

2

2,5

KP KON

g/l

Apo A1C

***

0

50

100

150

200

KP KON

g

/ml

SAAD

***

Graf 2: Aktivita paraoxonázy u pacientů s karcinomem pankreatu

KP: karcinom pankreatu, KON: kontrolní skupina, PON-A: arylesterázová aktivita paraoxonázy, PON-L: laktonázová aktivita paraoxonázy, SAA: sérový

amyloid A. Data prezentována jako průměr S.D. Statistické zpracování bylo provedeno t-testem. * KP vs. KON; *** p 0,001.

38

0

5

10

15

20

25

30

35

40

T2 T3 T4

g

/l

******

CCEA

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

T2 T3 T4

kU

/l

**

CA 72-4B

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

T2 T3 T4

*

*

CA 19-9k

U/l

A

0

50

100

150

200

250

300

T2 T3 T4

g

/ml

***

SAAD

*

Graf 3: Tumorové markery v závislosti na stádiu onemocnění

T: stádium onemocnění, SAA: sérový amyloid A, CEA: karcinoembryonální antigen, CA72-4, CA19-9: tumorové markery. Statistické zpracování bylo

provedeno Kruskal Wallis Anovou s post testem. * T4 vs. T2, T3; * p 0,05; *** p 0,001.

39

0

50

100

150

200

T2 T3 T4

mU

/lPON-A

A

0

5

10

15

20

25

T2 T3 T4

mU

/l

PON-LB

***

x

Graf 4: Aktivita paraoxonázy v závislosti na stádiu onemocnění

T: stádium onemocnění, PON-A: arylesterázová aktivita paraoxonázy, PON-L: laktonázová

aktivita paraoxonázy. Statistické zpracování bylo provedeno testem one-way ANOVA s

Newman Keuls post testem. * T4 vs. T2, T3; x T3 vs. T2; * p 0,05; *** p 0,001.

40

9 Diskuze a závěr

Ve své absolventské práci jsem se zaměřila na karcinom pankreatu. Jednak jsem sledovala

parametry vypovídající o oxidační rovnováze organismu, jednak jsem se zaměřila na markery

sloužící k diagnostice a monitorování KP. Z parametrů vypovídajících o oxidační rovnováze

jsem si zvolila jednak markery oxidačního stresu – CD a ox-LDL, které charakterizují míru

poškození lipidů reaktivními formami kyslíku, jednak antioxidační enzym paraoxonázu, jehož

úkolem je ochrana LDL a HDL částic proti působení oxidačního stresu. Z markerů

využívaných v diagnostice a monitorování karcinomů byly sledovány hladiny markerů CEA,

CA 72-4 a CA 19-9. Dále byly analyzovány hladiny proteinu SAA, který je některými vědci

navrhován jako potenciální nový diagnostický marker pro karcinomy pankreatu.

Do studie bylo zahrnuto celkem 52 pacientů s KP a 52 na základě pohlaví a věku spárovaných

zdravých kontrol. Pacienti s KP byly dále rozděleni do skupin podle míry pokročilosti – podle

stádia onemocnění. Vzhledem k tomu, že KP je v prvé fázi asymptomatické onemocnění, jen

velmi zřídka se ho podaří diagnostikovat v raném stádiu. Ve většině případů, v době, kdy se u

pacientů začnou projevovat nějaké potíže, je nemoc již v pokročilém stádiu. Z tohoto důvodu

nebylo možno do studie zahrnout pacienty ve stádiu 1 onemocnění a ve 2. stádiu jsme získali

pouze 12 pacientů. V rámci této absolventské práce bylo vyšetřováno a hodnoceno vždy 20

pacientů ve stádiu 3 a 4.

