A matrilin-2 expressziójának vizsgálata

májregenerációban kísérletesen és hepatocelluláris

carcinomában

Doktori értekezés

Szabó Erzsébet

Semmelweis Egyetem

Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető: Prof Dr. Schaff Zsuzsa, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora

Hivatalos bírálók: Dr. Mózes Miklós, egyetemi docens, PhD

Dr. Tóvári József, tudományos munkatárs, PhD

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Jeney András, egyetemi tanár,

az orvostudományok doktora

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár,

az orvostudományok doktora

Dr. Simon Károly, osztályvezető főorvos, PhD

Budapest 2007

1

TARTALOMJEGYZÉK

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................... 3

2. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR .......................................................... 6

2.1. Hepatocelluláris carcinoma ................................................................................................................6 2.1.1. Epidemiológia................................................................................................................................6 2.1.2. Etiológia.........................................................................................................................................6 2.1.3. Hepatocarcinogenesis, a HBV és HCV fertőzés szerepe a patogenezisben...................................7 2.1.4. HCC típusai, lokalizációja, morfológiája......................................................................................8 2.1.5. A HCC szövettana .........................................................................................................................9 2.1.6. Májfibrosis, cirrhosis ...................................................................................................................10

2.2. Májregeneráció..................................................................................................................................11 2.2.1. A májregenerációban szerepet játszó sejtek, májregenerációs kísérleti modellek .......................11 2.2.2. A humán máj progenitor sejtjei ...................................................................................................14 2.2.3. Az őssejtek és a hepatocarcinogenesis kapcsolata .......................................................................15

2.3. Az extracelluláris mátrix (ECM).....................................................................................................18 2.3.1. Az ECM szerkezete és jelentősége ..............................................................................................18 2.3.2. Az ECM szerepe a tumorprogresszióban.....................................................................................19 2.3.3. ECM a normál májban.................................................................................................................20 2.3.4. A máj sejtjei, szerepük az ECM proteinek szintézisében.............................................................21 2.3.5. Az ECM változásai fibrosisban és cirrhosisban...........................................................................21 2.3.6. Az ECM jellemzői a májregeneráció során .................................................................................24

2.4. A matrilin fehérje család...................................................................................................................26 2.4.1. A matrilinek szerkezete ...............................................................................................................26 2.4.2. A család tagjainak jellemzése és filogenetikai eredete ................................................................28 2.4.3. A matrilinek oligomerizációja és kölcsönhatása más ECM komponensekkel.............................30 2.4.4. A matrilinek expressziója különböző szövetekben és szervekben...............................................33 2.4.5. A matrilinek szerepe betegségekben............................................................................................34 2.4.6. A matrilin-2 expressziója humán szövetekben és tumorokban....................................................36

3. CÉLKÍTŰZÉSEK.......................................................................................... 38

4. ANYAG ÉS MÓDSZER................................................................................ 39

4.1. A vizsgálatokhoz használt oldatok, pufferek összetétele ................................................................39

4.2. Állatkísérletek....................................................................................................................................40 4.2.1. Parciális hepatectomia (PH).........................................................................................................40 4.2.2. Parciális hepatectomia/acetylaminofluorén (PH/AAF) modell....................................................40

4.3. Humán szövetek.................................................................................................................................40

4.4. Morfológiai vizsgálatok.....................................................................................................................41 4.4.1. Hisztológia...................................................................................................................................41 4.4.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok ..................................................................................................41

4.4.2.1. Paraffinos metszeteken végzett immunfestés.......................................................................41 4.4.2.2 Fagyasztott metszeteken végzett immunfloureszcenciás vizsgálat .......................................42 4.4.2.3. Fotódokumentáció................................................................................................................42 4.4.2.4. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése .....................................45

2

4.5. Molekuláris biológiai vizsgálatok.....................................................................................................45 4.5.1. Szöveti lézer mikrodisszekció és RNS izolálás patkány májból..................................................45 4.5.2. RNS-izolálás RNA laterben fixált humán anyagból ....................................................................45 4.5.3. cDNS előállítás ............................................................................................................................46 4.5.4. Primerek és a PCR körülményei ..................................................................................................47 4.5.5. Grádiens PCR ..............................................................................................................................47 4.5.6. Agaróz gélelektroforézis..............................................................................................................48 4.5.7. Real-time RT-PCR.......................................................................................................................49 4.5.8. Real-time RT-PCR eredmények elemzésének módszere.............................................................50 4.5.9. HCV vírus detektálása humán májmintákból Nested - PCR módszerrel .....................................51 4.5.10. RNS expresszió detektálása in situ hibridizációval ...................................................................55 4.5.11. Fehérje izolálás ..........................................................................................................................56

4.5.11.1. Patkány májakból...............................................................................................................56 4.5.11.2. Humán májakból................................................................................................................56

4.5.12. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis .........................................................................................57 4.5.13. Western blot...............................................................................................................................57

5. EREDMÉNYEK ............................................................................................ 59

5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata patkány májban immunhisztokémiával.......................59 5.1.1. Matrilin-2 vizsgálata immunhisztokémiával normál patkány májban .........................................59 5.1.2. Matrilin-2 immunhisztokémiai kimutatása májregenerációban..................................................60

5.2. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása AAF/PH kezelést követően Western blot technikával....................................................................................................................................................................66

5. 3. Matrilin-2-t termelő sejtek detektálása májregenerációban.........................................................68

5.4. Matrilin-2 expresszió vizsgálata real-time RT-PCR analízissel ....................................................70

5. 5. Matrilin-2 expresszió vizsgálata humán májban ...........................................................................71 5.5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata ép és cirrhotikus humán májszövetben immunhisztokémiai módszerrel.............................................................................................................71 5.5.2. Matrilin-2 fehérje expressziójának vizsgálata hepatocelluláris carcinomában ............................72 5.5.3. A laminin és matrilin-2 kolokalizációjának vizsgálata humán májszövetben..............................74 5.5.4. Matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése és statisztikai analízise ...........75 5.5.5. Matrilin-2 fehérjeexpresszió vizsgálata Western blot technikával humán májakon ....................77 5.5.6. Matrilin-2 mRNS expressziójának real-time RT-PCR analízise humán májmintákon................78

6. MEGBESZÉLÉS .......................................................................................... 81

7. KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................. 88

8. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................... 89

9. SUMMARY................................................................................................... 90

10. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................... 91

11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ..................................................... 108

12. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS...................................................................... 112

3

1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

AAF acetylaminofluorene, acetylaminofluorén

ABC avidin-biotin complex, avidin - biotin komplex

AEC 3-amino-9 ethyl-carbazole

AFB1 aflatoxin B1

AFP alpha-fetoprotein, alfa-fetoprotein

AS aminosav

BHMED bilateral hereditary microepiphyseal dysplasia, bilaterális örökletes

microepiphysealis dysplasia

BM basement membrane, bazális membrán

BMHSPG bazális membrán heparán szulfát proteoglikán

BSA bovine serum albumin, borjú szérum albumin

BT biotinilált tiramin

CC cholangiocarcinoma

cc coiled coil domén

CMP cartilage matrix protein, porc mátrix fehérje

COMP cartilage oligomeric matrix protein, porc oligomer mátrix fehérje

DAB 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindol

ECL enhanced chemiluminescence, erősített kemilumineszcencia

ECM extracellular matrix, extracelluláris mátrix

EDTA ethylene -diamine-tetraacetic acid

EGF epidermal growth factor, epidermális növekedési faktor

ELISA enzyme linked immunosorbent assay, enzim-kötött immunoszorbens

próba

GAG glükózaminoglikán

GAPDH glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase, glicerinaldehid-3-foszfát

dehidrogenáz

GBM multiform glioblastoma

HBV hepatitis B virus, hepatitisz B vírus

HCC hepatocellular carcinoma, hepatocellularis carcinoma

HCV hepatitis C virus, hepatitisz C vírus

4

HE hematoxilin –eozin

HRP horseradish peroxidase, tormaperoxidáz

HSPG heparánszulfát proteoglikán

IS idiopathic sclerosis, idiopatikus szklerózis

IL-1 interleukin-1

MDR-1 multidrog resistance gene-1, multidrog rezisztencia gén-1

MED multiple epiphiseal dysplasia, multiplex epipyseális dysplasia

MIDAS- metal ion dependent adhesion site, fémionfüggő adhéziós hely

MMP matrix metallpoproteinase, mátrix metalloproteináz

NF-κB nuclear factor-κB

NOH – AAF N-hidroxi- acetaminofluorén

ORF open reading frame, nyitott olvasási keret

PA pilocitikus astrocytoma

PBS phosphate buffer saline, foszfát puffer

PCR polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció

PG proteoglikán

PH partial hepatectomy, parciális hepatectomia

PPARα peroxisome proliferator-activated receptor-α

PSACH pseudochondrodysplasia

RT reverse transcriptase, reverz transzkriptáz

SDS sodium dodecyl sulfate, nátrium dodecil-szulfát

SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-poliacrilamide gel electrophoresis, nátrium

dodecil-szulfát -poliakrilamid gél elektroforézis

SSC sodium chloride/ sodium citrate, nátrium-klorid/citrát

NTB nitro- tetrazolium-blue

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

TBE tris –borát- EDTA

TBS tris-buffer-saline, tris-puffer

TGF transforming growth factor, transzformáló növekedési faktor

TGF α transforming growth factor-α, transzformáló növekedési faktor- α

TGF β transforming growth factor-β, transzformáló növekedési faktor- β

TIF tubulointersticial fibrosis, tubulointerszticiális fibrosis (vesében)

5

TIMP tissue inhibitor metalloproteinase, szöveti metalloproteináz inhibitor

TNFα tumor necrosis factor-α, tumor nekrózis faktor-α

U unique domain, egyedi szekvencia

vWFA von Willebrand factor A, von Willebrand Faktor A

6

2. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR

2.1. Hepatocelluláris carcinoma

A hepatocelluláris carcinoma (HCC) világviszonylatban az ötödik leggyakoribb

daganatos betegség. 2005-ben 667 000 esetet számoltak világszerte, ebből 17 500-at az

USA-ban (Rougier és mtsai 2007). Világviszonylatban évente körülbelül egymillió új

beteggel kell számolni, mortalitás tekintetében a harmadik helyen áll a malignus

daganatok között.

A daganat kezelése, különösen előrehaladott stádiumban megoldatlan, bár az utóbbi

hónapokban ismertetett cél-orientált gyógyszer, a sorafenib, talán áttörést jelent (Llovet

és mtsai 2007). A korai diagnózisban szerepet játszó érzékeny diagnosztikai markerek

feltárása, a posztoperatív szakban a HCC kiújulásának monitorozása változatlanul nagy

kihívást jelent.

2.1.1. Epidemiológia

A hepatocelluláris carcinoma (HCC) a humán carcinomák 5,6%-áért (férfiak: 7,5%,

nők: 3,5%) felelős. Prevalenciája az utóbbi években Európában és az USA-ban is

jelentősen növekedett, így a következő két évtizedben különösen jelentős orvosi és

népegészségügyi probléma lesz, amint az Japánban már ma is látható (Rougier és mtsai

2007). Magyarországon nem tartozik a leggyakoribb daganatok közé, de előfordulása

növekvő tendenciát mutat. (Szabo és mtsai 2003, Nagy és mtsai 2006).

2.1.2. Etiológia

A HCC etiológiájában több tényező játszik szerepet. Ezek között kiemelten a

vírusfertőzések, elsősorban a hepatitisz B vírus (HBV) és a hepatitisz C vírus (HCV)

fertőzés áll. A HCC előfordulásában kifejezett geográfiai különbségek tapasztalhatók.

Jellegzetes földrajzi eloszlást mutat, igen gyakori Afrika középső és déli területén,

Délkelet-Ázsiában, míg Európában és Észak-Amerikában ritkábban fordul elő (Buendia

1992, 2000). Az afrikai és az ázsiai HCC esetek többsége HBV fertőzéssel, míg a

7

Japánban, Európában és az USA-ban előforduló esetek HCV fertőzéssel függnek össze

(Hayashi és mtsai 1999, Aizawa és mtsai 2000, Szabo és mtsai 2003, 2004). A

legjelentősebb kofaktorok között az alkohol, az aflatoxin (AFB1), a dohányzás, egyes

szteroidok és egyéb toxikus tényezők szerepelhetnek a HCC etiológiájában. További

kockázati tényezőt jelentenek egyes genetikai rendellenességek (heamochromatosis,

Wilson kór, az α1-antitrypsin hiány), amelyek növelik a HCC kialakulásának esélyeit

(Hofseth és mtsai 2003). A cirrhosis önmagában is kockázati tényezőként jön

számításba, ugyanis a HCC-k 70-80%-a cirrhotikus talajon alakul ki. Újabban az

irodalom a nem alkoholos zsírmájat is kockázati tényezőként említi (Teufel és mtsai

2007).

Hazánkban elsősorban a hepatitisz C, majd a B és D, valamint az alkoholos cirrhosis és

a haemochromatosis a legfőbb oki tényező. A leggyakoribb HCV genotípus hazánkban

az 1b altípus (Gervain és mtsai 2001, Lengyel és Tulassay 2007).

2.1.3. Hepatocarcinogenesis, a HBV és HCV fertőzés szerepe a patogenezisben.

A HCC kialakulása többtényezős, többlépcsős és összetett folyamat, amely gyakran a

hepatitisz vírusok (HBV és HCV) perzisztens jelenlétével van összefüggésben. A HCC-

t tumorképződés számos jellemzője közül a gyors növekedés és infiltráció, a korai

metasztázisképzés, a nagyfokú malignitás jellemzi. A HCV-vagy a HBV-fertőzés lassan

progrediáló krónikus májbetegséget okoz, mely megjelenhet enyhe vagy súlyosabb

aktivitású krónikus hepatitis, cirrhosis vagy HCC formájában. A kiterjedt kutatások

ellenére sem a HBV és még kevésbé a HCV okozta májrák keletkezési mechanizmusa

nem egyértelműen tisztázott (Schaff és mtsai 2004). Számos adat a gyulladás és a

hepatocita-regeneráció jelentőségét hangsúlyozza a patogenezisben (Chisari 2000,

Szabo és mtsai 2004). Más szerzők a virális antigének direkt carcinogén hatását emelik

ki (Andriasini és Barnabas 1999).

A HCC–ben szenvedő betegek 40%-a HBV-vel fertőzött, bár ez kiemelten Afrikában és

Távol-Keleten jellemző (Hofseth és mtsai 2002, Szabo és mtsai 2004, Teufel és mtsai

2007). A HBV sajátságai közül kiemelendő, hogy a vírus-DNS integrációja a sejt DNS-

ébe nem szükséges a vírus replikációja szempontjából, azonban e mechanizmus

lehetővé teszi a virális genom perzisztálását a sejtben. Az integrálódott virális DNS a

hepatocita-proliferáció során a replikálódó sejt-DNS-sel együtt szaporodik. A HBV-

8

DNS-integráció többféle hatású lehet a sejtre; így kromoszomális DNS-instabilitást,

transzlokációt, duplikációt, kromoszóma rekombinációt, mutagenesist okozhat,

valamint inkomplett virális fehérjéket kódolhat. Ezek celluláris szabályozó gének,

tumorszupresszor gének, többek közt a p53 elvesztését eredményezhetik (Schaff és

mtsai 1995) Gyakori a p53 és más szupresszor gén mutációja, egyes növekedési

faktorok expressziója pedig fokozódik (Kiss és mtsai 2002). A vírus géntermékeinek,

főleg az X gén kódolta fehérjének a – HBX-nek szerepe van a HBV daganat-kialakulást

elősegítő hatásában. Az X gén p53 és RB fehérjékre kifejezett közvetlen hatását is

feltételezik (Staib és mtsai 2003).

A HCV fertőzéssel asszociált hepatocarcinogenesis folyamata kevésbé ismert mint a

HBV-vel asszociálté. A Flaviviridae családjába tartozó HCV egyszálú RNS vírus

(Clarke és mtsai 1997) nem integrálódik a fertőzött sejt genomjába, mivel nem

rendelkezik reverz transzkriptáz (RT) aktivitással. A vírusgenom strukturális (core,

burok) és nem strukturális fehérjéket kódol, amelyek enzimfunkciókkal bírnak- helikáz,

proteináz (NS3) vagy RNS-polimeráz (NS5) aktivitásuk van. A HCV fertőzés és a

dagnatképződés szempontjából a HCV sejtproliferációt moduláló hatása kap elsősorban

szerepet. Ezért a hatásáért egyes vírusproteinek, elsősorban a core-komponens, tehetők

felelőssé. Ugyanis a HCV core-fehérje, mint különböző virális és celluláris gén

regulátora befolyásolja egyes gének expresszióját, fokozott növekedési stimulust

okozva, mely elősegíti a HCC kialakulását (Barba és mtsai 1997). A core fehérje

közvetett módon aktiválja a TNF-α receptorát, a Raf-1 kináz, és az NF-κB útvonalakat,

amely a TNF-α -indukált és Fas-mediált apoptózishoz vezet (You és mtsai 1999, Block

és mtsai 2003). Az utóbbi években egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a NF-κB-

nukláris faktornak a máj carcinogenesisében (Arsura és Cavin 2005).

2.1.4. HCC típusai, lokalizációja, morfológiája

A HCC kialakulhat cirrhosis talaján és cirrhosismentes májban, az előző lényegesen

gyakoribb. A HCC megjelenési formái igen változatosak lehetnek, így makroszkóposan

szoliter, multiplex noduláris vagy diffúz formában mutatkozhat (Schaff és Nagy 1997).

Magyarországon a HCC túlnyomórészt (70-80%-ban) cirrhosis talaján alakul ki. A

kisebb méretű HCC-k tokkal rendelkezhetnek. A progresszió mértékét gyakran a

makroszkóposan is szembetűnő ún. fiókdaganatok megjelenése, valamint a vénák

9

inváziója jellemzi. A tumor színe többnyire szürkésfehér vagy bevérzés miatt vöröses,

néha az epetermelés miatt enyhén barnás-zöldes színű.

2.1.5. A HCC szövettana

Szövettanilag a HCC különböző szerkezetet és fokozatot mutathat (Schaff és mtsai

2004) Leggyakrabban trabeculáris, tubuláris vagy alveoláris formában jelentkezik.

Sajátos formák is ismeretesek, pl. a világossejtes („hipernefroid”), a pleomorf és a

fibrosus alak. Külön entitás a fibrolamelláris típusú HCC. Ezen jellegzetes szöveti

szerkezetű daganat cirrhosis mentes májban, fiatalabb életkorban fordul elő (átlagos

életkor 23 év).

A HCC TNM klasszifikációjának elve hasonló egyéb tumorokéhoz. A T1-T3 kategóriák

közötti differenciálást a 2 cm-es tumorátmérő, a daganat szoliter vagy multiplex volta, a

lebenyek érintettsége határozza meg. A HCC differenciáltsági fokozatai követik az I-IV

differenciáltsági fok szerinti beosztást (grade), a magasan differenciált formától a

differenciálatlan formáig (Schaff és mtsai 2004).

A HCC prognózisa rossz, ezért létfontosságú a korai diagnózis. Klinikai detektálásában

a szérum alfa-fetoprotein (AFP) -meghatározásnak nagy jelentőséget tulajdonítanak.

Noha az AFP hatékony markernek bizonyult a HCC monitorozásában és hisztológiailag

is detektálható, csak bizonyos korlátokkal alkalmazható. A korai HCC diagnózisában az

AFP mérése akár 40%-os hibát is okozhat (Deng-Fu Yao és mtsai 2007). Az AFP-

emelkedése a szérumban nem HCC – specifikus, mert más daganatokban (csírasejtes

tumorok, pancreatoblastoma stb.) ugyancsak emelkedett értéket mutathat. A recidívák

észlelésére azonban jól használható, valamint a cirrhosisban szenvedő betegek

követésére is lehetőséget nyújt. Újabb adatok szerint az AFP-termelés alapján a HCC-k

két jól elhatárolható csoportba sorolhatók (Lee és Thorgeirsson 2006). Ez a daganatok

differenciáltságával is összefügg: a magasabban differenciált daganatokban az AFP

mRNS expressziója alacsonyabb, mint a rosszul differenciáltakban (Craig 1997).

A HCC extrahepaticus terjedése elsősorban a perihepatikus és abdominális

nyirokcsomókba, a tüdőbe és a csontokba történik (Katyal és mtsai 2000, Schaff és

mtsai 2004).

10

2.1.6. Májfibrosis, cirrhosis

A máj krónikus elváltozásainak közös jellemzője, hogy többnyire fokozott kötőszövet

termeléssel járnak és májfibrosishoz vezetnek. A májfibrosis során az extracelluláris

mátrix kórosan felhalmozódik a májban, és szerkezeti átépüléshez vezethet (Schaff és

Illyés 2004, Kovalszky és mtsai 2006). Cirrhosis esetén a máj állománya nodulusosan

átépül, az eredeti acináris struktúra nem ismerhető fel. Diffúz, a máj szerkezetének

torzulásával, átépülésével, göbök kialakulásával és progresszív fibrosissal járó folyamat.

A májcirrhosis során a májállományt képező regeneratív göböket (nodulusok)

kötőszöveti rostokból álló sövények (septumok) vesznek köröl. A rostok között

limfocitás infiltráció és epeút-proliferáció észlelhető. A cirrhosis osztályozása a

morfológiai megjelenés és kórokok alapján történhet. Etiológiai szempontból a cirrhosis

legfontosabb formái: alkoholos, virális, biliáris, toxikus eredetű, posztnekrotikus,

autoimmun, metabolikus zavar okozta, egyéb fertőző ágens okozta és kriptogén (Schaff

és Illyés 2004).

A cirrhosis patogenezisében több tényező játszik szerepet. Ez egy multifaktoriális

folyamat, elindítója a sejtkárosodás, mely részben különböző immunológiai

mechanizmusok beindulását, másrészről a széteső sejtekből származó faktorok

felszabadulását idézi elő. A legfontosabb patogenetikai tényezők között a sejtpusztulás

eredményezte krónikus gyulladás, s ennek következtében különböző gyulladásos

citokinek (TNFα, TGFα, TGFβ, interleukinek) fokozott termelődése játszik szerepet. Ez

a különböző mezenhimális sejtek (Kupffer-sejt, endothelsejt, fibroblast stb.) aktiválását

és az extracelluláris mátrix különböző komponenseinek felhalmozódását eredményezi

(erről bővebben az Extracelluláris mátrix fejezetben lesz szó).

11

2.2. Májregeneráció

2.2.1. A májregenerációban szerepet játszó sejtek, májregenerációs kísérleti

modellek

Az egészséges felnőtt májban a sejtpusztulás és sejtképződés egyensúlyban van

egymással. A máj óriási regenerálódó képességgel bír (Sarraf és mtsai 1994, Taub

1996). Az elmúlt évek kutatásai során a legfontosabb kérdések egyike az volt, milyen

eredetű sejtekből történik a máj regenerációja a máj sérülését követően.

A máj regenerációban szerepet játszó folyamatok tanulmányozása állatmodelleken vált

lehetővé. Így az eddig felhalmozódott ismeretek elsősorban patkány májra vonatkoznak.

Normál körülmények közt a májsejtek minimálisan proliferálnak. A máj sérülését

követően a hepatociták a sejtciklus Go fázisába lépve regenerálják a sérült májszövetet.

Így a különböző májsejt - vesztéssel előidézett májsérülés, mint a parciális

hepatectomia, vírus fertőzés vagy más faktor okozta gyulladásos folyamatot követően a

májszövet újjáépülése elsősorban a hepatociták replikációjával történik (Forbes és mtsai

2002). Különböző állatmodellekbe transzplantált hepatocitákkal végzett kísérletek során

igazolódott, hogy a beültetett hepatociták bizonyos hányada klonális expanzióban vesz

részt, és jelentős regenerálódó kapacitással bír (Forbes és mtsai 2002) Ennek alapján

feltételezhető, hogy a hepatociták önmagukban is a máj funkcionális őssejtjei. A

májregeneráció hepatociták részvételével történő tanulmányozására általában a Higgins

és Anderson által már 1931-ben leírt parciális hepatectomiát (PH) alkalmazzák.

Eszerint, ha a máj 70%-át parciális hepatectomiával eltávolítjuk, a májtömeg 7-10 nap

múlva regenerálja önmagát. Ennek molekuláris mechanizmusát számos kutatócsoport

tanulmányozta (Fausto 2001). Ha azonban a májat súlyos károsodás éri és a hepatociták

sérülnek vagy replikációjuk gátolt, az ún. potenciális őssejtek (potencial stem cell)

kompartmentek aktiválódnak (Roskams és mtsai 2003, Fausto 2004, Santoni-Rugiu és

mtsai 2005). Ezek a bipotenciális képességgel bíró, más néven ovális sejtek, mind

hepatocitákká, mind epeút hámsejtekké képesek differenciálódni. Az ovális sejtek

jellemző epeúti markerei a CK7, a CK19, OV-6, OV-1, hepatocita markere az AFP,

neuroendokrin markerei a chromogranin-A, connexin 43, CD34 stb. (Roskams 2006).

Az ovális sejt elnevezést az ovális mag és a halvány bazofil citoplazma miatt kapta

(Farber 1956). A patkány májban a Hering canalisokat felépítő sejtek viselkednek

12

őssejtekként, melyekből aktivizálódásukkor tubulusszerű képleteket formáló ovális

sejtek képződnek (Paku és mtsai 2001, 2004). Ezek a tubulusszerű képletek

szövettanilag a Hering canalisok folytatását képezik.

Feltételezhetően az őssejteknek van egy harmadik populációja is, amely májsejt

potenciállal rendelkezik, és a csontvelőből származik. Ezek a heamatopoietikus őssejtek.

Jóllehet ezeknek a sejteknek a megújulási sebessége viszonylag alacsony,

jelentőségteljes szerepük felmerül a regenerációban (Theise és mtsai 2000, Alison

2005).

Noha az utóbbi években igen kibővült az őssejtek eredetével fogalkozó irodalom,

egészen pontosan még a mai napig sem derült fény ezek pontos anatómiai

lokalizációjára, növekedési mintázatára. Az azonban ismert, hogy ezek az őssejtek a

periportális területen proliferálnak és innen terjeszkednek a májparencymába. Ezt az is

bizonyítja, hogy a periportális régió szelektív roncsolásával jelentősen csökkent a

proliferáló ovális sejtek száma (Petersen és mtsai 1998). A Hering canalisból való

eredetüket az ovális sejtek és az epeutak hámsejtjei közötti igen kifejezett fenotípusos

hasonlatosság is alátámasztja. A Hering canalisok kötik össze a disztális hepatocitákat

az interlobuláris epeúti duktuszokkal, amelyek valószínűleg az őssejtek

„szálláshelyei”(Sell és Salman 1984). Egyes szerzők szerint valamennyi epeút hámsejt

potenciálisan képes őssejtként viselkedni, míg a hepatocitákra jellemző transzkripciós

faktorok megjelenése az ovális sejtekben hepatocita irányú differenciálódást jelezhet.

