LIPOZOMII - VECTORI MEDICAMENTOI I COSMETICI

ColegiulFarmacitilordin Romnialipozomii - vectorimedicamentoi i cosmeticiProf. univ. Dumitru Lupuliasa, Prof. univ. Victoria HrjuOrganizator:

Parteneri:

NOVARTISConsumer HealthMartie 20111. IntroducereCercetrile extinse din domeniul tiinelor farmaceutice au condus n ultimele decenii ladezvoltarea unor sisteme inovative de eliberare a ingredientelor active, capabile smbogeasc posibilitile de tratament aflate n prezent la dispoziia farmacoterapiei.n acest sens, se pot meniona sistemele de transport i eliberare la int (vectorizate) de tipmicro- i nanoparticule, microemulsii, emulsii multiple, cristale lichide, lipozomi etc.Lipozomii sunt sisteme veziculare sferice constituite din unul sau mai multe straturi duble delipide amfifile (n principal fosfolipide) dispuse concentric, care nglobeaz un numr egal despaii sau compartimente apoase.Au dimensiuni ce pot fi cuprinse de la 30-50 nm pn la civa p,m.Denumirea provine din limba greac (lipos = grsime i soma = corpuscul), cu referire lacompoziia i forma lor.Figura 1. Seciune transversal n structura unui lipozom unilamelarFigura 2. Reprezentarea schematic a structurii unui lipozom multilamelarLipozomii au fost inventai de Alec Bangham n anii '70, fiind folosii ca modele alemembranelor biologice n studii de biofizic. nc de la nceput, asemenea structuri dedimensiuni coloidale au fost considerate de farmacologi ca fiind sisteme mai mult sau mai puinbiomimetice, capabile s serveasc la administrarea unor substane medicamentoase.Ulterior, lipozomii au fost extensiv cercetai ca sisteme de eliberare sau ca sisteme de transporti eliberare la int (vectori medicamentoi) a unei game largi de ageni terapeutici de mareinteres medical, utili n tratamentul unor boli, prin modularea farmacocineticii i/sau abiodistribuiei substanei active, n beneficiul cii de administrare.ncercrile iniiale de folosire a lipozomilor ca sisteme de eliberare a substanelormedicamentoase au scos n eviden principalul dezavantaj al acestora, i anume clearance-ulnespecific i rapid din circulaia sistemic de celulele sistemului reticulo-endotelial (SRE).S-a considerat ns c recunoaterea de macrofagele SRE ar putea fi util pentru transportulantigenelor, activarea macrofagelor i combaterea infeciilor parazitare.Ulterior, prin controlul caracteristicilor fizico-chimice ale straturilor duble lipidice i ainteraciilor cu mediul biologic s-au investigat i obinut diverse tipuri de lipozomi, care potprezenta interes i pentru alte aplicaii n terapeutic.Tabel 1. Domenii de cercetare i aplicare terapeutic a lipozomilorDomeniu de aplicareCompui ncapsulai

Deficiene enzimaticeLizozim, a-glucozidaz, -glucozidaz

Inginerie geneticCromozomii care exprim sinteza de HGPRT

Chimioterapia canceruluiCitozin-arabinoz, vinblastin, actinomicin D,daunorubicin, metotrexat

Coadjuvani pentru cretereaimunitiiVirus influenzae, antigen pentru hepatita B, toxin difteric

Terapia antimicrobianAntibiotice beta-lactamice, cloramfenicol

Tratamentul intoxicaiei cu metaleEDTA-fosfatidiletanolamin, desferioxamina

Tratamentul artritei reumatoideCorticosteroizi

Coadjuvani pentru absorbie oralInsulin, heparin

Tratamentul infeciilor parazitarePrimachin, clorochin, ketoconazol, compui cu stibiu di- itrivalent

