95625578 Amaranto Tesis

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  • INSTITUTO POTOSINO DE INVESTIGACIN

    CIENTFICA Y TECNOLGICA, A.C.

    POSGRADO EN BIOLOGA MOLECULAR

    Ttulo de la tesis (Tratar de hacerlo comprensible para el pblico general, sin abreviaturas)

    Caracterizacin fisicoqumica y nutracutica de amaranto (Amaranthus hypochondriacus) cultivado

    en San Luis Potos

    Tesis que presenta

    Cecilia Silva Snchez

    Para obtener el grado de

    Doctor en Ciencias en Biologa Molecular

    Director de Tesis: Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa

    Codirector de tesis

    Dra. Elvira Gonzlez de Meja

    San Luis Potos, S.L.P., Marzo 2007.

  • Crditos Institucionales

    Esta tesis fue elaborada en el Laboratorio de Protemica y Expresin Gnica del

    Departamento de Biologa Molecular del Instituto Potosino de Investigacin

    Cientfica y Tecnolgica A.C., bajo la direccin de la Dra. Ana Paulina Barba de

    la Rosa y tambin en Laboratorio de la Dra. Elvira Gonzlez de Meja del

    Departamento de Ciencia de Alimentos y Nutricin Humana de la Universidad de

    Illinois en Urbana-Champaign. Durante la realizacin del proyecto el autor recibi

    una beca acadmica del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa (beca No.

    172330), as como del TIES-Training Program perteneciente al US-AID program,

    Joint Program in Value-Added Foods at the UIUC.

  • Acta de examen

  • NDICE GENERAL

    Pgina Resumen. i Abstract. ii I. Introduccin.

    1.1 Generalidades del amaranto y pptidos bioactivos. 1 II. Revisin de literatura.

    2.1 Historia, origen, distribucin, produccin y clasificacin

    del amaranto. 4

    2.1.1 Historia. 42.1.2 Origen, distribucin y produccin. 52.1.3 Clasificacin. 52.1.4 Caractersticas del cultivo. 7 2.2 Caractersticas generales de la semilla de amaranto. 82.2.1 Tamao y estructura. 82.2.2 Composicin qumica. 102.2.3 Protenas de reserva y su funcin. 112.2.3.1 Tipos de protenas de reserva. 122.2.3.2 Sntesis de protenas de protenas de reserva. 132.2.3.3 Localizacin de la traduccin de protenas de reserva. 15 2.3 Pptidos bioactivos en protenas de reserva. 152.3.1 Clasificacin de pptidos activos en protenas de reserva. 152.3.2 Lunasin. 172.3.2.1 Caracterizacin y funcin en plantas. 172.3.2.2 Funcin biolgica en clulas de mamfero. 18 2.4 Caractersticas generales del almidn de amaranto. 192.4.1 Generalidades del almidn. 192.4.2 El grnulo de almidn. 192.4.3 Composicin qumica del almidn. 202.4.4 Biosntesis del almidn. 212.4.5 Protemica en grnulos de almidn. 222.4.6 Caracterizacin fsica de los grnulos de almidn. 232.4.7 Microscopia de fuerza atmica. 24

  • Pgina

    III. Justificacin, hiptesis y objetivos.

    3.1 Justificacin. 263.2 Hiptesis. 273.3 Objetivos. 283.3.1 Objetivo general. 283.3.2 Objetivos especficos. 28 IV Materiales y mtodos. 4.1 Materiales. 294.1.1 Material biolgico. 294.1.2 Reactivos. 29 4.2 Mtodos. 30 4.2.1 Caracterizacin de la semilla de amaranto. 304.2.1.1 Rendimiento en campo. 304.2.1.2 Tamao de semilla. 304.2.1.3 Peso de 100 granos. 304.2.1.4 Composicin proximal. 30 4.2.2 Caracterizacin de protenas de reserva. 314.2.2.1 Extraccin de protenas. 314.2.2.2 Cuantificacin de protenas solubles. 314.2.2.3 Determinacin de aminocidos. 324.2.2.4 Electroforesis de protenas unidimensional. 324.2.2.5 Electroforesis de protenas bidimensional. 324.2.2.6 Ensayos RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA).

