ชอหนงสอ คมอทางหองปฏบตการตรวจวนจฉยธาลสซเมย และฮโมโกลบนผดปกต

จดทำโดย คณะกรรมการจดทำคมอปฏบตงานการตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมย และฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ

จดพมพ ศนยวจยทางคลนก กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสข ถ.ตวานนทอ.เมองจ.นนทบร11000 โทร.029510000ตอ99394 โทรสาร.029510000ตอ99394

พมพครงท1 มนาคม 2552 1,000เลม

พมพท:บรษทหมดเดดจำกด 1213/84ซอยลาดพราว94ถนนลาดพราว แขวงวงทองหลางเขตวงทองหลางกรงเทพฯ10310 โทร02-559-3298-9 www.knockoutblow.com

ขอมลทางบรรณานกรมของหอสมดแหงชาตคณะกรรมการจดทำคมอปฏบตงานการตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ.

คมอทางหองปฏบตการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกต.--นนทบร:ศนยวจยทางคลนกกรมวทยาศาสตรการแพทย,2552.

42หนา.

1.ธาลสสเมย–การวนจฉย.2.ฮโมโกลบน.3.การวนจฉยโรคทางหองปฏบตการ.I.ชอเรอง.

616.152075

ISBN:978-611-11-0023-5

III

คำนยม

ดฉนมความยนดเปนอยางยงทกรมวทยาศาสตรการแพทย ไดจดพมพคมอปฏบตงานดาน

การตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมยททนสมยกาวหนาและมคณภาพเพอใชในการฝกอบรมและบรการ

ตรวจโรคโลหตจางธาลสซเมยใหถกตองแมนยำรวดเรวทวประเทศจะทำใหแผนการควบคมปองกน

และรกษาโรคนเปนไปไดอยางมประสทธภาพยง

ดฉนขอขอบคณทานคณาจารย ผเชยวชาญจากสถาบนตางๆ ซงรวมมอกนสรางคมอนขนมา

ซงจะเปนคณานประโยชนอยางยงตอผปวยโรคโลหตจางธาลสซเมยและครอบครว อนเปนปญหา

สำคญทางสาธารณสขของประเทศ

ศ.พญ.คณหญงสดสาครตจนดา

ประธานมลนธโรคโลหตจางธาลสซเมยแหงประเทศไทยฯ

คำนำ ธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตเปนโรคโลหตจางเรอรงทางพนธกรรมทเปนปญหาสำคญ

ทางสาธารณสขของประเทศไทยหองปฏบตการทางการแพทยเปนหนวยงานหนงทมบทบาทสำคญใน

การควบคมและปองกนโรคผลการตรวจทนาเชอถอและรวดเรวนบเปนประโยชนทงในดานการรกษา

และพฒนาคณภาพชวตของผปวยตลอดจนการปองกนไมใหมผปวยใหมเพมมากขน

การใหบรการทางหองปฏบตการเพอตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตถงแมจะ

ดำเนนการมาแลวเปนเวลานานแตยงคงขาดแนวทางปฏบตทเปนมาตรฐานเดยวกนทำใหเกดความ

แตกตางในทางปฏบต หากบคลากรทเกยวของมความเขาใจทไมถกตอง จะสงผลกระทบโดยตรงตอ

ความสำเรจในการควบคมและปองกนโรคธาลสซเมยของประเทศได

กรมวทยาศาสตรการแพทยในฐานะทมภารกจหลกทางหองปฏบตการ เพอสนบสนนการแกไข

ปญหาสาธารณสขของประเทศ จงไดเรยนเชญคณะผเชยวชาญจากมลนธโรคโลหตจางธาลสซเมยแหง

ประเทศไทยกระทรวงสาธารณสขและมหาวทยาลยตางๆรวมกนจดทำคมอทางหองปฏบตการ

ตรวจวนจฉยโรคธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตเพอเผยแพรใหทกหนวยงานทเกยวของถอปฏบต

ใหเปนมาตรฐานเดยวกน

กรมวทยาศาสตรการแพทยขอขอบคณคณะผเชยวชาญทกทานทใหเกยรตเปนคณะกรรมการ

จดทำคมอฉบบน ขอขอบคณสำนกงานหลกประกนสขภาพแหงชาตทสนบสนนงบประมาณดำเนนการ

และหวงเปนอยางยงวาองคความรอนมคณคาทงหมดจะเปนประโยชนในการพฒนาศกยภาพเครอขาย

หองปฏบตการของประเทศ ใหรายงานผลการตรวจวเคราะหธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตได

อยางมคณภาพ อยบนมาตรฐานเดยวกน สามารถสนบสนนการควบคมและปองกนโรคไดอยางม

ประสทธภาพ

(นายแพทยมานตยธระตนตกานนท)

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

มนาคม2552

V

นพ.มานตธระตนตกานนท

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

โทร.02-5899862ตอ99001-2

คณะผจดทำ

VI

ศ.เกยรตคณพญ.คณหญงสดสาครตจนดา

มลนธโรคโลหตจางธาลสซเมย

แหงประเทศไทย

โทร.02-4198329

ศ.เกยรตคณพญ.วรวรรณตนไพจตร

ภาควชากมารเวชศาสตร

โรงพยาบาลศรราช

โทร.02-4198329

นพ.สวรรณชยวฒนายงเจรญชย

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

โทร.02-9511429ตอ99008-9

รศ.พนเอกนพ.กตตตอจรส

หนวยโลหตวทยา

กองกมารเวชศาสตร

โรงพยาบาลพระมงกฎเกลา

โทร.02-3547660ตอ93808

ดร.ปราณฟเจรญ

สถาบนวจยและพฒนาวทยาศาสตร

และเทคโนโลย

มหาวทยาลยมหดล

โทร.02-8892557-8

นพ.สมชายแสงกจพร

ศนยวจยทางคลนก

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

โทร.02-9510000ตอ98456

นพ.ชนนทรลมวงศ

ภาควชาอายรศาสตร

โครงการพฒนาระบบสขภาพ

สำหรบธาลสซเมยโรงพยาบาลศรราช

โทร.02-4199488

รศ.ดร.สพรรณฟเจรญ

ศนยวจยและพฒนาการตรวจวนจฉย

ทางหองปฏบตการทางการแพทย

คณะเทคนคการแพทย

มหาวทยาลยขอนแกน

โทร.043-202083

รศ.กลนภาฟเจรญ

ศนยวจยและพฒนาการตรวจวนจฉย

ทางหองปฏบตการทางการแพทย

คณะเทคนคการแพทย

มหาวทยาลยขอนแกน

โทร.043-202083

VII

รศ.พญ.พมพลกษณเจรญขวญ

ภาควชากมารเวชศาสตรคณะแพทยศาสตร

มหาวทยาลยเชยงใหม

โทร.053-945412-5

ผศ.ดร.จำนงคนพรตน

ภาควชาพยาธวทยาคณะแพทยศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร

โทร.074-451567

ผศ.ดร.ณฐยาแซอง

ภาควชาจลทรรศนคลนก

คณะเทคนคการแพทย

มหาวทยาลยขอนแกน

โทร.043-202087

อาจารยชวดนพรตน

ภาควชาพยาธวทยา

คณะแพทยศาสตร

มหาวทยาลยสงขลานครนทร

โทร.074-451562

รศ.ดร.ธนศกดตาต

ศนยวจยโลหตวทยาและเทคโนโลยสขภาพ

คณะเทคนคการแพทย

มหาวทยาลยเชยงใหม

โทร.053-949288

รศ.ดร.กนกวรรณแสนไชยสรยา

ภาควชาจลทรรศนคลนก

คณะเทคนคการแพทย

มหาวทยาลยขอนแกน

โทร.043-202087

นางสรภากรแสงกจพร

ศนยวจยทางคลนก

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

โทร.02-9510000ตอ99394

สทศนยวมลเศรษฐ

ศนยวทยาศาสตรการแพทยขอนแกน

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

โทร.043-240800

นางภทราภรณบญขนท

งานโลหตวทยาโรงพยาบาลราชวถ

กรมการแพทยกระทรวงสาธารณสข

โทร.02-3548108ตอ3620-1

นางนษฐชลหรโอตปปะ

ศนยอนามยท1กรมอนามย

กระทรวงสาธารณสข

โทร. 02-5216550-2 ตอ 105

VIII

นางบญนภาสวรรณกาล

ศนยวทยาศาสตรการแพทยอดรธาน

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

โทร.042-207364-6ตอ110,106

แนวทางการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ 1

การตรวจคดกรอง

-การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยการทดสอบความเปราะของเมดเลอดแดง 3

-การตรวจคดกรองฮโมโกลบนอ(HbE)ดวยนำยาDCIP 4

-การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยคาดชนเมดเลอดแดง 6

การตรวจวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกลบน(HbTyping&Quantitation) 9

การตรวจวเคราะหความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia1 17

การตรวจวเคราะหความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia 19

สรปแนวทางการดำเนนงานทางหองปฏบตการ 23

บรรณานกรม 25

ภาคผนวก 27

สารบญ

IX

�

แนวทางการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทางหองปฏบตการ

ธาลสซเมยเปนโรคโลหตจางเรอรงทถายทอดทางพนธกรรม เกดจากความผดปกตของยนท สงเคราะหฮโมโกลบนของเมดเลอดแดงนำไปสการเกดพยาธสภาพกบแทบทกอวยวะในรางกาย ผ ทมยนธาลสซเมยมทงผทเปนโรค และไมเปนโรคหรอพาหะ ผทเปนโรคมอาการแตกตางกน ตงแตมโลหตจางเลกนอยโลหตจางมากเรอรงไปจนถงอาการรนแรงมากจนเสยชวตตงแตอยในครรภมารดาหรอหลงคลอดไมนานสวนผทเปนพาหะมสขภาพปกตเหมอนคนทวไป แตสามารถถายทอดยนทผดปกตไปสลกหลานได อบตการณในประเทศไทยพบวา ประชากรทเปนพาหะมประมาณรอยละ30-40หรอประมาณ18-24 ลานคน มผท เปนโรคประมาณรอยละ 1หรอประมาณ6แสนคนในแตละปจากหญงตงครรภประมาณ 1 ลานคน มหญงตงครรภทเสยงตอการมบตรเปนโรคธาลสซเมยประมาณ5หมนคนและมเดกเกดใหมปวยเปนโรคเพมขนประมาณ 12,000คน ธาลสซเมยจงเปนปญหาสำคญทางการแพทยและสาธารณสข ซงไมเพยงแตมผลตอผปวยและครอบครวเทานน หากยงสงผลกระทบตอเศรษฐกจและสงคมของประเทศอกดวย การแกไขปญหาโรคธาลสซเมยจำเปนตองอาศยความรวมมอของหนวยงานตางๆ ในการดำเนนการควบคมและปองกน แผนการดำเนนการควบคมและปองกนโรค ประกอบดวยการใหความรแกประชาชนและบคลากรทางสาธารณสขการตรวจหาผ ปวยและพาหะ การใหคำปรกษาแนะนำทางพนธกรรมและการตรวจวนจฉยทารกในครรภ ห องปฏบ ต การทางการแพทยน บเป นหนวยงานทมบทบาทสำคญทงในดานการตรวจหาผ ป วยและพาหะ ตลอดจนการตรวจว น จฉ ยทารกในครรภซ งใหขอมลสำคญนำไปใชในการใหคำแนะนำทางพนธกรรมและชวยในการตดสนใจสำหรบสามภรรยาคเสยงทมโอกาสใหกำเนดบตรเปนโรคธาลสซเมยชนดรนแรง3โรคตามนโยบายของ