Az 1. ábra a tudomány jelenlegi álláspontja szerinti ovális sejtekre vonatkozó

terminológiát és lokalizációjukat tünteti fel.

13

1. ábra. Az őssejtek lokalizációja a májban (Roskams 2006).

A bal oldali rész a portális teret (PT) ábrázolja. Az epeút (biliary tree) legkisebb és

legtávolabbi elágazódása portális biliáris duktuszokból (BD) és intralobuláris

duktuszokból áll. A Hering canalisokat részben hepatociták, részben

cholangiocyták képezik. Az őssejtek a Hering canalis legtávolabbi elágazódásai. A-

artéria, V- centrális véna.

Wilson és Leduc (1958) írták le először a tartalék „őssejt kompartmentet” súlyos diétát

követően egérben, melyet azóta patkányban több kísérleti modellben is sikerült

kimutatni. A legtöbb modellben parciális hepatectomiát követően egy carcinogén

vegyülettel gátolják a májsejt proliferációt.

Az ovális sejt kompartmentek indukálta májregeneráció vizsgálatára a 2-

acetylaminofluorén (AAF)/parciális hepatectomia (PH) modell az egyik legalkalmasabb

kísérleti rendszer (Evarts és mtsai 1987, Nagy 1995).

Kísérletileg igazolták, hogy már az AAF kezelést követően, a hepatectomia előtti

periódusban is a májban jól definiált változások figyelhetők meg. Egyetlen AAF dózis

adagolása után is szignifikánsan megemelkedik a periportális régióban az osztódó sejtek

száma (Paku és mtsai 2001, 2004). Az acetylaminofluorén a fluorénből származó

carcinogén vegyület. A fluorént a szervezet nem metabolizálja, ezért az egy ártalmatlan,

carcinogén hatással nem rendelkező anyag. Az aminofluorént (AF) már képesek a

májsejtek acetaminofluorénné átalakítani, amiből N- hidroxilációval alakul ki a

carcinogén hatású, DNS-hez kötődni képes N-hidroxi-acetilaminofluorén (NOH AAF).

14

Az AAF a májsejtek DNS molekuláihoz való kötődése révén megakadályozza azok

belépését a sejtciklusba. Az AAF kezelést követő PH után az ovális sejtek proliferálnak

és messze a májparenchymába terjednek a májsejtgerendák közé, ott hepatocitákká

differenciálódnak. Az AAF kezelés parciális hepatectomiával történő kombinációja

során a proliferáló ovális sejtek sokkal nagyobb számban figyelhetők meg. Az ovális

sejtek hepatocitává történő differenciálódásában döntő fontosságú esemény, amikor az

ovális sejtekből „bazofil fókuszok” formálódnak. A fókuszokat felépítő sejtek

morfológiailag is átmenetet mutatnak az ovális sejtek és a hepatociták között, mind

nagyság, mind alak vonatkozásában. Funkcionálisan is a fókuszokat felépítő sejtekben

jelennek meg a magasan differenciált hepatocitákra jellemző vonások (jelentősen

fokozott albumintermelés, csökkent AFP expresszió, MDR-1 expressziója, HNF-4)

(Nagy 1995, Santoni-Rugiu és mtsai 2005).

Az AAF analóg vegyületek is képesek a periportális sejproliferáció kiváltására.

Dexamethason gátolja az ovális sejtek és a hepatociták osztódását is parciális

hepatectomiát követően. Ha a májregeneráció mindkét mechanizmusát - hepatocita

proliferáció, őssejt aktivizálás - gátolták, a máj tömege a hepatociták hypertrophiája

révén pótlódott. A periportáis zónában ilyenkor a hepatociták jelentős

megnagyobbodása figyelhető meg (Nagy és mtsai 2001). Az AAF-hez hasonló hatást

lehet elérni szén-tetraklorid (CCL4) adagolásával vagy ethionin intoxikációval is

(Alison és mtsai 1996). Az egérben előidézett zsírmáj modellekben, mint például az

ObOb (-/-) egérben vagy a PARP (-/-) egérben is gátolt a hepatociták proliferációja és

az ovális sejtek aktiválása jellemző (Roskams és mtsai 2003).

2.2.2. A humán máj progenitor sejtjei

Az eddigi irodalmi adatok alapján úgy tűnik, hogy a típusos ovális sejtek a patkány

májra jellemzőek. Egérben jóval nehezebben sikerült hasonló sejteket indukálni.

Hasonló a helyzet a humán májban is. Az emberi májszövetben az ovális sejt

proliferációhoz egy hasonló jelenséget, az un „atipusos duktuláris proliferációt” lehetett

megfigyelni elsősorban epeút elzáródással járó különböző májbetegségekben (Roskams

2006). Ezek az ovális sejtektől eltérően azonban nem mutatnak AFP expressziót.

Feltételezhető, hogy az atípusos duktuláris reakciók az emberi májban egy, az

őssejtekből kiinduló regeneratív válasznak felelhetnek meg. Számos morfológiai

15

hasonlóságot véltek felfedezni az ovális sejtek és a humán májban az ún. duktuláris

reakciók között:

• biliáris típusú citokeratinokat expresszálnak

• a periportális zónából a májlebenybe terjeszkednek

• közeli kontaktusban vannak az aktivált csillag sejtekkel

• növekedésüket ugyanaz a növekedési faktor rendszer szabályozza

• képesek hepatocitákká differenciálódni

Néhány közlemény óvakodik a duktuláris fenotípus elnevezéstől, így inkább IMHBC

(„intermediate hepatobilliary cells”) –névvel illeti a közepes méret (6 µm <IMHBC <40

µm), a CK19, CK7 pozitivitás és egyes hepatocita markerek (albumin, α1-antitrypsin,

HepPar1) pozitivitása miatt. Feltétlenül meg kell különböztessük a duktuláris reakciót

az abnormális non-reaktiv epeútszerű képződményektől („ductal plate malformations”),

pl. a fibropolycystikus májbetegségekben (Desmet 2005).

A máj különböző elváltozásaiban figyeltek meg duktuláris reakciót, amelyet az alábbi

csoportokba sorolhatunk:

A) A máj károsodásával lejátszódó duktuláris reakció (pl. masszív májnekrózis, súlyos

zsíros degeneráció, cirrhosis stb);

B) A máj károsodása nélkül lezajló duktuláris reakció (pl. krónikus hepatitisz, alkoholos

májbetegség, fokális noduláris hyperplasia (FNH), hosszan tartó hideg ischémia stb);

C) Májtumorokban (pl. peritumorális duktuláris reakció, köztes fenotípusú tumorokban)

(Thung 1990, Hsia és Evarts1992).

A duktuláris reakció intenzitása korrelál a gyulladásos folyamat intenzitásával és

hozzájárulhat a krónikus heptitisz során lejátszódó fibrogenezishez (Eleazar és mtsai

2004). Jó néhány olyan esetet közöltek már az irodalomban, amikor májnekrózist

követően a máj regenerálódása ezeknek a duktuláris sejteknek a részvételével zajlott

(Fujita és mtsai 2000).

2.2.3. Az őssejtek és a hepatocarcinogenesis kapcsolata

Még a 19. században Virchow figyelte meg, hogy számos tumorra jellemző az

embrionális eredet (Sell 2004). A tumorok az őssejtek malignus transzformációjából is

származhatnak. Az ovális sejtek hepatocarcinogenesisben betöltött szerepének direkt

bizonyítékát Dumble írta le (2002), amikor p53-mutáns egerekből izolált ovális sejteket

16

thymus-sérült egerekbe oltva HCC-t generált. Jelenleg a májban előforduló hosszú életű

heptocitákat, a cholangiocytákat és a bipotenciális őssejteket (amelyek a Hering

canalisok legtávolabbi részéből származnak) tekinti az irodalom a májban lezajló

carcinogenesis legújabb célpontjainak (Roskams 2004). Néhány krónikus

májbetegségben kimutatták, hogy a telomerhossz fokozatos rövidülése miatt (ezt igen

jellemzően figyelték meg cirrhotikus májban) a hepatociták „replikációs képessége

elöregszik”. A krónikus gyulladás, a növekedési faktorok jelenléte, a DNS-károsító

ágensek és a folyamatos replikáció egyaránt szerepet játszhat ebben a kórfolyamatban.

Ez a jelenség indukálja az őssejteket (a duktuláris reakciót) humán májban is. Krónikus

hepatitisz C-ben a duktuláris reakció intenzitása és a fibrosis mértéke között jelentős

összefüggés van (Lowes és mtsai 1999). A máj gyulladásos megbetegedéseiben a

hepatocitáknak egy olyan átmeneti alakját figyelték meg, amelyek átmenetet képeznek

az őssejtek és a hepatociták között. Ezek száma összefüggésben van a gyulladás

mértékével és a nekrózis fokával. Mindezek alapján valószínű, hogy ilyenkor elsősorban

az őssejtek differenciálódnak hepatocitákká, ezért nő meg ezen átmeneti hepatocita

alakok száma. Megfigyelték, hogy cirrhotikus májban és főképpen nem alkoholos

szteatohepatitiszben, a cirrhotikus nodulusokat is ilyen átmeneti hepatocita alakok

képezik. Igazolták, hogy ezek az ún. „hepatocita rügyek”, minden esetben reaktív

duktuszokkal vannak kapcsolatban. Ez is alátámasztja az őssejt eredetüket (Falkowski

2003).

Számos tanulmányban írták le a májtumorok monoklonalitását. A májra jellemző

legfontosabb rosszindulatú daganatoknak, a HCC-nek, a cholangiocelluláris

carcinomának (CC) és a kevert típusuknak (HCC/CC) eredete még máig sem teljesen

tisztázott. A HCC és CC fokális prekurzor léziókból alakul ki, egy többlépcsős folyamat

eredményeként, amelynek az őssejtek aktív résztvevői. Ezt az is bizonyítja, hogy a

HCC-k nagy része expresszálja az őssejtekre jellemző markerek egy részét (CK7,

CK19, OV6). A tumorsejtek ezekben a daganatokban fenotípusosan átmeneti hepatocita

alakokból és éretlen hepatocitákból állnak.

A tumorokban az őssejtek jelenlétét elsősorban két elmélettel hozzák összefüggésbe

(Roskams és mtsai 2006):

1. Az egyik szerint a tumorsejtek őssejt eredetűek („maturation arrest theory”)

17

2. A második szerint a tumor sejtek dedifferenciálódnak és progenitor sejt

tulajdonságokat vesznek fel a carcinogenesis során

Ez utóbbival magyarázható az, hogy a kis sejtes diszplasztikus fókuszok (< 1nm) 55%-a

progenitor sejtekből és átmeneti hepatocita alakokból áll. Míg a nagy sejtes

diszplasztikus fókuszokat érett pusztuló hepatociták alkotják.

CC-ben is sikerült azonosítani egyes őssejt markereket. A hepatoblastomában (HB), egy

igen gyakori gyerekkori tumorban is kimutatták az ovális sejteket. Ezt a daganatot őssejt

eredetűnek tartják (Fiegel és mtsai 2004).

Összességében tehát minden olyan krónikus májbetegségben, amely kockázati tényezőt

jelent a HCC vagy CC kialakulásához, az őssejtek (progenitor sejtek) proliferálnak, a

hepatociták pedig szeneszcensé válnak (Roskams 2004).

Az őssejt eredetet és a hepatocarcinogenesis összefüggését tumorokban a 2. ábra

szemlélteti.

2. ábra. Az őssejtből kiinduló lehetséges májdaganatok. Az őssejtek mind

hepatocitákká mind cholangiocytákká képesek differenciálódni (Roskams 2006).

18

2.3. Az extracelluláris mátrix (ECM)

2.3.1. Az ECM szerkezete és jelentősége

A szövetek felépítésében nemcsak sejtek, hanem az ezeken kívül található, az

extracelluláris teret kitöltő makromolekulákból (fehérjékből és szénhidrátokból) álló

hálózat – az ECM is részt vesz. A mátrixot felépítő molekulák sokfélék lehetnek, a

szövet által betöltött feladatnak megfelelően. Kémiai természetük alapján a következő

nagy kategóriákba sorolhatók a mátrix molekulái (Aumailley és Gayraud 1998,

Kovalszky 2004):

1. Nagy poliszacharid-láncokból felépülő glükózaminoglikánok (GAG) és

proteoglikánok (decorin, perlecan, versican, syndecan, agrin stb)

2. Fibrilláris strukturális fehérjék (kollagének, elasztin, fibrillin-1,-2, entactin stb)

3. Nem- kollagén szerkezetű fehérjék (laminin, fibronectin, vitronectin, tenascin,

entactin stb.).

3. ábra. Az ECM szerkezete. www. fasebj.org/cgi/content/full

proteoglikánok

Cukorláncok

kollagének

integrinek

fibronektin

19

Jelenleg a mátrixban előforduló kollagéneknek 26 típusát ismerjük (Gelse és mtsai

2003). Ezek főbb csoportjai a következők: fibrilláris kollagének (I-III, V, XI),

hálózatképző kollagének (IV, VIII, X), fibril- asszociált kollagének (IX, XII, XIV, XIX),

transzmembrán kollagén (XIII és XVII), stb.

A nem – kollagén szerkezetű ECM molekulák csoportjába szerkezetileg hosszú,

flexibilis, több kollagén típust kötő doménnel rendelkező molekulák sorolandók,

melyek más mátrix proteineket, poliszacharidokat, sejt-felszíni fehérjéket, növekedési

faktorokat és hormonokat képesek kötni. Kulcsfontosságú szerepük van a matix-matrix

és sejt-mátrix kapcsolatok kialakításában és fenntartásában. Ezek a multiadhézios

fehérjék a sejt-mátrix kapcsolatot az RGD domén részvételével valósítják meg. A

mátrixot felépítő molekuláknak ebbe a csoportjába tartozik a dolgozatom fő témája, a

nemrégiben leírt matrilin fehérje molekulák családja is, melyek képesek kötni a

kollagéneket és más ECM komponenseket (Deák és mtsai 1999) (erről majd a további

fejezetekben írok).

2.3.2. Az ECM szerepe a tumorprogresszióban

A daganatkutatás a mátrix (stroma) jelentőségét sokáig nem ismerte fel. A daganatokat

főleg genetikai szempontból vizsgálták és a fenotípus változással magyarázták a

tumorképződést. Mára már elfogadott tény, hogy a daganat kötőszövetes alapállománya

nagymértékben hozzájárul a daganatok kialakulásához. Ennek megfelelően az utóbbi

években az ECM a tumorbiológia egyik legintenzívebben kutatott területévé vált (Füle

és mtsai 2006, Li és mtsai 2007).

Az alapállományba hatolva a daganatsejtek úgy alakítják a mezenchimális sejtek

működését, hogy azok olyan mátrixot állítsanak elő, mely összességében elősegíti a

daganatsejtek további invázióját. A daganat növekedéséhez szükség van oxigénre és

tápanyagellátásra egyaránt, amelyet a daganat az érújdonképződés (neoangiogenesis)

segítségével old meg. A tumorok neoangiogenesisének szabályozásában szerepet játszó

számos tényező között (növekedési faktorok, sejtadhéziós molekulák és egyéb

mediátorok) meghatározó szerepet kapnak az ECM-molekulák is.

20

A tumorszövet kötőszöveti állományában jelen levő ECM mind mennyiségi mind

minőségi szempontból jelentősen eltér a normál szövetekben találtaktól.

Mennyiségi változások: A daganatos stromában több kollagén, proteoglikán és

glükózaminoglikán van jelen, mint az egészséges szövetben (Kalluri 2003). A heparán-

szulfát magasabb szintű felszaporodását például melanómában, májrákokban,

veserákokban figyelték meg. A laminin egyes alegységeinek nagymértékű

felszaporodását áttétképző melanómákban és fibrosarcomákban igazolták (Gianelli és

Antoniaci 2000, Canen és Yamada 2001, Chiquet- Ehrismann 2004).

Minőségi változások:

A daganatok ECM fehérjéi nemcsak mennyiségükben, hanem esetleg szerkezetükben is

eltérhetnek az egészséges sejtközötti állománytól. A nagy mennyiségben lerakódott

proteoglikánok általában módosultak. A fibronektin, tenascin, CD44 és versican

különböző formáit mutatták ki daganatokban (Kovalszky és mtsai 2004).

2.3.3. ECM a normál májban

Az ECM az egészséges májban részben a máj rostos vázát képezi, részben a Disse-

térben található. A normál májban relatív mennyisége alacsony, kevesebb mint 3% -ot

tesz ki. Strukturális szerepe mellett aktív szerepe van a májat alkotó sejtek

működésének szabályozásában és nélkülözhetetlen a hepatociták differenciált

funkciójának az ellátásához. A rostos mátrixot képező molekulák közt elsősorban a

kollagéneket (I, III, V, VI), a decorint és a fibronektint említhetjük meg. Eddigi

ismereteink szerint a bazális membrán (BM) felépítésében elsősorban a laminin, a IV

kollagén és a heparánszulfát PG-ok (BMHSPG) játszanak szerepet.

A rostos mátrix a periportális területen és centrális véna körül fordul elő, de elemei

finomabb módszerekkel elszórtan a Disse-térben is kimutathatók. Normál májban a BM

főleg periportálisan és a centrális vénák körül látható, de bizonyították, hogy az összes

BM-t alkotó fehérje megtalálható a Disse-térben is, bár nem szerveződnek klasszikus

értelemben vett BM-ná (Kovalszky 1993). A BM megjelenését a szinuszoidok mentén

fibrosisban és cirrhosisban detektálták (Kovalszky és mtsai 2006).

21

Összefoglalva, tehát a májban, klasszikus értelemben vett magas denzitású BM van az

erek körül, míg periszinuszoidálisan alacsony denzitású BM található.

2.3.4. A máj sejtjei, szerepük az ECM proteinek szintézisében

A hepatociták a magasan differenciált, máj specifikus működésében játszanak szerepet,

a mátrix fehérjék közül azonban feltehetően csak a szöveti fibronektin termelésére

képesek. A szinuszoidokat bélelő endothel sejtekben trombospondin, fibronectin,

kollagén IV, entactin, HSPG és decorin expresszióját mutatták ki, ami azt bizonyítja,

hogy az ECM fehérjéinek nagy része innen származik (Schaffener és Popper 1963,

Maher és McGuire 1990). A periszinuszoidális térben a hepatociták és endothel sejtek

között található Ito sejtek (“fat storing” sejtek vagy lipociták, vagy HSC-hepatic stellate

cells, csillag sejtek) figyelhetők meg, amelyek több irodalmi adat alapján a matrix

fehérjék legfontosabb termelői. A “pit” sejtek máj asszociált lymphocyták, a

szinuszoidok lumenébe vannak lehorgonyozva, szoros kapcsolatban az endothel és

Kupffer-sejtekkel. Pontos szerepük még nem ismert, főleg a fibrogenezist stimuláló

faktorok termelésében lehet szerepük (Friedman 2004a, b).

Az ECM-t termelő sejtek körül még mindig vita folyik. Még máig is az egyik leginkább

elfogadott elképzelés, mely szerint a Disse-térben található periszinuszoidális

csillagsejtek aktiválódnak, fenotípust váltanak, myofibroblasttá alakulnak át. Egy másik

feltevés, hogy legalább három különböző eredetű sejtpopuláció ölti fel a myofibroblast

fenotípust és termel kötőszövetet. Az irodalmi adatok elsősorban a periszinuszoidalis

csillagsejtekkel foglalkoznak, sokkal kevesebb adat áll rendelkezésre a portális

fibroblastokról. A legutóbbi álláspont (2005 decembere) szerint a periszinuszoidális

csillagsejtek, a portális és centrális véna körüli fibroblastok mellett még csontvelői

őssejt eredetű myofibroblastok is találhatók a májban (Kovalszky és mtsai 2006).

2.3.5. Az ECM változásai fibrosisban és cirrhosisban.

A fibrotikus máj ECM komponensei nagymértékben megegyeznek a normál máj ECM

komponenseivel, azonban mennyiségi szempontból jelentősen megváltozik az ECM a

fibrotikus és cirrhotikus májban. A fibrosisban a lefontosabb esemény a mátrix jelentős

átépülése során bekövetkező változás, de ez a folyamat szoros összefüggésben áll olyan

22

történésekkel, mint a például a májsejt regeneráció, az érátrendeződés („vascular

redistribution”). Mindezek igen jelentősen befolyásolják a máj funkcióját. Noha a

krónikus májbetegségekben a kötőszövet elsősorban a portális területeken szaporodik

fel, a máj funkciója szempontjából nem ez, hanem a periszinuszoidális régió

megváltozása a kritikus. A fibrosis, cirrhosis során a szinuszoidok kapillarizációja a

legfontosabb kísérőjelenség. Ilyenkor az endothel sejtek elvesztik fenesztráltságukat, a

szinuszoidok helyett kapillárisok alakulnak ki. Az endothel és a hepatociták között az

alacsony denzitású BM helyét, magas denzitású BM foglalja el. Ennek eredményeként a

szabad, kétirányú molekulaáramlás, amely a plazmatér és a hepatociták közt fennáll

egészséges májban, akadályozva van. A májsejtek méregtelenítési és intermedier

anyagcserében betöltött szerepüket képtelenek ellátni (Martinez-Hernández és mtsai

1991).

A kötőszövet mennyiségét a májban a termelés és lebontás egyensúlya szabja meg, így

aktuális mennyisége a képződés és lebontás eredője. A kötőszövetet a kollagenázok

bontják le, melyek termeléséért szintén a már említett myofibroblastok tehetők

felelőssé. A kollagenázokat gátló TIMP (metalloproteáz-gátló) és α2 macroglobulin

fokozott termelése is az ECM felszaporodását idézi elő. A 4. ábra a fibrosisban és

cirrhosisban az ECM átalakulásához és a mátrix molekulák felfalmozódásához vezető

fibrogenezis kaszkádot mutatja be.

23

hepatocita károsodás

TIMP α2 macroglobulin

nonparenchymális májsejtek aktiválása

endothel, Kupffer

Kötőszövet produkciót fokozó citokinek termelése

TGFβ, TGFα, IL1, EGF, bFGF, TNFα

Májkárosítás

hepatocita pusztulás

myofibroblastMononuclearis

sejtek aktiválódása

csillag sejt , portális fibroblast, csontvelői őssejt

aktiválása

ECM termelése (kollagén, laminin,

fibronektin, proteoglikán)

Kötőszövet + -

kollagenázok

4. ábra. A májfibrosis kialakulásának eseményei (Kovalszky és mtsai 2006 alapján).

24

2.3.6. Az ECM jellemzői a májregeneráció során

Egészen mostanáig nagyon keveset tudunk az ECM átalakulásáról a máj regenerálódás

során. Még ma sem tisztázott teljesen, hogy milyen mechanizmusok döntik el az akut

vagy krónikus máj sérülés kimenetelét: az előbbi májregenerálódást, az utóbbi cirrhosist

indukál.

Egy lényeges eltérés azonban biztos: a májregenerálódás során a szinuszoidok

újraképződése, míg cirrhosisban a kapillarizáció a jellemző, amely magas denzitású BM

képződéssel jár.

A máj kitűnően alkalmazható az ECM tanulmányozására, mivel nemcsakhogy

„sebgyógyulással” reagál, mint más szervek, hanem regenerálódik is. E folyamat során

nemcsak sejtproliferáció játszódik le, de az ECM-nek egy jelentős felhalmozása és

átalakulása is végbemegy. A legfontosabb ECM komponenseket: fibronektin, laminin

kollagén (I, III, IV) több tanulmányban is vizsgálták (Martinez-Hernandez és mtsai

1991, Martinez-Hernandez és Amenta 1993). Számos eltérést figyeltek meg a

májregenerációban, a cirrhosisban és a fibrosisban bekövetkező ECM átépülésében.

Kim és mtsai (1997) a fibronektin emelkedett, majd csökkent expresszióját írta le a

Disse-térben a májregeneráció első napjaiban, amit azzal magyaráztak, hogy a

fibronektin eltávolítása az ECM-ből a hepatociták osztódásának előfeltétele. Ezzel

szemben krónikus májsérülést követően fellépő cirrhosis során a fibronektin igen korai

depozíciója figyelhető meg a Disse-térben. Feltehetőleg ez a fehérje, mint az ECM

szerveződését segítő mátrix komponens funkcionál. Ugyancsak eltérést figyeltek meg a

laminin és entaktin szekréciójában is. A cirrhosisban megjelenő entaktin és laminin a

szinuszoidok kapillarizációja során képződő BM kialakításában tölthet be fontos

szerepet (Martinez – Hernandez és Amenta 1995).

A regenerálódó máj kollagén tartalmában is hasonló csökkenést észleltek a

cirrhotikushoz képest. Összességében véve a májregenerációban tehát az ECM/sejt

tömeg csökkenés figyelhető meg. Mire a regenerálódás során a hepatociták

vaszkularizációja megtörténik, és kialakulnak a szinuszoidok ez az arány

normalizálódik.

Közvetlenül PH-t követően a laminin, entactin és fibronektin szintje is csökken a

májban, majd később emelkedik a regeneráció során. Fokozott laminin expressziót

25

figyeltek meg a regenerálódó máj szinuszoidjaiban (Kim és mtsai 1997, Paku és mtsai

2001, 2004). A lamininnek a BM-ban betöltött szerepén túl igen jelentős szerepet

tulajdonítanak a növekedés stimulálásában, a sejt migráció modulálásában, a

sejtdifferenciációban és a morfogenezis eseményeiben, mely egy integrineket aktiváló

szignalizációs kaszkádon keresztül stimulálja a májsejt proliferációt.

Más nem- kollagén ECM mátrix komponensek szerepe, így például a tenascinok és

egyéb BM komponensek (kollagének) konkrét funkciója és változásai a

májregenerációban és a cirrhosisban nem egészen világos. Ez a kérdéskör a további

kutatások tárgyát képezi. Egyértelmű azonban, hogy a fentebb említett molekulákkal

kölcsönhatásban levő fehérjék szerepe is felmerül a májregenerációban és a máj

elváltozásaiban (ezek közt említendők a matrilinek is).

26

2.4. A matrilin fehérjecsalád

2.4.1. A matrilinek szerkezete

A család prototípusa a matrilin-1, mely korábban porc mátrix proteinként volt ismert

(CMP, cartilage matrix protein) (Kiss és mtsai, 1989). A porc mátrix fehérje a matrilin

család elsőként felfedezett tagja, kizárólag a porc érése során expreszálódik. Ezt a

fehérjét a porc különböző formáiban proteoglikánokkal asszociálva írták le. (Paulsson

és Heinegard 1979, 1981, 1982). A matrilin-2, matrilin-3 (Belluoccio és Trueb 1997,

Deák és mtsai 1997, Wagener és mtsai 1997, Belluoccio és mtsai 1998) és a matrilin-4

(Wagener és mtsai 1998a) felfedezésével derült fény egy közös szerkezeti szekvencia

felderítésére.

