7. S©quen§age des prot©ines - Universit© de Montr©al badiaa/sequence-   • D©termination

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  • 265

    7. Squenage des protines

    Protine inconnue

    Structure primaire

    squenage des acides amins

    structure secondaire structure tertiaire structure quaternaire

    266

    7.1 Stratgie de squenage dune protine

    Stratgie de base dveloppe par Frederick Sanger en 1953 (Prix Nobel 1958)

    tapes impliques dans le squenage dune protine: Dtermination du nombre de chanes polypeptidiques (sous-units)

    dans la protine Coupure des liens disulfures (inter- ou intramolculaires) Dtermination de la composition des acides amins de chaque chane

    polypeptidique Les chanes polypeptiques sont souvent trop longues pour tre

    directement squences; elles doivent avant tre coupes en des plus petits fragments peptidiques par des ractions spcifiques.

    Dtermination de la squence de chacun des fragments peptidiques par la dgradation dEdman

    lucidation de la squence de chacune des chanes polypeptidiques par recouvrement des squences des diffrents fragments

    Dtermination de la structure de la protine entire, incluant les liens disulfures entre les sous-units

  • 267

    7.2 Analyse des rsidus terminaux

    Puisque chaque chane polypeptidique possde un rsidu N-terminal et C-terminal, le nombre de sous-units distinctes dans une protine peut tre dtermin en identifiant le nombre de chacun des rsidus terminaux.

    NN

    N COO-

    O

    NH3+

    HR

    H

    R H

    O

    H

    H R

    O

    H

    R H

    rsidu N-terminal rsidu C-terminal

    268

    7.2.1 Analyse N-terminal

    Raction avec du chlorure dansyl (ragit avec des -amines):

    N(CH3)2

    SCl

    OO

    HN CH C NH CH C NHR1

    O R2

    OCH CR3

    O

    N(CH3)2

    SO2

    H2N CH C NH CH C NHR1

    O R2

    OCH CR3

    O

    H3O+

    HN CH C OHR1

    O

    N(CH3)2

    SO2

    HCl

    NH3 CH C OHR2

    O

    HN CH C NH CH C NHR1

    O R2

    OCH CR3

    O

    N(CH3)2

    SO2

    NH3 CH CR3

    OOH

    +

    chlorure dansyl

    polypeptide dansyl

    + ++ + + ...

    ...

    ...

    ...

    acide amin dansyl acides amins libres

    (espce fluorescente)

  • 269

    Dgradation dEdman (analyse squentielle):

    =

    phnyl isothiocyanate (PITC)

    (squenage de peptides constitus de 40 60 rsidus)

    270

    NCS

    NH CH C NH CH C NHR1

    O R2

    OCH CR3

    ONH

    C

    S

    H3O+

    H2N CH C NH CH C NHR1

    O R2

    OCH CR3

    O

    2. traitement avec H3O+

    NH3 CH C NHR2

    OCH CR3

    O

    HN N

    OR1

    PhS

    N S

    O

    NHPh

    R1

    +

    PITC polypeptide

    ... ...

    driv phnylthiohydantoin driv thiazolinone

    acide trifluoroactique

    ...++

    rptition du cycle

    max = 296 nm

    1. extraction dans un solvant organique

    PITC

  • 271

    Squenage automatis par dgradation dEdman

    272

    Raction enzymatique (exopeptidase):

    Lutilit des aminopeptidases pour lanalyse des rsidus N-terminalest limite puisque ces enzymes agissent spcifiquement sur certains acides amins et avec des vitesses de raction diffrentes.

    H2N CH C NH CH C NHR1

    O R2

    OCH CR3

    O...

    aminopeptidaseH2N CH C O

    -

    R1

    ONH3 CH C NH

    R2

    OCH CR3

    O...+

    +

  • 273

    7.2.2 Analyse C-terminal

    Il ny pas de processus comparable la dgradation dEdman pour lanalyse squentielle des rsidus C-terminal.

    Raction enzymatique (exopeptidase):

    Due la nature slective des carboxypeptidases, certains rsidus sont rsistants aux coupures ou sont coups trs lentement.

    HN CH C NH CH C NHR3

    O R2

    OCH CO-

    R1

    O...

    carboxypeptidaseH3N CH C O

    -

    R1

    ONH CH C NH

    R2

    OCH CO-

    R3

    O... +

    +

    274

    Raction chimique (ex. hydrazinolyse):

    NH CH C NHRn-1

    OCH CO-

    Rn

    OH3N CH C

    R1

    O

    NH2-NH2

    NH3 CH C NHRn-1

    ONH2H3N CH C O

    -

    Rn

    OH3N CH C NH-NH2

    R1

    O+

    +

    ...

    polypeptide

    90C, 20-100 h

    ++

    +... +

    acide amin libre hydrazines aminoacyles

    conditions lgrement acide

    +

  • 275

    7.3 Coupure des liens disulfures

    +H3N CH

    CH2

    COO-

    SH

    +H3N CH

    CH2

    COO-

    HS

    +H3N CH

    CH2

    COO-

    S

    +H3N CH

    CH2

    COO-

    S

    Cystine Cystine Cystine

    +

    Insuline Les liens disulfuresdoivent tre coupsavant le squenage pour sparer et dplier les sous-units.

    276

    Oxydation avec de lacide performique:

    Toutes les cystines dans une protine sont oxydes (celles qui sont lies ensemble par des ponts disulfures et celles qui sont en forme de thiol).