กระทรวงสาธารณสข ไดแก homozygous -tha-lassemia1(HbBart’shydropsfetalis),homozygousβ-thalassemiaและβ-thalassemia/HbE เนองจากชนดของธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตในประชากรไทยมความหลากหลาย จงไมมการทดสอบใดการทดสอบหนงทางหองปฏบตการทสามารถใหการวนจฉยไดครอบคลมความผดปกตไดทกชนด โดยทวไปการตรวจทางหองปฏบตการเพอการวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตในหญงตงครรภและคสมรสม3ระดบดงน ระดบท 1 การตรวจคดกรอง (screeningtests) เปนขนตอนแรกทมเปาหมายหลกในการคดกรองเอาคนปกตหรอคนทมความผดปกตชนดทไมรนแรงออกไป เพอจะไดไมตองตรวจเลอดตอและเปนการประหยดคาใชจาย คงเหลอแตผทนาจะมความผดปกตของธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตทเขาสกระบวนการตรวจวเคราะหในขนตอนตอไป ระดบท 2 การตรวจวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกลบนในเลอด(Hbtyping)สามารถตรวจวนจฉยธาลสซเมยทไมซบซอนไดเกอบทกชนดทพบบอยในประชากรไทยยกเวนพาหะ -thalassemia ระดบท 3การตรวจวเคราะหระดบดเอนเอ(DNAanalysis)ใชในกรณทผลการตรวจHbtypingในระดบท2ไมสามารถใหการวนจฉยไดชดเจนหรอกรณตองการทราบชนดของมวเตชนของธาลสซเมยทวนจฉยไดในระดบท 2 และกรณการตรวจวนจฉยทารกในครรภทมความเสยงตอการเปนโรคธาลส-ซเมยชนดรนแรง การดำเนนงานทางหองปฏบตการทกขนตอนลวนมความสำคญทงสนบคลากรทเกยวของควรพจารณาใหเหมาะสมตามหลกวชาการและสอดคลองกบขอกำหนดดานคณภาพเพ อใหผลการตรวจวเคราะหมความนาเชอถอ สามารถสนบสนนการควบคมและปองกนโรคธาลสซเมยชนดรนแรงไดอยางมประสทธภาพ

�

�

การตรวจคดกรองเปนการทดสอบอยางงาย

มขนตอนไมยงยากไมตองใชอปกรณราคาแพงและ

บคลากรทมความชำนาญมากนก สามารถทำไดใน

โรงพยาบาลทกระดบคลนกและสถานอนามยตางๆ

การตรวจคดกรองมเปาหมายหลกในการคดกรอง

เอาคนปกต หรอมความผดปกตชนดทไมรนแรง

ออกไป เพอจะไดไมตองตรวจเลอดตอและเปน

การประหยดคาใชจาย ดงนนผลการตรวจคดกรอง

จะตองมความไวสงอาจมผลบวกปลอมไดบางราย

ทผลการตรวจคดกรองเปนลบไมจำเปนตองนำไป

ตรวจยนยนตอการตรวจคดกรองจงชวยลดภาระงาน

และคาใชจายในการตรวจทางหองปฏบตการลงได

มาก โดยเฉพาะอยางยงเมอตองดำเนนงานในกลม

ประชากรขนาดใหญในระดบประเทศ

ในประเทศไทยการตรวจคดกรองทเก ยว

ของในการควบคมและปองกนโรคธาลสซเมยชนด

รนแรงตามนโยบายของกระทรวงสาธารณสข ม 3

การทดสอบคอ

1.การตรวจOF

2.การตรวจDCIP

3.การตรวจหาคาดชนเมดเลอดแดง

แนวทางท 1ประกอบดวยการตรวจosmotic

fragility(OF)รวมกบการตรวจdichlorophenolindo-

phenol(DCIP)precipitation

การตรวจคดกรองธาลสซเมยและฮโมโกลบน

ผดปกตในประชากรไทยสามารถเลอกทำไดจาก 2

แนวทางดงน

แนวทางท 2 ประกอบดวยการตรวจดชน

เมดเลอดแดง(MCV,MCH)รวมกบการตรวจdichlo-

rophenolindophenol(DCIP)precipitation

การตรวจ OF และ MCV/ MCH ใชใน

การตรวจคดกรองความผดปกตท มสาเหตจาก

-thalassemia และ β-thalassemia สวน DCIP

ใชในการตรวจHbE

การตรวจคดกรอง

�

การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยการทดสอบความเปราะของเมดเลอดแดง (osmotic fragility test: OF test)

หลกการ

เม ดเล อดแดงปกตเม ออย ในนำเกลอ

ความเขมขน รอยละ 0.85 จะคงสภาพปกตไวได

แตเมอลดความเขมขนของนำเกลอลงเรอยๆนำจะ

แพรเขาสเซลลเมดเลอดแดงทำใหเซลลบวมขนจน

ถงความเขมขนของเกลอระดบหนงเมดเลอดแดงจะ

แตกการทเมดเลอดแดงแตกงาย(increasedosmotic

fragility)หรอแตกยาก(decreasedosmoticfragility)

ขนอยกบอตราสวนของพนทผนงเซลลตอความเขมขน

ของสารภายในเซลลซ งสวนใหญคอ ฮโมโกลบน

เมดเลอดแดงทมอตราสวนนสงเชนtargetcellและ

hypochromiccellจะแตกยากในขณะทspherocyte

จะแตกงายดงนนในการทดสอบความเปราะของเมด

เลอดแดงเมดเลอดแดงปกตจะแตกไดหมดแตเมด

เลอดแดงของผปวยธาลสซเมยและพาหะธาลสซเมย

ทม target cell และ hypochromic cell จะไมแตก

อยางไรกตามภาวะอนททำใหเมดเลอดแดงมลกษณะ

เปนhypochromiccellเชนภาวะโลหตจางจากการ

ขาดเหลกหรอเปนtargetcellเชนในผปวยโรคตบ

สามารถใหผลบวกปลอมได

สารเคมและนำยา

ปจจบนมนำยาสำเรจรปหลายชนดจำหนาย

การเลอกใชควรพจารณาใหรอบคอบตามขอกำหนด

ดานคณภาพและขอมลอางองทางวชาการ

วธการ

-เปนไปตามมาตรฐานของนำยาทกำหนด

การรายงานผล

-เมอไดผลลบรายงานผล“Negative”

-เมอไดผลบวกรายงานผล“Positive”

การแปลผล

Negative:ไมเปนธาลสซเมยหรออาจเปน

ธาลสซเมยชนดทไมรนแรง เชน -thalassemia 2,

HbConstantSpring,HbPaksè

Positive : อาจเปน -thalassemia หรอ

-thalassemia โดย -thalassemia มโอกาส

เปนไดทงชนด -thalassemia 1 และบางรายของ

-thalassemia2สวน -thalassemiaกอาจเปนไดทง0-หรอ +-thalassemiaเมอผลการตรวจเปนpositive

ตองสงตวอยางเลอดตรวจHbtypingและดเอนเอ

ตอไป

ขอจำกดของการทดสอบ

1.การทดสอบOFเปนการตรวจคดกรองท

มวตถประสงคในการคดกรองα-thalassemia1และ

β-thalassemiaเปนหลกเทานนไมสามารถใชในการ

วนจฉยชนดของความผดปกตได

2.ผทเปนพาหะHbEบางรายอาจใหผลบวก

บางรายอาจใหผลลบกบการทดสอบน

3. อาจพบผลบวกลวงในภาวะโลหตจาง

จากการขาดเหลกและจากความผดปกตอนๆทพบ

targetcellเชนโรคตบ

�

หากไมสามารถทำการทดสอบไดท นท

หลงไดรบเลอด ควรเกบไวในตเยน 4ºC ไมควร

เกบไวนานเกน 48 ชวโมง ถาไมมตเยนตองเกบใน

กระตกทมนำแขง และทำการทดสอบภายใน 24

ชวโมง เนองจากเลอดเกาเมดเลอดแดงบางสวนม

การเสอมสภาพทำใหแตกงายเกดผลลบปลอมได

3.การควบคมคณภาพวธการทดสอบ

- นำยาทเกบในตเยน ควรนำออกมาวาง

ทอณหภมหองไมนอยกวา 15 นาท และเขยากอน

นำมาใชงาน

-ปเปตทพ(pipettetip)ควรใชของใหมเนอง

จากปเปตทพทนำมาลางเพอใชใหมอาจมสารตกคาง

และไมแหงสนท ทำใหเมดเลอดแดงแตก เกดผล

ลบปลอมได

- ไมควรใชเครองผสมสารละลาย (vortex

mixer)ผสมเลอดกบนำยาเพราะจะทำใหเมดเลอด

แดงแตกจากแรงเหวยงทำใหเกดผลลบปลอมได

- ระยะเวลาในการทำปฏกรยากอนอานผล

จะตองปฏบตตามรายละเอยดในเอกสารกำกบนำยา

อยางเครงครด เพอใหเมดเลอดแดงปกตแตกอยาง

สมบรณ

4.การอานผลไมควรนำมาอานผลทละหลอด

ควรใสrackยกขนอานทละแถวประมาณ10-12หลอด

จะไดมผลการทดสอบทงบวก และลบเปรยบเทยบไป

พรอมกน โดยมโคมไฟใหแสงพอด (ไมจาเกนไป)