2. Avantajele lipozomilor ca sisteme de eliberare a substanelor medicamentoaseAvantajele principale ale lipozomilor ca vectori medicamentai sunt urmtoarele: au structur versatil care poate fi uor adaptat prin formulare i/ sau preparare, nscopul conferirii unor proprieti necesare pentru o aplicaie specific; pot fi utilizai pentru a include numeroase substane medicamentoase lipofile (nstratul dublu lipidic), hidrofile (n compartimentul apos) sau amfifile (n ambele); sunt ineri din punct de vedere biologic i complet biodegradabili, deoarecefosfolipidele din structura lor sunt constitueni naturali ai membranelor celulare; prin ncapsulare n straturile duble lipidice sau n compartimentele apoase, substanelemedicamentoase sunt protejate fa de aciunea distructiv a unor factori de mediuextern (aer, lumina) sau intern (enzime sau inhibitori prezeni n mediile biologice); ofer noi posibiliti pentru furnizarea agenilor terapeutici ncapsulai la inta vizatdin organism (organ, esut, celul), acetia avnd aceeai evoluie ca lipozomii i fiindeliberai doar la locul lor de desfacere; ca vectori medicamentoi permit administrarea unor compui activi a croradministrare ridic probleme: indice terapeutic sczut, specificitate redus, numeroaseefecte secundare (antitumorale), stabilitate redus (proteine), inaccesibilitatea loculuide aciune (ADN).3. Dezvantajele lipozomilor ca sisteme de eliberare a substanelor medicamentoaseLipozomii prezint i unele dezavantaje poteniale comparativ cu alte sisteme farmaceutice,care le limiteaz folosirea i anume: prepararea poate fi mai costisitoare; pstrarea mai dificil i de scurt durat; incapacitatea de a traversa peretele capilar (cu excepia esuturilor inflamate), avndpredispoziia de a se acumula la nivelul SRE; capacitate de ncapsulare redus a substanelor active; tropism accentuat pentru ficat i splin, dup injectare intravenoas; dirijarea selectiv dificil a substanei medicamentoase ctre esuturi-int; nu constituie un sistem transportor (cru) medicamentos universal, ci prezint avantajespecifice doar pentru anumite aplicaii farmaceutice i cosmetice.4. Obiectivele utilizrii lipozomilorAvantajele menionate anterior justific pe deplin obiectivele urmrite prin folosirealipozomilor ca vectori medicamentai: dirijarea (intirea, vectorizarea) substanei active ctre locul de aciune din organism,crescndu-i eficacitatea terapeutic; prelungirea duratei de eliberare a substanei active ncorporate; lipozomii constituie unfel de rezervor care cedeaz n timp respectivul compus, fapt ce menine nivelele terapeuticeplasmatice sau tisulare ale substanei active un timp mai ndelungat i permite reducereafrecvenei administrrilor; protejarea compusului activ, n special a celui nglobat n compartimentul intern apos allipozomilor, fa de poteniale degradri sub aciunea unor factori ostili din mediul ambiental; protejarea pacientului de efectele toxice ale unor substane active (nefrotoxicitate,cardiotoxicitate etc.) ca urmare a eliberrii acestora chiar n aria patologic/la locul de aciune; posibilitatea eliberrii intracelulare a