    Lacide performique ragit aussi avec dautres rsidus; ex. le groupement indole de la Trp est partiellement dtruit et les rsidus Met sont oxyds.

    H C CH2 S S CH2 C H

    N H

    CO

    NH

    C O

    C O OH

    O

    HH C CH2 SO3

    -NH

    C O

    -O3S CH2 C H

    N H

    CO

    Cystine

    +

    Acide cystique

    NH CH C

    O

    (CH2)2

    S

    CH3

    C O OH

    O

    HNH CH C

    O

    (CH2)2

    S

    CH3OO

    Mthionine

  • 277

    Rduction avec du dithiothritol (DTT) ou du 2-mercaptothanol:

    H C CH2 S S CH2 C HN H

    CO

    NH

    C O2 HSCH2CH2OH CH2OH

    CH2SH

    CHOHCH2SH

    H C CH2 SHNH

    C OS

    SHO

    HOHS CH2 C H

    N H

    CO

    SCH2CH2OHSCH2CH2OH

    Cystine

    + ou

    + ou

    Cystines

    278

    H C CH2 SH

    NH

    C O

    ICH2COO- H C CH2 SCH2COO

    -NH

    C O

    +

    Cystine

    Iodoactate

    alkylation

    Cystine protge

    + HI

    Pour empcher la r-oxydation de la cystine forme:

  • 279

    7.4 Dtermination de la composition dacides amins dune protine

    Le nombre de chaque acide amin dans une chane polypeptidique est un paramtre caractristique de chaque protine. Une protine inconnue peut souvent tre identifie en mesurant le pourcentagerelatif des diffrents acides amins et en comparant avec des bases de donnes.

    Premirement, les liens peptidiques dans une protine sont hydrolyss par traitement acide, basique ou enzymatique. Les acides amins librs sont ensuite spars et quantifis.

    Traitement acide: polypeptides + 6 M HCl, reflux 100-120C pour 24 hres sous vide.

    280

    Des temps de raction plus long sont ncessaires pour une hydrolyse complte des rsidus Leu, Val et Ile.

    Par contre, certains rsidus sont dgrads dans ces conditions svres. Trp est considrablement dgrade. La vitesse de dgradation de certains rsidus, tels que Thr, Tyr et Ser peut tre mesure et un facteur de correction peut tre inclut pour tenir compte de la perte de ces acides amins en fonction du temps dhydrolyse.

    De plus, lhydrolyse acide convertit Asn Asp et Gln Glu, respectivement (du NH4+ est limin). Pour dterminer la quantit de ces acides amins, la teneur totale de Asx (Asn + Asp), Glx (Gln + Glu) et NH4+ (Asn + Gln) doit tre mesure et compare.

    Puisque des conditions optimales pour lhydrolyse acide sont difficiles tablir, la raction est effectue plusieurs fois dans des conditions diffrentes et la composition des acides amins est dduite partir des diffrentes expriences dhydrolyse.

  • 281

    Hydrolyse basique: Polypeptides + 6 M NaOH, reflux 100C pendant 4 8 hres. Lhydrolyse basique est seulement utilise dans des cas spciauxpuisquelle est plus problmatique que lhydrolyse acide.Dans ces conditions, Arg, Cys, Ser et Thr sont dcomposes et dautres rsidus sont d-amins et racmiss. Ceci limite lutilisation de lhydrolyse basique la dtermination de la teneur en Trp.

    Les mthodes enzymatiques sont surtout utilises pour la dtermination de lAsn, de la Gln et du Trp. Puisque les exopeptidases et endopeptidases exhibent des spcificits leves, il est essentiel dutiliser un mlange denzymes pour assurer lhydrolyse de tout les liens peptidiques. Des faibles concentrations denzymes doivent tre utilises (~1%) puisquelles sont aussi des protines qui peuvent tre dgrades et contamines le mlange ractionnel.

    282

    Aprs hydrolyse, les acides amins libres sont spars par chromatographie change dions ou par HPLC phase inverse.

    Exemple: composition des acides amins dans un peptide(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)

    Les acides amins peuvent tre identifis selon leur temps de rtention et quantifis selon leur volume dlution.

    HN CH C OHR1

    O

    N(CH3)2

    SO2

    CH C OHR1

    ON

    SCH2CH2OH

    drivs fluorescents

  • 283

    7.5 Coupure spcifique des liens peptidiques

    7.5.1 Fragmentation enzymatique

    Exopeptidases: Coupure dun acide amin N- ou C-terminal dune chane peptidique

    Endopeptidases: Coupure spcifique de liens peptidiques lintrieure dune chane

    284

    trypsine

    Protection de la Lys et de lArg contre lhydrolyse par la trypsine

  • 285

    La charge positive sur ce driv de la cystine rend cet acide amin plus susceptible lhydrolyse par la trypsine.

    286

    Br-

    H2O

    7.5.2 Fragmentation chimique

    Le CNBr coupe les liens peptidiques du ct C-terminal dun rsidu Met.

  • 287

    7.6 Dtermination de lordre des fragments peptidiques

    La squence des fragments peptidiques individuels est dtermin en tablissant lordre dans lequel ils taient connects.

    La squence des acides amins dans un 1er set de fragments est compar avec celui dun 2 set de fragments pour lequel les points de coupure sont diffrents.

    Un recouvrement de quelques rsidus est gnralement suffisant pour identifier un point de connexion.

    288

    7.7 Dtermination