สองจากดานบนลงมาทหลอด ตวอยางทใหผลขน

ไมชดเจน(weaklypositiveหรอsuspicious)มกเปน

ตวอยางเลอดของผทเปนพาหะHb Eบางราย และ

พาหะ -thalassemia 2 สำหรบในกรณทเปนพาหะ

Hb E ถาทำการตรวจคดกรองDCIP ดวย ตวอยาง

เหลานนกจะใหผลบวกชดเจนกบDCIP

การควบคมคณภาพ

1. ควรทำการตรวจสอบคณภาพของนำยา

กอนนำมาใชในงานบรการ โดยทำการทดสอบกบ

เลอดควบคมคณภาพ ซงมแนวทางในการเลอกตว

อยางเลอดควบคมคณภาพจากเลอดผใหญในงาน

ประจำวนดงน

ตวอยางควบคมผลลบ (Negative control)

MCV>85fL,MCH>28pgและHb>13.0g/dL

(ผชาย)หรอHb>12.0g/dL(ผหญง)

ตวอยางควบคมผลบวก (Positive control)

MCV<75fL,MCH<25pgและHb>11.0g/dL

(ผชาย)หรอHb>10.0g/dL(ผหญง)

เม อน ำยาผ านกระบวนการตรวจสอบ

คณภาพกอนใชงานแลวจงนำไปใชใหบรการ โดย

ในการทำงานประจำใหแบงเกบตวอยางเลอดทให

ผลการตรวจคดกรองเปนบวกและลบอยางละ1-2

ตวอยางไวในตเยน4ºCสำหรบใชเปนเลอดควบคม

คณภาพนำยาสำหรบการทดสอบในวนตอไป และ

เกบใหมวนตอวนไปเรอยๆ

2.การเกบตวอยางเลอดทไมเหมาะสมอาจ

ทำใหผลการตรวจผดพลาดไดเชนปรมาณเลอดกบ

EDTAมสดสวนทไมเหมาะสมถาปรมาณเลอดนอย

EDTAเหลอมากจะทำใหนำแพรออกจากเซลลเมด

เลอดแดงทำใหเมดเลอดแดงเหยว(crenatedRBC)

จะใหผลบวกปลอมตอการทดสอบไดในทำนองตรง

ขามถาเจาะเลอดมากเกนหรอผสมเลอดกบสารกน

เลอดแขงไมด เลอดบางสวนแขงตว (partial clot)

ทำใหผลการตรวจไมถกตอง

�

การตรวจคดกรอง ฮโมโกลบน อ (Hb E) ดวยนำยา DCIPdichlorophenolindophenol precipitation test

HbE(2 2

26Glu-Lys)เปนฮโมโกลบนผดปกต

ท กรดอะมโนตำแหนงท 26 ของสาย -globin

เปลยนจากกรดกลตามก(glutamic:Glu)เปนไลซน

(lysine:Lys)ทำใหโครงสรางทจดสมผสระหวางสาย

โกลบน1 1

ไมแขงแรงเมออยในสารละลายDCIP

จะถกออกซไดซใหกลายเปนโกลบนสายเดยวทม

ซลฟไฮดรลอสระจงตกตะกอนไดงาย และเรวกวา

ฮโมโกลบนปกต โดยปรมาณความขนของตะกอน

ทเกดขนจากตวอยางเลอดของHbEhomozygote

จะมากกวาของพาหะHbE

หลกการ

สารเคมและนำยา ป จจ บ นม น ำยาสำเร จร ปหลายชน ด

จำหนาย การเลอกใชควรพจารณาใหรอบคอบตาม

ขอกำหนดดานคณภาพและขอมลอางองทางวชาการ

วธการ

-เปนไปตามมาตรฐานของนำยาทกำหนด

การรายงานผล

-เมอไดผลลบรายงานผล“Negative”

-เมอไดผลบวกรายงานผล“Positive”

การแปลผล

Negative:ไมมHbE

Positive:อาจเปนผทมHbEซงพบไดทง

ทเปนพาหะHbE,HbEhomozygoteหรอ -tha-

ขอจำกดของการทดสอบ

-HbHซงเปนฮโมโกลบนทไมเสถยรถาม

ปรมาณมากจะถกออกซไดซตกตะกอนเกดผลบวกได

-ไมควรใชกบheparinizedbloodเนอง

จากheparinรบกวนการตรวจวดและกอใหเกดผล

บวกปลอมได

การควบคมคณภาพ

1. ควรทำการตรวจสอบคณภาพของนำยา

กอนนำมาใชในงานบรการ โดยทำการทดสอบกบ

เลอดควบคมคณภาพ ซงมแนวทางในการเลอกตว

อยางเลอดควบคมคณภาพจากเลอดผใหญในงาน

ประจำวนดงน

ตวอยางควบคมผลลบ (Negative control)

เปนตวอยางเลอดทมชนดของHbเปนA2A

ตวอยางควบคมผลบวก (Positive control)

เปนตวอยางเลอดทมชนดของHbเปนEA

ไมควรใช EE เพราะใหผลบวกแรงเกนไป

หองปฏบตการสามารถเกบตวอยางเลอด

ดงกลาวไวในตเยน4ºCสำหรบใชเปนเลอดควบคม

คณภาพตอไปได1สปดาห

ในกรณท ไม สามารถหาตวอยางเล อด

ดงกลาวไดผปฏบตสามารถใชตวอยางเลอดทเหลอ

lassemiaและหรอ -thalassemiaทมHbEรวมดวย

ตองสงตวอยางเลอดตรวจHbtypingตอไป

�

จากการตรวจคดกรองทใหผลการตรวจเปนบวกและ

ลบอยางละ1-2รายเกบไวในตเยน2-8ºCเพอใช

ควบคมคณภาพสำหรบการทดสอบครงตอไป และ

เกบเลอดใหมทกครงททำการทดสอบไปเรอยๆ

2. ตวอยางเลอดทนำมาทดสอบควรเปน

เลอดทเจาะใหมในวนนน หากไมสามารถทำการ

ทดสอบไดทนท ควรเกบเลอดไวในต เยน 4ºC

และไมควรเกบไวนานเกน1สปดาหแตถาไมมตเยน

เกบควรทำการทดสอบภายใน48ชวโมงเนองจาก

เลอดท เกาฮโมโกลบนบางสวนจะถกออกซไดซ

ไปแลวสงเกตไดจากเลอดมการเปลยนแปลงเปน

ส แดงคลำไม ใช แดงสดเหมอนเล อดเจาะใหม

เมอนำไปทำปฏกรยากบDCIPจะตกตะกอนไดงาย

ขนจนเกดผลบวกปลอมได

3. อณหภมท ทำปฏกรยาจะตองเทากบ

37±1ºC และเวลาท ใหทำปฏกร ยาจะตองตรง

ตามทระบในเอกสารกำกบนำยา ดงนนอางนำหรอ

บลอกควบคมอณหภม(heatblock)จะตองมระบบ

ตรวจสอบความถกตองของอณหภมเปนประจำ

เพราะถาอณหภมตำกวา 36ºC จะใหผลลบปลอม

แตถ ามากกวา 38ºC กจะใหผลบวกปลอมได

ขอควรระวง

นำยา DCIP เปนนำยาสนำเงนเขม มความไวตอแสง อากาศ และอณหภมทสงจงตองเกบนำยาในภาชนะทมฝาปดสนทบรรจในกลองเพอไมใหโดนแสงเกบในตเยน4ºC

หากทำการทดสอบแลวมผลลบหรอบวกทกตวอยาง

ใหตรวจสอบเร องอณหภม ท ทำปฏก ร ยาเปน

อนดบแรก สำหรบประเดนในเรองเวลาทำปฏกรยา

จะพบความผดพลาดไดมากกวา ถาผปฏบตทำการ

ทดสอบคร งละหลายตวอยาง (เชนมากกวา 10

ตวอยางตอครง) โดยเฉพาะถาทำการทดสอบใน

หองทไมไดปรบอากาศ และมอณหภมหองสงกวา

30ºC ตวอยางรายแรกๆ ทเตมเลอดลงไปในนำยา

ระหว างท รอเต มต วอย างเล อดรายตอๆ ไป

จนครบรายสดทายไดเกดปฏกร ยาไปบางสวน

แลว เมอนำไปอนตออก 15 นาท อาจทำใหเกด

ผลบวกปลอมได

4. การควบคมคณภาพการอานผลทำ

เชนเดยวกบการอานผลOF

�

การตรวจคดกรองธาลสซเมยดวยคาดชนเมดเลอดแดง

ในการตรวจหาคาดชนเมดเลอดแดง (red

bloodcellindices)คาทนยมใชในการตรวจคดกรอง

ธาลสซเมยคอคาMCVและMCHโดยเมดเลอด

แดงของผทเปนธาลสซเมยจะมคาMCVและMCH

ตำกวาเมดเลอดแดงคนปกต โดยใชตามเกณฑของ

WeatherallDJและCleggJBคอMCV<80fL

และ/หรอMCH<27pgซงมความไวสงพอในการ

คดกรองพาหะ -thalassemia1และ -thalassemia

วธการและการรายงานผล รายงานคาตามทวเคราะหได

การแปลผล MCV < 80 fL และ/หรอ MCH < 27 pg :อาจเปน -thalassemiaและหรอ -thalassemiaและหรอ Hb E โดย -thalassemia มโอกาสเปนไดทงชนด -thalassemia1และ -thalassemia2สวน-thalassemiaกมโอกาสเปนไดทง 0-thalassemiaและ +-thalassemia MCV > 80 fL และ MCH > 27 pg :ไมเปนธาลสซเมย หรออาจเปนธาลสซเมยชนดไมรนแรงเชน -thalassemia2,HbConstantSpring,HbPaksèหรออาจมHbE

ขอจำกดของการทดสอบ 1. การคดกรองดวยคาดชนเมดเลอดแดง

จำเปนตองทำการทดสอบกบเมดเลอดทเจาะใหม

หรอทเกบรกษาไวในตเยน 4ºC ไมเกน 24 ชวโมง

เนองจากเมดเลอดแดงเปนเซลลทมชวต มการใช

พลงงานในกระบวนการเมตาบอลซมเพอคงสภาพ

เซลลไวตลอดเวลาเมอพลงงานลดลงเซลลเมดเลอด

แดงกจะเปลยนแปลงรปรางและแตกในทสด

2.ประมาณรอยละ20-40ของพาหะHb

EมคาMCVและMCHมากกวา80fLและ27

pg ตามลำดบ จงจำเปนตองตรวจดวยวธ DCIP

รวมดวย

การควบคมคณภาพ

หองปฏบตการตองมแนวทางการปฏบตงานเพอคงมาตรฐานเครองมอตามเกณฑมาตรฐานทกำหนด รวมทงมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ(internalqualitycontrol)ดวยวสดควบคมคณภาพทไดมาตรฐานและเขารวมเปนสมาชกexternalqualityassuranceหรอproficiencytestingprogramและม การบำร งร กษาเคร องม อเป นประจำสมำเสมอ