unor molecule active ca urmare a interaciuniilipozomilor cu celulele int, molecule care n mod normal nu pot ptrunde ca atare n celuledin cauza unor proprieti fizico-chimice restrictive (de exemplu, o mas molecular mare); amplificarea rspunsului imun; lipozomii se pot comporta ca adjuvani imunologici nformulrile vaccinurilor.5. Clasificarea lipozomilorSe pot distinge mai multe criterii de clasificare a lipozomilor: dup dimensiune i organizare; dup natura lipidelor care formeaz stratul dublu lipidic; dup sarcina superficial a veziculei lipozomale; dup metoda de preparare; dup comportamentul in vivo.n continuare sunt prezentate clasificrile n funcie de dimensiune i organizare i dupaplicaiile in vivo.5.1. Clasificarea dup dimensiune i organizaren funcie de numrul de bistraturi (lamelaritate) i de mrime, se disting lipozomimultilamelari i unilamelari.Lipozomi multilamelari (MLV- multilamellar vesicles)Sunt alctuii din mai multe starturi duble (lamele) concentrice lipidice ce nconjoar uncompartiment intern apos relativ mic. Au un diametru cuprins ntre 0,4 i 3,5 pm.Figura 3. Seciune n structura schematic a unui lipozom multilamelarLipozomi unilamelari (ULV- unilamellar vesicles)n aceti lipozomi exist doar o singur structur bistratificat ce nconjoar un nucleu aposintern.Figura 4. Seciune n structura schematic a unui lipozom multilamelarn cadrul acestui grup se disting cteva subcategorii, n funcie de mrime:- lipozomi unilamelari mici (SUV - small unilamellar vesicles), cu o dimensiune a veziculelorcuprins ntre 20 i 40 nm; au o capacitate redus de ncapsulare (0,1-1%), dependent deconcentraia lipidic, care le limiteaz aplicabilitatea ca sisteme de eliberare a substanelormedicamentoase; lipozomi unilamelari medii (MUV - medium unilamellar vesicles), cu o mrime a veziculelorcuprins n domeniul 40-80 nm; lipozomi unilamelari mari (LUV - large unilamellar vesicles), cu un nucleu intern apos mare,avnd o dimensiune de la 10 la 1.000 nm , fapt ce permite ncapsularea unor cantiti mai maride substane active dect SUV; lipozomi unilamelari gigani (GUV - giant unilamellar vesicles), a cror dimensiune depete1.000 nm i care sunt, probabil, cei mai instabili din considerente fizico-mecanice.Lipozomi multiveziculari (MVV - multivesicullar vesicles)- n care o vezicul mare conine vezicule mai mici, n mod obinuit unilamelare.Figura 5. Tablou sinoptic al reprezentrii structurilor lipozomaleMrimea i modul de organizare ale lipozomilor sunt determinate de metoda folosit pentruobinerea lor.5.2. Dup compoziie i aplicaiile in vivoSe disting: lipozomi convenionali; lipozomi de lung circulaie (PEG-ylai , ascuni, disimulai); imunolipozomi;- lipozomi cationici.Ultimele trei tipuri de lipozomi au fost concepui pentru a rspunde unor cerine terapeuticespecifice prin schimbarea caracteristicilor lor structurale i fizico-chimice. Aceste schimbripermit modificarea comportamentului in vivo al lipozomilor cu scopul de a atinge obiectivebine definite.Tabel 2. Clasificarea lipozomilor n funcie de evoluia in vivoTip de lipozomiUtilizarea principal