A matrilin fehérjecsalád a nem-kollagén ECM fehérjéknek abba az alcsaládjába

sorolandó, amelybe a von Willebrand A factor (vWFA) domént tartalmazó fehérjék

tartoznak (Whittaker és mtsai 2002). A vWFA domén számos extracelluláris és

intracelluláris fehérje molekulában szerepel és gyakran résztvevője azoknak a fehérje-

fehérje kölcsönhatásoknak, amelyek a multimer fehérjék kialakításában játszanak

szerepet. A vWFA domén 200 aminosav (AS) maradékból épül fel, amelyek a

klasszikus Rossman fold szerkezetet hordozzák, középen a β-lemezzel és körülötte az α-

helikális struktúrákkal. Minden matrilin vWFA doménjére jellemző a konzervatív

szerkezetű MIDAS (metal ion dependent adhesion site, fémionfüggő adhéziós hely)

motívum, amelynek kitüntetett ligandumkötő szerepe van. A matrilin fehérjék vWFA

doménje szerkezetileg egy egyedülálló csoportot alkot az ugyanezt a domént tartalmazó

ECM molekulák között: érdekes megfigyelés, hogy minden matrilin családtag sokkal

nagyobb szerkezeti hasonlóságot mutat egymással, mint minden más vWFA modult

tartalmazó molekulával. Ez egyértelműen egy közös filogenetikai ősre utal (Deák és

mtsai 1999). A filogenetikai vizsgálatok alapján a matrilinekre jellemző két vWFA

domént két különböző csoportba sorolták be, amely szerint a matrilin-1/-3 és a matrilin-

2/-4 két külön alcsoportot képez a családon belül (Deák és mtsai 1999). A matrilinekben

található vWFA domének az N-terminushoz közel eső vWFA1 domén és a C-

terminushoz közel eső vWFA2 domén. A matrilin-3-ban a vWFA2 domén és az egér

egyik splice-variáns matrilin-4-ben a vWFA1 domén kiesett.

27

A matrilin-1-et a csirke, egér és emberi cDNS-ből írták le. Szerkezetileg két vWFA

domént tartalmaz, amelyet egy darab EGF-szerű domén köt össze. A matrilin-1 és

matrilin-3 splice-variánsaiból, hiányzik az EGF-szerű domén. Az összes többi

családtagban legalább egy ilyen domén van, legtöbb belőle a matrilin-4 splice-

variánsában található, amely 12 EGF-t tartalmaz (Ko és mtsai 2005). Ez az EGF-szerű

domén nem mutat szerkezeti hasonlóságot a Ca2+- kötő EGF-szerű motívumokkal: nem

Ca2+- kötők és növekedési faktor aktivitásuk sem bizonyított. Nagyobb valószínűséggel

egy elosztóként (ún. „spacerként”) szerepelnek a vWFA domének között. Szerkezetileg

leginkább a fibulin, a fibrillin EGF doménjeivel mutatnak rokonságot.

Végül a molekulák karboxi végén egy úgynevezett coiled-coil (cc) struktúra

helyezkedik el, amely α-hélixet formál. Ez teszi alkalmassá az egyedülálló alegységeket

a virágcsokorszerű oligomerizációra (Argaves és mtsai 1987, Kiss és mtsai 1989,

Hauser és Paulsson 1994). Az összes többi matrilin családtag ugyanezeket a doméneket

tartalmazza és ugyanolyan sorrendben, mint a matrilin-1. Kivétel jellemzi a matrilin-3-t,

amelyik szerkezetét jellemzi, hogy csak egyetlen vWFA doménje van és az EGF-

domének közvetlenül a C-teminálison levő coiled-coil szakaszhoz kapcsolódnak.

Továbbá, a matrilin-2 és a matriln-3 a fent említett doméneken kívül az N-terminálison

pozitív töltésű oldalláncokkal bíró AS maradékokat hordoz. Egyedül a matrilin-2-t

jellemzi egy úgynevezett egyedi (U, unique) szekvencia, a második vWFA domén és az

oligomerizációs domén között, amely egyedi, eddig még egyetlen más fehérjében sem

írtak le hozzá hasonlót.

A humán matrilin-2 prekurzort 4.0 kb mRNS kódolja, 956 aminosavból áll és 93%-os

egyezést mutat az egér fehérjével. 2 vWFA domént, 10 EGF-domént, egy egyedi

szekvenciát és egy oligomerizációs domént tartalmaz. Az első vWFA domén a

legkonzerváltabb. A matrilin-2 a 8q22 kromoszómára lokalizálódik. Az 5. ábrán a

matrilin család domén szerkezetét láthatjuk.

28

5. ábra. A matrilinek domén szerkezete (Wagener és mtsai 2005).

2.4.2. A család tagjainak jellemzése és filogenetikai eredete

A matrilin-1 (CMP), a vWFA-szerű domént tartalmazó család egyik legegyszerűbb

tagja, egy homotrimér glikoprotein, 52 000 Da alegységeket hordoz. 3, 9% szénhidrátot,

főképpen N-kapcsolt oligoszacharidokat tartalmaz (Paulsson és Heinegard 1981). A

porc különböző formáiban, nagy mennyiségben előforduló fehérje. A szem

alkotóelemeiben is kimutatták (Stirpe és mtsai 1989), ennek alapján egy nagyon

specifikus funkciója feltételezett. Elektronmikroszkópos felvételen egy tipikus

virágcsokorszerű szerkezetet mutat, ahol az egyedülálló vWFA domének nem nyitottak,

hanem egymással kölcsönhatásban van a már említett vWFA1 és a vWFA2. A domének

29

3 egymással párhuzamos láncú, diszulfid-híddal kapcsolt, α-helikális coiled-coilokba

rendeződnek.

A matrilin-2 a legnagyobb molekulasúlyú családtag, 104 300 Da méretű az egérben, N-

terminális oligoszacharidokat tartalmaz (Piecha és mtsai 1999). Elektronmikroszkópos

vizsgálatok igazolták, hogy a matrilin-1-hez hasonlóan itt is a két vWFA domén

egymáshoz kötődik. Jellemző, hogy szöveti kivonatból nyert fehérjekivonatban minden

esetben egy igen heterogén összetételű fehérje mutatható ki, valószínűleg a proteolitikus

hasítás következményeként. A humán matrilin-2 313 AS ORF régiója 87% -os egyezést

mutatott az egér matrilin-2-vel. A 87%-os egyezés az AS szekvenciában az egér és a

humán matrilin-2 között azt mutatja, hogy valószínűleg a matrilin-2 funkcionálisan egy

nagy jelentőséggel bíró ECM komponens lehet az emlős szövetekben és szervekben.

(Deák és mtsai 1997). Néhány tény igazolja, hogy a matrilin-2 valóban a CMP közeli

rokona: 1) a vWFA-szerű domének hasonlósága; 2) a vWFA-és EGF-szerű domének

azonos sorrendisége. A közös domén szerkezetből feltételezhető hogy valószínűleg a

matrilin-1 és a matrilin-2 ugyanannak a közös génnek a duplikációjából származik,

amely egy duplikált vWFA-t, egy egyedülálló EGF-et, és egy oligomerizációs domént

tartalmazott.

A matrilin-3 a legkisebb családtag, többnyire a matrilin-1-el koexpresszálódik (Wagener

és mtsai 1997, Klatt és mtsai 2000). MALDI-TOF tömegspektrometriával az egér

matrilin-3 tömegét 49300 Da-nak találták. A második vWFA domén hiánya miatt az

alegységek nincsenek kölcsönhatásban önmagukkal ezért az elektronmikroszkópban ezt

a fehérjét több kifeszített, flexibilis karral látjuk.

A matrilin-4 egérben a két vWFA modul között 4 EGF- szerű domént tartalmaz.

(Wagener és mtsai 1998a,b, Klatt és mtsai 2001). A rekombináns fehérje tömege 72900

Da, ami 7%-os poszttranszlációs modifikációra utal. Noha a matrilin-4 két vWFA

domént tartalmaz, elektronmikroszkópban nem mutatható ki nyilvánvaló kölcsönhatás a

domének között (Klatt és mtsai 2001).

Összességében véve tehát a matrilinek egy közös ősből származnak, amelyben a vWFA

domének már megduplázódtak, mert az összes vWFA1 domén közelebb áll egy másik

molekula vWFA1 doménjéhez, mint a vWFA2-es modulhoz. A feltételezhető hipotézis

az, hogy a primordiális matrilin gén duplikálódik és ebből ered a matrilin-1 és matrilin-

3 valamint a matrilin-2 és matrilin-4 közös őse. Továbbá, a második génduplikációt

30

követően, a matrilin-3-ban a matrilin-1 vWFA2 doménjével megegyező vWFA domén

kiesett (Deák és mtsai 1999).

2.4.3. A matrilinek oligomerizációja és kölcsönhatása más ECM komponensekkel

Ahogy azt már említettem, a matrilin család C-terminális régióján lévő α-helikális

coiled-coil domén teszi lehetővé a molekula alegységek virágcsokorszerű

oligomerizációját. A teljes hosszúságú molekulák elektronmikroszkópos vizsgálata

kimutatta, hogy a matrilin -1 és matrilin-4 homotrimereket (Hauser és Paulsson 1994,

Klatt és mtsai 2001), míg a matrilin-2 és-3 homotetramereket képez (Pan és Beck 1998,

Piecha és mtsai 1999, Klatt és mtsai 2000). Az oligomerizációt E. coli-ban termeltetett

rekombináns coild-coil doménekkel is tanulmányozták (Frank és mtsai 2002). A

biokémiai és biofizikai vizsgálatok nemcsak igazolták a teljes hosszúságú molekulák

által képzett eddig ismert homo- és heteromer oligomereket, de újabb további hét

rekombináns matrilin lánckombinációra derítettek fényt. Termodinamikai mérésekkel

alátámasztották a heterooligomerek nagyobb hőstabilitását. A különböző matrilin

láncok kombinációja igen változatos képet mutat (6. ábra) és expressziós szint által

szabályozott. A teljes hosszúságú matrilin-2 láncokkal szemben a rekombináns coiled-

coil ccMat2 domének csak trimereket képeznek. A coiled-coil domének ugyanazon a

helyen oligomerizálódnak, mint a teljes hosszúságú fehérjék azzal az előnnyel, hogy

rájuk nem jellemző a szupramolekuláris szerveződés. A coiled-coilok funkcionális

szerepe abban rejlik, hogy a multimerek képződéséhez vezető alegységek

oligomerizációjában vesznek részt. Az oligomerizáció eredményeként többértékűség jön

létre, és a funkcionális helyek helyileg koncentrálódnak (Deák és mtsai 1999). Továbbá

a heteromerek növelik a matrilinek funkcionális diverzitását. A homo-és

heterooligomerek képződése a vWFA domén ligandkötő aktivitására és affinitására is

hatással van. (Ugyanez a jelenség jobban érthető a trombospondin vagy a laminin

hasonló példáján, amelyekre jellemző, hogy heparinkötő affinitása a homo-és

heterotrimerek képzésével fokozódik).

A vWFA doméneken keresztül a matrilinek kölcsönhatnak önmagukkal és egymással,

ami szupramolekuláris szerkezetek képződéséhez vezet, amelyek az ECM struktúrák

stabilizálásában vesznek részt.

31

A teljes fehérjék elektronmikroszkópos felvételén kimutatható, hogy a matrilin-1és a

matrilin-4 homotrimereket (Hauser és Paulsson 1994, Klatt és mtsai 2001), míg a

matrilin-2 és -3 homotetramereket képez (Piecha és mtsai 1999, Klatt és mtsai 2000).

Matrilin-1 és matrilin-3 heterooligomereket izoláltak újszülött humán – és borjú porcból

(Wu és Eyre 1998, Klatt és mtsai 2000). Matrilin-1 és matrilin-2, matrilin-1 és matrilin-

3, matrilin-1 és matrilin-4 valamint matrilin-2 és matrilin-4 heterooligomereket

mutattak ki. Matrilin-2 és matrilin-3, matrilin-3 és matrilin-4 heterooligomerek nem

voltak kimutathatók (Frank és mtsai 2002).

Egyéb molekulákkal történő kölcsönhatását illetően a matrilin-1-t elsőként az

aggrekánhoz kötve együtt tisztították (Paulsson és Heinegard 1979, Hauser és mtsai

1996). Még nem ismert, hogy ebben a molekula komplexben egyedülállóan az aggrekán

és a matrilin-1 vesz részt vagy egyéb matrilinek is képesek proteoglikánokhoz kötődni.

Elképzelhető, hogy azok a család más tagjaihoz kötődnek. A matrilin-1 a II típusú

kollagén fibrillumokhoz egy meghatározott periodikussággal kötődik (Winterbottim és

mtsai 1992) és részt vesz a kollagén-független filamentózus hálózat kialakításában is.

Az aggrekánhoz való kötődése kovalens kereszt-kötéseket vesz igénybe, ami a kor

előrehaladásával fokozódik. Azt pontosan nem tudjuk, hogy a CMP-nek melyik

doménje vehet részt ebben a kölcsönhatásban, de nagy valószínűséggel a vWFA-szerű

domén az, amelyik szerepet kap ebben. Mindkét vWFA-szerű doménnek jelentős

szerepe van a hálózatképzésben. Ha kiesik a vWFA2 domén, nem képződik multimer

matrilin-1 fehérje, ha hiányzik valamelyik vWFA domén, akkor nem képződik

kollagén-független hálózat sem (Chen és mtsi 1999). Porcsejt-tenyészetekkel végzett

kísérletek igazolták a matrilin-1 jelenlétét pericelluláris kollagén-függő és kollagéntól–

független filamentumokban egyaránt (Chen és mtsai 1995). A matrilin-1, matrilin-3 és a

matrilin-4 köti a kollagénV összetételű mikrofibrillumokat az aggrekán core proteinhez

és a kollagén II típusú fibrillumokhoz a biglikánon vagy a dekorin alkotta

csoportosuláson keresztül (Wiberg és mtsai 2003). Matrilin-1 defficiens egerekben nem

volt kimutatható elváltozás a kollagén II, IX, X, XI, aggrekán és COMP

expressziójában. Ennek alapján feltételezhető, hogy a matrilin-1 expressziójának

változása nem befolyásolja szignifikánsan ezeknek a molekuláknak a biokémiáját.

Valószínűleg itt is a többi matrilin fehérje redundáns funkciója érvényesül, mivel a

fejlődő csontban minden matrilin fehérje expresszálódik.

32

Immunfluoreszcenciás kísérletekkel igazolták, hogy a matrilin-2 sejtkultúra

tenyészetben képes saját molekulákkal alkotott, sejten kívüli hálózat létrehozására.

Emellett más, kollagén és nem kollagén természetű extracelluláris molekulákhoz is tud

kötődni, tehát részt vesz több fehérjéből felépülő, heteromolekuláris fehérjehálózatok

létrehozásában is.

A matrilin-2 a legnagyobb mennyiségben előforduló szöveti kollagénhez, a kollagén I-

hez kötődik. Ebben a kapcsolatban a tropokollagén molekula két terminálisát részesíti

előnyben. Plasma rezonanciás módszerrel igazolták a matrilin-2 kölcsönhatását a

kollagén II, III, IV és V molekulákkal is (Piecha és mtsai 2002 a). A matrilin-2-t

gyakran BM-hoz és mikrofibrillumokhoz asszociáltan írták le. Így számos más

molekulát is kimutattak matrilin-2-vel köcsönhatásban: a fibronectin, a laminin-1 és a

nidogén kötődését igazolták csonkolt matrilin-2-höz (Piecha és mtsai 2002 b).

ELISA-n alapuló ligand esszével mutatták ki a matrilin-4 molekula kötődését a

kollagén I, II, XI, XII, XIV, XXII molekulákhoz. Az említett molekulákhoz képest

néhány nem-kollagén molekula nagyobb affinitással köti a matrilineket, különösen a

COMP-ra (cartilage oligomeric matrix protein) jellemző ez a jelenség (Mann és mtsai

2004). Abból eredendően, hogy a COMP és a decorin is kölcsönhat a kollagénnel, a

matrilinek a kollagén rostokhoz elképzelhetően egy szendvics részeként kötődnek, ahol

a többi résztvevő komponens közvetlenül és erős affinitással kötődik a kollagénhez.

6. ábra. A matrilinek oligomerizációja. Lehetséges homo-és heteromerek. Piros-

matrilin-1, fekete-matrilin-2, zöld-matrilin-3, kék-matrilin-4 (Frank és mtsai

2002).

33

2.4.4. A matrilinek expressziója különböző szövetekben és szervekben

A szöveti eloszlásuknak megfelelően a matrilineket két csoportra oszthatjuk. A matrilin-

1 és -3 a váz elemek jelentős alkotóeleme, de felnőtt egérben kimutatták a matrilin-1

gén expresszióját extraszkeletálisan is (Aszódi és mtsai 1996, Klatt és mtsai 2002). A

vázképződés során a matrilin-1 fehérje és mRNS akkumulálódik a humán, egér és csirke

porc növekedési zónájában (Aszódi és mtsai 1994). A matrilin-1 expressziója térben és

időben egyaránt szigorúan szabályozott. Matrilin-1 ellenes antitesttel a fehérje

detektálható az embrionális myocardiumban az embriogenesis 9, 5 napján. Ez egy

tranziens expresszió és valójában nincs élettani jelentősége. A leghosszabb ideig tartó

matrilin-1 és matrilin-3 expressziót az emrionális kötőszövetben mérték, a fejlődés 12, 5

napján. A vázfejlődés előrehaladásával a matrilin-1és a matrilin -3 expresszálódó

doménjei megegyeznek a kollagén II doménjeivel. A fejlődés későbbi szakaszában a

porc felszíni rétegeiben ezeknek a matrilineknek az expressziója már nem olyan

kifejezett, mint a porc mélyebb rétegeiben (Segat és mtsai 2000). A kalcifikáció után a

matrilin -1 és a matrilin-3 a csontba épül. Immunhisztokémiával a matrilin-1-t

kimutatták a korneában, a szklerában, a placentában, a lencse tokban és a lencse

epithéliumában (Tsonis és Goetnick 1988, Kabosava és mtsai 2007). In situ

hibridizációval kimutatták a humán embrió retinájában (Mundlos és Zabel 1994).

Tranziens matrilin -1 expresziót mutattak ki embrionális egér szívben (Segat és mtsai

2000). A matrilin-3 megtalálható a porc minden típusában és a csontban egyaránt

(Wagener és mtsai 1997, Klatt és mtsai 2000), szélesebb spektrumú szöveti expressziót

mutatva a matrilin-1-hez képest. A matrilin-3 szöveti expressziója azonban születés után

leáll. Nagy valószínűséggel ez a két családtag, a matrilin-1, -3- az élet korai

szakaszában expresszálódik jelentős mértében, de a fehérjék lassú turnovere miatt

szöveti szinten az élet későbbi szakaszában is detektálhatók. A porcsejtek mátrixában a

matrilin-3-t egy filamentózus, sejteket összekötő, kollagén-függő hálózatban és egy

kollagén-független pericelluláris hálózatban is kimutatták.

A matrilin-2- a matrilin- 4 képezi a másik alcsoportot. Ezek sokkal elterjedtebbek a

szövetekben. Northern blot vizsgálatokkal, a porcot kivéve, magas expressziójukat

detektálták az uterusban, a szívben, a koponyatetőben és az agyban, alacsonyabb

34

expresszió volt detektálható a vesében, a vázizomban és a bőrben. A matrilin-1-hez

hasonlóan a matrilin-2 is elsőként az egér embrió szívében detektálható, de a matrilin-2

a matrilin-1-hez képest később jelenik meg, a fejlődés 10, 5 napján és szintézise nem áll

le, hanem folyamatos. A fejlődés későbbi szakaszaiban számos kötőszöveti sejt,

simaizomsejtek és egyes hámsejtek expresszálják (Piecha és mtsai 1999). Ezek a sejtek

a matrilin-2-t az őket körülvevő pericelluláris mátrixba halmozzák fel. Jóllehet sok

esetekben BM-al asszociált, még ezidáig sem tisztázott integráns BM fehérje volta.

Más esetekben a matrilin-2 egy filamentumokból felépülő hálózat komponense. Jelen

van a porcban is. Minden eddig vizsgált szervben a matrilin-2 fehérje exszpresszió a

mért mRNS expresszióhoz képest alacsonyabb szinten volt. Az egér matrilin-2 gén

expressziót detektálták laza és tömött kötőszövetekben, izomsejtekben és néhány

epitheliális sejttípusban (Deák és mtsai 1997, Piecha és mtsai 1999), szubepitheliális

kötőszövetekben, bőrben és emésztő traktusban, vérerek falában. Matrilin-2 mRNS-t

detektáltak a szív kötőszöveti elemeiben, simaizomsejtekben, méhizomzatben és az

agyban (Deák és mtsai 1997, Sharma és mtsai 2006).

Az összes matrilin közül a matrilin-4 a legáltalánossaban előforduló, és mindenhol

kimutatható, ahol a többi matrilin megjelenik (Klatt és mtsai 2001). A matrilin-2-höz

hasonló a matrilin-4 szöveti expressziója: tömött- és laza- rostos kötőszövetben,

csontban, porcban, idegrendszerben és számos más szervben fordul elő (Wagener és

mtsai 1998a; 1998b). Részleges átfedést mutat a matrilin-2-vel. Az idegrendszeri

kifejeződése sokkal kifejezettebb, mint más matrilineké, így például az agy a

leggazdagabb matrilin-4-ben (Klatt és mtsai 2001).

A szöveti kivonatokban a matrilin-2 és matrilin-4 általában degradált, fragmentálódott.

Továbbá, a teljes hosszúságú fehérjékhez képest a fragmentekből hiányzik egy vagy

több alegység (Klatt és mtsai 2001). A matrilin-4 rekombináns formáját humán

embrionális vese - 293 sejtekben expresszálva, monomer, dimer és trimer fragmentek

keverékét kapták (Klatt és mtsai 2001).

2.4.5. A matrilinek szerepe betegségekben

A matrilin fehérje családban a matrilin-3 az egyetlen olyan családtag, amelynek

mutációja az eddigi ismeretek alapján a chondrodysplasia különböző formáival van

kapcsolatban (Aszódi 1998, 1999, Leighton és mtsai 2007).

35

A matrilin-1 és matrilin-3 mutánsok fenotípusosan normális vázrendszerrel

rendelkeznek, de biokémiai és ultrastruktúrális vizsgálatokkal eltéréseket lehetett

kimutatni. Ezt matrilin-1, -2 és -3 knock-out egereken is igazolták. Mind a matrilin-1,

mind a matrilin-3 modulálja a kollagén fibrillogenezisét a porcban, a normálisan

megjelenő fenotípus a matrilinek egymással történő kompenzációjára utal. A matrilin-

1/-3 kettős knock-outokban átmenetileg megemelkedő matrilin-4 homotrimer is a

kompenzációs mechanizmust támogatja, míg más elméletek szerint a funkcionális

redundancia lehetősége merül fel a matrilin molekulák és a kölcsönható molekulák

között (COMP, dekorin, biglikán). A COMP, matrilin-3 és kollagén IV károsodását

írták le pseudochondro-dysplasiában (PSACH). A multiplex epiphysealis dysplasia

domináns formájában (MED) (Briggs 2004), és az örökletes bilaterális

microepiphysealis dysplasiában (BHMED) is detektálható a matrilin-3 mutációja. A

mutáció elsősorban a vWFA domén β-lemezét érinti (Chapman és mtsai 2001, Jackson

és mtsai 2004, Mabuchi és mtsai 2004). A matrilin-3-ban a mutáció az első EGF-szerű

doménben is lehet, így például osteoarthritisben az EGF-ek első doménjében

bekövetkező cystein-serin csere okozza az S-S diszulfid-híd képződésében létrejövő

károsodást (Stefánsson és mtsai 2003). MED-ben nem írtak le matrilin-1 mutációt.

Ezzel szemben német populáció osteoarthritises betegeiben matrilin-1 gén mutációt,

matrilin-1 és matrilin-3 overexpressziót találtak (Okimura és mtsai 1997). Összefüggést

írtak le a felnőttkori idiopatikus szklerózis (IS) és a matrilin-1 expressziója között. Egy

igen ritka autoimmun porcbetegségben, amely elsősorban a külső fület és a tracheát

érinti a visszatérő polychondritisben (PA) matrilin-1 ellenes immunválaszt mutattak ki

(Buckner és mtsai 2000), rheumatoid arthritisben szenvedő betegekben emelkedett

volt a matrilin-1 fehérje expresszió szintje (Saxne és mtsai 1989).

Matrilin-2 és a matrilin-4 mutációval összefüggő genetikai elváltozásokat nem sikerült

kimutatni. Matrilin mutáns egerekben nem volt kimutatható fenotípusos elváltozás,

noha megfigyelhető volt az abnormális kollagén fibrillumok felhalmozódása és a

kollagén molekulák átmérőjének növekedése (Aszódi és mtsai 1999, Ko és mtsai 2004,

Mátés és mtsai 2004). A matrilin-2 hiányos egerek látszólagos normális fejlődése

többféleképpen is értelmezhető. Egyik kézenfekvő magyarázat az, hogy más matrilin,

vagy a sejtközöttti állomány más fehérjéje átveheti azokat a szerepeket, amelyeket a

matrilin-2 betölt. Erre azért gondolhatunk, mert a matrilinek szerkezeti felépítése és

36

szöveti előfordulása igen hasonló, részlegesen átfedő, továbbá nemcsak homo-, hanem

hétféle heterooligomert is tudnak formálni. A funkcionális redundancia lehet az oka

annak is, hogy eddig nem írtak le olyan súlyos fejlődési rendellenességet, amit a

matrilin gének mutációja idéz elő. Egérben indukált fibrotikus vese modellben (TIF =

renal tubulointerstitial fibrosis) az ECM-re fókuszált klaszter analízissel, a betegséggel

asszociált gének között a matrilin-2 down-reguláltságát mutatták ki (Sadlier és mtsai

2004). Összességében véve elmondható, hogy a matrilinek in vivo betöltött funkciója

még máig sem egészen pontosan tisztázott. Szupramolekuláris struktúrákban betöltött

„adaptor” szerepük ismert, noha ennek részletes tanulmányozását e molekulák

redundanciája nehézkéssé teszi. A sejt-mátrix kölcsönhatásokban is szerepük lehet: a

sejt felszíni filamentumok között foglalnak helyet, de azonkívül, hogy integrin

receptorok, még nem sokat tudunk a sej-sejt illetve sejt-mátrix kölcsönhatásban betöltött

szerepükről.