�

การตรวจวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกลบน (Hb typing & quantitation)

ปจจบนการตรวจวเคราะหชนดและปรมาณ

ฮโมโกลบน เพอวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบน

ผดปกตทางหองปฏบตการนยมใชเครองมออตโนมต

เนองจากมขอดหลายประการอาทเชนความสะดวก

รวดเรวในการปฏบตงาน เครองสามารถตรวจไดทง

ชนดและปรมาณของฮโมโกลบนไดอยางตอเนอง

ในขนตอนเดยวกน จงไมยงยากและไมตองอาศยผ

ทมความชำนาญสงอกทงยงมความถกตองแมนยำ

และเปนทยอมรบในระดบสากล ปจจบนเครองมอ

อตโนมตสำหรบวเคราะหชนดและปรมาณฮโมโกล

บนทมใชในประเทศไทยม2หลกการคอ

1. หลกการโครมาโตกราฟอดแรงดน มทง

ประเภทแรงดนสง(highpressureliquidchromato

graphy:HPLC)และแรงดนตำ(lowpressureliquid

chromatography : LPLC) โดยมหลกการเดยวกน

คอ เปนคอลมนโครมาโตกราฟแบบแลกเปลยน

อออนชนดบวก (cation exchange column chro-

matography) สวนคอลมนบรรจอนภาคขนาดเลก

(spherical silica gel) เคลอบดวยสารคารบอกซล

(carboxyl) ซงมประจลบ ทำหนาทเปน stationary

phase จบกบประจบวกของฮโมโกลบนทผานเขา

ไปในคอลมนทางระบบสงสารตวอยาง (sample

injector)จากนนฮโมโกลบนแตละชนดจะถกชะลาง

(elute) ออกจากคอลมนดวยบฟเฟอร (mobile

phase)ทมความแรงของประจ (ionicstrength)สง

กวาความแรงของประจของฮโมโกลบนทจบอยกบ

stationary phase แตเนองจากในตวอยางเลอดม

ฮโมโกลบนปนกนหลายชนด แตละชนดม ionic

strength ไมเทากน เครองอตโนมตเหลานจงตองม

โปรแกรมควบคมการผสมบฟเฟอร2ชนดทมionic

strengthตางกนเพอใหมการเปลยนแปลงของionic

strength ทเหมาะสมสำหรบฮโมโกลบนแตละชนด

ระยะเวลาทฮโมโกลบนแตละชนดคงอยในคอลมน

เรยกวาretentiontime(RT)ซงเปนคณสมบตเฉพาะ

ของแตละฮโมโกลบนจากนนฮโมโกลบนทถกชะออก

มาจะถกสงผานไปยงเครองตรวจวดคาการดดกลน

แสง(spectrophotometerdetector)ทความยาวคลน

ท เหมาะสม แลวสงขอมลไปยงสวนประมวลผล

เพอวเคราะหฮโมโกลบนชนดตางๆอางองตามRT

ของฮโมโกลบนมาตรฐาน และรายงานผลเปน 2

ลกษณะ คอ รายงานโครมาโตแกรม แสดงการดด

กลนแสงของฮโมโกลบนทถกชะลางผานคอลมน

ออกมาในเวลาตางๆ (หรอนยมเรยกกนวา peak)

และรายงานปรมาณฮโมโกลบนแตละชนดตามพน

ทใตกราฟในชวงเวลาทกำหนด

2.หลกการแยกดวยกระแสไฟฟาความตาง

ศกยสงในหลอดแกวนำไฟฟาขนาดเลก (capillary

electrophoresis)อาศยการแยกชนดฮโมโกลบน

ดวยกระแสไฟฟาความตางศกยสง (10,000-30,000

volts) ผานตวกลาง คอหลอดแกวนำไฟฟาขนาด

เลกมาก (silica capillary) ท มเสนผาศนยกลาง

25-100 ไมโครเมตร (high voltage capillary elec-

trophoresis) โดยปลายทงสองขางของหลอดแกว

จมอยในบฟเฟอรทเปนดาง (alkali buffer pH 9.4)

เมอปลอยกระแสไฟฟา เขาไปจะเกดการเคลอนท

ของฮโมโกลบนชนดตางๆ ทมประจสทธแตกตาง

กนไปตามแรงขบเคลอนไฟฟา (electro osmotic

flow) โดยตวอยางจะถกปลอยเขาไปในหลอด

แกวทางดานข วบวก เคล อนท ไปยงข วลบผาน

เครองตรวจวดการดดกลนแสงความยาวคลน 415

นาโนเมตร (detector) และระบบแปลงสญญาณ

แลวรายงานผลออกมา เรยกวา electrophore-

�0

gram (เทยบไดกบ chromatogram จากเคร อง

HPLC หรอ LPLC) โดยกอนการตรวจวเคราะหใน

ตวอยางเลอดจะมการปรบมาตรฐานตำแหนงของ

ฮโมโกลบนใหHbAอยตรงกลางของหนาตางelec-

trophoregram จากตวอยางควบคมคณภาพกอน

โดยฮโมโกลบนชนดตางๆทมในตวอยางเลอดจะถก

กำหนดเปนโซนเรยกวา โซน 1- โซน 15 ใน elec-

trophoregram ท ปรากฏโดยอางองจาก Hb A

และหรอHbA2ของตวอยางนนในกรณทตวอยาง

เลอดทตรวจวเคราะหไมม Hb A และหรอ Hb A2

เคร องจะอางองชนดฮโมโกลบนจากตวอยางท

วเคราะหกอนหนาน และจะไมปรากฏแถบโซนใน

electrophoregram

วสดอปกรณ นำยา และวธการ

เคร องมอของแตละบรษทมรายละเอยดแตกตางกนออกไป ผปฏบตควรไดรบการฝกอบรมทงในดานการเตรยมตวอยางเลอด การใชและบำรงรกษาเครองมอ ตลอดจนการอาน และการวเคราะหผลจากผเชยวชาญของบรษทและผทรงคณวฒในสาขาทเกยวของกอนการใหบรการทางหองปฏบตการ

การรายงานผล

รายงานชนดฮโมโกลบนจากโครมาโตแกรม

ทปรากฏออกมาจากสวนแสดงผลพรอมทงรายงาน

ปรมาณHbA2/EและHbFทเครองคำนวณใหโดย

การรายงานชนดฮโมโกลบนทพบบอยในประเทศไทย

คอHbConstantSpring,HbA2/E,HbF,HbA,

HbBart’sและHbH

เครองวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต หลกการ Capillary Electrophoresis รายงานชนดฮโมโกลบนตามลกษณะelectro-

phoregramทปรากฎและปรมาณฮโมโกลบนชนดตางๆ

ทเครองวเคราะหใหเหมอนกบ การตรวจวเคราะห

การแปลผลการวเคราะหฮโมโกลบน (Hb Typing) ทพบบอยในประชากรไทย

1.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปนA2A

และปรมาณHbA2นอยกวา4.0%พบไดในหลายกรณ

ดงน

1.1คนปกตทไมเปนธาลสซเมยหรออาจเปน

ธาลสซเมยชนดไมรนแรง กลมนผลการตรวจทาง

โลหตวทยาพบวาMCV,MCHและBloodSmear

ปกต

1.2 ผ ท เป นพาหะ -thalassemia 2

และผทเปนhomozygous -thalassemia2กลมน

โดยทวไปจะไมมอาการซดHbมากกวา10g/dLคา

MCVมคาตงแต70fLจนถงมากกวา80fL

1.3ผทเปนพาหะ -thalassemia1กลมน

โดยทวไปจะไมมอาการซด Hb มากกวา 10 g/dL

(ถาไมมภาวะอนแทรกซอน) blood smear พบเมด

เลอดแดงผดปกตเลกนอยและสวนใหญมคาMCV

นอยกวา80fLและMCHนอยกวา27pg

เนองจากผลการตรวจHbtypingไมสามารถ

แยกผทเปนพาหะ -thalassemia1พาหะ -tha-

lassemia 2 และ homozygous -thalassemia 2

ออกจากคนปกตทไมเปนธาลสซเมยหรอผทเปน

เครองวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต ระบบคอลมนโครมาโตกราฟ (HPLC และ LPLC)

ดวยระบบอนๆ แตเนองจากเครอง high voltage

capillary electrophoresis มศกยภาพในการแยก

HbA2กบHbEออกจากกนไดในขณะทเครองอน

ทอาศยหลกการคอลมนโครมาโตกราฟ ไมสามารถ

แยกออกจากกนไดคาอางองของHbA2และHbE

ในผทเปนธาลสซเมยชนดตางๆทมHbEจงแตกตาง

จากเครองอนๆซงปรมาณHbEทวดไดจะมปรมาณ

HbA2รวมอยดวยหากตองการใชคาอางองตามท

ยอมรบกนในปจจบน โดยเฉพาะอยางยงพาหะHbE

ทสงสยวาจะมยนแฝง -thalassemia1ซงใชคาcutoff

ทHbE<25%สามารถทำไดโดยการรวมปรมาณ

HbA2กบHbEเขาดวยกนได

��

ขอควรระวง

5.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปนEE

โดยมปรมาณHbE>80%และHbF<5%แปลผลเปน

homozygousHbEwithorwithout -thalassemia

เนองจากผทเปน homozygous Hb E ทงทมและ

ไมมยนแฝง -thalassemiaรวมมผลการตรวจHb

typingทคลายคลงกนตองตรวจวเคราะหDNAเทา

นนจงจะใหการวนจฉยการมยนแฝง -thalassemia

ไดโดยทวไปhomozygousHbEมคาHbมากกวา

10 g/dLMCV ประมาณ 60-70 fL ผลการตรวจ

blood smear พบเมดเลอดแดงมการเปลยนแปลง

ทงขนาดและรปราง พบ target cell จำนวนมาก

หากทำการตรวจคดกรองดวยDCIPจะใหผลบวก

6.ในกรณทไมแนใจวาผลการวเคราะหHb

typing เปน EEหรอ EF เนองจากปรมาณHb F

เพมขนจากทระบในขอ5ทำใหสบสนในการรายงาน

ผลวาเปน EE หรอ EF ดงนนจงอาจรายงานเปน

EE/EFและแปลผลเปน“suspectedhomozygous

HbEor -thalassemia/HbEwithorwithout

-thalassemiaกรณาดclinicalหรอทำfamilystudy

ประกอบการแปลผล” เนองจากความผดปกต 2

ชนดนมจโนไทปทตางกนและมความรนแรงตางกน

การวนจฉยแยกชนดตองพจารณาผลการตรวจอนๆ

ประกอบดวยหากเปนEEคอhomozygousHbE

จะไมเปนโรคธาลสซเมยทรนแรงดงรายละเอยดในขอ

5แตถาเปนEFกจะเปนโรค -thalassemia/HbE

ซงผลการตรวจทางโลหตวทยาจะพบความรนแรง

มากกวาดงรายละเอยดในขอ12

7.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน

CSA2AแปลผลเปนsuspectedHbConstantSpring

อยางไรกดฮโมโกลบนผดปกตนอาจเปนHbPakse

ไดเนองจากฮโมโกบนผดปกต2ชนดนมจำนวนกรด

อะมโนของสาย -globinมากกวาปกต31ตวเทากน

และถงแมจะมกรดอะมโนตำแหนงท 142 ตางกน

โดยทHbConstantSpringเปนกลตามน(Glutamine:

