ENZIMI SU BIOLOŠKI KATALIZATORIKARAKTERISTIKE DELOVANJA HEMIJSKIH KATALIZATORA I ENZIMA

HEM. KATALIZATORI • Mala količina ubrzava

hem. reakciju• Hemijski se ne menjaju

tokom katalize• Pokazuju specifičnost

delovanja• Snižavaju energiju

aktivacije• Ne utiču na položaj

hemijske ravnoteže

ENZIMI• Velika efikasnost u

ubrzavanju reakcija• Ne menjaju se tokom

katalize• Veoma visoka

specifičnost delovanja• Snižavaju energiju

aktivacije• Ne utiču na položaj

hemijske ravnoteže

ENZIMI NE IZAZIVAJU

BIOHEMIJSKE REAKCIJE ONI IH

SAMO UBRZAVAJU

UKOLIKO JE KOD NEKE REAKCIJE ΔG>0 (+), A PRODUKAT JE POTREBAN ĆELIJI, ONDA EMZIMI KATALIZUJU SPREGNUTE

REAKCIJE

ENZIMI SNIŽAVAJU ENERGIJU AKTIVACIJE

2 H2O2 → 2 H2O + O2

Ea, kJ/mol

Bez katalizatora

75,2

I- 56,4

Pt 48,5

Katalaza 23,0

Hemijska priroda enzimaEnzimi su proteini koji mogu sadržavati i

dodatne supstanceEnzimi se dele na:Proste proteinske monomerni oligomerniMetalo-proteinskeSadrže metalni jonSložene proteinskeSadrže prostetičnugrupu

TERMINOLOGIJA U ENZIMOLOGIJIENZIMProteinski molekul koji

ubrzava reakcijuSUPSTRATSupstanca koja se

vezuje za enzim i podleže reakciji

PROIZVODSupstanca koja nastaje

kao proizvod enzimske reakcije

AKTIVNO MESTOMesto na enzimu gde se

odvija reakcija

KARAKTERISTIKE DELOVANJAENZIM SE NE MENJA TOKOM REAKCIJE

MALA KOLIČINA ENZIMA STVARA MNOGO PRODUKATA REAKCIJE

KARAKTERISTIKE DELOVANJASPECIFIČNOST

SPECIFIČNOST PREMA SUPSTRATU

• APSOLUTNA SPECIFIČNOST

• GRUPNA SPECIFIČNOST

• STEREOHEMIJSKA SPECIFIČNOST

SPECIFIČNOST DELOVANJA

• KATALIZA SAMO JEDNE REAKCIJE

KARAKTERISTIKE DELOVANJAVELIKO UBRZANJE REAKCIJE

Brzina neenzimske reakcije (s-1)

Brzina enzimski katalizovane reakcije (s-1)

Povećanje brzine

Karboanhidraza 1,3∙10-1 106 7,7 ∙106

Trioza fosfat izomeraza

4,3∙10-6 4300 1 ∙109

Karboksipeptidaza A 3 ∙10-9 578 1,9 ∙ 1011

AMP nukleozidaza 1 ∙10-11 60 6 ∙1012

VEZIVANJE SUPSTRATA JE PRVI KORAK U ENZIMSKOJ KATALIZI

• Dva modela spajanja enzima i supstrata radi objašnjenja specifičnosti i ubrzanja reakcije

• Model ključa i brave

• Model indukovanog prilagođavanja

VEZIVANJE SUPSTRATA Model ključa i brave

VEZIVANJE SUPSTRATA Model indukovanog prilagođavanja

• 3-D struktura enzima se prilagođava supstratu

• Supstrat je “krut”• Enzim menja

konformaciju prilikom vezivanja supstrata

• “Konformaciona promena”

• Aktivne grupe se dovode u poziciju za početak katalize

NOMENKLATURA ENZIMAKako enzimi dobijaju imena

Enzimi dobijaju imena prema:

Supstratu

Reakciji

Supstratu i reakciji

Neinformativni nazivi

KLASIFIKACIJA ENZIMA

FAKTORI KOJI UTIČU NA AKTIVNOST ENZIMA

• Koncentracija enzima

• Koncentracija supstrata

• Temperatura

• pH

• Aktivatori i inhibitori

• Koenzimi

• Alosterični efektori

• Itd…….