2.4.6. A matrilin-2 expressziója humán szövetekben és tumorokban

Humán szerveket illetően kevés tudásunk van a matrilin-2 expressziójáról. Bőrben és a

bőr függelékekben, az erek BM-nak legalsó rétegében mutattak ki matrilin-2

expressziót. In situ hibridizációval a keratinocytákban és a fibroblastokban is sikerült

mRNS expressziót detektálni. Noha mindkét sejttípus expresszálta a matrilin-2-t,

különböző módon történik a fehérje processzálása. A fibroblastok, úgy tűnik, leginkább

fokozzák a matrilin-2 expresszióját (Piecha és mtsai 2002 b). A keratinocyták termelik,

majd a szubepidermális szövetek felé transzportálják, a kötőszöveti stroma irányában.

Ez a mechanizmus egészen pontosan nem ismert, de feltehetőleg specifikusan

kölcsönható partner molekulák bizosítják a matrilin-2 BM-ban történő lokalizációját

(Piecha és mtsai 2002 a, b).

Az egyik leggyakoribb gyerekkori primer agytumorban, a pilocitikus astrocytomában

(PA) és multiform glioblastoma (GBM) mintákban mérték az mRNS szintjét real-time

RT- PCR módszerrel. A PA tumorokban a matrilin-2 mRNS szintje hétszer olyan magas

volt, mint a tumor által nem érintett agyi fehérállományban. A GBM minták nem

mutattak matrilin-2 fehérjeszint emelkedést. A magas matrilin-2 szint tehát

összefügghet klinikailag agresszívebb tumorok kialakulásával és hozzájárulhat a tumor

37

terjedéséhez. A matrilin-2 overexpresszió prognosztikus marker lehet PA tumorokban

(Sharma és mtsai 2006).

A matrilin-2-ről májra vonatkozó adatokat mostanáig még nem találtunk az

irodalomban. Minthogy ECM és BM komponens, így jelentősége felmerülhet mind a

májregenerációban mind, pedig a máj cirrhotikus és tumoros elváltozásaiban.

A ECM lehetséges célpontot jelenthet a daganat terápiában. A közelmúltban

beigazolódott, hogy az ECM mikrokörnyezet jelentősen módosítani képes az egészséges

és a malignus sejtek fenotípusát, a tumorsejtek szaporodását, invaziv és metasztatikus

képességét, valamint daganatellenes szerekkel szembeni válaszreakcióját (Hodkinson és

mtsai 2007). Ez utóbbi is kiemeli e nemrégiben leírt mátrix molekulák vizsgálatának a

jelentőségét a HCC-ben és cirrhosisban egyaránt.

38

3. CÉLKÍTŰZÉSEK

Az előzőekben vázolt irodalmi áttekintés alapján vizsgálataink a következő kérdések

megválaszolását célozták meg:

1. Kimutatható-e matrilin-2 mRNS és fehérje expresszió normális patkány és

humán májban?

2. Milyen mértékben és hol expresszálódik a matrilin-2 a májregeneráció

során?

3. Milyen jelentősége lehet a matrilin-2-nek a májregenerációban?

4. Milyen sejteknek lehet szerepe a matrilin-2 termelésében a májregeneráció

során?

5. Hogyan változik mennyiségében és lokalizációjában a matrilin-2

expressziója a cirrhotikus májban, összehasonlítva normál májszövettel?

6. Van-e eltérés a matrilin-2 expressziójában a tumoros májszövetben a normál

májakhoz képest?

7. Milyen különbség figyelhető meg a matrilin-2 expresszió szempontjából az

eltérő eredetű (cirrhotikus és nem cirrhotikus talajon létrejött)

hepatocelluláris carcinomákban?

8. Van-e eltérés a matrilin-2 expressziójában a különböző differenciáltságú

tumorokban?

39

4. ANYAG ÉS MÓDSZER

4.1. A vizsgálatokhoz használt oldatok, pufferek összetétele

Oldat neve Összetétel DEPC víz DEPC (Sigma D 5758), 1l deszt víz

10xPBS 1,5 M NaCl (Sigma, S9625), 12,2 Na2HPO4 (Sigma, S0876), 0,014mM

K2HPO4 (Interkémia, 04190203)

10x TBE 1 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,83 Bórsav (GIBCO, 15705-023), 0,01 M

EDTA(GIBCO 15576-028)

10x Tris-HCl 0,05 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,3 M NaCl (Sigma, S9625)

TBS 0,05 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,15 M NaCl (Sigma, S9615)

TBS-Tween 0,05 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,15 M NaCl (Sigma, S9615), 0,1%

Tween

20x SSC 3 M NaCl (Sigma, S9625), 0,3 M Na –citrát (Sigma, S 4641)

10%-os

Pufferolt

formalin

40% Formalin (Sigma, 8775), 6,5g Na2HPO4 (Sigma, S 0876), NaH2PO4

(Sigma, S0751)

40

4.2. Állatkísérletek

4.2.1. Parciális hepatectomia (PH)

A beavatkozás 180-200g súlyú hím Fisher 344 (F- 344) patkányokon történt Higgins és

Anderson klasszikus módszere szerint (Higgins és Anderson 1931, Grisham és mtsai1997) az

SE I. sz Patológia és Kísérletes Rákkutató Intézetében. A vizsgálatokat a parciális

hepatectomiát követően 24, 48, és 72 órával a műtét után vett szövemintákon végeztük. Az

altatás dietil-éterrel történt. A májminták egy részét formalinban fixáltuk, más részét

folyékony nitrogénben fagyasztottuk további vizsgálatok céljából.

4.2.2. Parciális hepatectomia/acetylaminofluorén (PH/AAF) modell

Az állatok az 1 %-os dimethylcellulózban 2mg/ml koncentrációban oldott

acetylaminofluorént (AAF) 5 mg/kg dózisban kapták hat egymást követő napon át. Ezt

követően parciális hepatectomia történt a 7. napon, amit ezután még hat AAF-es kezelés

követett. Az állatok leölése a kezelés során különböző időpontokban történt (a PH-t követő 9.,

11. és 13. napokon) az ovális sejt proliferáció csúcspontjának meghatározása végett.

Az állatkísérleteket a Nemzetközi Állategészségügyi Intézet kísérleti protokolljaival

megegyező módon végeztük el.

4.3. Humán szövetek

A Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében archivált valamint újonnan gyűjtött

humán májmintákat használtuk fel vizsgálatainkhoz, amelyeket formalinban, illetve RNA-

laterben (Sigma) fixáltunk vagy folyékony nitrogénben történt fagyasztás után -80◦C-on

tároltunk. A sebészileg rezekált anyagok az SE I. sz. Sebészeti Klinikáról, a kontrollként

használt egészséges normál májak pedig balesetben elhunyt személyekből származtak, az SE

Igazságügyi Orvostani Intézetéből. A vizsgálatokhoz TUKEB engedéllyel rendelkezünk (#

172/2003, # 2/2004).

A vizsgált HCC-k csoportosítása az Edmonson-Steiner féle klasszifikáció alapján történt (G1-

G3) (1. táblázat). A nemek szerinti megoszlás a következő volt: 27 férfi, 8 nő. Az átlag

életkor 65 év (44-82). A 35 eset közül 15 esetben a hepatocelluláris carcinoma cirrhosis

talaján fejlődött ki. A többi esetben enyhe és igen mérsékelt mértékű fibrosis volt jellemző a

41

tumort környező májszövetre, de sem nodulus képződés, sem pedig a cirrhosisra jellemző

duktuláris reakció nem volt megfigyelhető. A 15 eset közül 7 minta volt HCV-vel fertőzőtt.

1. táblázat. A vizsgálatokhoz használt humán májminták.

Vizsgált májminták esetszám

Normál májminták 10

HCC környező tumormentes máj 35

HCC 35

I.

1. cirrhotikus talajú HCC 15

2. nem cirrhotikus talajú HCC 20

II.

1. jól differenciált HCC (G1) 19

2. közepesen differenciált HCC (G2) 9

3. rosszul differenciált HCC (G3) 7

4.4. Morfológiai vizsgálatok

4.4.1. Hisztológia

A patkány máj, valamint a sebészetileg eltávolított tumor mintákat a környező nem tumoros

szövetekkel együtt, valamint a normál humán máj mintákat 10%-os neutrálisan pufferolt

formalinban fixáltuk 24 órán keresztül, utána dehidráltuk és paraffinba beágyaztuk. A

morfológiai elváltozások kimutatása és a tumor grade megítélése 3-4 µm-os hematoxilin-

eozinnal (HE) festett metszeteken történt. Kiegészítő PAS, Shikata-féle orcein, Picrosirius-

vörös festéseket rutinszerűen elvégeztük.

4.4.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok

4.4.2.1. Paraffinos metszeteken végzett immunfestés A formalinban fixált, paraffinba ágyazott mintákból 3-4 µm-es metszeteket készítettünk, majd

deparaffináltuk: kétszer 10 percig xilolos, majd kétszer 5 percig etanolos áztatással. Desztillált

vízzel történő mosás után az endogén peroxidáz blokkolást 3%-os H2O2-ban végeztünk 20

percig. PBS pufferes mosás után az antigénfeltárás proteáz emésztéssel történt (ready-to-use

42

proteináz-K, 10 perc, 25◦ C, DAKO, CA, USA). Újabb PBS-sel történő mosás után az antitest

aspecifikus kötődéseket 1%-os normál ló szérummal illetve 3%-os BSA-val (PBS) blokkoltuk

20 percen át szobahőmérsékleten. Ezután a megfelelő elsődeges antitest oldatával egy

éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltunk. PBS-ben történt mosásokat követően 20 percig a másodlagos

antitesttel inkubáltuk a metszeteket. A biotinilált másodlagos antitestnél ezt az ABC inkubálás

követte.

A matrilin-2 kimutatása végett az immunreakció érzékenységét egy nagy érzékenységű

jelamplifikációs immuntechnika alkalmazásával, biotinilált tiraminnal fokoztuk (ABC-BT

módszer) (7. ábra) Az immunreakció Merz és munkatársai által leírt módszer szerint történt

(Merz és mtsai 1995). Az ABC inkubálást biotinilált tiraminos inkubálás követte (7mM

biotinált tiramin törzsoldatból 1: 125 + 0,033% H2O2 (PBS-ben) 10 perc, 37 ◦C). Ismételt

ABC reakció után az immunreakciót 3-amino-9-ethyl-carbazol (AEC) (Biogenex HK 129-5K,

San Ramon, USA) vagy 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) (Genetex, San Antonio,

USA) kromogénekkel hívtuk elő. A háttérfestés Mayer-féle hematoxilinnal történt és

glicerines fedőanyaggal fedtük a metszeteket. A kontroll metszeteknél az elsődleges antitesttel

való inkubálást elhagytuk.

4.4.2.2 Fagyasztott metszeteken végzett immunfloureszcenciás vizsgálat 6 µm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk kriosztáttal (SHANDON CC 0053000603,

Patosystems, Minnesota, USA), ezt követően 10 percig metanolban fixáltuk – 20◦C-on. A

fixálás után a metszeteket TRITON tartalmú PBS-ben (pH 7,4) tártuk fel 5 percig. A

metszeteket 1 éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltuk az elsődleges antitesttel. Ezt követően egymás

után háromszor 5 percig mostuk a metszeteket PBS-ben. A reakciót Alexa Flour-488-

konjugált- anti-egér IgG másodlagos antitesttel tettük láthatóvá (Molecular Probes, Oregon,

USA). A metszeteket DAPI-t tartalmazó Vectashield Mounting Mediummal fedtük le (Vector

Laboratories, Burlingame, CA, USA). Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz használt

antitesteket a 2. táblázat foglalja össze.

4.4.2.3. Fotódokumentáció A fotókat Olympus BX mikroszkóphoz (Tokyo, Japán) rögzített kamera segítségével

készítettük. Az immunfluoreszcenciás képeket konfokális lézer-szcanning mikroszkóppal

elemeztük és a hozzá tartozó szoftverrel fotóztuk (Bio-Rad MRC-1024 system, Bio-Rad,

Richmond, CA, USA).

43

2. táblázat. Az immunhisztokémiai vizsgálatok során használt antitestek

Elsődleges antitestek

• poliklonális nyúl anti - matrilin-2 (1:150 hígításban (PBS), ajándék dr Deák Ferenc

munkacsoportjától, Szeged, SZBK, Piecha és mtsai 1999)

• monoklonális egér anti-laminin (1:100 hígításban (PBS), Novocastra, Newcastle, UK)

• poliklonális nyúl anti-laminin (1:100 hígításban (PBS), DAKO)

• monoklonális anti-egér OV-6 (1:100 hígításban (PBS), R&D, Minneapolis, USA)

• monoklonális CD34 (1:100 hígításban ( PBS), DAKO, clone QBEnd/10)

Másodlagos antitestek

• biotinilált anti-nyúl IgG (ABC kit, Novocastra, Newcastle, UK)

• biotinilált anti-egér IgG (ABC kit, Novocastra, Newcastle, UK)

• Alexa Flour-488-konjugált anti-egér IgG (1: 100 hígításban (PBS), Molecular Probes,

Oregon, USA)

• Alexa Flour-568-konjugált anti-nyúl IgG (1: 100 hígításban (PBS), Molecular Probes,

Oregon, USA)

44

7. ábra. Az ABC –BT: biotinilált tiramin jelamplifikációs módszert bemutató sematikus

ábra (Füle és Kovalszky 2002)

A mintában található jelet (a kimutatni kívánt antigént) specifikus ellenanyaggal reagáltatjuk.

Ehhez kötjük a biotinnal jelzett másodlagos ellenanyagot. A következő lépésben avidin.-

biotin - peroxidáz komplexet adunk a mintához, ekkor az avidin a biotinhoz kötődik. A

peroxidáz a következő lépésben alkalmazott hidrogénperoxidot redukálja, a szabad gyökként

viselkedő nascens oxigén felszabadulási helyére bekötődik a biotinált tiramin, ami az ABC-

vel újra amplifikálható. A reakciót végül AEC-vel, a hidrogén-peroxidáz szubsztrátjával

tesszük láthatóvá. A tiraminhoz más molekulát kötve (fluoreszcein, digoxigenin) a reakció

fluoroszcens kimutatásra is használható.

45

4.4.2.4. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciókat fénymikroszkóp segítségével vizsgáltuk

(200X nagyítás, Olympus BX). Tíz egymást nem fedő random kiválaszott területet

értékeltünk ki. A matrilin-2 immunreakciót rögzítő digitális képeknek az

immunreakciók intenzitására és a pozitív területek meghatározására a Leica QWin

programot (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd., Cambridge, UK) használtuk

fel. Az immunpozitív területet kijelölve végeztük el a méréseket. A vörös, zöld, kék

összetevők alapján állítottuk be a küszöbértéket, amelyet minden metszet esetében

állandónak fogadtunk el az összevethetőség érdekében. Az értékelésre kiválasztott

területen azokat a reakciókat fogadtuk el pozitívnak, amelyek a küszöbértéket

meghaladták.

4.5. Molekuláris biológiai vizsgálatok

4.5.1. Szöveti lézer mikrodisszekció és RNS izolálás patkány májból

AAF/PH kezelt és a kontroll normál májakból 10 µm vastag fagyasztott metszeteket

készítettünk, acetonban fixáltuk és szobahőmérsékleten szárítottuk majd RN-áz mentes

HE-al festettük. A kiválasztott területeket lézer katapult technikával vágtuk ki a

metszetekből RNS izolálás és PCR vizsgálat céljából. A célterületek kivágásánál

nagyfokú óvatossággal jártunk el az RN-áz mentes környezet megőrzése miatt. A

mikrodisszekciót a PALM lézer mikrodisszekciós rendszer segítségével végeztük a II.

Belgyógyászati Klinika kutatólaboratóriumában. A kivágott sejteket steril Eppendorf

csövek kupakjában gyűjtöttük, 500-1000 ovális sejtet és hepatocitát gyűjtöttünk össze (a

PH-t követő 13. napon az AAF/PH-kezelt állatokból) lysis pufferbe (Qiagen). Az RNS

izolálást RNeasy Mini Kit-tel (Qiagen) végeztük el, a gyártó utasítása szerint.

4.5.2. RNS-izolálás RNA laterben fixált humán anyagból

13 HCC-t, ugyanennyi környező mintát és 10 normál májat használtunk fel RNS

izoláláshoz. Egyenként kb. 20 mg RNA laterben (Sigma) fixált szövetből Trizol

(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) módszerrel RNS-t izoláltunk (Mannhalter és mtsai

46

2000). Homogenizálás után a szövethomogenizátumot Trizol reagensben inkubáltuk

szobahőmérsékleten 15 percig, majd 0,2 ml kloroform hozzáadása után vortexeltük és

centrifugáltuk. Ezután a felülúszót, amely az RNS-t tartalmazta, kloroformmal tovább

tisztítottuk. Az RNS-t izopropanollal kicsaptuk, vortexeltük és tíz perc állás után újra

centrifugáltuk. Ezután leöntöttük a felülúszót és 75 %-os etanollal mostuk, majd

centrifugáltuk. Roche RNS tisztító kitből (Roche, 3270289, Indianapolis, USA)

származó elúciós pufferben oldottuk az RNS-t, DNázzal emésztettük és tisztítottuk. A

kapott pelletnek spektrofotométerrel megmértük az optikai denzitását (O.D.) és az RNS

koncentrációját. További felhasználásig a tisztított RNS-t -80°C-on tároltuk. Az RNS-ek

integritását 1%-os agaróz gélen történt futtatással ellenőriztük.

4.5.3. cDNS előállítás

1 µg-nyi mennyiségű totál RNS felhasználásával egy RT-PCR reakcióban cDNS-t

állítottunk elő. A reakcióhoz random hexamert és M-Mulv reverz transzkriptázt

használtunk. A reakcióelegy összetételét a 3. táblázat foglalja össze.

3. táblázat. A cDNS szintézis komponensei

Komponensek

Térfogat

A kompnenst gyártó cég

RT Puffer 2 µl Applied Biosystems, CA, USA

Hexamer 0,5 µl Applied Biosystems, CA, USA

dNTP mix 0,5 µl Roche D 8220, Indianapolis, USA

20 U/ µl RN-áz gátló 0,5 µl Applied Biosystems, CA, USA

50U/ µl Reverz Transzkriptáz 1 µl Applied Biosystems, CA, USA

dH2O 4,5 µl Eppendorf 0032006159

RNS templát 1 µg

Összesen 10 µl

A reakció paraméterei:

25°C 10 perc

42°C 50 perc

95°C 5 perc,

4°C ∞

47

4.5.4. Primerek és a PCR körülményei

A kísérletek megkezdése előtt a rendelkezésre álló szekvenciák alapján a Primer

Expressz 2 program (Applied Biosystems, CA, USA) segítségével megterveztük a

lehetőségek szerinti legideálisabb primereket. A tervezésnél figyelembe vettük, hogy

bizonyos fehérjéknek több transzkripciós variánsa is létezik; ezeknél olyan primereket

használtunk, amely valamennyi variáns expressziójának kimutatására alkalmas. A

tervezés eredményei az 4. táblázatban összefoglalt primerek:

4. táblázat. A kísérletek során alkalmazott primerek.

Primer neve Orientáció Szekvencia (5’-3)

HUMÁN PRIMEREK

MATN2 forward GACGGAAGACGGTGCAAGAA

MATN2 reverse CCAGTGACAAACTGCTTCACGA

GAPDH forward CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT

GAPDH reverse TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT

PATKÁNY PRIMEREK

Matn2 forward AAACTGGACTCTTGTGCTTTGGG

Matn2 reverse AAACTGGACTCTTGTGCTTTGGG

Gapdh(rat) forward TGGAGAAACCTGCCAAGTGTG

Gapdh(rat) reverse GAGTGGGAGCTGCTGTTGAAGT

4.5.5. Grádiens PCR

A PCR-hez beállítottuk az optimális primer kötődési hőmérsékletet grádiens PCR-rel

(Merck, Eppendorf Mastercycler Gradient). A reakcióhoz használt komponenseket az 5.

táblázat tartalmazza. Az azonos tartalmú PCR csöveket úgy helyeztük el a készülékben,

hogy 53°C és 66°C közötti hőmérsékleten történjen meg a primer kötődés.

48

5. táblázat. A grádiens PCR-hez használt komponensek.

Komponensek

Térfogat

A komponenst gyártó cég

10x PCR puffer MgCl2dal 2,5 µl Roche J 0051

10mM dNTP mix 0,5 µl Applied Biosystems, D8220

25 µM forward primer (MATN2) 0,5 µl

25 µM forward primer (MATN2) 0,5 µl

Csertex

Csertex

5U/ µl AmpliTaq Gold Enzim 0,5 µl Roche G0448

dH2O 19,5 µl Eppendorf 0032006159

cDNS 1 µl

Összesen 25 µl

A reakció paraméterei:

kezdeti denaturálás 95°C 10 perc

denaturálás 95°C.............. 30 másodperc

primer kötődés 53-66°C ....... 30 másodperc

szintézis 72°C ............. 30 másodperc

leállítás 4°C………… ∞

Ciklusszám: 35

A következő hőmérsékleteken vizsgáltuk a primerek kötődését: 53, 2°C, 55, 5◦C, 58,

1°C, 60, 8°C, 63, 5°C, 66°C.

4. 5. 6. Agaróz gélelektroforézis

A grádiens PCR reakciók során nyert termékeket 2%-os agaróz gélben futtattuk meg (8.

ábra). A gélkészítésnél 1 g agarózhoz (GIBCO 15510-019) 50 ml 1x-es TBE puffert

adtunk, majd forraltuk és 2, 5 µl etidium-bromidot (BIO-RAD 161 0433) adtunk hozzá.

A mintákat (12 µl) mintafelvivő pufferben (Novagen 69180) futtattuk párhuzamosan a

DNS létrával (5 µl) (Novagen 70539), 1x TBE pufferben. A futtatás 100 V-on 40 mA

áramerősség mellett 20-30 percig történt. Ezután a SYNGENE MultiGenius Bio

Imaging rendszerével GeneSnap szoftver felhasználásával lefotóztuk a gélt. Ez alapján a

primer legoptimálisabb kötődési hőmérsékletének a 63°C találtuk. A későbbiekben

49

elvégzett real-time RT-PCR reakciókban ezt állítottuk be primer kötődési

hőmérsékletként. A továbbiakban ezen a hőmérsékleten végeztük a reakciókat.

4.5.7. Real-time RT-PCR

A real-time RT-PCR-hez mintánként 12, 5 µl Sybr Green Master Mixet (BIO-RAD

1708882), illetve az általunk megtervezett primerekből 500 nM koncentrációban 0,5-0,5

µl-t és a korábban előállított cDNS-ből 2 µl-t, valamint 9,5 µl desztillált vizet

használtuk fel. A reakció paraméterei:

Kezdeti denaturálás.............95°C .........2 perc

Denaturálás .........................95°C .........20 másodperc

Primer kötődés ....................63°C .........30 másodperc

Szintézis..............................72°C .........30 másodperc

Ciklusszám: 40

A termék homogenitásának ellenőrzése miatt olvadáspont analízist végeztünk el 55 °C -

95°C-on (9. ábra), mely a termékek homogenitását és a primer specifikus kötődését is

alátámasztotta. A mérések 96-os plate-eken, duplikátumokban történtek a kontroll

génekkel párhuzamosan futtatott reakcióban. A PCR termékek méretének ellenőrzésére

a reakció termékekből 10 µl-t futtattunk 2%-os agaróz gélen, majd etídium-bromidos

festéssel tettük láthatóvá az amplikonokat (9. ábra).

1 2 3 4 5 6 L

8. ábra. Matrilin-2 grádiens PCR termékek

(1 - 53,2 ◦C; 2 - 55, 5◦C; 3 - 58,1◦C; 4 - 60,8 ◦C; 5 - 63,5 ◦C;L - DNS létra)

100 bp

50

9. ábra. A. Matrilin-2 real-time RT-PCR termékek agaróz gélen. B. A termékek

olvadáspont analízise.

4.5.8. Real-time RT-PCR eredmények elemzésének módszere

A kapott adatokat a REST (Relative Expression Software Tool) néven ismert relatív

kvantifikálásra alkalmas számítógépes program segítségével értékeltük ki. (Pfaffl és

mtsai 2002). A vizsgálatokhoz a GAPDH háztartási gént használtuk, ezekhez

viszonyítottuk az általunk vizsgált gének expresszióját, az alábbi képletet figyelembe

véve.

(E célgén) ▲CPcélgén (Ct kontroll – Ct minta)

(E referencia gén) ▲CPreferencia gén (Ct kontroll – Ct minta)

R= a relatív expresszió;

E = a PCR reakció hatékonysága (azaz a ciklusonként észlelt PCR növekedés szorzója);

CP = crossing point, az a ciklusszám, ahol az RNS mennyisége meghaladja a

detektálhatóság küszöb (treshold) értékét;

t - treshold, küszöbérték: exponenciális fázisban;

Ct – treshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája ezt a

szintet – a kiindulási DNS mennyiséggel arányos;

A

R =

B

51

Ct kontroll – a kontrollnak vett minta treshold ciklus értéke, Ct minta- a minta treshold

ciklus értéke.

A statisztikai kiértékelést mind az immunhosztokémiai reakciók esetében, mind pedig a

real-time RT-PCR eredményeknél a GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Inc.

San Diego, CA, USA) program segítségével végeztük. A csoportok közötti

összehasonlításra a Mann-Whitney U tesztet alkalmaztuk. A különbséget p < 0,05

esetén vettük szignifikánsnak.

4.5.9. HCV vírus detektálása humán májmintákból Nested - PCR módszerrel

A módszer két egymást követő PCR lépésből áll, melynek során az első amplifikálás

alatt felszaporított nagyobb DNS fragmentről a második lépésben egy kisebb

bennfoglalt szakaszt amplifikálunk. A módszer növeli a DNS amplifikáció

érzékenységét azáltal, hogy egy nem specifikus DNS amplifikáció is történik a reakció

során. Ez azt jelenti, hogy a HCV esetében egy olyan – általánosabb DNS szakaszt

felszaporítunk, amely a vírus több típusában is megtalálható. Ehhez két primer párt

használunk. Az első amplifikálás során nyert DNS terméket használjuk a második

PCR-ben templátként. A második lépésben a felszaporított fragmentről amplifikáljuk a

belső, specifikus primerpárok segítségével az adott HCV típusra egyedien jellemző

DNS szakaszt (10. ábra).

52

10. ábra. A Nested PCR elvét bemutató sematikus ábra.

Az első lépésben a cDNS szintézist a külső primer pár forward primerével (HCV-8)

végeztük el. A használt reakcióelegy és paraméterek a 6. táblázatban vannak feltüntetve.

6. táblázat. HCV- cDNS szintézishez használt komponensek

Komponensek

Térfogat (µl)

A komponenst gyártó cég

RT puffer 5x 2 Boehringer 1465376

HCV-8 primer 0,5 Genset 351330F

10 mM dNTP mix 0,5 Roche D 8220

20 U/ µl RN-áz gátló 0,5 Applied Biosystems, D8220

50 U/ µl Reverz Transzkriptáz 0,5 Boehringer 84106920

H2O 5 Eppendorf 0032006159

DNS 1

Összesen 10

Külső primer pár Külső primer pár Target DNS

Belső primer pár Belső primer pár

Az első amplicon

A target DNS specifikus amplifikációs terméke

53

A reakció paraméterei:

25◦C 10 perc, 42◦C 30 perc, 48◦C 10 perc, 95 ◦C 5 perc, 4◦C – on leállítás.

