Význam imunofenotypizace uzlin v diferenciální diagnostice uzlinového syndromu

Pavlína Tinavská 1, Jana Vondráková 2

1 CL ‐ Pracoviště imunologie, Nemocnice České Budějovice, a.s.2  Oddělení klinické hematologie, Nemocnice České Budějovice, a.s.

Uzlinový syndrom I.

je stav, kdy jsou zvětšeny lymfatické uzliny generalizovaný lokalizovaný

normální uzlina na krku je do velikosti 10 mm, v nadklíčku nehmatné, v axilách a tříslech do velikosti 15 mm 

uzliny musí být volné, měkké a nebolestivé při palpaci

často podceňován – přes nepřítomnost známek infekčního onemocnění opakovaná léčba několika liniemi ATB, často dáván do příčinné souvislosti s anamnestickými protilátkami proti EBV, CMV, borelióze či toxoplazmóze 

pravidlo „2‐2“ u dospělých: jakákoli uzlina větší než 2 cm, která se objevila bez souvislosti s infekcí a perzistuje po dobu delší než jsou 2 měsíce, by měla být histologicky ověřena

uzlina větší než 3 cm bez jednoznačné souvislosti s infekcí či rychle se zvětšující uzlina – vždy bezodkladné histologické ověření

příčinou zvětšení uzlin může být celá řada benigních a maligních onemocnění

Uzlinový syndrom II.

Příčiny lymfadenopatiíZánětlivé zvětšení uzlin

* lokalizované lokálních zánětech kůže, při ORL obtížích, při yersinióze, erysipeloidu, antraxu, difterii, tyfu, paratyfu, leishmanióze aj.

* generalizované při systémových infekcích EBV, CMV, toxoplasmóza, zarděnky, spalničky, tularemie, AIDS, lues, toxokaróza, borrelióza, listerióza, brucelóza, TBC, atypické mykobakteriózy, herpes zoster, infekční hepatitidy aj.

Granulomatózní záněty  Sarkoidóza, histiocytóza X, Wegenerova granulomatóza

Hypersenzitivní reakce postvakcinační lymfadenitida (BCG), sérová nemoc, dráždivé látky – silikóza, berylióza, léky 

Autoimunitní choroby pojiva SLE, RA, Sjögrenův syndrom, dermatomyozytida

Jiné benigní příčiny Kawasakiho nemoc, hypertyreóza, únavový syndrom

Nádorové zvětšení uzlin

* primární – maligní lymfoproliferativní choroby nehodgkinské lymfomy, Hodgkinova choroba, chronická lymfatická leukemie, akutní lymfoblastická leukemie, chronická myeloidní leukemie, akutní myeloidní leukemie, vlasatobuněčná leukemie, myelom

* sekundární – metastázy solidních tumorů

Možnosti vyšetření uzlinového syndromu Vedle konvenčních a funkčních metod (fyzikální vyšetření, KO, 

infekční sérologie, biochemie – laktátdehydrogenáza, CT/PET, KD, EKG, spirometrie) mají zásadní význam nejen pro diagnostiku, ale i pro staging, monitoraci léčby a pro průkaz MRD další laboratorní metody: 

Histologie, imunohistochemieImunofenotypizaceMolekulárně biologické metody (PCR – klonalita = přestavba imunoglobulinových a T buněčných receptorů)Molekulárně cytogenetické metody (FISH – průkaz chromozomálních aberací, př. translokace t(14, 18)q(32,21) u FL)Mikrobiologie

Zpracování uzliny pro vyšetření průtokovou cytometrií

transport nativního vzorku z operačního sálu

mechanická homogenizace vzorku 

filtrace

stanovení buněčnosti suspense 

základní barvení (CD45, CD14, lymfocyty)

měření na průtokovém cytometru

Reprezentativní nativní vzorek !!!

Cíle základní imunofenotypizace uzliny

Definovat:na základě FS/SS a CD45 molekuly leukocytární buňky (CD45+), popřípadě CD45‐ elementy

zastoupení jednotlivých lymfoidních linií (CD19+, CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16+56+ lymfocytů)

klonalitu B lymfocytů (kappa/lambda) a jejich imunofenotyp (CD5, CD10, CD20,CD22, CD23, CD79b, CD200, FMC7)

Panleukocytátní marker CD45

T - markery CD3, CD4, CD8, CD5, CD2, CD7

B - markery CD19, CD20, CD22, CD23, CD79b, CD200, FMC7, HLADR, kappa, lamda

NK - markery CD16, CD56

Reaktivní uzlina (NV, 1983 ž)

• 90 % lymfocytů CD45+, polyklonální CD19+ B lymfocyty (kappa/lambda = 1,3), T lymfocytární predominance CD3+CD2+CD5+CD7+ s IRI = 4,1 a aktivací (HLADR+)

• FCM závěr: imunofenotypově normální nález, reaktivní změny

• Závěrečná diagnóza: zánětlivé změny 

B‐NHL (DLBCL), (JM, 1967 m)

• 59 % lymfocytů CD45+, převaha monoklonálních CD19+ B lymfocytů (kappa+CD10+CD20+CD22+CD79b+CD11c+FMC7++CD5‐CD23‐CD103‐CD25‐), T lymfocytární CD3+CD2+CD5+CD7+ s IRI = 1,5 a bez aktivace (HLADR‐)