KONCENTRACIJA ENZIMA• Kako raste koncentracija enzima raste i brzina

reakcije• Više enzima → više aktivnih centara → češći

sudari sa molekulama supstrata• Dolazi do usporavanja porasta brzine reakcije• Supstrat postaje ograničavajući faktor → ne

mogu svi molekuli enzima naći supstrat

KONCENTRACIJA SUPSTRATA

• Kako raste koncentracija supstrata raste i brzina reakcije

• Više supstrata → češći sudari sa enzimom• Dolazi do usporavanja porasta brzine reakcije• Svi aktivni centri su angažovani → enzim je zasićen

→ postiže se maksimalna brzina reakcije

TEMPERATURA• Optimalna temperatura• Najveći broj molekulskih

sudara• Iznad optimalne

temperature• Povećana energija

molekula dovodi do raskidanja veza u enzimu i između enzima i supstrata (slabe veze…)

• Denaturacija – gubitak 3D strukture

• Ispod optimalne temperature

• Molekuli se kreću sporije, smanjuje se broj sudara između enzima i supstrata

Različiti enzimi kod različitih organizama funkcionišu u različitim uslovima

pH• Promena pH• Dodaje ili oduzima H+ (protonacija i deprotonacija)• Raskida veze, narušava 3D strukturu• Raskida veze između naelektrisanih aminokiselina• Utiče na 2o i 3o strukturu• Denaturiše proteine

Kofaktori i koenzimi

• Kofaktor: neproteinska komponenta enzima • Kofaktor – kokatalizator neophodan za punu

aktivnost enzima• Koenzim – disocijabilni kofaktor obično organske

prirode• Prostetična grupa – nedisocijabilni kofaktor• Vitamin - neophodan sastojak u hrani • Apoenzim - enzim bez kofaktora (neaktivan)• Holoenzim - enzim sa kofaktorom (aktivan)

JEDINJENJA KOJA POMAŽU ENZIMIMAAKTIVATORI - KOFAKTORI

• Mali neorganski molekuli ili joni

• Neproteinske prirode

• Mg2+, K+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Cl-…

• Vezani u molekulu enzima

6.1. Koenzimi

• Većina enzima obavlja svoju katalitičku funkciju uz “pomoć” molekula ili jona - kofaktora koji su nazvani koenzimima i ili prostetičnim grupama. – Oni se razlikuju samo u stepenu afiniteta prema enzimima u toku

enzimskih reakcija (koenzimi se lako, a prostetične grupe teško odvajaju dijalizom od proteinskog dela enzima). Danas se prostetičnom grupom nazivaju takve grupe (molekuli ili joni) koje se hemijski menjaju, a koenzimima grupe odnosno jedinjenja, koja se ne menjaju u enzimskim reakcijama. Oni svoju funkciju biostimulatora obavljaju uglavnom kao posrednici u vezivanju enzima za supstrat, čineći ga tako dostupnom enzimu da ga po mehanizmu enzimske katalize transformiše do krajnjih proizvoda reakcije.

6.1.1. Klasifikacija koenzima

• Većina koenzima sadrži u svojoj strukturi fosfornu kiselinu koja je često povezana u obliku nukleozid-fosfata ili nukleotida. Neki koenzimi sadrže u svojoj strukturi i vitamine te ih nazivamo i derivatima vitamina. Koenzimi se prema vrsti enzima u čiji sastav ulaze mogu podeliti u tri grupe:

• koenzimi oksidoreduktaza, • koenzimi transferaza i• koenzimi liaza, izomeraza i ligaza.

6.1.2. Struktura i funkcija koenzima oksidoreduktaza

• ► Koenzimi oksidoreduktaza su sastojci preko stotinu specifičnih enzima, koji katalizuju oksidoredukcione procese u ćeliji biljaka. Najznačajniji su:

• nikotinamidski nukleotidi,• flavinski nukleotidi,• ubihinoni,• liponska kiselina,• citohromi (hem-proteini) I• ne-hem-proteini.