Dle očekávání byly u pacientů s KP oproti KON pozorovány zvýšené hladiny všech

sledovaných diagnostických markerů karcinomů (CEA, CA 72-4, CA 19-9) a též pozměněný

diabetický soubor (hladina glukózy, koncentrace insulinu, HOMA-IR). Pozorované rozdíly

v diabetickém profilu mezi KP a KON jsou podmíněny poškozením pankreatu vlivem

karcinomu a rozvojem diabetu mellitu (DM) u KP pacientů (celkem u 19 z 52 pacientů byl

diagnostikován DM). Karcinom vychází z exokrinní části pankreatu a ovlivňuje tak tedy

trávení. Jedním z doprovodných projevů u pacientů s KP je tedy postupný úbytek na váze a

rozvoj malnutrice. Ve sledovaném souboru KP bylo celkem 28 pacientů s těžkou malnutricí,

což koresponduje se sníženými hladinami albuminu v krvi KP oproti KON.

Ve srovnání s KON byla u pacientů s KP pozorována zvýšená koncentrace CRP, markeru

zánětu. Chronický zánět pankreatu se řadí mezi faktory ovlivňující vznik karcinomu

41

pankreatu. A na druhé straně nekrotický proces vyvolaný působením nádoru vede k rozvoji

zánětlivého procesu.

Výsledky této studie ukazují, že KP je spojen se zvýšeným oxidačním stresem. Pozorovány

byly zvýšené hladiny jak CD, tak ox-LDL u pacientů s KP ve srovnání s KON. Tyto získané

výsledky jsou ve shodě se studiemi Vecka et al. (41) a Kodydková et al. (42). Jak

arylesterázová, tak laktonázová aktivita antioxidačního enzymu PON byla u KP pacientů

snížená ve srovnání s KON. V současnosti byly publikovány dvě práce zabývající se aktivitou

PON1 u pacientů s PC a v obou případech byla u tohoto onemocnění pozorována snížená

aktivita PON1 (42; 43).

Hladina SAA byla sledována hned ze dvou důvodů, jednak je prokázáno, že v případě

akutního zánětu SAA vytěsňuje PON z její vazby na apo-A1 v HDL a nahrazuji ji, jednak

protože je tento protein studován jako potenciální nový marker pro diagnostiku a monitoring

karcinomu pankreatu. V naší studii byly pozorovány zvýšené koncentrace SAA u KP oproti

KON, což je ve shodě s dříve publikovanými studiemi (42; 44; 45).

Bylo prokázáno, že SAA stimuluje svoji vlastní transkripci, stejně jako transkripci pro-

zánětlivých proteinů jako S100A8 a S100A9 a je tak spojeno s růstem a metastazováním

tumoru. Vzhledem k tomu, že SAA stimuluje migraci a invazi nádorových buněk, byl

některými vědci navržen jako možný diagnostický marker KP. Dřívější studie však

zpochybňují dostatečnou citlivost a specifičnost SAA jako potenciálního markeru KP (44;

45).

Výsledky získané v této studii ukazují, že zatímco arylesterázová aktivita PON u pacientů

s KP se s pokročilostí onemocnění snižuje, koncentrace SAA naopak vzrůstá a oba parametry

se signifikantně liší u pacientů v jednotlivých stádiích onemocnění. Podíváme-li se na běžně

testované tumorové markery a jejich změny podle pokročilosti onemocnění, ani jeden z těchto

markerů nekoreluje se stádiem KP. Z tohoto úhlu pohledu se SAA jeví jako lepší

monitorovací marker KP než tumorové markery CEA, CA 72-4 či CA 19-9. Zda je však

specifický pouze pro KP není možno v rámci této studie zjistit, vyžadovalo by to rozsáhlejší

studie s pacienty s různými druhy karcinomů a i dalších onemocnění.

42

Výsledky získané v rámci mé absolventské práce potvrzují zvýšený oxidační stres u pacientů

s KP spojený se sníženou aktivitou antioxidačního enzymu PON1. Dále bylo zjištěno, že

dosud užívané tumorové markery nekorelují se stádiem onemocnění a že nově navrhovaný

marker SAA by potenciálně mohl být markerem odrážejícím pokročilost onemocnění KP.

43

10 Seznam použité literatury a zdrojů informací

1. DVOŘÁČKOVÁ J.: Cytologie pankreatu: manuál EUS-FNA on site. Praha: Maxdorf,

2013. ISBN 978-80-7345-320-6.

2. BOROVANSKÝ L.: Soustavná anatomie člověka. Praha: Státní zdravotnické

nakladatelství, 1960.