• FCM závěr: B‐NHL, vzhledem lokalizace maligních buněk na FS/SS a CD10+ možný DLBCL

• Závěrečná diagnóza: difúzní velkobuněčný B – lymfom, klonální přestavba IgH genu, Klinefelterův XXY sy

B‐NHL (FL), (BJ, 1945 m)

• 98 % lymfocytů CD45+, převaha monoklonálních CD19+ B lymfocytů (kappa+CD10+CD20+CD22+CD79b+CD38+CD5‐CD23‐FMC‐), T lymfocytární CD3+CD2+CD5+CD7+ s IRI = 1,3 a bez aktivace (HLADR‐)

• FCM závěr: B‐NHL, vzhledem CD10+ možný FL

• Závěrečná diagnóza: folikulární lymfom, translokace t(14; 18)

B‐CLL, (MJ, 1934 m)

• 96 % lymfocytů CD45+, převaha CD19+ B lymfocytů (CD5+CD23+CD20dimCD79bdimCD10‐lambda+/‐), T lymfocytární CD3+CD2+CD5+CD7+ s IRI = 1,5  a bez aktivace (HLADR‐)

• FCM závěr: B‐CLL

• Závěrečná diagnóza: B‐CLL, molekulárně nalezen nemutovaný IgH gen

Hodgkinův lymfom, (TI, 1990 m)

• 92 % lymfocytů CD45+, polyklonální CD19+ B lymfocyty (kappa/lambda = 1,5), mírná T lymfocytární predominance CD3+CD2+CD5+CD7+ s IRI = 2,6 a bez aktivace (HLADR‐)

• FCM závěr: imunofenotypově normální polyklonální lymfocyty

• Závěrečná diagnóza: Hodgkinův lymfom 

Nádorová infiltrace, (ŠH, 1936 ž)

• 19 % lymfocytů CD45+ imunofenotypově normální, polyklonální

• Výrazné zastoupení neleukocytárních elementů CD45‐

• FCM závěr: imunofenotypově normální lymfocyty, nelze vyloučit infiltraci nádorovými buňkami CD45‐

• Závěrečná diagnóza: metastáze plicního karcinomu

Kazuistika, (BM, 1953 ž) I.

nevidomá pacientka s vysokou degenerativní myopií   přichází 12/2015 do hematologické ambulance k dořešení paraproteinémie, která jí spolu s osteoporózou a anémií  byla zjištěna po úrazu páteře (11/2015)

subjektivně jí trochu pobolívají záda zejména při pohybu,  bez analgetik, kosti ani klouby nebolí

paraprotein IgA 31,1 g/l (norma 0,7‐ 4,0 g/l)

FLC kappa/FLC lambda 2,615 (norma 0,31 – 1,56)

1/2016 vyšetření kostní dřeně zjišťuje přítomnost asi

37% CD38+CD138+CD56+CD19‐CD27‐CD45‐ckappa+ buněk MM

cytogenetika a molekulární genetika: 40 % hyperdiploidní klon s monozómií chromozómu 13, zlom v lokusu IgH

Dg. Mnohočetný myelom

Kazuistika, (BM, 1953 ž) II.

• vzhledem k věku indikována vysokodávkovaná chemoterapie s podporou kmenových buněk CD34+ (růstovým faktor) a jejich autologní transplantace

• podařilo se nasbírat kvalitní štěp kmenových buněk –transplantace do 1‐2 měsíců 

• nástup k transplantaci – klinicky v pořádku, při vyšetření však zjištěna drobná uzlina (1‐2 cm) v tříslech, vrácena z transplantační jednotky k dovyšetření uzlinového syndromu a vyloučení případného zánětu, resp. nádoru

• zánětlivé markery neg, progresivní zvětšení, tvrdá uzlina• 8/2016 extirpace uzliny – průtoková cytometrie a následně pak histologie prokazuje přítomnost myelomových buněk

Kazuistika, (BM, 1953 ž) III.

• 7 % lymfocytů CD45+ imunofenotypově normální, polyklonální

• 46 % CD38+CD138dimCD45dimCD56+CD19‐CD27‐ckappa+

• FCM závěr: infiltrace buněk MM

• Závěrečná diagnóza: extramedulární myelom

Kazuistika, (BM, 1953 ž) IV.

Staging ‐ PET/CT vyšetření potvrzuje generalizovanou lymfadenopatii většiny uzlin

4 cykly chemoterapie s krátkodobou reakcí a opakovaným relapsem

vysoce agresivní forma MM s extramedulární lokalizací

Kazuistika, (BM, 1953 ž) V.

ZávěrImunofenotypizace uzliny průtokovou cytometrií:

rychlá, citlivá a v mnoha případech diagnostická metoda umožňující v závažných případech bezprostřední léčbu

odlišení uzlin postižených lymfoproliferacemi od metastatických uzlin (negativita CD45 na metastatických   buňkách)

u Hodgkinova lymfomu vyšetření problematické!? (diagnostické maligní buňky HRS tvoří 1‐2% z celé buněčné populace postižených lymfatických uzlin)

Děkuji za pozornost

Bořetice 2017