A második körben a kapott cDNS-t amplifikáltuk fel a cDNS előállítás során használt

reakcióelegyében fölöslegben maradt forward primerrel és a külső reverse (HCV-11)

primerrel. A reakcióelegy összetételét a 7. táblázat tartalmazza.

7. táblázat. Az első amplifikációs körben használt reakcióelegy összetétele.

Komponensek

Térfogat µl

A komponenst gyártó cég

10x PCR puffer 5 Roche J0051

Taq Gold enzim 0,5 Roche G0448

10 mM dNTP mix 1 Roche D 8220

HCV-11 primer 1 Genset 351332

dH2O 38,3 Eppendorf 0032006159

RNS templát 5

Összesen 50 µl

Reakció paraméterek: kezdeti denaturáció 95◦ C 10 perc

denaturáció 95◦ C 30 másodperc

primer kötődés 55◦ C 30 másodperc

DNS szintézis 72◦ C 60 másodperc

extenzió 4 ◦C 4 perc

Az utolsó amplifikációs körben alkalmazott reakcióelegy és primerek a 8. és 9.

táblázatban vannak összefoglalva. A reakció paraméterek az előző ampifikációs kör

paramétereivel egyeztek meg. A reakciót Perkin Elmer Gene Amp 2400 PCR System

készülékkel (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA) végeztük. Pozitív és negatív

kontrollokat egyaránt használtunk. A termékeket 2%-os agaróz gélen futtattuk (11.

ábra).

54

8. táblázat. A második amplifikációs körben használt reakcióelegy összetevői.

Komponensek

Térfogat

A komponenst gyártó cég

10x PCR puffer 5 µl Roche J0051

Taq Gold enzim 0,5 µl Roche G0448

10 mM dNTP mix 1 µl Roche D 8220

HCV-3 primer 1 µl Genset 351332

HCV-4 primer 1 µl Genset 351334

dH2O 38,5 µl Eppendorf 0032006159

RNS templát 3 µl

Összesen 50 µl

9.táblázat. A HCV detektálása során használt primerek Primer Orientáció Szekvencia (5’-3) GI lokalizáció amplikon

HCV 8 forward ccatagatcactcccctgtg 13-32

HCV 11 reverse gcacggtctacgagacct

2764397 321-304

308

HCV 3 forward ctgtgaggaactactgtcttcacgcag 28-54

HCV 4 reverse cggttccgcagaccactatg

7669491 141-122

114

11. ábra. HCV vírus detektálása humán máj mintákban. Futtatás 2%-os agaróz

gélen. +k– pozitív kontroll, -k – negatív kontroll, 903, 951- tumoros májszövet; 904,

952- tumormentes májszövet. L - DNS létra.

100 bp

55

4.5.10. RNS expresszió detektálása in situ hibridizációval

Az in situ hibridizációs technika adott nukleinsav-szekvenciák kimutatására használt

molekuláris biológiai módszer. Alapja, hogy az ismert egy szálú szekvencia, esetünkben

RNS – egy szakasza és a hozzá tervezett komplementer, jelzett próba adott

körülmények között hibridizálni képesek egymással.

A 644 bp hosszú patkány matrilin-2 fragmentet RT-PCR-el amplifikáltunk a következő

primerekkel (5’ cctaccccaacggcataca 3’), (5’ tgtgtgaacagtggcgaatc 3’). Az amplifikált

fragmentnek pBluescript IISK vektorba történt a klónozása. A sense és antisense

matrilin-2 riboprobákat digoxigenin-UTP-vel jelöltük (Roche, Mannheim, Germany).

6 µm vastag RN-áz mentesen kezelt paraffinba ágyazott metszetek deparaffinálása 3 x

15 percig xilolban, majd 2x10 percig etanolban történt. Ezt követően a metszeteket RN-

áz mentesen készített PBS-ben mostuk. Ezután pepszines emésztés következett (10

µl/ml, 37◦C-on, 25 percig 0,2N HCl-ban). A metszeteket 4%-os paraformaldehydben

(PBS-ben) posztfixáltuk (jégen 10 percig) és 0,25 %-os ecetsavanhidriddel acetiláltuk.

A metszetekre prehibridizáló oldatot tettünk és hibridizálás előtt denaturáltuk a

ribopróbákkal együtt (94◦C- 4 perc). A prehibridizáló oldatot kicseréltük az ugyanilyen

összetételű, de jelzett próbát is tartalmazó hibridizáló elegyre, amit 53◦C-on történő

inkubálás követett 12-16 órán át.

Negatív kontrollként párhuzamos metszeteken az antiszenz RNS próba helyett szenz

próbát hibridizáltunk. A hibridizációt mosások követték: 20 percig a hibridizációs

hőmérsékleten 2x nátrium-citrate/klorid pufferben (SSC); majd 20µg/ml RNA-ázzal

kezeltük TNE pufferben 30 percig (10 mM Tris- HCl, pH 7,05; 0,5 M NaCl, 1mM

EDTA, 37 ◦C –on), majd tovább mostuk 50 ◦C-on 2x SSC 0.01%, Triton X-100 és 0.1x

SSC, 0.01% TritonX-100, 5mM EDTA oldatokban 20-20 percig.

A reakció detektálása anti-digoxygenin- alkalikus-foszfatáz- IgG-Fab-ellenes

fragmenttel történt (Roche). Az endogén alkalikus-foszfatáz enzimaktivítást 1 perces

20%-os ecetsavval történő kezeléssel blokkoltuk. Az alkalikus-foszfatáz reakció

detektálását NTB (nitro-tetrazolium-blue chloride) (Sigma) és BCIP (5-bromo-4-chloro-

3-indolyl-phosphate) (Sigma) elegyével végeztük. A metszeteket Kaiser- féle glicerin-

zselatinnal fedtük le.

56

4.5.11. Fehérje izolálás

A humán és patkány mintákból a Western blothoz fehérjét izoláltunk.

4.5.11.1. Patkány májakból A fehérje kinyeréshez használt izoláló puffer (0. 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM

EDTA (pH 7.4), proteáz inhibitorok: 2 mM phenylmethylsulfonyl fluorid, 2mM N–

ethylmaleimid, 0.1 M ε-amino-kapronsav, 15 mM benzamidin és 1660 egység

GORDOX (aprotinin)) 1 ml-éhez 100 mg szövetmintát adtunk és Turrax

homogenizátorral végeztük el a szövetek homogenizálást. A homogenizálás után a

mintákat 15 percig 4◦C-on 8000 rpm-en centrifugáltuk, majd a pelletet ugyanilyen

összetételű homogenizáló oldatban szuszpendáltuk és 4M-os ureával történt kezelés

után a mintákat 30 percig jégen extraháltuk. Az így kapott elegyet ismét 8000 rpm-en

15 perig centrifugáltuk 4◦C-on. A kapott felülúszót használtuk a fehérjék további

vizsgálatához. Felhasználás előtt meghatároztuk az íly módon kapott fehérje oldatok

koncentrációját.

4.5.11.2. Humán májakból A humán minták esetében használt izoláló puffer összetétele eltért a patkány minták

esetében használtaktól (a patkány májmintáknál az intenzívebb proteáz gátlás miatt

többféle proteázgátlót is használtunk). Ebben az esetben az izoláló puffer összetétele a

következő volt: 50 mM/l Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM N-

ethylmaleimid és 2mM phenylmethylsulfonyl fluorid.

A kapott homogenizátumot 8000 rpm-en 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót

összegyűjtöttük és a fehérjekoncentráció mérése után SDS-poliakrilamid

gélelektroforézisnek vetettük alá.

A fehérje koncentrácót minden esetben a Qubit Fluorimeterrel (Molecular Probes)

mértük a Quanti-iTM Protein Assay Kit (Molecular Probes, Q33212) leírásának

megfelelően.

57

4.5.12. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis

Az izolált fehérjék szeparálása SDS-poliakrilamid (SDS-PAGE) gélelektroforézissel

történt nem redukáló körülmények között. Minden mintából 40 µg fehérjét futtattunk

azonos térfogatban. A minták kihígítása és gélre történő felvitele mintapufferben (0,5

M/l Tris-HCl, (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, (0,5 v/v) bromophenol kék) történt. A

patkány mintákat 4-8 %-os grádiens gélen, a humán mintákat pedig 4-12%-os grádiens

gélen futtattuk előrefestett molekulasúly markerekkel párhuzamosan (Amersham

Pharmacia Biotech, Little Chalfont, United Kingdom és PageRulerTM Prestained

Protein Ledder, Fermentas). A futtatást először 80 V-on 10 percig, majd 60 V

feszültségen kb. 1 órán át végeztük, BIORAD PowerPac készülékkel. Futtató pufferként

10 x-es Tris/Glicin/SDS puffert (BIORAD, 161-0732) használtunk tízszeresére hígítva.

Minden esetben ugyanabból a mintasorozatból párhuzamosan két-két gélt futtattunk.

Elektroforézis után az egyik gélt Commassi-kék (BIORAD) fehérje markerrel festettük

meg 30 percig. Majd a fehérjék láthatóvá tétele végett a megfestett gélt differenciáltuk

5% metanolt és 7,5% ecetsavat tartalmazó oldattal. Ez abból a célból történt, hogy

ellenőrizzük a fehérjék futását és szeparálódását a gélben. A másik gélt blottoláshoz

használtuk.

4.5.13. Western blot

A futtatás után nitrocellulóz membránra (Protran, Schleicher and Schuell, BIORAD,

CA) blottoltuk a fehérjét, amely 4°C-on, 10 percig 60 V-on, majd 50 percig 80 V -on

történt. A blottolás után a membránt desztillált vízzel mostuk, majd Ponceau festéssel

ellenőriztük, hogy a fehérjék transzferje megtörtént-e. A festék membránból történő

eltávolításához NaOH-t használtunk, majd mostuk TBS-sel. A filtert ezután egész

éjszakán keresztül blokkoltuk a nem specifikus kötődés megakadályozása miatt. A

blokkoló oldat 5%-os zsírmentes tejpor volt TBS-ben oldva (pH = 7,6). A filtert ezután

nyúl anti-matrilin-2 antitesttel (1: 500 hígítva a blokkoló pufferben) 1 éjszakán keresztül

inkubáltuk 4◦C-on. TBS-Tweennel történő alapos mosás után a membránt ezen antitest

ellen termelt, peroxidáz-konjugált kecske anti-nyúl IgG ellenanyaggal 1: 1000 hígítva

58

ugyancsak a blokkoló oldatban inkubáltuk 1 órán át, végül a jelet erősített

kemilumineszcenciával (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) mutattuk ki.

59

5. EREDMÉNYEK

5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata patkány májban

immunhisztokémiával

5.1.1. Matrilin-2 vizsgálata immunhisztokémiával normál patkány májban

Normál, kezeletlen patkány májban immunhisztokémiai reakcióval a matrilin-2 a

portális térben, az erek és az epeutak BM-ban, valamint az azt körülvevő kötőszöveti

rétegben volt kimutatható (12. ábra). Az ereket erős pozitivitás jellemezte, míg az

epeutak BM-ja nem mutatott intenzív reakciót, helyenként az epeúti pozitivitás igen

gyenge vagy fragmentált volt. A májparenchymában a szinuszoidok mentén nem volt

matrilin-2 expresszió. A centrális vénákban sem detektáltunk matrilin-2-t.

12. ábra. A, B. Matrilin-2 immunreakció normál patkány májban. Pozitív reakció

detektálható a portális tér (PT) ereiben (nyíl), az epeutakat körülvevő

kötőszövetben (nyíl). Nagyítás: A. 200x; B. 600x.

A

PT

B

PT

60

5.1.2. Matrilin-2 immunhisztokémiai kimutatása májregenerációban

A matrilin-2 expressziójában bekövetkező változásokat először a parciális

hepatectomiát (PH) követően vizsgáltuk F-344 patkány májban. Mint arról már az

irodalmi áttekintésben szó esett, ilyenkor a májtömeg pótlása döntően a hepatociták

osztódása réven történik. A hepatociták DNS szintézisének csúcsa patkányban jól

reprodukálhatóan 24 órával a műtét után van, amit a nem parenchymális sejtek

osztódása 24-48 óra múlva követ. Ennek alapján a parciális hepatectomiával kezelt

patkányokból immunhisztokémiai vizsgálatokhoz a mintákat a PH-t követően a 24., 48.

és a 72.-ik órában leölt állatokból nyertük. Mindhárom időpontban az immunreakció

hasonló pozitivitást mutatott mind a lokalizáció mind pedig az intenzitás tekintetében.

Immunhisztokémiával a különböző időpontokban vett mintákból nem volt

fénymikroszkóppal látható eltérés. A PH utáni metszeteken végzett immunreakciót

összehasonlítva a kezeletlen normál májakból nyert mintákkal a reakció jelentős

hasonlóságot mutatott: a matrilin-2 hasonló lokalizációját figyelhettük meg mint a

normál májakban, azaz minden esetben detektálható volt a matrilin-2 jelenléte a portális

térben (13. ábra). Az epeutak és az erek BM-jában is láttunk hasonlóan gyengén pozitív

reakciót, itt az epeutak BM-jában detektálható pozitív reakció sokkal egyértelműbb volt

mint a kezeletlen májakban. Míg a máj szinuszoidjaiban és a centrális vénákban

ezekben az esetekben sem volt immunhisztokémi módszerrel kimutatható matrilin-2

fehérjeexpresszió.

61

13. ábra. Matrilin-2 fehérje immunhisztokémiai detektálása parciális

hepatectomiával kezelt patkány májakon, PT-portális tér. A nyíl a pozitív reakciót

jelzi. A. 24 órával a PH után, B. 48 órával a PH után, C, D. 72 órával a PH után.

Nagyítás: A, B, C 200x; D 600x.

A következő lépésben a matrilin-2 fehérje expresszióját immunhisztokémiával az ovális

sejtek részvételével történő májregenerációban vizsgáltuk. Az ovális sejtek

proliferációját AAF/PH kezeléssel értük el az „Anyag és módszer” fejezetben leírtaknak

megfelelően. Az AAF/PH kísérleti rendszerben történő májregenerációt a 14. ábra

mutatja be.

A

PT

PT

C D

PT

B

PT

62

14. Ábra. Az AAF/PH kísérleti rendszerben lezajló májregenerációt bemutató

sematikus ábra. Alacsony dózisú modell: az ovális sejt duktuszok a májlebenybe

penetrálnak és szimultán „kis hepatocitákká” differenciálódnak. Magas-dózisú modell:

Az ovális sejtek mélyen a májparenchymába hatolnak és csak jelentéktelen mértékben

változnak. A differenciálódó sejtek fókuszokat képezve tekervényes és elágazó

duktuszokba rendezőnek. A napok száma a parciális hepatectomia után eltelt időt jelenti

(Paku és mtsai 2004).

Kísérleteinkhez a magas – dózisú modellt használtuk. Az ovális sejtek a PH utáni 5.

napon jelentek meg először, számuk ezután a napok múlásával progresszíven

növekedett. A mintavétel az AAF/PH kezelés során a PH-t követően a 9., 11., és 13.

napokon történt. A különböző időpontokban történt mintavételt abból a célból végeztük,

hogy meghatározzuk azt az időpontot, amikor az ovalis sejt proliferáció a

legintenzívebb. Az AAF/PH kezelést követően az ovális sejtek proliferációja és a

duktuláris reakció legintenzívebben a parciális hepatectomiát követően a 13. napon volt

detektálható (15., 16. ábra).

Magas dózisú AAF

Alacsony dózisú AAF

3-4 nap 5-6 nap

8-10 nap 11-13 nap

Norm máj

63

15. ábra. HE festés AAF/PH kezelést követő regenerálódó patkány máj metszeten.

A. Ovális sejt proliferációban gazdag portális tér (nyilak), 200 x; B. Ovális sejtek

(nyilak), 600x

Az ovális sejtek detektálása specifikus OV-6 antitesttel is megtörtént fagyasztott

metszeteken. OV-6-al egyértelműen azonosíthatóak az ovális sejt proliferációban

gazdag portális terek és a májparenchymába mélyen behatoló “ovális sejt képezte

duktuszok”, az ún. „ovális sejt lécek” (16. ábra).

16. ábra. Hepatikus ovális sejtek detektálása OV-6 antitesttel (zöld),

immunfluoreszcenciával AAF/PH kezelt patkány májakon. A. Erős pozitív reakció

a portális terekben (nyíl), 200x; B. Ovális sejt lécek (*), 400x. A kék festődés a

magokat jelzi.

B

A B

A

*

*

B

64

A matrilin-2 fehérje kifejeződése ez esetben erősen követte az OV-6 festődést. A

normál és PH- kezelt májakhoz hasonlóan az AAF/PH regenerációs modellben is

pozitív reakció jellemezte a portális tereket, amelynek intenzitása sokkal erősebb volt,

mint a hepatociták osztódásával történő májregeneráció során és a normál májban.

Továbbá matrilin-2 reakció volt megfigyelhető a szinuszoidok egy részében (a lebenyek

külső 2/3-ban) és az ovális sejt képződményekben, a duktuszokban. Míg a

májparenchyma centrális zónájában - amelyik területen ovális sejtek nem jelentek meg

– a matrilin-2 expressziója nem volt kimutatható (17. ábra).

17. ábra. A matrilin-2 immunhisztokémiai detektálása AAF/PH kezelt patkány

májakon. A. Erős pozitivitás látható a periportális területen, a proliferáló ovális

sejtek területén, a portális térben és a szinuszoidok külső 2/3-ában, 100x. B. Nincs

pozitív reakció a centrális vénában (CV) és a centrolobuláris régió

szinuszoidjaiban, 200x. C. Erős matrilin-2 expresszió detektálása a portális térben

(PT), 400x, AEC. D. Negatív kontroll, 100x. A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

C

PT

CV

B

D

A

65

Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a matrilin-2 expresszója hogyan követi a laminin

expresszióját, párhuzamos metszeteken minden esetben laminin immunreakciót is

végeztünk. A laminin expressziójának változását már előző kísérletekben leírták (Paku

és mtsai 2004). Ezen eredmények alapján feltételezhettük, hogy a matrilin-2

expressziója hasonló mintázatot mutat, mint a lamininé. Megfigyelhető volt a laminin és

a matrilin-2 koexpressziója (18. ábra).

18. Ábra. Laminin immunhisztokémiai detektálása AAF/PH kezelt patkány

májakon, paraffinba ágyazott metszeten. A. Erős pozitivitás látható a periportális

(nyilak) területen, a proliferáló ovális sejtek területén, a portális térben és a

lebenyke külső 2/3-ának a szinuszoidjaiban, 100x. B. Nincs pozitív reakció a

centrális vénában (CV, nyíl) és centrális szinuszoidokban, 200x, AEC.

D

B CV

A

66

5.2. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása AAF/PH kezelést követően Western

blot technikával

Azonos mennyiségű normál patkány, PH kezelt és AAF/PH kezelt patkány májszövet

homogenizátumot 4-8%-os poliakrilamid gélen futtatva igen jelentős eltéréseket

találtunk az AAF/PH kezelt májakban a normál májak matrilin-2 fehérje

expressziójához képest. Jelentős mennyiségű matrilin-2 volt detektálható az AAF/PH

kezelt májakban, míg a normál májakban illetve a PH-kezelt patkány májakban a

fehérje igen jelentéktelen mennyiségben volt jelen, vagy egyáltalán nem volt

kimutatható.

19. ábra. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása Western blot technikával. PH

kezelt máj (p), AAF/PH kezelt máj (a), kontroll máj homogenizátum (c), uterus,

pozitív kontroll (u); A. A gél Commassie-kékkel festett fehérjeképe. B. A

párhuzamos minták immunoblotja. A matrilin-2 monomer ~ 100kDa-nál

detektálható.

A máj homogenizátum Commassie-val visszafestett fehérjeképén jól látható, hogy a

különböző mintákból azonos mennyiségű fehérjét vittünk fel (19.A.ábra). Több

próbálkozás után a patkány májmintákból a detektált jel mindegyik mintában

megközelítőleg 100 kDa-nál volt látható, ez jól megegyezik a matrilin-2 monomer

A B

67

molsúlyával. Pozitív kontrollként a matrilin-2 fehérjében igen gazdag uterusból nyert

fehérje kivonatot használtuk. Ezzel többek közt az is volt a célunk, hogy ellenőrizzük az

általunk használt antitest specificitását, valamint azt, hogy a szérum felismeri-e a

redukálatlan uterus mintákban már régebben kimutatott oligomereket is (Piecha és mtsai

1999). A matrilin-2 sok más fehérjéhez hasonlóan, amelyekben van von Willebrand

Faktor modul, tartalmaz egy úgynevezett MIDAS motívumot (Metal Ion Dependent

Adhesion Site, fémionfüggő adhéziós hely), amely - nevéből adódóan - fémion kötésre

képes, és ezen keresztül más fehérjékhez kapcsolódhat. Ez a kölcsönhatás

megszüntethető volt azzal, hogy EDTA-t adtunk az extrakciós pufferbe. Az ureát

tartalmazó oldattal pedig megszüntettük az ionos kölcsönhatások nagy részét, illetve az

úgynevezett gyenge kölcsönhatásokat.

Az ábrán jól látható, hogy az uterus szövetkivonatból futtatott mintában a fő csík

elektroforetikus mobilitása a patkány mintákban található monomerrel azonosan fut. Az

uterus mintában látható, hogy a fehérjének több formája is létezik (a proteolízis

megakadályozására proteázgátlót, fenil-metil-szulfonil-fluoridot raktunk a pufferekbe,

ezért a csíkok nem lehetnek a vizsgálat során esetlegesen képződő fehérje-degradáció

melléktermékei). Az uterus kivonatban megjelenő többféle matrilin-2 oligomer

molsúlya megfelel a más szerzők által már azonosított méreteknek (Piecha és mtsai

2002; Korpos és mtsai 2005). Azonban a fehérjének ezeket a formáit a patkány májban

többszöri próbálkozás után és intenzív proteáz gátlás mellett sem sikerült azonosítani.

Azt hogy az oligomerek hiánya egy intenzív proteolitikus emésztés eredménye a

májban, vagy más folyamatok játszanak szerepet ebben a jelenségben, nem tudjuk.

A kísérletet AAF/PH kezelt májakon több egymást követő napon vett mintákból is

megismételtük (9., 11., 13., napokon) Pozitív kontrollként ez esetben patkány vesét

használtunk (20. ábra).

68

20. ábra. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása Western blot technikával. 1, 2, 3

normál májak; 4, 5, 6 - AAF/PH kezelt minták a PH-t követő 9, 11, és 13. napon

vett mintákból, 7- pozitív kontroll, vese. A matrilin-2 monomer csík ~ 100kDa-nál

detektálható. NK-negatív kontroll, az elsődleges antitest helyett blokkoló pufferrel

inkubáltuk.

A Western blottal az eltérő napokon vett mintákból nem volt kimutatható eltérés a

matrilin-2 fehérje mennyiségében. A Western blottal nyert eredmények alátámasztották

az immunhisztokémiával nyert eredményeket: a matrilin-2 fehérje nagy mennyiségben

detektálható az ovális sejtek proliferációjával történő májregeneráció során, míg a

normál májban és a hepatociták részvételével történő májregenerációban nem, vagy

csak alig mutatható ki.

5. 3. Matrilin-2-t termelő sejtek detektálása májregenerációban

A fehérjeexpresszió vizsgálatára irányuló kísérleteink azt sugallták, hogy az AAF/PH

májregenerációs modellben az ovális sejtek proliferációval történő regeneráció során

sokkal kifejezettebb a matrilin-2 fehérje expresszió, mint a hepatociták regenerációja

69

során a PH modellben illetve a normál kezeletlen májakban. Ennek alapján az volt a

célunk, hogy megvizsgáljuk milyen sejtek termelhetik a megemelkedett matrilin-2

fehérjét a májregeneráció során, és megvizsgáljuk, hogy van-e kimutathtaó eltérés

mRNS expressziós szinten a matrilin-2 termelésében a normál májban, és az AAF/PH

kezelt májakban. Mivel a PH-kezelt májak a normál májhoz hasonlóan viselkedtek a

Western blot analízis során, így ezzel a csoporttal mRNS szinten nem foglalkoztunk.

A matrilin-2 fehérjét termelő sejtek azonosítását nem radioaktív in situ hibridizációval

végeztük és a reakciót alkalikus foszfatáz-rendszerrel detektáltuk. Az in situ

hibridizációs kísérletek alapján az intenzíven pozitív jelnek értékelhető indigókék

reakciót csak az ovális sejtek citoplazmájában láttunk, míg az érett hepatociták nem

mutattak pozitivitást (21. ábra). Ennek alapján úgy tűnik, hogy az ovális sejtek termelik

és szekretálják a matrilin-2-t az őket burkoló BM-ba, amely a proliferáció során

képződő „ovális-sejt léceket” veszi körül. Feltételezhető, hogy a matrilin-2-nek fontos

szerepe lehet az ovális sejtek indukálta májregenerációban. Az in situ hibridizáció során

kapott eredmény az immunhisztokémia és Western blot eredményeinket is

alátámasztja.

21. ábra. A, B. Matrilin-2 mRNS detektálása ovális sejtekben in situ

hibridizációval. A periportális területen jól láthatók az indigókék reakciót mutató

ovális sejt duktuszok (nyíl), PT-portális traktus. A 200x; B 400x.

*

B

PT

A

PT

70

5.4. Matrilin-2 expresszió vizsgálata real-time RT-PCR analízissel

Annak igazolására, hogy a matrilin-2-t valóban az ovális sejtek termelik a SE II.

Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratóriumában (dr Molnár Béla vezetésével) ovális

sejteket és hepatocitákat disszekáltunk lézer mikrodisszekcióval. Az ovális sejteket az

AAF/PH kezelést követően a 13. napon vett májmintákból disszekáltuk. Az ún. „régi”

hepatocitákat normál kezeletlen patkány májból izoláltuk, illetve az „új” hepatocitákat a

PH műtétet követő regeneráció során képződött érett hepatocitákból nyertük. 3-3

párhuzamos mintával végeztük el a kísérletet. A real-time RT-PCR-el kapott adatok

alapján egyik hepatocita frakcióban sem volt detektálható a matrilin-2 expressziója

mRNS szinten (a matrilin-2 mRNS a 40. ciklusnál sem volt detektálható). mRNS

expressziót csak az ovális sejtekben detektáltunk. A mikrodisszekció az ovális sejtekben

gazdagon proliferáló periportális területről történt. A sejtek eredetét AFP (ovális -sejt

marker) expresszió detektálásával igazoltuk. A PCR reakció eredménye is az in situ

hibridizációval nyert eredményeket támasztja alá, miszerint detektáható matrilin-2

mRNS expresszió csak az ovális sejtekben volt.

