IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

Importância:

- Diagnóstico de microrganismos patogênicos

- Estudos ecológicos

- Desenvolvimento de produtos biotecnológicos.

Diferentes espécies podem apresentar morfologia e metabolismo idênticos. Assim, a identificação

requer a observação de um conjunto complexo de características:

1. Morfologia celular: dimensões, forma, arranjos, comportamento tintorial, estruturas e

mobilidade.

2. Características culturais: formas de crescimento das colônias em diferentes meios (meio

em placas, meio inclinado, meio líquido, gelatina), odor.

3. Ecologia: hábitat, proveniência, condições ambientais, patogenicidade, hospedeiros,

resistência.

4. Genética: seqüência de genes específicos, variações transitórias e permanentes.

5. Fisiologia: exigências nutritivas, fontes de carbono e nitrogênio, fatores de crescimento.

As informações devem ser associadas umas às outras e comparadas com as informações do

Manual de Bergey – obra referência oficial da taxonomia de bactérias.

Procedimentos para observar expressões fenotípicas:

1. Meio líquido: observar o aspecto das culturas antes de utilizar nas demais inoculações.

2. Preparar lâmina a fresco: observar motilidade.

3. Preparar lâmina corada: observar reação de Gram, forma, arranjos e estruturas.

4. Inocular placas com ágar-nutriente em estrias cruzadas: observar morfologia das colônias

5. Inocular meio com ágar-amido: observar a hidrólise do amido com algumas gotas de

solução de iodo

6. Inocular meio inclinado em linha reta: observar formas de crescimento

7. Inocular meio com gelatina: verificar atividade proteolítica

Preencher a ficha da página 67 do livro Microbiologia Manual de Aulas Práticas

Culture Reaction Description Culture Reaction Description

Escherichia coli

Esta bactéria forma colônias de tamanho médio com margens regulares e elevação convexa

Klebsiella pneumoniae

Esta bactéria forma colônias ligeiramente úmidas e viscosas, circulares. convexas, com margens lisas.

Serratia marcescens

Colônias são vermelhar e circulares coom margem inteira

Pseudomonas fluorescens

Colônias circulares, convexas e com margens lisas.

Chromobacterium violaceum

Colônias circulares, convexas com margem inteira, e apresentam-se roxas na maioria dos meios

Micrococcus luteus

Colônias puntiformes, convexas com margens lisas, com cor amarelada na maioria dos meios.

Enterococcus faecalis

Colônias puntiformes, convexas, com margens lisas. O tamanho muito reduzido é devido ao metabolismo ineficiente dessa bactéria. Ela pode levar 3-4 dias para alcançar um tamanho apreciável.

Lactobacillus plantarum

Colônias puntiformes, convexas, com margens lisas. . O tamanho reduzido é devido ao metabolismo ineficiente, que pode levar 3-4 dias para atingir um tamanho apreciável.

Bacillus subtilis

Colônias são largas, porém menos que as de B. cereus. As margens são onduladas, com forma circular e uma elevação achatada.

Bacillus cereus

Colônias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

Bacillus polymyxa

Colônias largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

Staphyloccocus epidermidis

Colônias, largas, irregulares e achatadas com margens onduladas.

Exemplos de vários tipos de morfologia das colônias

Descrições das diferentes formas das colônias em placas

- Uma das placas ou tubos poderá ser utilizada para fazer a reação da catalase.

Culture Reaction Description Culture Reaction Description

Escherichia coli

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Klebsiella pneumoniae

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Serratia marcescens

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Pseudomonas fluorescens

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Chromobacterium violaceum

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Micrococcus luteus

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Enterococcus faecalis

Observe a ausência de bolhas. Esta bactéria usa peroxidase para eliminar H2O2, uma enzima que não libera oxigênio.

Lactobacillus plantarum

Observe a ausência de bolhas. Esta bactéria usa peroxidase para eliminar H2O2, uma enzima que não libera oxigênio.

Bacillus subtilis

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Bacillus cereus

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Bacillus polymxya

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Staphylococcus epidermidis

Observe a formação de bolhas. Catalase positiva

Teste para presença de catalase

Características fisiológicas – Provas bioquímicas

Os microrganismos realizam variadas atividades bioquímicas utilizando nutrientes do ambiente que

os rodeia Essas reações que ocorrem dentro ou fora das células são catalisadas por enzimas.

Geralmente, o metabolismo origina produtos finais cuja detecção pode auxiliar na identificação.

Utilização de fontes de carbono:

Provas fermentativas (Glicose, lactose, sacarose, manose, xilose, sorbitol etc.)

Um determinado carboidrato pode ser fermentado originando diferentes produtos finais, o que

depende do microrganismo envolvido. Isso pode gerar gás (que pode ser detectado pela presença

de bolhas no tubo de Durham) e ácidos orgânicos (que pode ser detectado pela mudança de cor do

indicador).

Mesmo com uma reação negativa, o microrganismo pode ter utilizado outros nutrientes do meio de

cultura do teste, como a peptona. As leituras devem ser feitas em no máximo 24 h, pois podem

ocorrer reações alcalinas sobre outros substratos.

Utilizam-se meios básicos (pH 7,2) e o indicador Andrade para ácidos.