Funkcija koenzima oksidoreduktazajedna reakcija oksidoredukcije

etanol pirogrožđana kis. etanal mlečna kis.

red1 ox2 ox1 red2

Reakcije oksidoredukcije uvek teku simultano (povezano)

Kod ovih reakcija dolazi do primopredaje elektrona

Kod većine biohemijskih reakcije oksidoredukcija se ostvaruje putem dodavanja i oduzimanja vodonika

CH3 CH2 OH CH3 C COOH

O

CH3 C H

O

CH3 CH COOH

OH

+ +

Funkcija koenzima oksidoreduktazadrugi pogled na jednu reakciju oksidoredukcije

CH3 CH2 OH CH3 C COOH

O

CH3 C H

O

CH3 CH COOH

OH

+ +

CH3 CH2 OH CH3 C H

O

+ 2 H

+CH3 C COOH

O

2 H CH3 CH COOH

OH

ova reakcija oksidoredukcije se može podeliti u dva dela

OKSIDACIJA

REDUKCIJA

koenzimi oksidoreduktazaprenose vodonik

Funkcija koenzima oksidoreduktazadrugi pogled na jednu reakciju oksidoredukcije

CH3 CH2 OH CH3 C H

O

+ 2 HOKSIDACIJA

+CH3 C COOH

O

2 H CH3 CH COOH

OH

REDUKCIJA

Rezervoar (pul) vodonika vezanihza koenzime oksidoreduktaza

A. Nikotinamidski nukleotidi • NIKOTINAMIDSKI

NUKLEOTIDI - su koenzimi nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD+/NADH) i nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP+/NADPH), koji prenose vodonik (H2), odnosno elektrone i protone (H+), pri oksidacijama supstrata sa dehidrogenazama.

– Dokazani su u svim ćelijama. Njihovi redukovani oblici su sastojci mnogih dehidrogenaza u mitohondrijama, citosolu i endoplazmatičnom retikulumu ćelija. Rastvorni su u vodi i obično slobodno difunduju od enzima.

• nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD/NADH)

• nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat (NADP/NADPH),

N

CONH2

N

N

N

N

NH2

O

OH OHOHOH

O

O

OCH2P

O

O

OPCH2OO

N

CONH2

N

N

N

N

NH2

O

OH O P O

O

O

OHOH

O

O

OCH2P

O

O

OPCH2OO

2'

Hemizam delovanja NAD+ i NADP+

• Reaktivno mesto u NAD+ i NADP+ je nikotinamidski prsten (vitamin PP; niacin). Da bi se redukovao potrebna su 2H po molekulu piridinskog prstena nikotinamida. Prvi atom H se razlaže na H+ i e-. – Proton odlazi u rastvor, a

elektron neutrališe pozitivno naelektrisanje piridinijum katjona. Drugi hidridni H atom će se vezati za piridinski prsten čime on gubi aromatičnu (a) i dobija hinoidnu (b) strukturu (slika 6.1-3).

• Hemizam:

A.

B.

N

C O N H 2

H

R

N

H H C O N H 2

R

+ SH 2 + S + H +

SH 2 + NAD + S + NADH + H

+

a) b)

_

C O H

H

H

CONH2

H

N

R

N

H HCONH2

R

+ H+

H3C

H3C C O

H

+

NADHNAD+

+

Acetaldehid

Etanol

__

B. Flavinski nukleotidi

• FLAVINSKI NUKLEOTIDI su koenzimi flavin-mononu-kleotid (FMN) i flavin-adenin-dinukleotid (FAD), derivati riboflavina (vitamina B2). Oni su koenzimi i /ili prostetične grupe dehidrogenaza poznatiji pod nazivom flavoproteini.

– Flavin-mononukleotid (FMN) - je izgradjen iz 6,7-dimetilizoaloksa-zina (flavina), i ribitolskog ostatka vezanog za N u položaju 9. Ribitol je u položaju 5’ esterifikovan fosfornom kiselinom (slika 6.1-8).

– Flavin-adenindinukleotid (FAD) - je izgradjen iz dva nukleotida (riboflavin-fosfata i adenozin-monofosfata) povezanih difosfatnom vezom. FAD je aktivna grupa mnogih enzima.

• Flavin-mononukleotid (FMN)

• Flavin-adenindinukleotid (FAD)H3C

H3C

N

N N

NH

O

O

CH2

C OH

C OH

C OH

C O P O P O

H

H

H

H

H O O

O O

CH2

1

10

O

OH OH

N

N

N

N

NH2

ostatakD-ribitola

ostatak 6,7-dimetilizoaloksazina

adenin

ribofuranoza

6

7

9

H3C N

NNH

N

O

O

H3C

CH2

C2 OH

C3 OH

C4 OH

C5 O P

H

H

H

1

10

6

7

H2

9

6,7-dimetilizo-aloksazin

ribitol

Hemizam delovanja FMN i FAD

► Flavinski nukleotidi kao koenzimi oksidoreduktaza mogu vezivati vodonikove atome na način prikazan na slici 6.1-10. Proizvodi reakcije su FMNH2 ili FADH2 koji nastaju vezivanjem 2 vodonika u položajima 1 i 10 (slika 6.1-10).