    33

    4.2.3 Caracterizacin de pptidos activos en protenas de reserva de amaranto. 34

    4.2.3.1 Prediccin de pptidos activos en protenas de reserva de amaranto. 34

    4.2.3.2 Identificacin de pptidos activos en la fraccin glutelinas mediante cromatografa de lquidos acoplada a espectrometra de masas (LC MS/MS).

    35

    4.2.3.2 Caracterizacin de lunasin. 364.2.3.2.1 Cuantificacin por ensayos de ELISA. 364.2.3.2.2 Identificacin por Western blot. 374.2.3.2.3 Ensayo de inmunoprecipitacin. 384.2.3.2.4 MALDI-TOF(Matrix assisted lasser desorption ioinization).

    38

  • Pgina

    4.2.4 Caracterizacin de grnulos de almidn de amaranto. 394.2.4.1 Extraccin de almidn. 394.2.4.2 Extraccin de protenas asociadas a grnulos de almidn. 394.2.4.3 Caracterizacin fsica del grnulo de almidn de amaranto. 40 4.2.5 Anlisis estadstico. 40 V. Resultados y discusin. 5.1 Caracterizacin fisicoqumica de las semillas de

    amaranto cultivadas en San Luis Potos. 415.1.1 Propiedades fsicoqumas de la semilla de amaranto. 415.1.1.1 Variabilidad gentica intra especie mediante anlisis de

    RAPD. 425.1.2 Composicin qumica de las semillas de amaranto. 43

    5.1.3 Patrn electrofortico de las protenas de reserva de amaranto. 46

    5.1.3.1 Caracterizacin de glutelinas de amaranto mediante electroforesis bidimensional. 48

    5.1.3.2 Identificacin de glutelinas por LC MS/MS. 52 5.2 Caracterizacin de pptidos bioactivos en protenas de

    reserva de amaranto. 545.2.1 Prediccin de pptidos con actividad biolgica potencial en

    protenas de reserva. 545.2.1.1 Identificacin de pptidos activos en la fraccin glutelinas de

    amaranto. 565.2.2 Caracterizacin del pptido tipo Lunasin en protenas de

    reserva de amaranto. 595.2.2.1 Contenido de Lunasin en protenas de reserva de amaranto. 595.2.2.2 Deteccin del pptido tipo Lunasin mediante Western blot. 615.2.2.3 Purificacin del pptido tipo Lunasin por ensayos de

    inmunoprecipitacin. 645.2.2.4 Identificacin del pptido tipo Lunasin por MALDI-TOF. 645.2.2.5 Caracterizacin de Lunasin en glutelinas de amaranto

    mediante electroforesis bidimensional. 66 5.3 Caracterizacin de almidn de amaranto 665.3.1 Caracterizacin bioqumica de las protenas asociadas a

    grnulos de almidn. 665.3.1.1 Protenas asociadas a grnulos de almidn mediante

    electroforesis unidimensional. 665.3.1.2 Caracterizacin de las protenas asociadas a grnulos de

    almidn mediante electroforesis bidimensional. 67

  • Pgina

    5.3.1.3 Anlisis de las protenas asociadas a grnulos de almidn mediante MALDI-TOF. 68

    5.3.2 Caracterizacin fsica de los grnulos de almidn de amaranto. 70

    VI. Conclusiones y perspectivas. 6.1 Conclusiones. 74 VII. Referencias. 75 VIII. Anexos Anexo I Captulo en libro Characterization of bioactive pepetides in

    Amaranthus hypochondriacus seed storage proteins 85Anexo II Artculo de investigacin Bioactive peptides in Amaranth

