7 " d e " M a y o " d e " 2 0 1 8 ""

d e " t e j i d o s " a " m o l é c u l a s " " ""

UNIVERSDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

UNIDAD DE IMAGENOLOGÍA

Lupa simple

Fotónico compuesto

Estereoscopico binocular

Electrónico de barrido

Epifluorescencia Confocal 1P & 2P

Zacharias Janssen 1590

Anton van Leeuwenhoek >1660

Cristal de roca Niníve Imperio Asirio - 612 a.C.

Johan Giovanni Faber Microscopio 1624

Robert Hooke 1665

Célula

Microscopio simple 1686 Microscopio compuesto 1850

Microscopio compuesto

S I S T E M A S D E U N M I C R O S C O P I O

ILUMINACIÓN M E C Á N I C O ÓPTICO

FUENTE DE

LUZ

CONDENSADOR

DIAFRAGMA

T. MACROMÉTRICO

T. MICROMÉTRICO

TUBO Y REVOLVER

OBJETIVOS

OCULARES

PIE

BRAZO Y

PLATINA

Interacción luz lente A"

B"

Aire Cristal

Haz de luz

Aire

Lente

Índice de refracción A"

B"

ÍNDICES DE REFRACCIÓN DE DIVERSOS MEDIOS

Medio Índice de refracción

Aire 1.00

Agua 1.33

Glicerina 1.45

Aceite de inmersión 1.51

Vidrio 1.52

Fluorita 1.43

Trayectoria de la luz y formación de la imagen

Tipos de lentes

Formación de la imagen

Distintos tipos de óptica corregida utilizada en los microscopios

Tipo de óptica Corrección que realiza

Plan Esférica

Acrómatica Cromática

Neofluor Cromática con lentes de fluorita (λ290nm)

Planacromática Esférica y cromática

Planeofluor Esférica y cromática con lentes de fluorita (λ290nm)

Planapocromatica Esférica y cromática

Ultraflar λ230 – 700nm

Epiplan Luz reflejada

Pol Para polarización

Apertura numérica: es la medida de amplitud del cono luminoso formada por las lentes del microscopio (condensador u objetivo)

Distancia de trabajo: es la medida de la distancia entre la muestra y el objetivo

Apertura numérica

> aumento, >campo visual, distancia focal larga, para uso de gafas

Corrección planar (PL); Aumentos/distancia focal (10X/22), uso de gafas (M), campo amplio (WF),Harmonic component (HC)

Número de aumentos

Poder de Resolución

PR: Es la capacidad de percibir por separado dos puntos adyacentes y cercanos. El poder resolutivo aumenta a medida que disminuye la distancia que separa dichos puntos.

Objetivo Condensador

Límite de Resolución

LR= Longitud de onda

AN del objetivo + AN del condensador

LR: la distancia mínima que debe existir entre dos puntos para que sean distinguidos por separado,

1885

La principal ventaja es la de permitir observar muestras vivas.

Microscopio invertido

Estereoscopico binocular

Contraste de fases

Campo oscuro

Luz polarizada

Microscopia de Contraste por interferencia diferencial (DIC)

Microscopía de disección laser

8 " d e " M a y o " d e " 2 0 1 8 ""

d e " t e j i d o s " a " m o l é c u l a s " " ""

Lupa simple

Fotónico compuesto

Estereoscopico binocular

Electrónico de barrido

Fluorescencia Confocal 1P & 2P

epifluorescencia

Campo amplio

Fluorescencia

Interacción entre la radiación y la materia, el segundo absorbe la radiación de una fuente específica y muy rápidamente emite luz.