• Enzimi zavisni od flavinskih koenzima se nazivaju flavin-zavisnim enzimima, jer sadrže čvrsto vezane FMN ili FAD, zbog čega ove koenzime često ubrajamo i u prostetične grupe.

H3C

H3C

N

N N

NH

O

O

R

+2H

+

N

N N

NHH3C

H3C

O

O

H

HR

1

10

1

10

C. Ubihinoni (Q; CoQ) i Plastohinoni

• UBIHINONI (KOENZIMI Q; CoQ) I PLASTOHINONI - su niskomolekularna redoks jedinjenja respiratornog lanca. Po hemijskom sastavu su benzohinonski derivati koji u bočnom lancu sadrže 6-10 izoprenskih jedinica (slika 6.1-12). Nalaze se najviše u hloroplastima. Razlažu se sporo kiseonikom, UV zracima i sunčevom svetlosti.

• UBIHINONI (CoQ) U raznim živim organizmima nalaze se različiti oblici koenzima Q od Co Q1 do Co Q10. Smatra se da samo CoQ10 je oblik sposo- ban da inicira i modulira ćelijske energetske procese. Ovaj koenzim služi kao prenosilac H koji dobija od NADH.

H 3 C O

H 3 C O

C H 3

O

O

H

C H 3 n

Hemizam delovanja hinona

• Reversna reakcija je dehidrogenovanje hidrohinona u hinon, koja započinje disocijacijom hidrohinona u hidrohinonski anjon uz oslobadjanje dva protona. Dalja oksidacija se odvija u tri stepena odstranjivanja elektrona.

• Plastohinoni

- su poliizoprenski ubihinoni. Po strukturi su slični ubihinonu ali se od njega razlikuju po tome što umesto metoksi grupe sadrže metil grupu u aromatičnom prstenu. Izolovani su iz hloroplasta u kojima prenose elektrone i protone u fotosintezi.

OH

OH

O

O

O

O

O

O

-2H -e -e

2H e e-

-

-

-

+ + ++

+

hidrohinon hidrohinon hidrohinon benzohinon anjon(fenolat) radikal(semihinon)

Slika 6.1-13. Redukcija hinona.

D. Liponska kiselina • Liponska kiselina [Lip(S2)] –

ili tioksična kiselina• je ciklični disulfid koji u bočnom

lancu sadrži karboksilnu grupu. Ona je koenzim u reakcijama u kojima se prenose vodonik i acil-grupe.

• Vezuje se karboksilnom grupom za dehidrogenaze (npr. dihidrolipoil- dehidroge-naza) ili neke transferaze (npr. dihidrolipoil-transferaza) i gradi amidnu vezu sa ε-grupom ostatka lizina. Redukcijom gradi dihidrolipo-nsku kiselinu (slika 6.1-14).

• STRUKTURA (sl.6.1.14)

Liponska kiselina Dihidroliponska kiselina

S S

C H O O

S H S H

C H O O

+2H 2H _

+

+

Arsenik i stare čipkeHemijska osnova trovanja arsenikom

E. CITOHROMI (HEM PROTEINI) • CITOHROMI (HEM PROTEINI) - su

porfirinski hromoproteini koji služe kao redoks katalizatori u respiraciji (prenose elektrone od dehidrogena-za na molekulski kiseonik), konve-rziji energije i dr.

• Sastojci su svih ćelija i vezani su za mitohondrije ili druge ćelijske organele. Hem je po hemijskom sastavu tetrapirolski helat sa gvožđem. Četiri pirola povezana metinskim vezama (CH=) grade tetrapirol ili porfirin u kojem H atomi mogu biti supstituisani alkilnom, hidroksilnom, vinilnom, karbonilnom ili karboksilnom grupom (slika 6.1-15). Oni deluju kao donori ili akceptori elektrona reversnom izmenom valence atoma gvožđa koji se nalaze u centru porfirinskog kompleksa .

citohrom a (sadrži Fe-formilporfirin) citohrom b (sadrži Fe-protoporfirin) citohrom c (sadrži Fe-mezoporfirin sa

kovalentno vezanim ostatkom proteina).