VM (Vermelho de Metila)

Teste que avalia se as bactérias fermentam a glicose pela via ácida mista, com a produção de

vários ácidos (ácido fórmico, lático, acético), o que prova o abaixamento do pH a menos 4,4, que é

o limite de viragem do indicador de pH. Embora todas as enterobactérias fermentem glicose, alguns

microrganismos, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos

como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6). O indicador de pH é o

vermelho de metila que em pH abaixo de 4,4 é vermelho e acima de 6 é amarelo. Adicionar 4 gotas

e rolar gentilmente entre a palma das mãos.

VP (Voges Proskauer)

Há bactérias que utilizam a fermentação butilenoglicólica. Fermentam a glicose produzindo acetil-

metil-carbinol (acetoína), butilenoglicol e pequenas quantidades de ácidos. Quando KOH (4 gotas

do Barrit II) é adicionado, e na presença de O2 atmosférico, a acetoína é oxidada a diacetil. A adição

de alfa-naftol (10 gotas do Barrit I) nesta reação catalisa a produção de um anel vermelho tijolo,

após 10-15 minutos. Adicionar primeiro o Barrit I, depois o Barrit II e agitar o tubo para expor ao

oxigênio.

Hidrólise do amido

O amido é um polissacarídeo de elevado peso molecular. Para ser transportado para o interior da

célula e ser utilizado, é necessário, primeiro, que ele seja quebrado em unidades menores. A

habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de várias amilases. A

quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são cobertas com uma

solução de iodo (3 a 4 mL por placa). O iodo reage com o amido para formar um complexo azul

escuro. As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu redor.

Citrato

Este teste determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de

carbono para o metabolismo e crescimento. Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons,

contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol. Com a facilidade do transporte

de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de

amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. Nesse teste, utilizam-se tubos

com meio inclinado para a cultura ter mais acesso ao oxigênio, que é necessário para utilização do

citrato. O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina.

Malonato (teste FM)

Essa prova determina a capacidade de uma bactéria de utilizar malonato como única fonte de

carbono, alcalinizando o meio. O malonato liga-se competitivamente à desidrogenase succínica,

impedindo sua ação catalítica sobre o ácido succínico com interrupção do Ciclo de Krebs, tirando da

bactéria sua principal fonte de energia e impedindo a formação de outros intermediários

necessários ao metabolismo.

Incuba-se a 35-37OC durante 24-48 horas. Indicador azul de bromotimol.

Utilização de fontes de nitrogênio:

Fenilalanina - desaminação (teste FM)

Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio,

originando o ácido fenilpirúvico, que reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio,

formando uma cor verde.

Obs: Como se utiliza o mesmo ensaio para o malonato, é necessário acidificar o meio com HCl, que

passa para amarelo, antes de adicionar o cloreto férrico.

Lisina - descarboxilação

Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos

aminoácidos, com formação de aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. A reação

ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas, mas inicialmente ocorre a

utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio.

O meio contém o indicador bromocresol púrpura. Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se

amarelo devido à fermentação da glicose. Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor

(-) (+)

púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para

agilizar o processo.

Indol

O indol é produzido pela ação da triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura,

ocorrendo, também, a produção de ácido pirúvico e amônia. O indol pode ser detectado pela

formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição de p-

dimetilaminobenzaldeído (reativo de Erlich).

Produção de H2S (meio SIM)

Algumas bactérias são capazes de degradar compostos contendo enxofre (como o tiossulfato de

sódio e a cisteína das peptonas), através da tiossulfato redutase, produzindo H2S que é incolor.

Este reage com o ferro (indicador) formando um precipitado preto (sulfeto ferroso). Para que esta

reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido.

Uréia

Há bactérias que possuem a enzima urease que garante a capacidade de degradar a uréia

presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. A amônia reage formando carbonato de amônia

que alcaliniza o meio. O indicador de pH é o vermelho de fenol que em meio alcalino toma a

coloração magenta. Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.

Redução de Nitratos

Muitas bactérias são capazes de reduzir nitratos a nitritos, ocorrendo mais rapidamente em

condições anaeróbias (condição em que o nitrato substitui o oxigênio como aceptor final de

elétrons). Adicionando-se algumas gotas dos reativos de Griess-Ilosva, o nitrito é evidenciado

através da formação de um composto avermelhado.

Motilidade

A motilidade é observada através do aspecto do meio, isso decorre pelo do fato de o meio ser semi-

sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. Se a motilidade

é positiva o aspecto do meio será turvo enquanto que motilidade negativa o crescimento só será

observado na zona da picada. Fica mais fácil de observar a motilidade pondo os tubos contra uma

folha de papel pautado, se conseguir observar as linhas através do tubo é motilidade negativa.

Escherichia coliEsta bactéria é altamente móvel e provocará turbidez no meio.

Klebsiella pneumoniae

Esta bactéria não é móvel e formará somente uma linha de crescimento.

Provas IMViC (Indol, Vermelho de Metila, Voges-Proskauer, Citrato)

Esta série de quatro provas já vistas anteriormente permite diferenciar os principais grupos de

Enterobacteriaceae:

Grupo I: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella

Grupo II: Klebsiella, Enterobacter, Hafnia, Serratia

Grupo III: Proteus

Grupo IV: Yersinia