3. MARTÍNEK J, Vacek Z.: Histologický atlas. Praha: Grada, 2009. ISBN 978-80-247-

2393-8.

4. ČIHÁK R.: Anatomie 2. Třetí, upravené a doplněné vydání. Praha: Grada Publishing,

a.s., 2013. ISBN 978-80-247-4788-0.

5. ZAVORAL M.: Karcinom pankreatu. Praha: Galén, c2005. ISBN 80-7262-348-6.

6. POVÝŠIL C, ŠTEINER I.: Speciální patologie. 2., dopl. a přeprac. vyd. Praha: Galén,

c2007. ISBN 978-80-7262-494-2.

7. SCHEIN M, ROGERS Paul N.(ed.): Urgentní břišní chirurgie: Schein's common sense

emergency abdominal surgery. Praha: Grada, 2011. ISBN 978-80-247-2357-0.

8. REJCHRT S.: Diagnostika cystických tumorů pankreatu. Bull HPB. 2007;15:35-7

9. https://www.linkos.cz/slovnicek/nadorove-markery-onkomarkery/ (platné dne 26. 1.

2018)

10. http://www.cskb.cz/cskb.php?pg=doporuceni--tumorove-markery#biol (platné dne 26. 1.

2018)

11. http://www.stefajir.cz/?q=tumor-markery (platné dne 26. 1. 2018)

12. https://www2.ikem.cz/plm_lp/_LP_12299-L0000006.htm (platné dne 9. 2. 2018)

13. PRÉCOURT LP, Amre D, Denis MC, Lavoie JC, Delvin E, Seidman E, Levy E.: The

three gene paraoxonase family: physiologic roles, actions and regulation. Atherosclerosis

2011; 214(1): 20-36.

44

14. HAREL M, Aharoni A, Gaidukov L, et al.: Structure and evolution of the serum

paraoxonase family of detoxifying and antiatherosclerotic enzymes. Nat Struet Mol Biol

2004; 11: 412-9.

15. DEAKIN SP, James RW.: Genetic and environmental factors modulating serum

concentrations and activities of the antioxidant enzyme paraoxonase-1. Clin Sci (Lond)

2004; 107(5): 435-47.

16. JOSSE D, Lockridge O, Xie W, Bartels CF, Schopfer LM, Masson P.: The active site of

human paraoxonase (PON1). J Appl Toxicol 2001; 21, S7–S11.

17. KUO CL, La Du BN.: Calcium binding by human and rabbit serum paraoxonases.

Structural stability and enzymatic activity. Drug Metab. Dispos. 1998; 26, 653–60.

18. KUO CL, La Du BN.: Comparison of purified human and rabbit serum paraoxonases.

Drug Metab Dispos 1995; 23: 935–944.

19. JOSSE D, Xie W, Renault F, Rochu D, Schopfer LM, Masson P, Lockridge O.:

Identification of residues essential for human paraoxonase (PON1)

arylesterase/organophosphatase activities. Biochemistry 1999; 38, 2816–2825.

20. DAVIES H. G., Richter, R. J., Keifer, M., Broomfield, C. A., Sowalla, J., Furlong, C. E.:

The effect of the human serum paraoxonase polymorphism is reversed with diazoxon,

soman and sarin. Nat Genet 1996; 14: 334–336.

21. AVIRAM M, Billecke S, Sorenson R, et al.: Paraoxonase active site required for

protection against LDL oxidation involves its free sulfhydryl group and is different from

that required for its arylesterase/paraoxonase activities: selective action of human

paraoxonase allozymes Q and R. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998a; 18(10): 1617-24.

22. BILLECKE S, Draganov D, Counsell R, Stetson P, Watson C, Hsu C, La Du BN.:

Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze lactones and cyclic

carbonate esters. Drug Metab Dispos 2000; 28, 1335–1342.

23. RAJKOVIC MG, Rumora L, Barisic K.: The paraoxonase 1, 2 and 3 in humans. Biochem

Med (Zagreb) 2011; 21(2): 122-30.