• Struktura hema citohroma b

NCH

N

CHN

HC

N

HC

Fe

CH3 CH

CH2

CH3

HC CH2

CH3CH2

CH2

COO-

CH2

CH2

COO-

H3C

Vinilgrupa

1 2

3

4

56

7

8

I

II

III

IV

Propionilgrupa

Citohrom c

• Citohrom c (Cyt c) - je jedini od citohroma izolovan u kristalnom stanju iz p{enice i njegova primarna struktura je detaljno proučena. To je konjugovani hemoprotein s porfirinskim helatnim kompleksom gvožđa. Sastoji se iz monomernog lanca od 112 aminokiselinskih ostataka. Mr je relativno mala i za većinu biljnih vrsta iznosi oko 13.000, dok npr. Mr citohroma c iz pšenice iznosi 24.000. Jedan molekul citohroma sadrži jedan porfirinski prsten sa Fe-atomom u centru (slika 6.1-15). Porfirinski prsten je kovalentno vezan za proteinski lanac preko sulfhidrilne grupe cisteina.

• Model strukture citohroma c

• Tercijarna struktura cyt C

Funkcije citohroma

• Uloga citohroma u biohe-mijskim procesima je znača -jna i višestruka. Sastavni su deo respiratornog lanca, učestvuju pri enzimskim reakcijama hidroksilovanja, posreduju kod fiksacije N2 u bakterijama itd.

• Citohromi su nazvani i redoks katalizatorima, jer u oksidovanom obliku oduzi-maju elektrone od vodonika i prenose ga u lancu disanja, procesu u kojem se oslobađa energija i skladišti u obliku ATP.

• Citohromi su nazvani i redoks katalizatorima, jer u oksidovanom obliku oduzimaju elektrone od vodonika i prenose ga u lancu disanja (procesu u kojem se osloba|a energija i skladišti u obliku ATP).

F. Ne-hem proteini (feredoksini)

• Ne-hem proteini (Fe-S-proteini) - su posebna grupa redoks jedinjenja koja sadrže Fe-S-centre i učestvuju u prenosu elektrona.

• Kako u svojoj strukturi ne sadrže hem nazivaju se još i ne-hem proteini. Mnogi najvažniji proteini iz ove grupe sadrže i sumpor, kao što je slučaj sa ne-hem proteinima uključenim u transport elektrona; to su Fe-S-proteini kao komponente respiratornog kompleksa. 

• Struktura feredoksina 2Fe-2S

Tercijarna struktura feredoksina

CysS

FeS

Cys

S

SFe

S

SCys

Cys

Prosti Fe-S-proteini (feredoksini-Fd)

• Prosti Fe-S-proteini su feredoksini (Fd). To su niskomolekularni specifični proteini sa Mr 6.000-24.000. Prenose elektrone od jednog enzimskog sistema na drugi, a da sami ne poseduju aktivnost enzima. Izolovani su iz biljaka i fotosintetičkih algi u kristalnom stanju. Primarna struktura je određena kod malog broja feredoksina..

• Feredoksini se prema kvantitativnom udelu atoma Fe i S klasifikuju u četiri grupe i to: 1Fe-1S (bakterijski rubredoksin), 2Fe-2S (biljni, bakterijski i `ivotinjski), 4Fe-4S (nefotosinteti~ki bakterijski) i 8Fe-8S (bakterijski).

• Gvožđe je obično vezano disulfidnom vezom za ostatke cisteina (Cys) u proteinskom delu molekula feredoksina, odnosno za S-2 jon, kao što pokazano slikom.

• Biljni Fd su lokalizovani u hloroplastima u kojima prenose elektrone za fiksaciju N2, redukciju H, fotosintetičku redukciju NADP+, sintezu ketokiselina i fosforilaciju.

• Pored hloroplasta nalaze se i u mitohondrijama gde učestvuju u mnogim reakcijama metabolizma Feredoksin-NADP-oksidoredu-ktaza prenosi elektrone od redukovanog Fd na NADP+ po jednačini (6.1-4).

• 2Fdred + 2H+ + NADP+ 2Fdox + NADPH + H+

Zašto je potrebno toliko koenzima oksidoreduktaza?Svaki od njih ima karakterističan redoks potencijal.

Lanac transporta elektrona - disanje

ENZIMSKA KINETIKAMihaelis-Mentenov model dobro opisuje kinetiku mnogih

enzimskih reakcija

PRVI KORAKNastajanje kompleksa enzim - supstrat

• Jednom stvoreni ES kompleks može ili preći u produkt,

• ili ponovo disocirati na E i S.

Početna brzina enzimske reakcije