Radiación Luz

1) La absorción de la luz de excitación elevala molécula del fluorocromo a un estado deexcitación con un mayor contenido deenergía, S1

2) En este estado de excitación semantienen un tiempo determinado, en elcual la molécula sufre cambiosconformacionales e interacciona con lasmoléculas de su entorno.Como consecuencia, parte de la energía delestado S1 se disipa, creándose un estadoS1’ de menor energía

3) Pasado este tiempo de excitación lamolécula emite luz de menor energíavolviendo a su estado fundamental, S0

S0

S1

S1’

1

2

3

Diagrama de Jablonski

1.#Absorción#de#energía#por#parte#del#fluorocromo##en# estado# fundamental# (S0)# lo# eleva# al# estado#excitado#(S1).##2.# Interacción# con# moléculas# del# entorno# S1,#cambios# conformacionales,# se# disipa# energía#creándose#un#estado#S1’.##3.# Emisión# de# luz# fluorescente# de#menor# energía#en#su#retorno#a#S0##

Diagrama de Jablonsky

Espectro electromagnético

Fluorescencia primaria Fluorescencia secundaria

Fempto"

Nan

o"Pico"

Fluorocromo: molécula capaz de absorber y emitir fotones de menor energía. Fluoróforo: es la parte activa del fluorocromo responsable de la emisión de la fluorescencia.

Disminución de la fluorescencia

1. Photobleaching (Fotoblanqueo). Descomposición irreversible de las moléculas de los fluorocromos. Relacionado con la intensidad y tiempo de excitación de la muestra.

2. Quenching (efriamiento).Cualquier proceso que disminuye el tiempo del estado excitado o el tiempo de vida de un fluorocromo.

Principio microscopia de campo amplio

Sobre"/"en"la"superficie"

Recursos de Iluminación

Las más utilizadas. Proporcionan excitación en el rango del ultravioleta así como en las regiones azul y verde.

Flujo luminoso estable y regular. Máximos irregulares entre 800 y 1.000 nm. Suficiente radiación en 440 a 540 nm, deficientes en el ultravioleta.

Mercurio

Xenon

Filtros

Filtros

Distintos tipos de óptica corregida utilizada en los microscopios

Tipo de óptica Corrección que realiza

Plan Esférica

Acrómatica Cromática

Neofluor Cromática con lentes de fluorita (λ290nm)

Planacromática Esférica y cromática

Planeofluor Esférica y cromática con lentes de fluorita (λ290nm)

Planapocromatica Esférica y cromática

Ultraflar λ230 – 700nm

Epiplan Luz reflejada

Pol Para polarización

Caja de prismas

M I C R O S C O P I O D E F L U O R E S C E N C I A

V E N T A J A S DESVENTAJAS CUANTITATIVA

IMÁGENES IN VIVO

PREVIO AL USO

DEL CONFOCAL

BAJA

RESOLUCIÓN

AUTOFLUORESCENCIA

ALTO

CONTRASTE

ALTA

ESPECIFICIDAD

RÁPIDO

FOTOBLANQUEO

ALTA DISPERSIÓN

DE LA LUZ

IMÁGENES 2D

TIRF, Total internal reflection fluorescence

FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRAP, Fluorescence Recovery After Photobleaching FRAP y FLIP

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específicapor altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación defluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiemporegulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad demacromoléculas.

Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decoloradapor el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célulacompleta. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmentedecolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexiónla fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas,movimiento de proteínas

FLIP, Fluorescence Loss in Photobleaching

FRAP y FLIP

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) se decolora un área específicapor altos pulsos de láser de intensidad. Posteriormente la cinética de recuperación defluorescencia es registrada por imágenes de muestreo en intervalos de tiemporegulares con la iluminación de intensidad baja. Uso: Difusión y movilidad demacromoléculas.

Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) una célula fluorescente es decoloradapor el láser sostenidamente en una única región mientras se registra la célulacompleta. Cualquier región en contacto con el área afectada será gradualmentedecolorada por los movimientos laterales de las proteínas. En regiones sin conexiónla fluorescencia permanecerá intacta. Uso: evaluar continuidad entre áreas,movimiento de proteínas