45

24. DRAGANOV DI, Teiber JF, Speelman A, Osawa Y, Sunahara R, La Du BN. Human

paraoxonases (PONÍ, P0N2, and P0N3) are lactonases with overlapping and distinct

substrate specificities. J Lipid Res 2005; 46: 1239-47.

25. NGUYEN SD, Hung ND, Cheon-Ho P Ree KM, Dai-Eun S.: Oxidative inactivation of

lactonase activity of purified human paraoxonase 1 (PON1). Biochim Biophys Acta

2009; 790: 155-60.

26. YILMAZ N.: Relationship between paraoxonase and homocysteine: crossroads of

oxidative diseases. Arch Med Sci 2012; 8(1): 138-53.

27. JAKUBOWSKI H.: Calcium-dependent human serum homocysteine thiolactone

hydrolase. A protective mechanism against protein N-homocysteinylation. J Biol Chem

2000; 275: 3957–3962.

28. MACHARIA M, Hassan MS, Blackhurst D, Erasmus RT, Matsha TE.: The growing

importance of PON1 in cardiovascular health: a review. J Cardiovasc Med (Hagerstown).

2012; 13(7): 443-53 .

29. PERLA-KAJÁN J, Jakubowski H. Paraoxonase 1 protects against protein

Nhomocysteinylation in humans. FASEB J 2010; 24: 31-6.

30. MACKNESS MI, Arrol S, Durrington PN.: Paraoxonase prevents accumulation of

lipoperoxides in low-density lipoprotein. FEBS Lett 1991; 286, 152–154.

31. MACKNESS MI, Arrol S, Abbot C, Durrington PN.: Protection of low-density

lipoprotein against oxidative modification by high-density lipoprotein associated

paraoxonase. Atherosclerosis 1993; 104: 129–135.

32. WATSON AD, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Faull KF, Fogelman AM, Navab M.:

Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase. Inhibition of the

biological activity of minimally oxidised low density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96,

2882–2891.

33. ECKERSON HW, Wyte CM, La Du BN.: The human serum paraoxonase/arylesterase

polymorphism. Am J Hum Genet 1983; 35: 1126-1138 s.

46

34. HASSELWANDER O, McNaster D, Fogarty DG, Peter Maxwell A, Paul Nicholls D,

Young IS.: Serum paraoxonase and platelet-activating factor acetylhydrolase in chronic

renal failure. Clin Chem 1998; 44: 179–81.

35. FERRÉ N, Camps J, Prats E, Vilella E, Paul A, Figuera L.: Serum paraoxonase activity: a

new additional test for the improved evaluation of chronic liver damage. Clin Chem

2002; 48: 261.

36. GAIDUKOV L, Tawfik D.: The development of human sera tests for HDL-bound serum

PON1 and its lipolactonase activity. J Lipid Res 2007; 48: 1637–46.

37. DRAGANOV DI, Stetson PL, Watson CE, et al.: Rabbit serum paraoxonase 3 (PON3) is

a high density lipoprotein-associated lactonase and protect slow density lipoprotein

against oxidation. J Biol Chem. 2000; 275: 33435-42.

38. RAINWATER DL, Rutherford S, Dyer TD, et al.: Determinants of variation in human

serum paraoxonase activity. Heredity (Edinb). 2009; 102: 147-54.

39. WIELAND H, Seidel D.: A simple specific method for precipitation of low density

lipoproteins.J Lipid Res 1983; 24:904-909.

40. AHOTUPA M, Ruutu M, Mantyla E.: Simple methods of quantifying oxidation products

and antioxidant potential of low density lipoproteins.Clin Biochem 1996;29: 139-144

41. VECKA M, Jáchymová M, Vávrová L, et al.: Paraoxonase-1 (PON1) status in pancreatic

cancer: relation to clinical parameters. Folia Biologica. 2012; 58(6):231-7.

42. KODYDKOVA J, Vavrova L, Stankova B, Macasek J, Krechler T, Zak A.: Changes in

antioxidants and oxidative stress markers in pancreatic diseases. Pancreas 2013; 42(4):

614-21.

43. AKÇAY MN, Polat MF, Yilmaz I, Akçay G.: Serum paraoxonase levels in pancreatic

cancer. Hepatogastroenterology 2003a; 50 Suppl 2: ccxxv-ccxxvii.