Glu) สวน Hb Pakse เปนไทโรซน (Tyrosine:Tyr)

แตประจสทธไมตางกน จงตรวจพบในตำแหนง

เดยวกนทงการแยกดวยกระแสไฟฟาและการตรวจ

ธาลสซเมยชนดไมรนแรงได หากผลการตรวจพบHb

typingA2AโดยHbA

2นอยกวา4.0%หองปฏบตการ

สามารถแปลผลเปนnormalHbtyping,notruleout

-thalassemia

2.ในกรณท ผลการวเคราะหHbtyping

เปนA2AและปรมาณHbA

2>4.0%แปลผลเปน

-thalassemiatraitwithorwithout -thalassemia

สวนใหญมปรมาณHbA2ประมาณ4-7.5%MCV

ประมาณ60-75fLผลการตรวจbloodsmearพบ

เมดเลอดแดงผดปกตเลกนอย หากทำการตรวจ

คดกรองดวย OF และ DCIP จะใหผลบวกกบ

การทดสอบ OF test แตใหผลลบกบการทดสอบ

DCIP

- ในพาหะ -thalassemia ทม -thalas

semia1รวมดวย(doubleheterozygote)ปรมาณ

HbA2อาจตำลงบางรายอาจตำกวา 4%และคา

MCVอาจจะสงขนเปน78-80fLทำใหการวนจฉย

ผดพลาดได

-ในบางภมภาค +-thalassemiaบางชนด

อาจมคาMCVเลกและมปรมาณHbA2อยในชวง

3.5-4% ได หากคสมรสเปนพาหะ -thalassemia

ควรพจารณาสงตรวจหาชนดของmutationตอไป

3.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน

EAและปรมาณHbE25–35%แปลผลเปนHbEtrait

โดยทวไปผทเปนพาหะHbEจะมคาMCVประมาณ

75-85fLหากทำการตรวจคดกรองดวยOFสามารถ

ใหผลไดทงบวกและลบแตผลการตรวจคดกรองดวย

DCIPจะใหผลบวก

4. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing

เปน EA และปรมาณHb E < 25% แปลผลเปน

Hb E trait with or without -thalassemia

โดยทวไปผทเปนพาหะ Hb E รวมกบพาหะ -

thalassemia1พบHbEประมาณ19-21%MCV

ประมาณ 60-75 fL ผลการตรวจคดกรองดวย OF

และDCIPเปนบวกทงค

��

ดวยเครองวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต HPLC

หรอLPLCแตจะรายงานผลจากการตรวจวเคราะห

ฮโมโกลบนเปนHbConstantSpringเนองจากHb

ConstantSpringมความชกในการตรวจพบมากกวา

Hb Pakse โดยทวไปผทเปนพาหะจะไมซด และม

ขอมลทางโลหตวทยาอนๆอยในเกณฑปกต

8.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน

CSA2ABart’sแปลผลเปนsuspectedhomozygous

Hb Constant Spring ซงผปวยมกมภาวะซดคลาย

ผทเปนโรคHbHอยางไรกตามอาจตรวจไมพบHb

Bart’sไดเนองจากสาย -globinมปรมาณนอย

9. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing

เปน A2A H หรอ A

2A Bart’s H ปรมาณHb A

2

คอนขางตำกวาปกต แปลผลเปน Hb H disease

( -thalassemia 1/ -thalassemia 2) เนองจาก

การตรวจพบ Hb H (4) หรอ Hb Bart’s (

4)

แสดงวาสาย -globinจะตองมปรมาณนอยลงมาก

จงทำใหสาย -globinและสาย -globinเหลออยมาก

จงจบกนเอง4สายกลายเปนHbHและHbBart’s

ในผปวยบางรายอาจไมพบHbBart’sเนองจากสาย

-globinมปรมาณนอยผลการตรวจbloodsmear

ในผ ปวยกล มน พบลกษณะเมดเลอดแดงแบบ

ธาลสซเมย แตมลกษณะผดปกตประมาณ 1+ ถง

2+ ลกษณะจำเพาะทใชวนจฉยโรค Hb H ไดด

คอการตรวจพบเมดเลอดแดงทม inclusion body

โดยอาจตรวจพบเมดเลอดแดงเชนนไดถง 30-90%

ของเมดเลอดแดงทงหมด

10.ในกรณทผลการวเคราะหHbtyping

เปนCSA2AHหรอCSA

2ABart’sHแปลผล

เปน Hb H-CS disease ( -thalassemia 1/

Hb CS หรอ -thalassemia 1/ Hb Pakse )