22. ábra. Az RT-PCR reakció termékek futtatása 2%-os agaróz gélen. Matrilin-2

(Matn2) mRNS detektálható az ovális sejtekben (1), nincs matrilin-2 PCR termék

a „régi hepatocitákban”(2) és az „új hepatocitákban”. (3). A GAPDH (1, 2, 3) belső

kontrollként szerepelt. L – 100 bp DNS létra.

100 bp

71

5. 5. Matrilin-2 expresszió vizsgálata humán májban

5.5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata ép és cirrhotikus humán

májszövetben immunhisztokémiai módszerrel

35 sebészileg rezekált tumormintából és azok megfelelő környező szövetéből nyert,

formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszeteken végeztük el az „Anyagok és

módszerek” fejezetben leírtaknak megfelelően az immunhisztokémiai reakciókat.

Minden általunk vizsgálatra kiválasztott normál máj HE metszetén a máj szerkezetére

jellemző normál méretű portális tér, fibrosismentes szerkezet volt látható.

A normál májban (23. ábra) illetve a tumor melletti nem cirrhotikus májszövetben a

matrilin-2 csak a portális térben, az erek és az epeutak BM-jában mutatott erősen pozitív

reakciót. Nem volt azonban kimutatható matrilin-2 fehérje expresszió sem a centrális

vénák körül, sem pedig a szinuszoidokban és hepatocitákban sem. Ezek az eredmények

megegyeznek a patkány normál májmintákban kapott immunhisztokémiai

eredményekkel.

23. ábra. A, B. Matrilin-2 immunhisztokémiai reakció normál májban. A matrilin-

2 festődés jól látható a portális erekben (nyíl) és az epeutakat körülvéve (nyílhegy).

A szinuszoidokban nem látható pozitív reakció. A 200x, B 600x, AEC.

A HCC-k, melyekből a mintavétel történt, 42, 8 %-a cirrhotikus talajon alakult ki. A

tumor környéki cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 expressszió fokozott mértékben

BA

PT

PT

72

volt jelen a cirrhotikus nodulusok széli részén, a szinuszoidok mentén. Különösen erős

pozitív reakciót észleltünk a cirrhosisra jellemző kötőszöveti sövényekben, az itt

előforduló erekben és a proliferáló epeutak BM zónájában (24. ábra).

24. ábra. A. Negatív matrilin-2 immunfestés a tumor melletti nem cirrhotikus

szövet acinusaiban, pozitivitás csak a tumor-máj határ kötőszövetében

detektálható, elsősorban az erekben (nyíl) 400x. B. Intenzív matrilin-2 pozitív

reakció a tumor melletti cirrhotikus szövetben, az erekben és a májszinuszoidok

mentén (nyilak), 200x. C. Intenzív matrilin-2 reakció a cirrhotikus kötőszöveti

sövényekben (nyíl), 100x; D. Matrilin-2 reakció cirrhotikus szinuszoidokban

(nyilak) 600x, AEC.

5.5.2. Matrilin-2 fehérje expressziójának vizsgálata hepatocelluláris carcinomában

Az általunk vizsgált, morfológiailag jól differenciált tumorok (G1, grade1) trabekuláris

növekedési mintázatot mutattak. A tumorsejtekre jellemző volt a pleiomorfizmus eltérő,

bár viszonylag enyhe foka. A kevésbé differencált (G2, grade 2) tumorokban a

D

B

C

A

73

daganatsejtekre az acináris, tubulo-acináris szerkezet volt jellemző. Mindegyik

szövetminta tartalmazott ép vagy cirrhotikus peritumorális májszövetet

összehasonlításként. A 35 vizsgált esetből 15 eset cirrhotikus talajon kialakult HCC

volt. A további 20 esetben a tumort környező szövet ép volt vagy enyhe fibrosis

jellemezte. Nodulusok képződése, duktuláris reakció nem volt megfigyelhető ezekben

az esetekben.

Az immunhisztokémiával detektált matrilin-2 megjelenési mintázata a HCC-ben

jelentősen eltért a normál májszövetéhez képest. Igen intenzív matrilin-2 fehérje

expresszió volt megfigyelhető az újonnan képződő az erek BM zónájában, a tumor

neovaszkulatúra mentén. A tumorok differenciáltsági fok szerint nem mutattak eltérést.

A makrotrabekuláris egységekben azonban nem jelent meg matrilin-2 a tumor sejteket

kísérve, hasonlóan a normális máj trabekuláihoz.

*

25. ábra. Matrilin-2 lokalizációja jól és gyengén differenciált tumorokban (nyíl). A.

Heterogén tumor, (*) jól differenciált (G1), (**) mérsékelten (G2) differenciált

területek a HCC-ben. A jól differenciált tumorsejtek trabekuláit matrilin-2

expresszió kíséri (nyíl), a rosszabbul differenciált területeken a nagyobb tumorsejt

csoportokon belül, az egyes sejtek környezetében nincs matrilin-2 expresszió, 200x.

B. Rosszul differenciált tumorban matrilin-2 expresszió csak a

neovaszkulatúrának megfelelően detektálható (G3), 200x.

A matrilin-2 neovaszkuláris BM-ban történő lokalizációjának a megerősítése végett

elemeztük a CD34, mint endothel markert ezeken a tumor mintákon. A CD34

lokalizációban nagy mértékű hasonlóságot mutatott a matrilin-2 expressziójával a HCC-

ben (26. ábra)

* **

A B

74

26. ábra. Immunhisztokémiai reakció trabekuláris (G1) HCC-ben. (A) Matrilin-2,

AEC. (B) CD34 (DAB), 200x. A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

5.5.3. A laminin és matrilin-2 kolokalizációjának vizsgálata humán májszövetben

Az irodalmi leírásoknak megfelelően a matrilin-2 különböző struktúrák BM-jában

lokalizálódik és több helyen is kolokalizációt mutatott a lamininnal, például bőrben

(Piecha és mtsai 1999, 2002 a, b). Ezért fontosnak tartottuk, hogy megvizsgáljuk,

hogyan viszonyul a matrilin-2 és a laminin lokalizációja egymáshoz normál májban,

cirrhotikus májban, valamint hepatocelluláris carcinomában.

A 27. ábra a laminin immunhisztokémiai reakcióját mutatja be cirrhotikus májban. A

párhuzamos metszeteken jól látható, hogy a matrilin-2 és a laminin egyes részeken

kolokalizálódik. A részleges kolokalizációt paraffinos metszeten kettős

immunfluoreszcenciával is igazoltuk.

A B

75

27. ábra. Immunhisztokémiai reakció paraffinba ágyazott metszeten. Matrilin-2

(A) és laminin (B) expresszió cirrhotikus nodulusban, 200 x, AEC. C. Laminin és

matrilin kettős immunfloureszcencia (C, D). Zöld-matrilin-2, piros-laminin; sárga-

kolokalizáció, C 200x, D 400x.

5.5.4. Matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése és

statisztikai analízise

Az immunhisztokémiai reakciók morfometriai értékelése során a matrilin-2 pozitív

területek eloszlására százalékos arányban a következő eredményeket kaptuk: 0,57 % a

normál májakra, 0,59 % a környező nem cirrhotikus májakra, 3,97 % a cirrhotikus

környező májakra, 4,26 % a cirrhotikus talajon képződött HCC-re és 3,03 % a nem

cirrhotikus talajon képződött HCC-re vonatkoztatva. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy

szignifikánsan több matrilin-2 fehérje volt detektálható a HCC-ben és a cirrhotikus

májakban, mint a nem cirrhotikus környező májakban és az ép szövetekben ( p< 0.0001)

(28. ábra). A cirrhotikus talajon kialakult HCC-k és a nem cirrhotikus talajon képződött

D C

A B

76

HCC-k matrilin-2 fehérje expressziója között nem volt szignifikáns eltérés. Továbbá, a

jól – és közepesen differenciált tumorok sem mutattak szignifikáns eltérést a fehérje

expressziójában a rosszul differenciált tumorokhoz képest. A tumorok

differenciáltságának megfelelően az immunpozitív területek százalékos eloszlására a

következő értékeket kaptuk 3, 78 % G1, 4,62% G2 , 4,33 % a G3 HCC-re ( 29. ábra).

28. ábra. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók során mért intenzitások

összehasonlítása normál májban, cirrhotikus májban és HCC-ben. NORM =

normál máj; NCIRRH = környező nem-tumoros, nem cirrhotikus májszövet;

CIRRH = környező nem tumoros, cirrhotikus máj; HCC (ncirrh) = nem

cirrhotikus talajon kifejlődött HCC; HCC (cirrh) = cirrhotikus talajon létrejött

HCC. A * a csoportok közötti szignifikáns eltérést jelöli. Az immunhisztokémiai

reakciók analízise a Leica Qwin Pro programmal történt, az adatokat a GrapPad

Prism 2.01 programmal értékeltük ki.

77

29. ábra. Különböző differenciáltsági fokú tumorok matrilin-2 immunhisztokémiai

reakcióinak összehasonlítása (G1= grade 1, jól differenciált, G2 = grade 2,

közepesen differenciált, G3 = grade 3, rosszul differenciált tumor). Az

immunhisztokémiai reakciók analízise a Leica Qwin Pro programmal történt, az

adatokat a GraphPad Prism 2.01 programmal értékeltük ki.

5.5.5. Matrilin-2 fehérjeexpresszió vizsgálata Western blot technikával humán

májakon

Azonos mennyiségű normál májból, cirrhosis talaján létrejött HCC-ből, nem cirrhotikus

HCC-ből és ezeknek megfelelő nem tumoros környezetből nyert fehérje kivonatot

futtattunk 4-12%-os SDS poliakrilamid grádiens gélen, majd blottoltuk az „ Anyag és

módszer” fejezetben leírtaknak megfelelően.

A Western blot detektálás eredménye megerősítette a patkány májban nyert

eredményeinket. A pozitív jelet minden mintában kb 95 kDa – nál észleltük. Ez a

mobilitás és a molekulatömeg megfelel a már leírt matrilin-2 monomernek (~100 kDa).

Hasonló eredményre jutottunk a patkány májak esetében is. A humán májak futtatásánál

pozitív kontrollként matrilin-2-ben igen gazdag humán veséből származó

78

fehérjekivonatot használtunk (30. ábra). Az ábrán jól látható, hogy a matrilin-2 fehérjére

jellemző nagyobb molekulasúlyú oligomer frakció is jelen volt a humán májakban. A

patkány májakban, ezt nem tapasztaltuk, ott csak a matrilin-2 monomert tudtuk

detektálni. Noha ez esetben is ez az oligomer frakció a monomer frakcióhoz képest

elenyésző intenzitású volt és az immunoblot képen alig látható. Megfigyelhető, hogy a

normál humán májban és a tumoros májakban az általunk alkalmazott módszerrel

hasonló intenzitású és azonos mennyiségű matrilin-2 fehérje volt detektálható.

30. ábra. Humán májminták matrilin-2 protein tartalmának összehasonlítása

immunoblot analízis során nyert eredmények alapján. N – normál májból

származó minta; 1 – nem cirrhotikus talajon kialakult HCC-ből származó minta;

2-cirrhotikus talajon létrejött HCC minta; 3 – nem cirrotikus, nem tumoros

környező szövet; 4 – cirrhotikus környező szövet, C- pozitív kontroll, humán vese.

5.5.6. Matrilin-2 mRNS expressziójának real-time RT-PCR analízise humán

májmintákon

A matrilin-2 mRNS expressziót az eddigiekhez hasonlóan humán májmintákban is real-

time RT-PCR módszerrel vizsgáltuk. Olvadáspont analízissel, illetve 2%-os agaróz

gélen történt futtatással ellenőriztük a termékeket.

79

Amint azt már az „Anyagok és módszer” fejezetben írtam, a real-time RT- PCR-rel

kapott adatokat egy relatív kvantifikációra alkalmas program segítségével értékeltük ki.

Ebben a programban az általunk választott GAPDH kontrollgén Ct értékeit a referencia

gén adatainak fenntartott helyre illesztettük be és a kiértékelésnél minden esetben két

csoportot hasonlítottunk össze egymással. A 11. táblázatban a kontroll csoport

elnevezés arra a mintacsoportra vonatkozik, amelyikhez a másik csoportot

hasonlítottuk. (Így például a 11. táblázat 1. sora azt mutatja meg, hogy a cirrhotikus

talajon létrejött HCC-ben a matrilin-2 mRNS expressziója hányszorosára változott a

normál minták esetén tapasztalt értékekhez képest).

A 11. táblázat összefoglalja a real-time RT-PCR eredményeit valamennyi általunk

vizsgált csoportra vonatkoztatva. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az egyes

csoportokban jelentősebb, szignifikánsnak mondható mRNS expressziós eltérés a

normál májakhoz képest nem volt detektálható (31. ábra).

Összehasonlítottuk a HCV vírussal fertőzött környező cirrhotikus májak matrilin-2

expresszióját a nem fertőzött környező cirrhotikus májak matrilin-2 expressziójával. A

két csoport között csak jelentéktelen, szignifikánsnak nem mondható eltérést

detektáltunk. A HCV-vel nem fertőzött cirrhotikus májakban a matrilin-2 expressziója

alacsonyabb volt a HCV-vel fertőzött májakhoz képest.

11. táblázat. A matrilin-2 mRNS relatív expressziója real-time RT-PCR-el

detektált Ct értékek alapján. MINTA

CSOPORT KONTROLL CSOPORT

MATRILIN-2 RELATÍV EXPRESSZIÓ

NORM CIRRH(HCC) U 1,21 NS p= 0,756

NORM NCIRRH(HCC) U 1,39 NS p= 0,245

NORM HCC(cirrh) U 1,91 NS p= 0,213

NORM HCC(ncirrh) U 1,55 NS p= 0,245

HCC(cirrh) HCC(ncirrh) D 1,34 NS p= 0,715

CIRRH HCC(cirrh) D 2,32 NS p= 0,415

NCIRRH HCC(ncirrh) U 1,21 NS p= 0,654

HCV(+)cirrh HCV(-)cirrh D 1,14 NS p= 0,785

Magyarázat: A félkövérrel szedett oszlopban feltüntetett csoportok a vizsgálni

kívánt minta csoportot jelentik, amelyet a kontrollként vett csoportokhoz

80

hasonlítottunk (a táblázat 1. oszlopa). U-up-regulált, D-down-regulált relatív

expressziót jelent, NS - nem szignifikáns; NORM - normál máj, HCC -

hepatocelluláris carcinoma, CIRR (HCC) - cirrhotikus talajon létrejött HCC

tumormentes környezete, NCIRRH (HCC) – nem cirrhotikus talajon kifejlődött

HCC tumormentes környezete; HCC (cirrh)-cirrhotikus talajon létrejött HCC;

HCC (ncirrh)- nem cirrhotikus talajon kifejlődött HCC.

31. ábra. A matrilin-2 mRNS relatív expresszióját ábrázoló diagram. A különböző

színnel jelölt csoportok megegyeznek a 11. táblázatban feltüntetett csoportokkal. A

csoportok matrilin-2 mRNS expressziója között nincs szignifikáns eltérés.

-2,5-2

-1,5-1

-0,50

0,51

1,52

1

Matriln-2 mRNS expresszió

NORM CIRRH(HCC)

NORM NCIRRH(HCC)

NORM HCC(cirrh)

NORM HCC(ncirrh)

HCC( cirrh) HCC(ncirrh)

CIRRH HCC(cirrh)

NCIRRH HCC(ncirrh)

HCV(+)cirrh HCV(-)cirrh

MATRILIN-2 mRNS expresszió

81

6. MEGBESZÉLÉS

Az elmúlt évtizedben a normális és kóros szöveti működés sejten belüli eseményeinek

vizsgálata mellett egyre inkább hangsúlyt kaptak azok a kutatások, amelyek a szöveti

kötelék szerves részét képező ECM-re és sejtfelszíni molekulákra irányulnak. Számos

kutatás tárgya a stroma – daganatos sejt kapcsolat, valamint azok mennyiségi, minőségi

változásai összefüggéseinek a vizsgálata.

Munkámban egy nemrégiben felfedezett ECM fehérje, a matrilin-2 expresszióját

tanulmányoztam májszövetben, valamint próbáltam választ keresni arra, hogy mint az

ECM alkotóelemének és a BM komponensének, ennek a fehérjének lehet-e szerepe

kísérletileg indukált májregenerációban, illetve cirrhosisban és HCC-ben.

A tumorok heterogének lehetnek mind a vaszkularizáció mértékében, mind pedig a

stroma jellegében és bizonyos anyagok termelésében egyaránt, többek közt a mátrix

termelésében is. Mivel a daganatok ECM-je különböző módon befolyásolhatja egy

tumor biológiai viselkedését, egyre több olyan irodalmi adat jelenik meg, melyek szerint

bizonyos mátrix komponensek fokozott vagy kóros expressziója rosszabb prognózist

jelenthet (Xiong és mtsai 2006). Szinte minden mátrix fehérje képes a tumoros sejtek

biológiai viselkedésének a befolyásolására.

Matrilin-2 expresszió regenerálódó májban

Jelen tanulmány során a matrilin-2 expresszióját vizsgáltuk normál májakban és

májregenerációs modelleken. Kísérleteinkben ezen újonnan felfedezett mátrix fehérje

csak nagyon kis mennyiségben volt kimutatható a normál patkány májban és a parciális

hepatectomiát követő májregeneráció során. Immunhisztokémiai vizsgálatokkal

kizárólag a portális tér ereiben illetve az epeutak BM zónájában, valamint az ezt

körülvevő kötőszöveti rétegben volt kimutatható matrilin-2 expresszió.

Az ovális sejt indukálta májregenerációban az ovális sejteket magába ágyazó ECM BM

zónájában volt kimutathaó jelentősen megemelkedett matrilin-2 expresszió a normál

májakhoz képest. Ezt mind immunhisztokémiai módszerrel mind Western blot

technikával sikerült igazolni.

82

Kísérleteinkben in situ hibridizációval kimutattuk az mRNS expressziót az ovális sejtek

citoplazmájában. Érett hepatocitákban a matrilin-2 mRNS expressziója nem volt

detektálható. Lézer mikrodisszekcióval disszekált ovális sejtekből és hepatocitákból

tisztított RNS-el végzett PCR kísérletek is alátámasztották az in situ hibridizáció

eredményeit. Ezek birtokában feltételezhető, hogy májregenerációban a vizsgált

modellben, az ECM-ben lezajló változások során a matriln-2-t elsődlegesen termelő

sejtek az ovális sejtek lehetnek.

Ahogyan azt már a bevezetőben is írtam, a matrilin fehérjéket számos szövetben

azonosították (Deák és mtsai 1999, Wagener és mtsai 2005). A matrilin-2–t elsősorban

BM-hoz asszociálva találták meg különböző szervekben (Piecha és mtsai 1999, Segat és

mtsai 2000, Mátés és mtsai 2004, Korpos és mtsai 2005). Az ovális sejt indukálta

májregenerációban különös jelentőséggel bír a BM. A differenciált májsejtekre nem

jellemző a BM. Ezzel szemben a differenciálatlan ovális sejtek BM-on ülnek. A

differenciálódás során ez a struktúra eltűnik (Paku és mtsai 2001). Kísérletileg

igazolták, hogy egy anti-BM ellenes antitest az ovális sejtek igen gyors

differenciálódását idézi elő (Paku és mtsai 2004). Az ECM komponensei intenzíven

termelődnek a regenerálódó májban, ugyanis az ECM normál struktúrája

nélkülözhetetlen a hepatociták differenciált funkciójához. Úgy tűnik, elsősorban a BM

komponenseket tartalmazó mátrix és bizonyos glikoproteinek azok, melyek jelenléte

szükséges ezekhez a folyamatokhoz. Így a laminin és a vele kölcsönható molekulák

jöhetnek először számításba, közöttük lehet a matrilin-2 is (Gressner 1988). A laminin,

ahogy azt már igazolták, kulcsfontosságúnak bizonyult a differenciálódó ovális sejt-

lécek mentén az újonnan formálódó BM-ban (Paku és mtsai 2004). Kísérleteinkben a

matrilin-2 mintázat hasonló lokalizációt mutatott a májregeneráció során a

lamininéhoz, ennek alapján feltételezhető, hogy a matrilin-2 a lamininhez hasonlóan

igen fontos szerepet tölthet be az ECM alakulásában a regeneráció során.

Az ovális sejtek differenciálódását gátló és indukáló mechanizmusok az ECM

komponensei közötti kölcsönhatásukat illetően még nem teljesen ismertek. Az arra

vonatkozó adatok, hogy a regeneráció során egészen pontosan mikor, melyik fázisban

jelennek meg az egyes ECM komponensek még hiányosak. Nemrégiben igazolták egy

kötőszöveti növekedési faktorról, (CTGF = connective tissue growth factor), hogy

83

stimulálja az ECM termelését és kíséletesen indukált májregenerációban számos májsejt

expresszálja, többek közt a máj csillag sejtek és epitheliális sejtek is (Sedlaczek és mtsai

2001). AAF/PH indukált májregenerációs modellben pedig az ovális sejtekben fokozott

expresszióját mérték ennek a növekedési faktornak; továbbá a CTGF up-reguláció

gátlása az ovális sejtek számának szignifikáns csökkenéséhez vezetett. Ez a jelenség is a

kötőszövet igen fontos szerepét támasztja alá az ovális sejtekkel történő

májregenerációban (Pi és mtsai 2005). Feltehető, hogy többek közt ennek a faktornak is

szerepe lehet a matrilin-2 expresszióját fokozó szignalizációs kaszkádban.

Kísérleteink alapján normál patkány májban nem volt kimutatható matrilin-2 expresszió

a centrális vénákban, a szinuszoidokban, és nagyon gyenge expressziót mutatott az

epeutak BM-jában, míg az ovális sejtekkel történő regeneráció során a matrilin-2

expressziója igen intenzív, a szinuszoidok mentén a portális areában, míg a

centrolobuláris régió felé az expresszió eltűnik és a centrális vénákban nem

detektálható a matrilin-2. Ez a matrilin-2-nek a májregeneráció korai szakaszában

betöltött szerepét sejteti.

Az eddig leírtaknak megfelelően (lásd Bevezetés) a máj csillagsejtek lehetnek az ECM-

et felépítő molekulák fő forrásai (Martinez -Hernandez és mtsai 1995, Bedossa és

Paradis 2003). Noha egyre több sejt kap szerepet a máj ECM komponenseinek a

termelésében, még mai napig sem tisztázott teljesen, hogy egyes mátrix komponenseket

milyen sejtek termelnek (lásd Bevezető). Ahogyan már említettem, eredményeink

alapján a matrilin-2–t a regenerálódó májban az ovális sejtek csoportja termelheti. Az a

kérdés, hogy milyen más sejtek, így elsősorban a csillagsejtek, fibroblastok milyen

körülmények között, milyen arányban termelhetnek matrilin-2-t (pl. cirrhosisban)

további vizsgálatok tárgya.

Igazolták, hogy matrilin-2 mRNS expresszió kimutatható hámsejtekben, de a fehérje

expresszió csak szubepitheliális szövetekben volt kimutatható. Patkány bőrben a

dermisz felső rétegében, az erekben és az idegekben volt detektálható (Piecha és mtsai

1999). Humán bőrben in situ hibridizációval keratinocytákban és fibroblastokban is

sikerült matrilin-2 mRNS-t detektálni. A matrilin-2 fehérje termelésének mechanizmusa

és transzportja a BM-on kersztül a stromába pontosan nem ismert, de feltehetőleg a

matrilin-2-vel specifikusan kölcsönható molekulák biztosítják a fehérje transzportját a

84

kötőszöveti stroma irányába és a BM-ban lévő specifikus kötő ligandjai eredményezik a

depozicióját a BM-ba (Piecha és mtsai 2002 a).

A vWFA-szerű doménjének köszönhetően a matrilin-2 a kollegénekkel,

proteoglikánokkal, a laminin család tagjaival és egyéb ECM komponensekkel is

kölcsönhatásba lép, de makromolekuláris kölcsönhatások révén szerepe van az ECM

molekulák összeszerelésében, a kollagén fibrilláris hálózat képzésében is (Piecha és

mtsai 2002 b, Mátés és mtsai 2002). A matrilin-2 vWFA doménje révén erősen kötődik

a kollagén rostokhoz, esetleg azok integráns része, bőrben kolokalizációt mutat a

kollagénnel és szilárd fázisú vizsgálatokban kölcsönhatásba lép a fibrilláris

kollagénekkel, fibrillinekkel, fibronektinnel, laminin-nidogén komplexszel (Piecha és

mtsai 2002 a, b). Ezen ismeretek birtokában feltételezhető, hogy a matrilin-2 a normális

májban a portális terület mátrixot alkotó fibrilláris hálózat kialakításában vehet részt,

ahol a kollagén makromolekuláris szerveződését segítheti. A regenerálódó májban ettől

némileg eltérő szerepe lehet. Az eredményeink azt sugallják, hogy a matrilin-2 a

regenerálódó májban az elsőként termelődő ECM komponensek között lehet.

Feltételezhető, hogy a matrilin-2-re, mint az elsők között megjelenő BM komponensre a

laminin, a kollagének, és más molekulák együttes szerveződésében lehet szükség, amely

a májregenerációban a proliferáló ovális sejtek differenciálatlan állapotának a

fenntartásában alapvető szerepet játszhat. A matrilin-2 pontos funkciójának kérdése

azonban a májregeneráció során még további tisztázásra vár.

A szarvas agancsban, mely egy különlegesen csontosodó szerv, modellje a

csontregenerációnak, emlősökben az egyetlen eset, amikor egy teljes szerv

regenerálódik, vizsgálták a matrilin fehérjék expressziójának változását. Ebben a

differenciálódási rendszerben, is a matrilin-2-t igen intenzíven osztódó, még nem

teljesen differenciálódott sejtek markereként azonosították. Emelt protein expressziós

szinten fejeződött ki mesenchyma sejtekben, előporcban és preosteoblastokban. Ezek az

eredmények szolgáltatták az első bizonyítékait annak, hogy a matrilin-2 különböző

szövetek differenciálatlan sejtjeiben is kifejeződik (Segat és mtsai 2000, Korpos és

mtsai 2005). Újabban pedig cornea-limbalis stem sejtekben mutattak ki matrilin-2

expressziót, nidogénnel és agrinnal párhuzamosan (Schlötzer-Schrehardt és mtsai 2007).

85

A matrilin-2 expressziója humán májban

A munkának ebben a részében a matrilin-2 exressziójával foglalkoztunk normál májban,

májcirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában.