    (amaranthus hypochondriacus) 93

  • NDICE DE TABLAS

    Pgina Tabla 1 Rendimiento en campo de amaranto, algunos cereales y

    leguminosas. 8Tabla 2 Comparacin de la composicin proximal entre amaranto

    y algunos cereales. 10Tabla 3 Composicin de aminocidos esenciales de semillas de

    tres especies de amaranto en (g/100g de protena). 11Tabla 4 Mezcla de reaccin para PCR. 33Tabla 5 Condiciones de PCR para RAPD. 34Tabla 6 Oligonucletidos para RAPD. 34Tabla 7 Propiedades fsicas de las semillas de amaranto

    cultivadas en San Luis Potos. 41Tabla 8 Anlisis proximal de las semillas de amaranto cultivadas

    en San Luis Potos. 44Tabla 9 Fracciones protenicas de amaranto cultivado en San Luis

    Potos. 44

    Tabla 10 Identificacin de protenas de glutelinas de amaranto mediante espectrometra de masas. 53

    Tabla 11 Biopptidos identificados en la digestin trptica de las glutelinas de amaranto mediante cromatografa de lquidos acoplado a espectrometra de masas. 58

    Tabla 12 Concentracin del pptido tipo Lunasin en extractos totales de protena y fracciones de protenas en g/g de protena total cuantificados por ELISA. 60

    Tabla 13. Concentracin del pptido tipo Lunasin en extractos totales de protena y fracciones de protenas en g/g de harina cuantificados por ELISA. 60

  • NDICE DE FIGURAS

    Pgina Figura 1. Apariencia del cultivo de amaranto. 6Figura 2. Microgrfica electrnica del grano de amaranto. 9Figura 3. Sntesis de glicina en cotiledones de soya. 14Figura 4. Ruta biosinttica de almidn mediante ADP-glucosa. 21Figura 5. Organizacin de amilopectina para formar el grnulo de

    almidn. 24Figura 6. Productos de amplificacin de las cuatro variedades de

    amaranto para el ensayo RAPD. 42Figura 7. Composicin de aminocidos de harinas de amaranto

    cultivado en San Luis Potos. 45Figura 8. Composicin de aminocidos de las fracciones de

    protenas de reserva de amaranto cultivado en San Luis Potos. 46

    Figura 9 Patrn electrofortico de la fracciones de protenas de reserva de amaranto cultivado en San Luis Potos. 47

    Figura 10. Patrn bidimensional de glutelinas de amaranto pH 3-10 lineal. 49

    Figura 11. Comparacin de glutelinas Criolla vs. Nutrisol pH 3-10 mediante Image Master (GE Healthcare). 49

    Figura 12. Patrn bidimensional de glutelinas de amaranto pH 4-7. 50Figura 13. Comparacin de glutelinas Criolla vs. Nutrisol pH 4-7

    mediante Image Master (GE Healthcare). 50Figura 14. Patrn bidimensional de glutelinas de amaranto pH 6-11. 51Figura 15. Comparacin de glutelinas Criolla vs. Nutrisol pH 6-11

    mediante Image Master (GE Healthcare). 51Figura 16. Glutelinas de amaranto variedad Criolla que fueron

    analizadas por LC MS/MS. 52Figura 17. Prediccin de pptidos con potencial actividad biolgica

    en protenas de amaranto. 55Figura 18. Curva estndar de Lunasin sinttico mediante ELISA. 59Figura 19. Deteccin del pptido tipo lunasin mediante Western blot. 62Figura 20. Western blot de extractos totales de protenas de

    amaranto mezcladas con Lunasin de soya. 63Figura 21. Western blot despus de la inmunoprecipitacin de

    glutelinas 64Figura 22. Masas monoisotpicas de cuatro fragmentos detectados

    por anlisis de MALDI-TOF y sus secuencias esperadas. 65Figura 23. Identificacin del pptido tipo lunasin mediante

    electroforesis bidimensional. 66Fi