อาการตางๆ จะคลายผทเปนโรค Hb H disease

( -thalassemia 1/ -thalassemia 2) ในขอท 9

แตอาการมกจะรนแรงกวาเนองจากมความไมเสถยร

ของHbHรวมกบHbCSหรอHbPakse และขอ

ควรระวงสำหรบหองปฏบตการคอ ความไมเสถยร

รวมกบมปรมาณนอยของHbHและHbCSหรอ

HbPakse หากเกบเลอดไวนานเกนไปอาจตรวจไม

พบทำใหการแปลผลผดพลาดได

11. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing

เปน A2F ในเดกอายมากกวา 1 ป รวมกบการม

อาการของโรคธาลสซเมยชดเจน ซด ตบมามโต

แปลผลเปนhomozygous o-thalassemiawithor

without -thalassemia จากการทตรวจไมพบHbA

แสดงวาผปวยสงเคราะหสาย -globin ไมไดเลย

จงมการสงเคราะหสาย -globin ขนมาทดแทน

ทำใหตรวจพบHbFมปรมาณสงมากสวนปรมาณ

Hb A2 อาจสงขนเลกนอยหรออยในเกณฑปกต

ผลการตรวจbloodsmearพบเมดเลอดแดงมลกษณะ

ผดปกตมากกวาในโรคHbHไมพบHbHinclusion

body ในเมดเลอดแดง แตผปวยทตดมามแลวอาจ

จะพบตะกอนของฮโมโกลบนในเมดเลอดแดงได

ข อควรระว งหากพบผลการว เคราะห

ฮ โมโกลบนเปน A2F คอ ตองตรวจสอบอาย

ของผ ปวยใหด ถาเปนเดกทารกท อายยงไมถง

1 ป จะไมสามารถวนจฉยจโนไทปท แนนอนได

เนองจากปรมาณHbFยงคงสงอยตองรอใหHbF

คอยๆลดลงจนอายมากกวา1ปจงสามารถแปลผล

การตรวจHbtypingได

12.ในกรณทผลการวเคราะหHbtyping

เปน EF โดยมปรมาณ Hb E ประมาณ 40-80%

Hb F ประมาณ 20-60% ไมพบ Hb A พบได

ในหลายกรณดงน

12.1กรณทเปนผปวย 0-thalassemia/Hb

Ewith orwithout -thalassemia ผปวยมอาการ

ของโรคธาลสซเมยชดเจน ซด ตบมามโต คลาย

homozygous 0-thalassemia หรออาจนอยกวา

โดยทวไปผปวยกลมนมปรมาณHb4-10g/dL

MCVประมาณ55-75fLผลการตรวจbloodsmear

พบเมดเลอดแดงทมการเปลยนแปลงทงขนาดและ

รปราง อาจพบเมดเลอดแดงตวออน (nucleated

red cell) ในกรณทผ ปวยไดรบการรกษาโดยการ

ใหเลอดมาแลวอาจพบHbAจากdonor blood

ทำใหปรมาณ Hb E และ Hb F เปลยนแปลงไป

��

ถาไมทราบประวตการรบเลอดมากอนจะทำใหการ

วนจฉยผดพลาดได

12.2กรณทผปวยมdeletionalHPFHรวมกบ

HbEโดยทวไปผปวยกลมนจะไมซดมปรมาณHb>

10g/dLผลการตรวจbloodsmearพบลกษณะเมด

เลอดแดงคอนขางปกตรายงานผลเปนsuspected

HPFH/HbE

เนองจากผลการตรวจHbtypingไมสามารถ

แยกผทเปน 0-thalassemia/HbEและHPFH/Hb

E ออกจากกนได หากผลการตรวจพบ Hb typing

EF โดยมปรมาณHbEประมาณ40-80%HbF

ประมาณ 20-60% ไมพบ Hb A หองปฏบตการ

สามารถแปลผลเปนsuspected 0-thalassemia/Hb

EorHPFH/HbEwithorwithout -thalassemia

13.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน

A2FAโดยปรมาณHbF10–30%พบไดในหลายกรณ

ดงน

13.1 ในกรณทผปวยมภาวะซดไมมประวต

การรบเลอดภายใน3เดอนกอนทำการตรวจเลอด

ควรแปลผลเปน suspected 0-thalassemia/ +-

thalassemiaหรอ +-thalassemia/ +-thalassemia

13.2 ถาไมมอาการของโรคธาลสซเมย

เลยกอาจเปนไปไดวาตวอยางเลอดรายนนเปน

พาหะHPFHหรอพาหะ( )o-thalassemiaซงเปน

ภาวะทยน -globinสรางสาย -globinไดในปรมาณ

สงโดยไมแสดงอาการผดปกตใดๆ ควรแปลผลเปน

suspectedHPFHtraitor( )o-thalassemiatrait

เนองจากผลการตรวจHbtypingไมสามารถ

แยกผทเปน 0-thalassemia/ +-thalassemia, +-tha-

lassemia/ +-thalassemia,พาหะHPFHและพาหะ

( )o-thalassemiaออกจากกนไดหากผลการตรวจพบ

HbtypingA2FAโดยปรมาณHbF10–30%

หองปฏบตการสามารถแปลผลเปนsuspected0-thalassemia/ +-thalassemiaor +-thalassemia/

β+-thalassemiaorHPFHtraitor( )o-thalassemiatrait

withorwithout -thalassemiaอยางไรกตามการ

ตรวจพบ Hb F ในตวอยางเลอดผปวย กอนทจะ

ทำการวนจฉยใดๆตองตรวจสอบอายของผปวยกอน

เสมอหากอายยงไมครบ1ปจะยงไมสามารถใหการ

วนจฉยท ถ กตองได นอกจากน นควรพจารณา

อาการทางคลนกประกอบ หากไมมอาการของโรค

ธาลสซเมยเลยกอาจเปนไปไดวาผปวยมภาวะHPFH

��

ขอจำกด

1. เคร องวเคราะหฮโมโกลบนอตโนมต

แสดงผลในลกษณะโครมาโตแกรมหรอโซนตางๆ

ทปรากฎรวมกบปรมาณของฮโมโกลบนแตละชนด

โดยไมไดสรปผล Hb typing ใหผปฏบตงานจงตอง

มความร และประสบการณสงในการรายงานผล

และแปลผล

2.อนพนธของฮโมโกลบน(hemoglobin

derivatives)เชนglycosylatedHb,acetylated

HbFและฮโมโกลบนท โมเลกลสลายบางสวน

หรอ( )o-thalassemiaหรอภาวะทมstresseryth-

ropoiesisจากสาเหตอนๆททำใหมภาวะเลอดจาง

เชน การต งครรภ ภาวะเลอดจางเร อรง มะเรง

เมดเลอดขาว แตการเพมขนของปรมาณ Hb F

ในภาวะทม stress erythropoiesis นมกจะเพมขน

ไมเกนรอยละ 10 ดงนนการทตรวจพบปรมาณ

Hb F สงขน แลวจะสรปวาเปนโรค -thalassemia

จงตองพจารณาใหรอบคอบ โดยเฉพาะอยางยง

ตองทราบประวต และอาการของคนไข หากมผล

การตรวจเลอดของครอบครวประกอบดวยจะชวย

ใหวนจฉยไดถกตองมากยงขน

14.ในกรณทผลการวเคราะหHbtypingเปน

EFA ผปวยมภาวะซดไมมประวตการรบเลอดภายใน3

เดอนกอนทำการตรวจเลอดควรแปลผลเปน +-tha-

lassemia/HbEwithorwithout -thalassemia

15. ในกรณทผลการวเคราะห Hb typing

เปนEABart’s,EEBart’s,EFABart’s,EFBart’s,

CSEABart’s,CSEEBart’s,CSEFABart’sและ

CS EF Bart’s ทงหมดนเปนกลมโรคธาลสซเมย

ทมฟโนไทปและจโนไทปซบซอน ซงมภาวะรวม

ระหวาง -thalassemia, -thalassemiaและHbE

ภาวะเหลานเกดเนองจากสาย -globin มปรมาณ

นอยลงและสาย -globinชอบจบกบสาย -globin

ปกตมากกวาสาย E-globinในกรณทเปนHbEtrait

จงตรวจพบปรมาณของHbEลดลงดวยเสมอเมอ

เทยบกบปรมาณHbAโดยจะพบปรมาณนอยกวา

รอยละ 20 แตการจะสรปจโนไทปใหถกตองจรงๆ

ควรจะตองทำการตรวจวเคราะหDNAท งยน

-thalassemiaและ -thalassemiaดวยจงจะสามารถ

สรปเพ อใหคำปรกษาเก ยวกบการถายทอดทาง

กรรมพนธของครอบครวผปวยไดอยางถกตอง

16. ในกรณพบฮโมโกลบนผดปกตทนอก

เหนอจาก Hb E และ Hb CS จดเปนฮโมโกลบน

ผดปกตท พบไมบอย(rareabnormalHb)เชน

HbJBangkok,HbHope,HbQ-Thailand,HbC,HbO

และอ นๆควรรายงานตำแหนงของฮโมโกลบน

ผดปกตทพบบนโครมาโตแกรมหรอelectrophoregram

และแปลผลเปนsuspectedabnormalHbไมควรระบ

ชนดของฮโมโกลบนผดปกตถงแมวาเครองจะรายงาน

Window ของฮโมโกลบนเหลานนกตาม เนองจาก

ฮโมโกลบนผดปกตหลายชนดมคณสมบตใกลเคยงกน

ไมสามารถวนจฉยแยกจากกนโดยการตรวจHbtyping

ไมวาจะโดยเครอง HPLC, LPLC หรอ CE เชน

การพบฮโมโกลบนผดปกตท S window ในระบบ

คอลมนโครมาโตกราฟ เมอนำไปตรวจวเคราะห

DNAพบวาเปนไดท งHbTak,HbDPunjab,

HbQueens,HbSiamและHbSหากตองการทราบ

ชนดของความผดปกตจะตองตรวจยนยนโดยการ

ตรวจวเคราะห DNA หรอตรวจหาลำดบการเรยง

ตวของกรดอะมโนตอไป

ทกลาวมาทงหมดเปนแนวทางในการแปล

ผลการตรวจวเคราะหฮโมโกลบนเพอการวนจฉย

ธาลสซเมยทพบบอยในประเทศไทยซงตองอาศย

ขอมลหลายอยางประกอบตงแตผลการตรวจคดกรอง

คาดชนเมดเลอดแดงผลHbtypingปรมาณHbA2

ปรมาณHbFนอกจากนประวตผปวยและครอบครว

ตลอดจนผลการตรวจเลอดของครอบครวกมสวนชวย

ใหการวนจฉยมความถกตองแมนยำมากยงขน

��

(degradation)เนองจากเลอดเกาอาจทำใหเกดปญหา

การเคลอนของคา retention time และสบสนในการ

อานผลได

3. ในกรณทพบปรมาณHb F สงกวาปกต

ถาไมใชเลอดเดกแรกเกดควรยอม FCell ประกอบ

การรายงานผลดวย เน องจากม abnormal Hb

บางชนดปรากฎในตำแหนงเดยวกบHbF

4.ในกรณทไมแนใจวาเปนHbHหรอไม

การยอมHbHinclusionbodiesจะชวยยนยนการ

รายงานผลได

5. ในกรณทสงสยวามฮโมโกลบนผดปกต

การตรวจเลอดบคคลอนๆ ในครอบครว และการ

ตรวจแยกชนดฮโมโกลบนดวยระบบอนดวยอาจจะ

ชวยยนยนผลในเบองตนไดวามฮโมโกลบนผดปกต

หรอไมอยางไรกตามยงไมสามารถรายงานชนดของ

ฮโมโกลบนผดปกตได จนกวาจะไดตรวจวเคราะห

DNAหรอลำดบกรดอะมโน

1.ควรใหความสำคญในการดแลบำรงรกษาและสอบเทยบครภณฑเปนประจำสมำเสมอ 2. ควรมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ (internal quality control) โดยใชวสดควบคมคณภาพท ม มาตรฐานทกคร งท ทำการวเคราะหตวอยางสงตรวจ 3.ควรเขารวมกจกรรมควบคมคณภาพโดยหนวยงานภายนอก(externalqualityassuranceหรอproficiencytestingprogram)เปนประจำ 4.การรายงานผลแต ละต วอย างควรตรวจสอบความสมพนธกบผลการตรวจคดกรองเบองตนทมดวยเสมอ 5. ผ ปฏบตงานควรไดร บการฝกอบรมและตรวจประเมนประสทธภาพดานองคความรในการวเคราะหและประมวลผลการตรวจทางหองปฏบตการเปนประจำ

การควบคมคณภาพการตรวจวเคราะห ฮโมโกลบนดวยเครองอตโนมต

��

��

PCRProduct โดยการทำagarosegel electrophore-sis อาศยการสราง primer ใหครอมบรเวณ DNAท ขาดหายไปเมอนำไปทำ PCR จะสามารถเพมจำนวนชนสวนของ DNA ได เนองจากการขาดหายไปของ DNA ทำให primer ดงกลาวถกเลอนเขามาใกลกน สวน DNA คนปกต (normalDNA)primerทงสองทใชอยหางกนมากกวา17.5kb(SEAdeletion)และมากกวา38kb(THAIdeletion)ซ งเป นขนาดท ใหญเก นกวาจะเพ มจำนวนไดในการทำ PCR ทวๆ ไป จงไมม PCR productเกดข น และเพอใหสามารถวนจฉยแยกระหวางhomozygous -thalassemia1และพาหะ -tha-lassemia1จงมการเพมprimerสำหรบเพมปรมาณnormal DNA ลงไปในการทำปฏกรยา PCR ดวยจากนนจงตดตามการเกดPCRproductsโดยการทำagarosegelelectrophoresisและเปรยบเทยบขนาดDNAทเกดขนทำใหทราบวาบคคลนนมความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia1ชนดSEAdeletionหรอชนดTHAIdeletionหรอไม

Relative Quantitative PCR

เทคนค Relat ive Quantitat ive PCR

อาศยการออกแบบprimerและprobe3ชดสำหรบ

เพมปรมาณDNAและตรวจหาความผดปกตของยน

ท เปนสาเหตของ -thalassemia1ชนดSEA

deletion และชนด THAI deletion เปรยบเทยบกบ

ยน -globinทปกตโดยprobeทง3ชนดไดรบ

การออกแบบใหตดฉลากดวยสfluorescenceท

แตกตางกนจงสามารถตดตามความผดปกตของยน

-thalassemia1ทง2ชนดได

ตวอยางทไมพบความผดปกตของ -tha-

lassemia1ทงชนดSEAและชนดไทยจะพบเฉพาะ

การตรวจวเคราะหความผดปกต ของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia 1

ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -tha-

lassemia1ในประชากรไทยมสาเหตมาจากการขาด

หายไปของยน -globin ทงสองยนบนโครโมโซม

เดยวกน จงไมสามารถสงเคราะหสาย -globin

ไดเลย สาม-ภรรยาทมความผดปกตของ -tha-

lassemia1ทงคมโอกาสถายทอดความผดปกตรวม

กนไปสลกทำใหลกเปนhomozygous -thalassemia

1(HbBart’shydropsfetalis)ซงเปนโรคธาลสซเมย

ทมอาการรนแรงทสด ทารกจะเสยชวตตงแตอย

ในครรภ ตายคลอด หรอไมก ช วโมงหลงคลอด

ในขณะท มารดาจะเกดภาวะแทรกซอนของการ

ต งครรภ มอาการครรภเปนพษ มการคลอดผด

ปกต ตกเลอดหลงคลอด หากอาการรนแรงมาก

อาจเสยชวตได หากหองปฏบตการมศกยภาพใน

การตรวจหาความผดปกตของยน -thalassemia1

ไดอยางมประสทธภาพถกตองและรวดเรว จะชวย

ปองกนอนตรายทจะเกดขนกบมารดาทตงครรภบตร

เปนHbBart’shydropsfetalisไดอยางทนทวงท

ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -tha-

lassemia 1 ทมรายงานในประชากรไทยม 2 ชนด

คอชนด SEA deletion และชนด THAI deletion

สวนใหญทพบเปนชนดSEAdeletionชนดTHAI

deletionถงแมจะพบในอตราสวนทนอยกวาแตถาพบ

ความผดปกตรวมกบชนดSEAdeletionกสงผลใหเกด

HbBart’shydropsfetalisไดเชนเดยวกน

ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia1สามารถตรวจหาไดโดยเทคนคPCRสวนใหญนยมใชวธGapPCRรวมกบการวเคราะห

หลกการ Gap PCR/ Agarose Gel Electrophoresis

��

วธการ สวนใหญแตละหนวยงานจะพฒนาวธการตรวจวเคราะหขนใชเอง หลกการวเคราะหจงอาจแตกตางกนขนกบปรมาณตวอยางสงตรวจตลอดจนความพรอมของบคลากรและเครองมอ สงทสำคญคอจะตองมการตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห (method validation) กอนเปดบรการเพอใหสอดคลองตามขอกำหนดในมาตรฐานสากลและมความม นใจในประสทธภาพของการตรวจวเคราะห

การรายงานผลในกรณตรวจวนจฉย ในบคคลทวไปทไมใชการตรวจวนจฉย ทารกในครรภมารดา

การควบคมคณภาพ 1. ควรมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ(internalqualitycontrol)โดยใชตวอยางDNA ควบคมคณภาพทผานการตรวจยนยนแลวใหครบทง3ชนดคอDNAควบคมคณภาพชนดSEAdeletion,DNAควบคมคณภาพชนดTHAIdeletionและ DNA ควบคมคณภาพทไมพบความผดปกตของทงSEAและTHAIdeletion(negativecontrol)ทกครงททำการวเคราะหตวอยางสงตรวจ 2. ควรเข าร วมโครงการทดสอบความชำนาญทางหองปฏบตการเพอเปรยบเทยบผลการตรวจวเคราะหกบหนวยงานอน 3. ควรใหความสำคญในการดแลบำรงรกษาและสอบเทยบครภณฑทมผลกระทบตอความนาเชอถอของการตรวจวเคราะห เชน เครอง PCRไปเปตอตโนมตตเยนและตแชสำหรบเกบตวอยางและนำยาทใชในการตรวจวเคราะห 4. บคลากรทปฏบตหนาทควรไดรบการฝกอบรมเปนประจำอยางตอเนอง

การเรองแสงของสfluorescenceของnormalprobe

สวนตวอยางทพบความผดปกตของ -thalassemia 1

(SEA)heterozygoteจะพบการเรองแสงของสfluores-

cenceของnormalprobeและSEAprobeและตว

อยางทพบความผดปกตของ -thalassemia1 (THAI)

heterozygote จะพบการเรองแสงของส fluorescence

ของnormalprobeและTHAIprobe

รายงานNegativefor -thalassemia1(SEA

andTHAIdeletions)ในกรณทตรวจไมพบความผดปกต

ของยนα-thalassemia1ชนดSEAและชนดTHAI

รายงานPositivefor -thalassemia1(SEA

deletion) ในกรณทตรวจพบความผดปกตของยน

-thalassemia1ชนดSEA

รายงานPositivefor -thalassemia1(THAI

deletion) ในกรณทตรวจพบความผดปกตของยน

-thalassemia1ชนดTHAI

��

polymeraseชนดทไมมฤทธของ3’-5’exonucleaseภายใตสภาวะในการทำ PCR ทเหมาะสม primerจำเพาะแตละชนดจะทำใหเกดการเพ มจำนวน -globingeneจากAlleleใดAlleleหนงทจำเพาะเทานนจงสามารถแยก -globin gene ปกต และ -tha-lassemia ออกจากกนไดโดยตรวจดชนสวน DNAทเพมจำนวนขนมาไดโดยการแยกดวยกระแสไฟฟา(agarosegelelectrophoresis) ในการทำ ASPCR ตวอยางท ใหผลลบจะไมปรากฏแถบ DNA ใดๆ ใหเหนบนแผนเจลท แยกดวยกระแสไฟฟา ดงน นนอกเหนอจากตวอยางควบคมทใหผลบวก (positive control)และใหผลลบ(negativecontrol)แลวจะตองมการควบคมคณภาพปฏกรยา PCR ในหลอดทดลอง(internal control) ของการทำ PCR ดวย โดยเปนการเพมจำนวนของยนอนทไมใช -globin geneและมขนาดชนสวน DNA ทแตกตางจากยนทเปนสาเหตของ -thalassemiaทกำลงจะตรวจ วธASPCRนบเปนวธทรวดเรวและสะดวกในการตรวจหาความผดปกตของยน เน องจากขนตอนทตองทำการวเคราะหภายหลงขนตอนPCR(postPCR)มเพยงการตรวจหาDNAทเพมจำนวนไดโดยการแยกดวยกระแสไฟฟาเทานน

เทคนค Reverse Dot Blot Hybridization (RDB)

เทคนค Reverse Dot Blot Hybridization

(RDB) อาศยการออกแบบและสงเคราะห Allele

Specific Oligonucleotide (ASO) Probe หลายๆ

ชนดทมปลายขางหนงเปนหมอะมโน(NH2)นำมา

ยดตดบนแผนไนลอนเมมเบรน(nylonmembrane)

ทเปนประจลบแลวนำDNAของผปวยทไดทำPCR

โดยใหนวคลโอไทดบนสายDNAตดฉลากดวยBiotin

การตรวจวเคราะหความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -thalassemia

ความผดปกตของยนทเปนสาเหตของ -tha-

lassemiaในประชากรไทยสวนใหญเปนชนดpoint

mutationซงเกดจากการมเบสเปลยนแปลงไป(basesub-

stitution)หรอเบสจำนวนนอยๆขาดหายไปหรอเกนมา

(small deletion หรอ insertion) ทำใหเกดmutation

ทเรยกวาframeshiftmutationความรนแรงของ

-thalassemia ขนกบชนดของmutation ทเกดขน

วาสามารถสรางmRNAหรอสาย -globinไดหรอไม

หากไมสามารถสรางสาย -globinไดเลยเรยก 0-

thalassemiaแตถาสามารถสรางสาย -globinไดบาง

เรยก +-thalassemia ความผดปกตของยนทเปน

สาเหตของ -thalassemiaในประชากรไทยมความ

หลากหลายมากปจจบนมรายงานมากกวา30ชนด

โดยแตละภมภาคแตละชมชนกมความแตกตางกน

การตรวจหาความผดปกตของยนท เปน

สาเหตของ -thalassemiaในปจจบนนยมใชเทคนค

allelespecificPCR(ASPCR),เทคนคreversedot

blothybridization(RDB)และการตรวจหาลำดบการ

เรยงตวของสารพนธกรรม(DNAsequencing)

เทคนคallelespecificPCR(ASPCR)อาศยการออกแบบและสงเคราะห primer ใหมความจำเพาะตอmutationชนดใดชนดหนงชนดละ2 primer, primer ท 1 จำเพาะตอ Allele ปกตและ primer ท 2 จำเพาะตอmutation ชนดนนๆโดยออกแบบใหมเบสจำเพาะท ปลายดาน 3’จากนนนำ primer ทงสองชนดนไปทำ PCR คกบprimer ปกตอกชนดหนง ซงเปน common primerโดยอาศยเอนไซมTaqDNApolymeraseหรอDNA

หลกการ

เทคนค Allele Specific PCR (ASPCR)

�0

การตรวจหาลำดบการเรยงตวของสารพนธกรรม (DNA sequencing)

ว ธ ตรวจหาลำดบการเร ยงต วของสาร

พนธกรรม (DNA sequencing)ทนยมใชในปจจบน

คอวธchain terminationของSangerซงสามารถ

พฒนาใชรวมกบเคร องอตโนมต ทำใหการอาน

และการวเคราะหผลทำไดสะดวกมากขนอาศยการ

เพ มปร มาณDNAท ต องการตรวจหาลำด บ

การเรยงตวของสารพนธกรรมดวยเทคนคPCR

โดย DNA สายใหมท สรางข นจะถกจำกดความ

ยาวดวย dideoxy nucleotide ตวใดตวหนงใน 4

ตว คอ ddATP, ddGTP, ddCTP และ ddTTP

ท ต ดฉลากดวยสฟลออเรสเซนตท แตกตางกน

เม อนำปฏกรยาทไดไปทำ polyacrylamide gel

electrophoresis จะสามารถแยกชนสวนของ DNA

ทมความยาวตางกน1เบสไดการทำelectrophore-

sis โดยใชเครองอตโนมต ซงมอปกรณการอาน

และการแปลผลขอมล จะชวยอำนวยความสะดวก

ในการตรวจวเคราะหไดเปนอยางด

วธการ

สวนใหญแตละหนวยงานจะพฒนาวธการตรวจวเคราะหขนใชเอง หลกการวเคราะหจงอาจแตกตางกนขนกบปรมาณตวอยางสงตรวจตลอดจนความพรอมของบคลากรและเครองมอ สงทสำคญคอจะตองมการตรวจสอบ ความถกตองของวธวเคราะห(methodvalidation)กอนเปดบรการเพอใหสอดคลองตามขอกำหนดในมาตรฐานสากลและมความมนใจในประสทธภาพของการตรวจวเคราะห