44. YOKOI K, Shih LC, Kobayashi R, et al.: Serum amyloid A as a tumor marker in sera of

nude mice with orthotopic human pancreatic cancer and in plasma of patients with

pancreatic cancer. Int J Oncol 2005; 27(5): 1361-9.

47

45. FIRPO MA, Gay DZ, Granger SR, et al.: Improved diagnosis of pancreatic

adenocarcinoma using haptoglobin and serum amyloid A in a panel screen. World J Surg

2009; 33(4): 716-22.

48

11 Seznam zkratek

ACTH adrenokortikotropní hormon

AFP alfa-fetoprotein

APO-A1 apolipoprotein A

APO-B apolipoprotein B

BMI body mass index

CA125 sérový nádorový marker

CA15-3 glykoproteinový nádorový marker

CA 19-9 glykolipidový nádorový marker

CA 72-4 glykopeptidový nádorový marker

CD Clastr of Differentiation (zkratka pro identifikaci molekul na povrchu buněk,

které poskytují informaci o jejich imunofynotypu)

CEA karcinoembryonální antigen/nádorový marker

CRP C-reaktivní protein

CT počítačová tomografie

CYFRA21-1 fragment cytokeratinu 19

DM diabetes mellitus

EGF epidermal growth factor receptor / epidermální růstový faktor

ERCP endoskopická retrográdní cholangiopankreatografie

EUS endoskopická ultrasonografie

EUS-FNA tenkojehlová aspirace pod sonografickou navigací

EUS- FNAB tenkojehlová aspirační biopsie pod sonografickou navigací

hCG lidský choriogonadotropin

HDL-C lipoproteiny s vysokou hustotou (High density lipoproteins)

HER2/neu transmembránový receptor

49

HOMA-IR homeostatic model assessment of insulin resistance /homeostatický model

hodnocení inzulínové rezistence

IDUS intraduktální sonografie

IMPN intraduktální papilární mucinózní neoplazie

KD konjugované dieny

KON zdravé kontroly

KP karcinom pankreatu

LD laktátdehydrogenáza

LDL-C lipoproteiny s nízkou hustotou (Low density lipoproteins)

M muži

MCC mucinózní cystický karcinom

MR magnetická rezonance

N počet

NEMK neesterifikované mastné kyseliny

NRI nutrition risk index

NSE neuron specifická enoláza

ox-LDL oxidované LDL

p-AMS pankreatická amyláza

PDA duktální adenokarcinom / pancreatic ductal adenocarcinoma

PON paraoxonáza

PON-A arylesterázová aktivita paraoxonázy

PON-L laktonázová aktivita paraoxonázy

PSA prostatická kyselá fosfatáza

SAA sérový amyloid A

SD směrodatná odchylka

TAG triacylglyceroly

50

TC celkový cholesterol

TPA tkáňový polypeptidický antigen

TPS tkáňový specifický polypeptidový antigen

TRIS trisaminomethan

VFN Všeobecné fakultní nemocnice

WHCR poměr pas/body

Ž ženy

51

12 Seznam tabulek

Tabulka 1: Diferenciálně diagnostické rysy adenokarcinomu a reaktivní hyperplazie u

chronické pankreatitidy ............................................................................................................ 19

Tabulka 2: Typické cytologické rysy adenokarcinomu pankreatu podle stupně diferenciace 21

Tabulka 3: Parametry měření pro stanovení PON 1 ................................................................. 30

Tabulka 4: Schéma pro stanovení aktivity PON 1 ................................................................... 30

Tabulka 5: Charakteristika skupin ............................................................................................ 33

Tabulka 6: Markery lipidového a sacharidového metabolismu................................................ 34

52

13 Seznam grafů

Graf 1: Koncentrace markerů oxidačního stresu u pacientů s karcinomem pankreatu ............ 35

Graf 2: Aktivita paraoxonázy u pacientů s karcinomem pankreatu ......................................... 37

Graf 3: Tumorové markery v závislosti na stádiu onemocnění ................................................ 38

Graf 4: Aktivita paraoxonázy v závislosti na stádiu onemocnění ............................................ 39