Vizsgálataink során a matrilin-2 a humán normál máj portális terében, így az epeutak

BM-jában, a portális artériák, és vénák BM-jában volt erős intenzitással kimutatható,

míg a centrális vénában a matrilin-2 immunohisztokémiai módszerrel nem volt

detektálható. A normál máj szinuszoidjaiban sem volt detektálható a matrilin-2

expressszió. A cirrhotikus májban a matrilin-2 fehérje expressziója jelentős mértékben

volt kimutatható a szinuszoidokban. A HCC-ben a matrilin-2 a neovaszkularizáció BM-

jai mentén figyelhető meg. A tumorban a vaszkularizáció során kialakuló erek

biztosítják a tumor tápanyagellátását. A matrilin-2 neovaszkuláris BM lokalizációjának

megerősítésére CD34-ellenes antitesttel végzett immunreakció, mint az endothel

expressziós markere, részben kolokalizációt mutatott a matrilin-2-vel. Noha a matrilin-2

a májrákok neovaszkulaturáját kirajzolva jelenik meg tumorokban, az eltérő

differenciáltságú tumorok matrilin-2 fehérje expressziója között nem volt

szignifikánsnak mondható eltérés. Az utóbbi években derült fény arra, hogy a

daganatos kapillárisok szerkezete eltérő, ennek alapján több BM komponensről

igazolódott, hogy kevésbé differenciált tumorokban eltűnik illetve fragmentálódik,

amely a BM fellazulásával is jár. A szinuszoidális kapillarizáció a tumor

dedifferenciálódása során történik. A tumorsejtek progresszív dedifferenciálódásával,

atipikussá válnak az ECM termelésére, ezáltal a tumorok metasztázis képző hajlamát

növelve (Giannelli és mtsai 2003). A munkacsoportunk által vizsgált agrinról is ez

igazolódott (Kovalszky és matsai 2004, Batmunkh és mtsai 2007). Az hogy a matrilin-2

fehérje expressziója nem mutat jelentősebb mennyiségbeli eltérést az eltérő

differenciáltságú tumorok és a cirrhosis között, azt jelentheti, hogy ez a fehérje már a

cirrhosis során megjelenik és nincs különösebb jelentősége a tumor kialakulásában,

illetve prognózisában. Az is érdekes jelenség, hogy a matrilin-2 expressziójában az

eltérő talajon (cirrhotikus és nem cirrhotikus) kialakult HCC-k között sincs lényeges

86

különbség. Az irodalomból ugyanis ismeretes, hogy a májrákokat befolyásolja, hogy a

tumor cirrhotikus vagy nem cirrhotikus májban alakul ki. Így egyes stroma

komponensek is eltérhetnek az eltérő talajú tumorokban, pl. a syndecan, a decorin és a

már említett agrin expresszióját nem befolyásolja a cirrhosis jelenléte, míg pl. a

glipican-3 expressziójának fokozódása figyelhető meg cirrhosishoz társult tumorokban

(Kovalszky és mtsai 2004). A matrilin-2 expresszióját feltehetőleg nem befolyásolja

nagy mértékben a cirrhosis jelenléte tumorban.

Mindenestre felsorolt eredményeink alátámasztják azt a tényt, miszerint a matrilin-2 az

eddigi irodalmi adatoknak megfelelően elsősorban a BM struktúrákban volt

detektálható (Piecha és mtsai 1999, 2002, Schlötzer-Schrehardt és mtsai 2007),

májrákokban is ezt találtuk.

Számos közlemény született bizonyos BM-t alkotó, ECM komponensek szerepéről a

fibrogenezisben és a különböző tumorok patogenezisében, többek közt a HCC-ben is.

Így például a kollagén IV, a laminin és az integrinek fokozott expresszióját írták le

cirrhotikus májban és HCC-ben (Kin és mtsai 1994). A COMP (oligomer porc mátrix

fehérje) fokozott expresszióját írták le HCC-ben. Erről a fehérjéről ismertették, hogy a

matrilinekkel szerkezeti hasonlóságot mutat és makromolekuláris kölcsönhatásban áll

velük (Xiao és mtsai 2004). A lamininnel és matrilin-2-vel párhuzamos metszeteken

végzett immunhisztokémiai reakciókkal kimutattuk, hogy ezek a fehérjék részben

kolokalizálódnak. Ez is igazolja, hogy a matrilin-2 a lamininhez hasonlóan egy BM

komponens és a lamininhez, valamint más ECM molekulákhoz hasonlóan a

„kapillarizáció” során felszaporodik a cirrhotikus máj szinuszoidjaiban (Kovalszky

2006).

Immunoblottal a matrilin-2 monomert kb 100 kDa-nál detektáltuk, mind a humán, mind

a patkány májak esetében. A nagyobb molekulasúlyú dimer-, és oligomer frakciónak

megfelelő fehérje a patkány májakban nem volt kimutatható, míg minden humán májban

csekély mennyiségben ugyan, de jelen volt ez a frakció is. Eddigi közleményekben

publikált Western blot kísérletek során kapott adatok a matrilin-2-t kimutatták dimer és

oligomer formában is (Piecha és mtsai 2002, Korpos és mtsai 2005). Annak, hogy saját

eredményeink nem ezt mutatták, több oka lehet: a májban olyan intenzív proteolitikus

hasítása történik a fehérjének, hogy csak a monomer formája marad meg; de

87

elképzelhető, hogy a májból csak a matrilin-2 oligomerek mutathatók ki, vagy a

fehérjének ez a formája van túlsúlyban a többihez képest.

Western blottal nem volt kimutatható mennyiségi eltérés a humán normál májban, a

cirrhotikus és nem cirrhotikus környező májakban valamint a HCC-ben. Ez

ellentmondásosnak tűnik az immunhisztokémiával nyert eredményekhez képest, amely

alapján a cirrhotikus májban és a tumorokban is megemelkedik a matrilin-2

mennyisége. A matrilin-2 monomer sávok intenzitásának hasonlósága a különböző

mintákban a cirrhotikus májban található fehérje nem megfelelő szolubilizációjával

magyarázható a normál máj és a nem cirrhotikus májakhoz képest. Egy másik

magyarázat lehetne erre az ellentmondásra, hogy a portális terek képleteinek BM-jai

igen nagy mennyiségű matrilin-2-t tartalmaznak. Az újonnan képződött szinuszoidok

BM-ja viszont relatíve az összmennyiséghez képest csekélyebb mennyiségben tartalmaz

matrilin-2-t. Bár immunhisztokémiával ez egyértelműen detektálható, de ez

mennyiségben elmarad a Western blottal mérhető összehasonlításban.

Összességében eredményeink alapján feltételezhető, hogy a matrilin-2 mind a

májregenerációban mind a kapillarizációban az elsők között megjelenő ECM

komponensként szerepelhet. Elképzelhető, hogy ezekben az esetekben is a már ismert

„adaptor” funkciója révén a mátrix átépítésében vesz részt más fehérjékkel együttes

kölcsönhatásban.

Eredményeink újabb kérdések sorozatát vetik fel:

1) Milyen molekulákkal együtt jelenik meg a matrilin-2 a májregenerációban és a

cirrhosisban, valamint a tumorokban ?

2) Milyen transzkripciós faktorok indukálják az expresszióját?

3) Milyen molekulák hatására csökken a matrilin-2 fehérje expressziója a májban és a

májregeneráció melyik fázisban következik ez be?

A matrilinek carcinogenezisben és fibrosisban betöltött szerepének precíz

tanulmányozása knock-out állatokon lehetséges. Ilyen irányú vizsgálatok már

folyamatban vannak.

88

7. KÖVETKEZTETÉSEK

1. A normál patkány májszövetben a matrilin-2 fehérje a portális terek

ereinek és epeútjainak BM-ban fordul elő, míg a májszinuszoidokban

a matrilin-2 expressziója nem mutatható ki.

2. Az ovális sejtekkel történő májregeneráció során patkányban a

matrilin-2 expresszió megnő a normál májban detektált expresszióhoz

képest és kimutatható a szinuszoidokban valamint az ovális sejt

képezte duktuszokban is. A matrilin-2 mRNS expresszióját az ovális

sejtekben az RT-PCR és az in situ hibridizáció is igazolta, tehát a

matrilin-2 termelésben az ovális sejtek részt vesznek, melyet elsőként

detektáltunk az irodalomban.

3. A matrilin-2 az ovális sejt duktuszok mentén kolokalizációt mutat a

lamininnal, tehát a lamininhoz hasonlóan fontos komponens lehet az

ECM-ben a májregeneráció során.

4. Humán májban elsőként mutattuk ki a matrilin-2 expressziót mind

mRNS, mind fehérje szinten.

5. Normál humán májban fehérje szinten a matrilin-2 az epeutak, a

portális tér ereinek BM zónájában detektálható, a szinuszoidok

mentén nem volt megfigyelhető matrilin-2 fehérje pozitivitás.

6. A cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 fehérje expressziót a

proliferáló epeutak és az erek BM zónájában, valamint a

szinuszoidokban azonosítottuk.

7. A hepatocellularis carcinomákban (HCC) erős matrilin-2 expresszió

figyelhető meg az újonnan képződött erek BM-jában, mely azonban

nem mutat szignifikáns eltérést a különböző differenciáltságú

tumorokban.

8. Az endothelt jellemző CD34 fehérje expresszió a HCC-ben részben

kolokalizál a matrilin-2 expresszióval.

89

8. ÖSSZEFOGLALÁS

A hepatocelluláris carcinoma (HCC) az egyik leggyakoribb malignus daganatok közé

sorolható a világon. A hepatociták malignus transzformációja olyan többlépcsős

folyamat eredménye, amelyben a daganat kialakulásához vezető genetikai elváltozások

mellett egyre jobban felismerjük a tumor extracelluláris mátrixának (ECM) jelentőségét,

mely cél-orientált terápia célpontja is lehet.

A mátrix biológia csak az utóbbi évtizedben fedezte fel a nem-kollagén szerkezetű ECM

fehérjékhez tartozó matrilin fehérjék családját. A matrilin fehérjék négy tagja közül a

matrilin-2 szöveti előfordulása a legszélesebb körű: számos szerv bazális membránjában

(BM) leírták jelenlétét. Amikor ebben az értekezésben ismertetett munka elkezdődött,

humán májjal kapcsolatos irodalmi adatok még nem voltak a matrilin-2-ről. Kutatásaink

legfőbb célkitűzése éppen ezért a matrilin-2 expressziójának tanulmányozása volt

májregenerációban, cirrhosisban és HCC-ben, figyelembe véve az ECM jelentőségét

ezen folyamatokban.

Kísérleteinkben tanulmányoztuk a matrilin-2 mRNS és fehérje expresszióját patkány

normál májban, parciális hepatectomiát követően hepatocitákkal történő, illetve ovális

sejtek indukálta májregenerációs kísérleti modelleken. Elsőként mutattuk ki, hogy az

ovális sejtekkel történő májregenerációban az ovális sejtek termelik a matrilin-2-t. Ezt

fehérje és mRNS szinten is igazoltuk, detektáltuk a matrilin-2 monomer formáját.

Humán májmintákon (35 HCC, 15 cirrhotikus, 20 nem cirrhotikus környező szövet) és

10 normál máj) a matrilin-2-t a normál máj portális tereiben, az epeutak és a portális

erek BM zónájában elsőként detektáltuk; a szinuszoidokban nem volt kimutatható

matrilin-2 fehérje expresszió. A cirrhotikus májak szinuszoidjaiban erős matrilin-2

fehérje expressziót mutattunk ki. A HCC-ben intenzív matrilin-2 fehérje expressziót

találtunk az erek mentén, amely a tumorok differenciáltsági fokával nem mutatott

összefüggést. Feltételezhető, hogy a matrilin-2 a májregenerációban az elsők között

megjelenő ECM komponensként szerepelhet. A fokozott matrilin-2 expresszió

cirrhosisban és a tumorokban e fehérjének a kapillarizációban és a

neovaszkularizációban betöltött szerepére utalhat. Elképzelhető, hogy ezekben az

esetekben is a már ismert „adaptor” funkciója révén a daganat mátrix átépítésében vesz

részt, más fehérjékkel együttes kölcsönhatásban.

90

9. SUMMARY

Hepatocellular carcinoma (HCC) is among the most common causes of cancer death

worldwide. The malignant transformatiormation of the hepatocytes is a longterm multistep

process, in which the genetic alterations and molecular changes in the extracellular matrix

(ECM) play role together in carcinogenesis and tumor progression.

The recently described matrilin protein family is part of the ECM, their pathophysiological

role as well as distribution in the liver have not yet been studied. Matrilin-2 displays a broad

tissue distribution and has been detected in basement membranes of other tissues. Considering

its role in cell growth and tissue remodeling we aimed to study the expression of matrilin-2

during liver regeneration, in normal human liver, HCC and surrounding cirrhotic liver.

Liver regeneration was induced in rats by partial hepatectomy (PH) and 2-

acetylaminofluorene (AAF)/partial hepatectomy (PH) in experimental models.

A total of 35 cases of surgically resected HCCs, 35 corresponding surrounding liver tissues

and 10 normal liver samples were used for the study of human tissues. The expression of

matrilin-2 was analyzed both at mRNA and protein levels. Matrilin-2 was detected in normal

rat liver and partially hepatectomized liver in the portal area, but could not be demonstrated in

the acini. In the AAF/PH model the oval cells but not the hepatocytes produced matrilin-2

mRNA. Increase in protein level in the AAF/PH regenerating liver model was demonstrated

by Western blotting. The protein was present in the basement membrane zone around the

tubules formed by oval cells.

In normal human liver matrilin-2 expression was detected in normal liver, portal blood

vessels, while sinusoids were negative. Cirrhotic surrounding tissues of HCCs showed

intensive matrilin-2 staining along the sinusoids. Tumorous neovasculature was found to be

strongly positive in HCCs. No differences, however, were detected by morphometry based on

the grade of HCC.

Taken together, our data show that among mesenchymal cells hepatic oval cells produce

matrilin-2, a novel ECM protein which appears during capillarization in liver cirrhosis and

hepatocarcinogenesis. Based on our findings, it is suggested that matrilin-2 is one of the

important components of ECM during stem cell-driven liver regeneration and is also

synthetised during the remodeling of the cirrhotic ECM and tumor stroma. Matrilin-2 as

putative adaptor protein might help other molecules for proper ECM assembly during the

reorganization of matrix.

91

10. IRODALOMJEGYZÉK

Aizawa Y, ShibamotoY, Takagi I, Zeniya M, Toda G. (2000) Analysis of factors affecting the

appearance of hepatocellular carcinoma in patients chronic hepatitis C. Cancer, 89: 53-59.

Alison M, Golding MH, Sarraf CE. (1996) Pluripotential liver stem cells: facultative stem

cells located in the biliary tree. Cell Prolif, 29: 373-402.

Alison M. (2005) Liver stem cells: implications for hepatocarcinogenesis. Stem Cell Rev, 1:

253-260.

Andrisani OM, Barnabas S. (1999) The transcriptional function of the hepatitis B virus X

protein and its role in hepatocarcinogenesis. Int J Oncol, 15: 373-379.

Argraves WS, Deák F, Sparks K, Kiss I, Goetinck PF. (1987) Structural features of cartilage

matrix protein deduced from cDNA. Proc Natl Acad Sci USA, 84: 464-468.

Arsura M, Cavin LG. Nuclear factor-kappa B and liver carcinogenesis. (2005) Cancer Lett,

229: 157-169.

Aszódi A, Bateman JF, Hirsch E, Baranyi M, Hunziker EB, Hauser N, Bösze Z, Fasller R.

(1999) Normal skeletal development of mice lacking matrilin1: redundant function of

matrilins in cartilage? Mol Cell Biol, 19: 7841-7845.

Aszódi A, Beier DR, Hiripi. L, Bösze Z, Fassler R. (1998) Sequence, structure and

chromosomal localization of Crtm gene encoding mouse cartilage matrix protein and its

exclusion as a candidate for murine achondroplasia. Matrix Biol, 16: 563-673.

Aszódi A, Hauser N, Studer D, Paulsson M, Hiripi L, Bösze Z. (1996) Cloning, sequencing

and expression analysis of mouse cartilage marix protein (CMP) cDNA. Eur J Biochem, 236:

970-977.

92

Aszódi A, Módis L, Páldi A, Rencendroj A, Kiss I, Bösze Z. (1994) The zonal expression of

chicken cartilage matrix protein gene in the developing skeleton of transgenic mice. Matrix

Biol, 14: 181-190.

Aumailley M, Gayraud B. (1998) Structure and biological activity of the extracellular matrix.

J Mol Med, 76: 253-65.

Barba G, Harper F, Harada T, Kohara M, Goulinet S, Matsuura Y, Eder G, Schaff Z,

Chapman MJ, Miyamura T, Brechot C. (1997) Hepatitis C virus core protein shows a

cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci

USA, 94: 1200-1205.

Batmunkh E, Tátrai P, Szabó E, Lódi C, Holczbauer A, Páska C, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff

Z, Kovalszky I. (2007) Comparison of the expression of agrin, a basement membrane heparan

sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma Hum Pathol, 38:

1508-1515.

Bedossa P, Paradis V. (2003) Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol, 200:

504-515.

Belluoccio D, Schenker T, Baici A, Trueb B. (1998) Characterization of human matrilin-3.

Genomics, 53: 391-394.

Belluoccio D, Trueb B. (1997) Matrilin-3 from chicken cartilage. FEBS Lett, 415: 212-216.

Block TM, Mehta AS, Fimmel CJ, Jordan R. (2003) Molecular viral oncology of

hepatocellular carcinoma. Oncogene, 22: 5093-5107.

Briggs MD. (2004) Missense mutations in the beta strands of the single A-domain of matrilin-

3 result in multiple epiphyseal dysplasia. J Med Genet, 41: 52-9.

93

Buckner JH, Wu JJ, Reife RA, Terato K, Eyre DR. (2000) Autoreactivity against matrilin-1 in

a patient with relapsing polychondritis. Arthritis Rheum, 43: 939-43.

Buendia MA. (1992) Hepatitis B viruses and hepatocellular carcinoma. Adv. Cancer Res, 59:

167-226.

Buendia MA. (2000) Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Cancer Biol, 10: 185-200.

Canen EH, Yamada KM. (2001) Fibronectin, integrins and growth control. J Cell Physiol,

189: 1-13.

Chapman KL, Mortier GR, Chapman K, Loughlin J, Grant ME, Briggs MD. (2001) Mutations

in the region encoding the von Willebrand factor A domain of matrilin-3 are associated with

multiple epiphyseal dysplasia. Nat Genet, 28: 393-396.

Chen Q, Johnson DM, Haudenschild DR, Tondravi MM, Goetinck PF. (1995) Cartilage

matrix protein forms a types II collagen-independent filamentous network: Analysis in

primary cell cultures with a retrovirus expression system. Mol Biol Cell, 6: 1743-1753.

Chen Q, Zhang Y, Johnson DM, Goetinck PF. (1999) Assembly of a novel cartilage matrix

protein filamentous network: molecular basis of differential requirement of von Willebrand

factor A domains. Mol Biol Cell, 10: 2149-2162.

Chiquet-Ehrismann R. (2004) Tenascins. Int J Biochem Cell Biol, 36: 986-990.

Chisari FV. (2000) Viruses, immunity, and cancer: Lessons from hepatitis B. Am J Path, 156:

1118-1132.

Clarke B. (1997) Molecular virology of hepatitis C virus. J Gen. Virol, 78: 2397-2410.

Craig JR. (1997) Cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and survival. Hepatology, 26: 798-799.

94

Deák F, Piecha D, Bacharati C, Paulsson M, Kiss I. (1997) Primary structure and expression

of matrilin-2, the closest relative of cartilage matrix protein within the von Willebrand factor

type A module superfamily. J Biol Chem, 272: 9268-9274.

Deák F, Wagener R, Kiss I, Paulsson M. (1999) The matrilins: a novel family of oligomeric

extracellular matrix proteins. Matrix Biol, 18: 55-64.

Deng-Fu Yao, Zhi-Zhen Dong, Min Yao (2007): Specific molecular markers in hepatocellular

carcinoma, Hepatobiliary Pancrat Dis Int, 6: 241-247.

Dumble ML, Croager EJ, Yeoh GC, Quail EA. (2002) Generation and characterization of p53

null transformed hepatic progenitor cells: oval cells give rise to hepatocellular carcinoma.

Carcinogenesis, 23: 435-445.

Desmet VJ. (2005) Cystic diseases of the liver. From embryology to malformations.

Gastroenterol Clin Biol, 29: 858-860.

Eleazar JA, Memeo L, Jhang JS, Mansukhani MM, Chin S, Park SM, Lefkowitch JH, Bhagat

G. (2004) Progenitor cell expansion: an important source of hepatocyte regeneration chronic

hepatitis J Hepatol, 41: 983-991.

Evarts RP, Nagy P, Marsden ER, Thorgeirsson SS. (1987) A precursor-product relationship

exists between oval cells and hepatocytes in rat liver. Carcinogenesis, 8: 1737-1740.

Falkowski O, An HJ, Ianus IA, Chiriboga L, Yee H, West AB, Theise ND. (2003)

Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells. J Hepatol, 39: 357-

364.

Farber E. (1956) Similarities in the sequence of early histological changes induced in the liver

of the rat by ethionine, 2-acetylaminofluorene, and 3’ methyl-4-dimethylaminoazobenzene.

Cancer Res, 16: 142-148.

Fausto N. (2001) Liver regeneration: from laboratory to clinic. Liver Transpl, 7: 835-844.

95

Fausto N. (2004) Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells.

Hepatology, 39: 1477-1487.

Fiegel HC, Glüer S, Roth B, Rischewski J, von Schweinitz D, Ure B, Lambrecht W, Kluth D.

(2004) Stem-like cells in human hepatoblastoma. Histochem Cytochem, 52: 1495-501.

Forbes S, Vig P, Poulsom R, Thomas H, Alison M. (2002) Hepatic stem cells. J Pathol, 197:

510-518.

Frank S, Schulthess T, Landwehr R, Lustig A, Mini T, Jenö P, Engel J, Kammerer RA. (2002)

Characterization of the matrilin coiled-coil domains reveals seven novel isoforms. J Biol

Chem, 277: 19071-19079.

Friedman SL. (2004a) Mechanism of disease: mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic

implications. Nature Clin Practice Gastroenterol Hepatol, 1: 98-105.

Friedman SL. (2004b) Stellate cells: a moving target in hepatic fibrogenesis. Hepatology, 40:

1041-1043.

Fujita M, Furukawa H, Hattori M, Todo S, Ishida Y, Nagashima K. (2000) Sequential

observation of liver cell regeneraton after massive hepatic necrosis inauxiliary partial

orthotopic liver transplantation. Mod Pathol, 13: 152-157.

Füle T, Baghy K, Tátrai P, Péterfia B, Kovalszky I. (2006) A stroma szerepe a daganatok

biológiai viselkedésében. Orvosképzés, 3. 137-244.

Füle T, Kovalszky I. (2002) Vírusok molekuláris diagnosztikája. Magy Onkol, 46: 17-22.

96

Gelse K, Poschl E, Aigner T. (2003) Collagens-structure, function, and biosynthesis. Adv

Drug Deliv Rev. 55: 1531-1546.

Gervain J, Simon G Jr, Papp I, Szabóné BK. (2001) A magyarországi krónikus C

vírushepatitises betegek vírustípus- és szubtípus meghatározása. Orv Hetil, 2001. 142: 1315-

1319.

Giannelli G, Antoniaci S. (2000) Biological and clinical revelance of Laminin-5 in cancer.

Clin Exp Metastasis, 18: 439-443.

Giannelli G, Quaranta V, Antonaci S. (2003) Tissue remodelling in liver diseases. Histol

Histopathol, 18: 1267-1274.

Gressner AM. (1998) The cell biology of liver fibrogenesis - an imbalance of proliferation,

growth arrest and apoptosis of myofibroblasts. Cell Tissue Res, 292: 447-52.

Grisham JW. (1980) Cell types in long term propagable cultures of rat liver. Ann NY Acad

Sci, 349: 128-134.

Hauser N, Paulsson M, Heinegard D, Morgelin M. (1996) Interaction of cartilage matrix

protein (CMP) with aggrecan. Increased covalent cross-linking with tissue maturation. J Biol

Chem, 271: 32247-32252.

Hauser N, Paulsson M. (1994) Native cartilage matrix protein (CMP). A compact trimer of

subunits assembled via a coiled-coil α-helix. J Biol Chem, 269: 25747-26753.

Hayashi J. Aoki H, Arakawa Y, Hino O. (1999) Hepatitis C virus and hepatocarcinogenesis.

Intervirology, 42: 205-210.

Higgins GM, Anderson RM. (1931) Experimental pathology of the liver: restoration of the of

the white rat following partial surgical removal. Experimental Pathol, 12: 186–202.

Hodkinson PS, Mackinnon AC, Sethi T. (2007) Extracellular matrix regulation of drug

resistance in small-cell lung cancer. Int J Radiat Biol, 28. 1-9.

97

Hofseth LJ, Saito S, Hussain SP, Espey MG, Miranda KM, Araki Y, Jhappan C, Higashimoto

Y, He P, Linke SP, Quezado MM, Zurer I, Rotter V, Wink DA, Appella E, Harris CC. (2003)

Nitric oxide-induced cellular stress and p53 activation in chronic inflammation. Proc Natl

Acad Sci USA, 100: 143 -148.

Hsia CC. Evarts RP. Nakatsukasa N, Marsden E, Thorgeirsson SS. (1992) Occurence of oval-

type cells in hepatitis B virus associated human hepatocarcinogenesis. Hepatology, 16: 1327-

1333.

Jackson GC, Barker FS, Jakkula E, Czarny-Ratajczak M, Mäkitie O, Cole WG, Wright MJ,

Smithson SF, Suri M, Rogala P, Mortier GR, Baldock C, Wallace A, Elles R, Ala-Kokko L,

MD Briggs. (2004) Missense mutations in the β strands of the single A-domain of matrilin-3

result in multiple epiphyseal dysplasia. J Med Genet, 41: 52-59.

Kabosova A, Azar DT, Bannikov GA, Campbell KP, Durbej M, Ghohestani RF, Jones JC,

Kenney MC, Koch M, Ninomiya Y, Patton BL, Paulsson M, Sado Y, Sage EH, Sasaki T,

Sorokin LM, Steiner-Champliaud MF, Sun TT, Sundarraj N, Timpl R, Virtanen I, Ljubimov

AV. (2007) Compositional Differences between Infant and Adult Human Corneal Basement

Membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48: 4989-99.

Kalluri R. (2003) Basement membranes: structure, assembly and role in tumor angiogenesis.

Nat Rev Cancer, 3: 422-433.

Katyal S, Oliver JH 3rd, Peterson MS, Ferris JV, Carr BS, Baron RL. (2000) Extrahepatic

metastases of hepatocellular carcinoma. Radiology, 216: 698-703.

Kim TH, Wendy M, Mars DB, Stolz B, Petersen E, Michalopoulos GK. (1997) Extracellular

matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology, 26: 896-904.