การรายงานผล

รายงานผล Negative ในกรณตรวจไมพบ

ความผดปกตของยน -thalassemia ทตรวจสอบ

เชนNegativefor -thalassemiacodons41/42

(-TTCT),codon17(A-T)andIVSI-5(G-C)

รายงานผลPositivefor -thalassemiaและ

ระบความผดปกตของยน -thalassemiaทตรวจพบ

เชน Positive for -thalassemia [Codons 41/42

(-TTCT)]

รายงานPositiveforcompoundheterozygous

-thalassemiaและระบชนดของยนท ผ ดปกต

ในกรณทตรวจพบความผดปกตของยน2ชนดรวมกน

เชนPositiveforcompoundheterozygous -tha-

lassemia [Codons 41/42 (-TTCT) and IVS I-5

(G-C)]

มาhybridizeกบASOProbeบนแผนเมมเบรนดงกลาว

แลวตรวจสอบปฏกรยาhybridizationระหวางASO

ProbeกบDNAผปวยโดยการทำcolordetection

วธการดงกลาวสามารถตรวจหาความผดปกตของยน

-thalassemiaไดหลายชนดจากการทำhybridization

เพยงครงเดยวนบเปนวธทสะดวกรวดเรว

��

ชนดการผาเหลา -thalassemia ในคนไทย

��

เทคนค Reverse Dot Blot Hybridization (RDB)

1. กรณทเปน compound heterozygote

ของmutation ทมตำแหนงใกลกน เชน IVS 1 nt

1 และ IVS 1 nt 5หรอ codon 17 และ codon

19จะไมพบการเกดสบนnormalprobeเนองจาก

ตำแหนงทผดปกตใกลกนทำใหnormalprobeทง2

ชนดไมสามารถhybridizeกบDNAtemplateได

2.เปนวธทคอนขางยากและมหลายขนตอน

จงตองอาศยผเชยวชาญและมประสบการณสง

การตรวจหาลำดบการเรยงตวของสารพนธกรรม (DNA sequencing)

การควบคมคณภาพ 1. ควรทำ positive control และ negativecontrol โดยใชตวอยางDNA ทผานการตรวจยนยนแลวทำปฏกรยาควบคไปกบตวอยางสงตรวจทกครง 2. ควรเขารวมโครงการทดสอบความชำนาญทางหองปฏบตการเพอเปรยบเทยบผลการตรวจวเคราะหกบหนวยงานอนหากไมมโครงการดงกลาวอาจเปรยบเทยบผลการวเคราะหกบหนวยงานอนทนาเชอถอ(inter-laboratorycomparison)เปนระยะๆตามความเหมาะสม 3.ควรใหความสำคญในการดแลบำรงรกษาและสอบเทยบครภณฑทมผลกระทบตอความนาเชอถอของการตรวจวเคราะห 4. บคลากรทปฏบตหนาทควรไดรบการฝกอบรมเปนประจำอยางตอเนอง

เทคนค Allele Specific PCR (ASPCR)

1. การตรวจยน -thalassemia ดวยวธmultiplexASPCRเม อพบผลบวกกบmutationชนดใดชนดหนงจะสรปจโนไทปยงไมไดจะตองทำPCRอกหลอดดวยprimerปกต(N)ท codonทมmutationนนถาตรวจพบแถบDNAทจำเพาะเมอใชprimerNดวยกแสดงวาเปนheterozygoteแตถาไมพบกแสดงวาเปนhomozygoteการตรวจดวย primer N น จะใชในกรณท ทำการตรวจวนจฉยตวอยางทารกท พอและแมม mutationชนดเดยวกนแตถาพอและแมมmutationตางชนดกนเชนพอม -thalassemiacodon17[A-T]แมมHb E ตวอยาง DNA ของทารกกจะตรวจดวยprimerMของcodon17[A-T]และHbEเทานน

ขอจำกด

1.เปนวธทคอนขางยากและมหลายขนตอน

จงตองอาศยผเชยวชาญและมประสบการณสง

2. เปนวธทตองใชเครองมอทมราคาแพง

จงเหมาะกบหองปฏบตการอางองทใหบรการตรวจ

หาลำดบการเรยงตวของสารพนธกรรมในดานอน

ทนอกเหนอจากการตรวจหาความผดปกตของยน

ธาลสซเมย

สวนการตรวจหาmutation ของยน -thalassemiaในหญงตงครรภ และหรอคสมรสทมผลการตรวจคดกรองเปนบวกและผลวเคราะหฮโมโกลบนทวนจฉยไดแลววาเปนพาหะ -thalassemia (Hb typingA

2A

wihhighHbA2)เมอใหผลบวกกบmutationใดแลวก

ไมจำเปนตองตรวจกบprimerNตอ 2. จำเปนตองใช primer หลายชนดในการตรวจแตถาเลอกศกษาในกลมประชากรเปาหมายแลวจะมmutationทตองตรวจไมมากนก

��

ภาพสรปแนวทางการดำเนนงานทางหองปฏบตการ

��

��

1.กลนภาฟเจรญ.การตรวจทางหองปฏบตการ

เพอการตรวจวนจยธาลสซเมย และฮโมโกลบน

ผดปกตทพบบอยในประเทศไทย. พมพครงท 1.

ขอนแกน:ศนยวจยและพฒนาการตรวจวนจฉยทาง

หองปฏบตการทางการแพทยคณะเทคนคการแพทย

มหาวทยาลยขอนแกน,2549.

2. กลนภา ฟ เจรญ. การตรวจทางหอง

ปฏบตการ เพอการตรวจวนจยธาลสซเมย และ

ฮโมโกลบนผดปกตท พบบอยในประเทศไทย.

พมพคร งท 2. ขอนแกน: ศนยวจยและพฒนา

การตรวจวนจฉยทางหองปฏบตการทางการแพทย

คณะเทคนคการแพทยมหาวทยาลยขอนแกน,2551.

3. กลนภา ฟ เจรญ, สพรรณ ฟ เจรญ.

การตรวจคดกรองธาลสซเมยในประเทศไทย.วารสาร

เทคนคการแพทย และกายภาพบำบด 2551; 20:

165-176.

4.จว เชาวถาวร,สทศนฟเจรญ,จนตนา

พฒนพงศธร.ธาลสซเมยคมอการวนจฉยและแนะนำ

ปรกษา.พมพครงท1กรงเทพฯ:ชมนมสหกรณการ

เกษตรแหงประเทศไทย,2542.

5.ปราณ(วนจจะกล)ฟเจรญและสทศนฟเจรญ

(บรรณาธการ).ธาลสซเมยการตรวจวเคราะหยนดวย

เทคนคPCRพมพครงท1โครงการวจยธาลสซเมย

สถาบนวจย และพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลย

มหาวทยาลยมหดล,2541

6.ปราณ(วนจจะกล)ฟเจรญ.Laboratory

diagnosisofthalassemiaandhemoglobinopathies.

การประชมเชงปฏบตการ(Workshop)Thalassemia:

from molecular biology to clinical medicine.

สถาบนวจยและพฒนาวทยาศาสตรและเทคโนโลย

มหาวทยาลยมหดล,9-20มนาคม2541

7.วชยเหลาสมบต.ธาลสซเมย.กรงเทพ:

โอเอสพรนตงเฮาส,2541:71-124.

8.สาครวนทอง,กลนภาฟเจรญ,เชยวชาญ

สระคพนธ, กนกวรรณ แสนไชยสรยา, ณฐยา

แซอง, สพรรณ ฟเจรญ. การจดตงระบบควบคม

คณภาพเพอเพมประสทธภาพการตรวจคดกรอง

ธาลสซเมยทโรงพยาบาลเมองสรวงจงหวดรอยเอด.

วารสารเทคนคการแพทยและกายภาพบำบด2550;

19:148-166.

9.สรภากรแสงกจพร,สมชายแสงกจพร.

การตรวจวนจฉยทางหองปฏบตการเพอสนบสนนการ

ควบคมและปองกนโรคทางพนธกรรม พมพครงท 1

นนทบร:กรมวทยาศาสตรการแพทย,2548.

10. สพรรณ ฟเจรญ, กลนภา ฟเจรญ.

การตรวจทางหองปฏบตการเพอการวนจฉยธาลสซเมย

ตามแผนงานการควบคมและปองกนโรคของประเทศ

ไทย.สงขลานครนทรเวชสาร2545;20:43-55.

11.FucharoenG,SanchaisuriyaK,Sae-

ungN,DangwibulS,FucharoenS.Asimplified

screeningstrategy for thalassemiaandhaemo-

globinEinruralcommunitiesinsouth-eastAsia.

BullWorldHealthOrgan2004;82:364-372.

12. Sanchaisuriya K, Fucharoen S,

Fucharoen G, Ratanasiri T, Sanchaisuriya P,

ChangtrakulY,etal.Areliablescreeningproto-

col for thalassemia and hemoglobinopathies in

pregnancy;analternativeapproachtoelectronic

bloodcellcounting.AmJClinPathol2005;123:

113-118.

13.WeatherallDJ,CleggJB.Thelabora-

torydiagnosisofthethalassemias.In:Thethalas-

saemiasyndromes.4rded.BlackwellScientific

Publication,Oxford,2001:690.

บรรณานกรม

��

��

ASO allelespecificoligonucleotide

ASPCR allelespecificpolymerasechainreaction

CE capillaryelectrophoresis

CS constantspring

DCIP dichlorophenolindophenol

Hb hemoglobin

Hct hematocrit

HPFH hereditarypersistanceoffetalhemoglobin

HPLC highpressureliquidchromatography

LPLC lowpressureliquidchromatography

MCH meancorpuscularhemoglobin

MCV meancorpuscularvolume

OF osmoticfragility

PCR polymerasechainreaction

RDB reversedotblot

SEA Southeastasia

Taq Thermusaquaticus

Thal thalassemia

คำยอ

��

/2551 ( )

( )

1. 2. . 3. 4. . 5. . 6. 7. 8.

1.

2. -

3.

. . 2551

( ) 9 ( )

��

/2552

………………………….

-

13

1.

2.

3.

4.

5.

6.

/2...

�0

- 2 -

7. .

8.

9. .

10.

11.

12. .

13. .

14.

15.

16.

1

17.

18.

/3...

��

- 3 -

1.

2.

3.

. . 2552

��

กรมวทยาศาสตรการแพทยขอขอบคณคณะผเชยวชาญทกทานทใหเกยรตเปนคณะกรรมการ

จดทำคมอทางหองปฏบตการตรวจวนจฉยธาลสซเมยและฮโมโกลบนผดปกตฉบบน