Kin M, Torimura T, Ueno T, Inuzuka S, Tanikawa K. (1994) Sinusoidal capillarization in

small hepatocellular carcinoma. Pathol Int, 44: 771-778.

98

Kiss A, Lotz G, Kaposi NP, Schaff Zs. (2002) Hepatitisvírusok és hepatocarcinogenesis. Orv

Hetil, 143: 83-86.

Kiss I, Deák F, Holloway RG, Delius H, Mebust KA, Frimberger E, Argraves WS, Tsonis

PA, Winterbottom N, Goetnick PF. (1989) Structure of the gene for cartilage matrix protein, a

modular protein of the extracellular matrix. J. Biol. Chem, 264: 8126-8134.

Klatt AR, Nitsche DP, Kobbe B, Mörgelin M, Paulsson M, Wagener R. (2000) Molecular

structure and tissue distribution of matrilin-3, a filament-forming extracellular matrix protein

expressed during skeletal development. J Biol Chem, 275: 3999-4006.

Klatt AR, Nitsche DP, Kobbe B, Macht M, Paulsson M, Wagener R. (2001) Molecular

structure, procesing, and tissue distribution of matrilin-4. J Biol Chem, 276: 17267-17275.

Klatt AR, Paulsson M, Wagener R. (2002) Expression of matrilins during maturation of

mouse skeletal tissues. Matrix Biol, 21: 289-296.

Ko YP, Kobbe B, Paulsson M, Wagener R. (2005) Zebrafish (Danio rerio) matrilins: shared

and divergent characteristics with their mammalian counterpart. Biochem J, 386: 367-379.

Korpos E, Molnar A, Papp P, Kiss I, Orosz L, Deak F. (2005) Expression pattern of matrilins

and other extracellular matrix proteins characterize distinct stages of cell differentiation

during antler development. Matrix Biol, 24: 124-135.

Kovalszky I, Baghy K, Tátrai P, Schaff Zs. (2006) A májfibrogenezis pathomechanizmusa.

Orv Hetil, 33: 1593-1599.

Kovalszky I, Dudás J, Gallai M, Hollósi P, Tátrai P, Tátrai E, Schaff Z. (2004)

Proteoglikánok a májban. Magy Onkol, 48: 207-213.

Kovalszky I. (1993) Máj fibrogenesis-fibrózis, cirrhózis. Orv Hetil, 1: 59-64.

99

Lee JS, Thorgeirsson SS. (2006) Comparative and integrative functional genomics of HCC.

Oncogene, 25: 3801- 3809.

Leighton MP, Nundlall S, Starborg T, Meadows RS, Suleman F, Knowles L, Wagener R,

Thornton DJ, Kadler KE, Boot-Handford RP, Briggs MD. (2007) Decreased chondrocyte

proliferation and dysregulated apoptosis in the cartilage growth plate are key features of a

murine model of epiphyseal dysplasia caused by a matn3 mutation. Hum Mol Genet, 16:

1728-1741.

Lengyel G, Tulassay Z. (2007) A májtranszplantáció után visszatérő hepatitis-C-vírus-fertőzés

kezelése. Orv Hetil, 148: 1875-1881.

Li H, Fan X, Houghton J. (2007) Tumor microenvirovment: the role of the tumor stroma in

cancer. J. Cell Biochem, 101: 805-815.

Llovet J, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Raoul J, Zeuzem S, Poulin-Costello M, Moscovici

M. (2007) Randomized phase III trial of sorafenib versus placebo in patients with advanced

hepatocellular carcinoma. ASCO Annual Meeting Proceedings, 25:1.

Lowes KN, Brennan BA, Yeoh GC, Olynyk JK. (1999) Oval cell numbers in human chronic

liver diseases are directly related to disease severity. Am J Pathol, 154: 537-541.

Mabuchi A, Haga N, Maeda K, Nakashima E, Manabe N, Hiraoka H, Kitoh H, Kosaki R,

Nishimura G, Ohashi H, Ikegawa S. (2004) Novel and recurrent mutations clustered in the

von Willebrand factor A domain of MATN3 in multiple epiphyseal dysplasia. Hum Mutat,

24: 439-40.

Maher JJ, McGuire RF. (1990) Extracellular matrix gene expression increases preferentially

in rat lipocytes and sinusoidal endothelial cells during hepatic fibrosis in vivo. J Clin Invest,

86: 1641-1648.

100

Mann HH, Özbek S, Eugel J, Paulsson M, Wagener R. (2004) Interactions between the

cartilage oligomeric matrix protein and matrilins. Implications for matrix assembly and the

pathogenesis of chondrodysplasisas. J Biol Chem, 279: 25294-25298.

Mannhalter C, Koizar D, Mitterbauer G. (2000) Evalution of RNA isolation metods and

reference genes for RT-PCR analyses of rare target RNA. Clin Lab Med, 38: 171-177.

Martinez-Hernandez A, Amenta PS. (1993) The hepatic extracellular matrix. Ontogenesis,

regeneration and cirrhosis. Virchows Archiv A Pathol Anat, 423: 77-84.

Martinez-Hernandez A, Amenta PS. (1995) The extracellular matrix in hepatic regeneration.

FASEB J, 9: 1401-1410.

Martinez-Hernandez A, Mertinez- Delgado F, Amenta PS. (1991) The extracellular matrix in

hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab

Invest, 64: 157-166.

Mátés L, Korpos E, Déak F, Liu Z, Beier DR, Aszódi A, Kiss I. (2002) Comparative analysis

of the mouse and human genes (Matn2 and MATN2) for matrilin-2, a filament-forming

protein widely distributed in extracellular matrices. Matrix Biol, 21: 163-174.

Mátés L, Nicolae C, Mörgelin M, Deák F , Kiss I , Aszódi A. (2004) Mice lacking the

extracellular matrix adaptor protein matrilin-2 develop without obvious abnormalities. Matrix

Biol, 23: 195-204.

Merz H, Malisius R, Mannweiler S, Zhou R, Hartmann W, Orscheschek K, Moubayed P,

Feller AC. (1995) ImmunoMax. A maximized immunohistochemical method for the retrieval

and enhancement of hidden antigens. Lab Invest, 73: 149-156.

101

Mundlos S, Zabel B. (1994) Develpomental expression of human cartilage matrix protein.

Dev Dyn, 199: 241-252.

Nagy P, László V, Schaff Zs. (2006) A hepatocarcinogenesis folyamata humán májban. Magy

Onkol, 50: 107-112.

Nagy P. (1995) The facultative stem cell: a new star in liver pathology. Pathol Oncol Res. 1:

123-126.

Nagy P, Teramoto T, Factor VM, Sanchez A, Schnur J, Paku S, Thorgeirsson SS. (2001)

Reconstitution of liver mass via cellular hypertrophy in the rat. Hepatology, 33: 339-345.

Okimura A, Okada Y, Makihira S , Pan H , Yu L , Tanne K, Imai K, Yamada H, Kawamoto

T, Noshiro M, Yan W, Kato Y. (1997) Enhancement of cartilage matrix protein synthesis in

arthritic cartilage. Arthritis Rheum, 40: 1029-1036.

Paku S, Schur J, Nagy P, SS Thorgeirsson. (2001) Origin and strctural evolution of the early

proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol, 158: 1313-1323.

Paku S, Nagy P, Kopper L, Thorgeirsson SS. (2004) 2-acetylaminofluorene dose-dependent

differentiation of rat oval cells into hepatocytes: confocal and electron microscopic studies.

Hepatology, 39: 1353-1361.

Pan OH, Beck K. (1998) The C-terminal domain of matrilin-2 assembles into a three-stranded

α-helical coiled coil. J Biol Chem, 273: 14205- 14209.

Paulsson M, Heinegard D. (1979) Matrix proteins bound to associatively prepared

proteoglycans from bovine cartilage. Biochem J, 183: 539-545.

Paulsson M, Heinegard D. (1981) Purification and structural caracterization of a cartilage

matrix protein. Biochem J, 183: 539-545.

102

Paulsson M, Heinegard D. (1982) Radioimmunoassay of the 148-kilodalton cartilage protein.

Biochem J, 207: 207-213.

Petersen BE, Zajac VF, Michalopoulos GK. (1998) Hepatic oval cell activation in response to

injury following chemically induced periportal or pericentral damage in rats. Hepatology, 27:

1030-1038.

Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. (2002) Relative expression software tool (REST) for

group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR.

Nucleic Acids Res, 1: 30-36.

Pi L, Oh SH, Shupe T, Petersen BE. (2005) Role of the connective tissue growth factor in

oval cell response during liver regeneration after 2-AAF/PHx in rats. Gastroenterology, 128:

2077-2088.

Piecha D, Muratoglu S, Morgelin M, Hauser N, Studer D, Kiss I, Paulsson M, Deak F. (1999)

Matrilin-2, a large, oligomeric matrix protein, is expressed by a great variety of cells and

forms fibrillar networks. J Biol Chem, 274: 13353-13361.

Piecha D, Hartmann K, Kobbe B, Haase I, Mauch C, Krieg T, Paulsson M. (2002a)

Expression of matrilin-2 in human skin. J Invest Dermatol, 119: 38-43.

Piecha D, Wiberg C, Morgelin M, Reinhardt DP, Deak F, Maurer P, Paulsson M. (2002b)

Matrilin-2 interacts with itself and with other extracellular matrix proteins. Biochem J, 367:

715-721.

Roskams T, Yang SQ, Koteish A, Durnez A, DeVos R, Huang X, Achten R, Verslype C,

diehl AM. (2003) Oxidative stress and oval cell accumulation in mice and humans with

alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease. Am J Pathol, 163: 1301-1311.

103

Roskams T. (2006) Liver stem cells and their implication in hepatocellular and

cholangiocarcinoma. Oncogene, 25: 3818-3822.

Roskams TA, Theise ND, Balabaud C, Bhagat G, Bhathal PS, Bioulac-Sage P, Brunt EM,

Crawford JM, Crosby HA, Desmet V, Finegold MJ, Geller SA, Gouw AS, Hytiroglou P,

Knisely AS, Kojiro M, Lefkowitch JH, Nakanuma Y, Olynyk JK, Park YN, Portmann B,

Saxena R, Scheuer PJ, Strain AJ, Thung SN, Wanless IR, West AB. (2004) Nomenclature of

the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.

Hepatology, 39: 1739-1745.

Rougier P, Mitry E, Barbare JC, Taieb J. (2007) Hepatocellular carcinoma (HCC): An

Update. Semin Oncol, 4: 12-20.

Sadlier DM, Connolly SB, Kieran NE, Roxburgh S, Brazil DP, Kairaitis L, Wang Y, Harris

DC, Doran P, Brady HR. (2004) Sequential extracellular matrix-focused and baited-global

cluster analysis of serial transcriptomic profiles identifies candidate modulators of renal

tubulointerstitial fibrosis in murine adriamycin-induced nephropathy. J Biol Chem, 279:

29670 -2980.

Santoni-Rugiu, E, Jelnes, P, Thorgeirsson, SS, Bisgaard, HC. (2005) Progenitor cells in liver

regeneration: molecular responses controlling their activation and expansion. APMIS, 113:

876-902.

Sarraf C, Lalani EN, Golding M, Anilkumar TV, Poulsom R, Alison M. (1994) Cell behavior

in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver. Light and electron microscopic

observations. Am J Pathol, 145: 1114-1126.

Saxne T, Heinegard D. (1989) Involvment of non-articular cartilage, as demonstrated by

release of a cartilage-specific protein, in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 32: 1080-

1086.

Schaff Z, Nagy P. Pathology techniques and grading systems in the diagnosis of HCC. In

Liver Cancer. Eds. Okuda K, Tabor E. Churchill Livingstone, London, 1997: 111-133.

104

Schaff Z, Sárosi I, Hsia CC, Kiss A, Tabor E. (1995) p53 in malignant and beningn liver

lesions. Eur J Cancer, 31A: 1847-1850.

Schaff Zs, Illyés Gy. A máj és az epeutak patológiája. In: Kopper L és Schaff Zs (szerk),

Patológia. Medicina, Budapest, 2004: 827-839.

Schaff Zs, Székely E, Járay B, Kiss A. (2004) A májdaganatok patológiája. Orv Hetil, 145:

368-374.

Schaffener F, Popper H. Capillarization of hepatic sinusoids in man. Gastroenterology, 1963.

44: 239-242.

Schlötzer-Schrehardt U, Dietrich T, Saito K, Sorokin L, Sasaki T, Paulsson M, Kruse FE.

(2007) Characterization of extracellular matrix components in the limbal epithelial stem cell

compartment. Exp Eye Res, nyomtatásban.

Sedlaczek N, Jia JD, Bauer M, Herbst H, Ruehl M, Hahn EG, Schuppan D. (2001)

Proliferating bile duct epithelial cells are a major source of connective tissue growth factor in

rat biliary fibrosis. Am J Pathol, 158: 1239-1244.

Segat D, Frie C, Nitsche PD, Klatt AR, Piecha D, Korpos E, Deák F, Wagener R, Paulsson M,

Smyth N. (2000) Expression of matrilin-1, -2 and -3 developing mouse limbs and heart,

Matrix Biol, 19: 649-655.

Sell S, Salman J. (1984) Ligh- and electron-microscopic autoradiographic analysis of

proliferating cells during the early of chemical hepatocarcinogenesis in the rat induced by

feeding N-2 fluorenylacetamide in a choline-deficient diet. Am J Pathol, 114: 287-300.

Sell S. (2004) Stem cell origin of cancer and differentiation therapy Crit Rev Oncol Hematol,

51: 1-28.

105

Sharma MK , Watson MA, Lyman M, Perry A, Aldape KD, Deak F, Gutmann DH. (2006)

Matrilin-2 expression distinguishes clinically relevant subsets of pilocytic astrocytoma.

Neurology, 66: 127-130.

Staib F, Hussain SP, Hofseth LJ, Wang XW, Harris CC. (2003) TP53 and liver

carcinogenesis. Hum Mutat, 21: 201-16.

Stefánsson SE, Jónsson H, Ingvarsson T, Manolescu I, Jónsson HH, Olafsdóttir G, Pálsdóttir

E, Stefánsdóttir G, Sveinbjörnsdóttir G, Frigge ML, Kong A, Gulcher JR, Stefánsson K.

(2003) Genomewide scan for hand osteoarthritis: a novel mutation in matrilin-3. Am J Hum

Genet, 72: 1448-1459.

Stirpe NS, Goetinck PF. (1989) Gene regulation during cartilage differentiaton: temporal and

spatial expression of link protein and cartilage matrix protein in the developing limb.

Development, 107: 23-33.

Szabo E, Lotz G, Paska C, Kiss A, Schaff Z. (2003) Viral hepatitis: new data on hepatitis C

infection. Pathol Oncol Res, 9: 215-221.

Szabo E, Paska C, Kaposi Novak P, Schaff Z, Kiss A. (2004) Similarities and differences in

hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res, 10: 5-11.

Taub R. (1996) Liver regeneration in health and disease. Clin Lab Med, 16: 341-360.

Teufel A, Staib F, Kanzler S, Weinmann A, Schulze-Bergkamen H, Galle PR. (2007)

Genetics of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 13: 2271-2282.

Theise ND, Nimmakayalu M, Gardner R, Illei PB, Morgan G, Teperman L, Henegariu O,

Krause DS. (2000) Liver from bone marrow in humans. Hepatology, 32: 11-16.

Thung SM. (1990) The development of proliferating ductular structures in liver disease. Arch

Pathol Lab Med, 114: 407-411.

106

Tsonis PA, Goetinck PF. (1988) Expression of cartilage-matrix genes and localization of their

translation products in the embryonic chick eye. Exp Eye Res, 46: 753-764.

Wagener R, Kobbe B, Paulsson M. (1997) Primary structure of matrilin-3, a new member of a

family of extracellular matrix proteins related to cartilage matrix protein (matrilin-1) and von

Willebrand factor. FEBS Lett, 413: 129-134.

Wagener R, Kobbe B, Paulsson M. (1998 a) Genomic organisation, alternative splicing and

primary structure of human matrilin-4. FEBS Lett, 438: 165-170.

Wagener R, Kobbe B, Paulsson M. (1998 b) Matrilin-4, a new member of the matrilin family

of extracellular matrix proteins. FEBS Lett, 436: 123-127.

Wagener R., Ehlen HW, Ko YP, Kobbe B, Mann HH, Sengle G, Paulsson M. (2005) The

matrilins - adaptor proteins in the extracellular matrix. FEBS Lett, 579: 3323-3329.

Whittaker CA. Hynes RO. (2002) Distribution and evolution of von Willebrand/Integrin A

domains: widely dispersed domains with roles in cell adhesion and elsewhere. Mol Biol Cell,

13: 3369-3387.

Wiberg C, Klatt AR, Wagener R, Paulsson M, Bateman JF, Heinegård D, Mörgelin M. (2003)

Complexes of matrilin-1 and biglycan or decorin connect collagen VI microfibrils to both

collagen II and aggrecan. J Biol Chem, 278: 37698-37704.

Wilson JW, Leduc EH. (1958) Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse

after dietary injury. J Pathol Bacteriol, 76: 441-449.

Winterbottim N, Tondravi MM, Harrington TL, Klier FG, Vertel BM, Goetinck PF. (1992)

Cartilage matrix protein is a component of collagen fibril of cartilage. Dev Dyn, 193: 266-

276.

107

Wu JJ, Eyre DR.(1998) Matrilin-3 forms disulfide-linked oligomers with matrilin-1 in bovine

epiphyseal cartilage. J Biol Chem, 273: 17433-17438.

Xiao Y, Kleeff J, Guo J, Gazdhar A, Liao Q, Cesare PD, Büchler MW, Friess H. (2004)

Cartilage oligomeric matrix protein expression in hepatocellular carcinoma and the cirrhotic

liver. J Gastroenterol and Hepatol, 19: 296-302.

Xiong ZW, Dan C, Guang RX. (2006) Extracelular matrix remodelling in hepatocellular

carcinoma: effects of soil on seed? Medical Hypotheses, 66: 1115-1120.

You LR, Chen CM, Lee YH. Hepatitis C virus core protein enhances NF-kappaB signal

pathway triggering by lymphotoxin-beta receptor ligand and tumor necrosis factor alpha. J

Virol. 1999. 73: 1672-1681.

11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

Az értekezés alapjául szolgáló elsőszerzős közlemények jegyzéke: Szabó E., Lódi C., Korpos E., Batmunkh E., Rottenberger Z., Deák F., Kiss I, Tőkés AM.,

Lotz G., László V., Kiss A., Schaff Z., Nagy P. Expression of matrilin-2 in oval cells during

rat liver regeneration. Matrix Biol, 2007. 26: 554-560.

IF: 3,679

Szabó E., Korpos É., Batmunkh E., Lotz G., Holczbauer Á., Kovalszky I., Deák F., Kiss I.,

Schaff Zs., Kiss A. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma.

Pathol Oncol Res, 2007. Accepted for publication, august 2007.

IF: 1,241

Szabo E., Lotz G., Paska C., Kiss A., Schaff Z. Viral hepatitis: New data on hepatits C

infection. Pathol Oncol Res, 2003. 9: 215-221.

Szabó E., Páska C., Kaposi Novák P., Schaff Z., Kiss A. Similarities and differences in

hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res, 2004. 10: 5-11.

Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények:

Paska C., Bögi K., Szilák L., Tőkés A., Szabó E, Sziller I, Rigó J Jr, Sobel G, Szabó I,

Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Z. Effect of formalin, acetone, and RNA later fixatives on

tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded

tissue. Diagn Mol Pathol, 2004. 13: 234-240.

IF 2,292

Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Szíjártó A., Kupcsulik P., Kovalszky I, Paku

S., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from

hepatocellular carcinomas. Mod Pathol, 2006. 19: 460-469.

109

IF 3,753

Batmunkh E., Tátrai P., Szabó E., Lódi C., Holczbauer A., Páska C., Kupcsulik P., Kiss A.,

Schaff Z., Kovalszky I. Comparison of the expression of agrin, a basement membrane heparan

sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma. Hum Pathol,

2007. 38: 1508-1515.

IF: 2,81

Borka K., Kaliszky P., Szabó E., Lotz G., Kupcsulik P., Schaff Z., Kiss A. Claudin

expression in pancreatic endocrine tumors as compared with ductal adenocarcinomas.

Virchows Arch, 2007. 450: 549-557.

IF 2,251

Megjelent, illetve elfogadott in extensio közlemények impakt faktora összesen: 16, 026

Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok:

Szabó E., Nagy P., Paku S., Korpos E., Kiss I., Deak F., Lódi C., Páska C., Kiss A., Schaff Z.

High expression of matrilin-2 by stem cells in liver regeneration. 40th Annual Meeting of the

European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France. J Hepatol,

42. S2, 2005.

Szabó E., Páska C., Deák F., Kiss I., Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Kiss A.,

Kovalszky I., Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis and

hepatocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of

the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France. J Hepatol, 42. S2, 2005.

110

Szabó E., Páska C., Lódi C., Batmunkh E., Holczbauer Á., Korpos É., Deák F., Kiss I., Kiss

A., Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 47th

Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 07-11,

2005, Z. Gastroenterol, Issue 5. Volume 43. 2005.

Egyéb kutatási témákból, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok:

Szabó E., Kaposi Novák P., Kiss A., Páska Cs., Lotz G., Schaff Zs. Activation of beta-catenin

pathway in human hepatocellular carcinoma negatively correlates to AFP and CD-44

expression. 46th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga,

June 1-5, 2004, Z. Gastroenterol, 42: 438, 2004.

Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P., Páska C., Kiss A., Kupcsulik P.,

Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular

carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April

13-17, 2005, Paris, France, J Hepatol, 42. S2, 2005.

Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P., Páska C., Kiss A., Kovalszky I.,

Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 47th

Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 7-11, 2005.

Gastroenterol, 43, 2005.

Lódi Cs., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kiss A., Kupcsulik P., Illyés Gy.,

Schaff Zs. High expression of claudin-4 in biliary carcinomas. 20th European Congress of

Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005, Virchows Arch, 447: 404, 2005.

Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Kiss A., Illyés G., Paku S., Schaff Z., Nagy

P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. 41th Annual Meeting of the

European Association for the Study of the Liver, Viena, Austria, April 26-27, 2006, J

Hepatol, 44. S2, 2006

Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kupcsulik P., Illyés G., Kiss A.,

Schaff Z. Different claudin-4 expression on biliary and hepatocellular carcinomas. 41th

111

Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Vienna, Austria,

April 26-27, 2006, J Hepatol, 44. S2, 2006.

Egyéb kutatási témákból készült, nem idézhető abstractok:

Kiss A., Páska C., Szabó E., Holczbauer Á., Szíjártó A., Kupcsulik P., Schaff Z. Markedly

downregulated claudin-4 expression differentiates human hepatocellular carcinomas from

metastatic liver tumors. Falk Symposium, Freiburg, Germany, October 16-17, 2004.

Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P, Páska C., Kiss A., Kupcsulik P.,

Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular

carcinoma. Falk Symposium, Berlin, Germany, October 3-4, 2005.

Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Kiss A., Illyés G., Paku S., Schaff Z., Nagy

P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. Falk Symposium, Berlin Germany,

October 3-4, 2005.

Batmunkh E., Tátrai P., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Páska C., Kiss A., Kupcsulik P.,

Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in cholangiocarcinoma. Falk Symposium,

Freiburg, Germany, October 10-11, 2006.

Lódi C., Szíjártó A., Holczbauer Á., Szabó E., Batmunkh E., Kiss A., Illyés G., Schaff Z.,

Kupcsulik P. High expression of claudin-4 in human cholangiocarcinomas. 6th Congress of

the European Hepato-Pancreato-Biliary Association, Heidelberg, Germany, May 25-28, 2005.

Holczbauer Á., Halász J., Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Benyó G., Galántai I., Kiss A.,

Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 7th Ph.D. Conference at

Semmelweis University, Budapest, Hungary, April 14-15, 2005.

Szabó E., Orbán E., Lódi C., Batmunkh E., Holczbauer Á., Korpos E., Deak F., Kiss I., Kiss

A., Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 1st

Central European Regional Meeting, Liver and Pancreas Pathology, Eger, Hungary, june 1-3,

2006.

112

12. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS

Köszönetet mondok témavezetőmnek, Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, aki lehetővé

tette számomra, hogy a vezetése alatt álló Semmelweis Egyetem, II. sz Patológia Intézetben

végezhessem PhD tanulmányaimat. Köszönöm mindenkori támogatását, rendkívüli türelmét,

tanácsait és szakmai segítségét egyaránt. Köszönöm továbbá a részéről jövő kemény, de építő

szavakat is. Szintén szeretném kifejezni köszönetemet dr. Kiss András docensnek, aki

laborvezetőként mindig biztosította számunkra az anyagi és szellemi támogatást egyaránt,

köszönöm a szakmai tanácsait és segítő emberi jó tanácsait. Hálás köszönettel tartozom dr.

Deák Ferencnek és dr. Kiss Ibolyának, akik előkísérletei nélkül ez a munka nem született

volna meg. Külön köszönöm dr. Deák Ferenc szakmai tanácsait, türelmét és hogy lehetővé

tette számomra számos kísérlet elvégzését laboratóriumában. Hálás és baráti köszönettel

tartozom dr. Korpos Évának és Rottenberger Zsoltnak, akik segítettek a kísérletek

elvégzésében. Hasonlóképpen külön köszönöm dr. Nagy Péter egyetemi tanárnak minden jó

tanácsát és szakmai támogatását. Valamint köszönöm dr. Kovalszky Ilona egyetemi

tanárnőnek az értékes szakmai tanácsait. Köszönöm PhD társaimnak, hogy mindig

segítségemre voltak, dr. Lódi Csabának, dr. Szász Attila-Marczellnek, dr. Holczbauer

Ágnesnek, Német Zsuzsannának. Külön köszönettel tartozok dr. Batmunkh Enkjhargal

kollégámnak, akivel végig együtt dolgoztam, és mindig számíthattam rá a segítségnyújtásban.

Köszönöm dr. Tőkés Anna-Máriának a mindenkori bátorító szavait, értékes szakmai

észrevételeit és tanácsait valamint baráti és emberi támogatását. Továbbá köszönettel

tartozom dr. Páska Csilla biológus kollégámnak, aki sokat segített a módszertani alapok

elsajátításában, dr. Lotz Gábor adjunktusnak a türelmét a fotók igényes elkészítésében.

Szeretném kifejezni köszönetemet Szik Ágnesnek, Pekár Zoltánnénak, Azumahné

Erzsébetnek és Oláh Júliának, akik a munkám gyakorlati részében nyújtottak nagy

támogatását. Hasonlóan köszönettel tartozom az intézet minden munkatársának az általuk

nyújtott segítségért, Rigóné Kálé Elvirának az angol nyelvű cikkek lektorálásáért és formába

öntésért tartozom köszönettel.

És végül, de nem utolsósorban szavakba nem önthető hálával tartozom Szüleimnek,

különösképpen Édesanyámnak és Testvéremnek a támogatásukért.