intirea macrofagelor

Lipozomi convenionaliDepozit localizat

Vaccinare

Lipozomi cu circulaie ndelungatintirea selectiv a ariei patologiceMicrorezervor circulant

Imunolipozomiintire specific; pilotai de anticorpi

Lipozomi cationiciEliberarea la int a genelor

Lipozomi convenionaliSunt lipozomi alctuii doar din fosfolipide (neutre i/sau ncrcate negativ) i/sau colesterol. Au untimp de circulaie n fluxul sangvin relativ scurt. Biodistribuia lor depinde n mare msur deproprietile lor fizico-chimice (mrime, potenial zeta, compoziie) i de condiiile fiziologicei patologice ale organismului. Aceti lipozomi realizeaz o intire pasiv a moleculelormedicamentoase.Cnd sunt administrai pe cile parenterale (foarte des pe cale i.v.) prezint o tendin puternicde acumulare rapid n celulele sistemului fagocitar mononuclear (MPS) i frecvent, n sistemulreticuloendotelial (SRE). Splina i ficatul, datorit abundenei de macrofage MPS i a uneiirigri sangvine bogate, reprezint organele principale de acumulare.De aceea, acest tip de lipozomi sunt candidai potrivii pentru eliberarea substanelormedicamentoase n macrofagele sistemului fagocitar mononuclear, putnd fi incrcai cusubstane antimicrobiene sau imunomodulatoare.Au dezavantajul c sunt rapid eliminai din circulaie de macrofage, fapt ce compromite nmare msur utilizarea lor n tratamentul bolilor care sunt extinse i la alte arii aleorganismului.Lipozomi cu circulaie ndelungat (PEG-ylai, ascuni)S-au dezvoltat cu scopul de a evita preluarea lor de SRE i implicit de a prelungi timpul decirculaie a acestora n organism (T1/2 la om este de aproximativ 48 de ore).S-au obinut prin grefarea pe suprafaa lor a unor lanuri liniare de polietilenglicoli (PEG-uri),polimeri hidrofili ineri.Figura 6. Reprezentarea schematic a lipozomilor cu circulaie lungLipozomii pe care sunt grefate moleculele de PEG (stabilizai steric) evit recunoaterea desistemul imunitar.Stabilizarea steric rezult din concentrarea local la suprafaa lipozomilor a gruprilor PEGnalt hidratate, care confer o barier steric ntre lipozomii pe care s-au grefat PEG-urilempotriva interaciunilor cu componentele moleculare i celulare din mediul biologic.Moleculele de PEG neutralizeaz sarcina electric a veziculelor i previne astfel opsonizarealor. De asemenea, opsonizarea lipozomilor este redus din cauza inabilitii opsoninelor de alega de suprafee hidrofile. n plus, grosimea stratului de PEG (dependent de masa moleculari de procentul ncorporat n compoziia lipozomilor) influeneaz interacia lipozomilor cumacrofagele.Apariia acestui tip de vezicule a dus la un reviriment al interesului fa de sistemele deeliberare lipozomale i a deschis oportuniti terapeutice noi n raport cu lipozomiiconvenionali.Cea mai important caracteristic a lipozomilor de lung circulaie este faptul c sunt capabilis extravazeze n locurile din organism n care permeabilitatea peretelui vascular este ridicat,incluznd tumori solide i arii infectate sau inflamate.Produsele autorizate pentru uz clinic, Doxil- doxorubicin i DaunoXome - daunorubicin,reprezint exemple de formulri lipozomale de acest tip.ImunolipozomiiImunolipozomii conin pe suprafaa bistratului lipidic anticorpi specifici sau fragmente deanticorpi, cu scopul de a mri legarea de locul-int.Dei imunolipozomii au fost cercetai pentru diverse aplicaii terapeutice, interesul a fost nprincipal centrat pe eliberarea la int a agenilor antitumorali.Totui, accesul lor din circulaia sangvin n alte locuri dect ficatul i splina este dificil,administrarea local n cavitile organismului prezentnd un interes mai mare.Aceti lipozomi sunt potrivii pentru inducerea imunitii umorale i celulare in vivo, putnd fifolosii n procedurile de imunizare ca vehicule ideale pentru vaccinuri.Figura 7. Reprezentarea schematic a unui imunolipozomLipozomi cationiciLipozomii cationici, denumii i catezomi, sunt cei mai noi reprezentani, fiind cercetai pentrumbuntirea cedrii materialului genetic. Sunt constituii dintr-un compus amfifil cationic ilipide neutre.Transferul genei este mediat de interacia electrostatic a lipozomilor ncrcai electric pozitivcu secvenele oligonucleotidice ale ADN-ului ncrcat negativ. Se formeaz compleci capabilis ptrund n celul, unde ADN-ul este cedat lent nucleului acesteia.Din aceast categorie sunt disponibile comercial produsele LipofectAMINE, LipofectAce,Lipofectine (GIBCO/BRL), Transfectam (Promega) i DOTAP (Boeringer).6. Formularea lipozomilorn formularea lipozomilor se gsesc urmtoarele categorii de componente: componentele stratului dublu lipidic; componentele compartimentului apos; substana activ.Componentele care intr n formularea lipozomilor joac un rol important n stabilizarea in modul lor de aciune.6.1. Componentele bistratului lipidicFosfolipideFosfolipidele reprezint componenta principal, elementul constructiv al lipozomilor. Suntbiomacromolecule naturale care joac un rol important n fiziologia uman, fiind componentestructurale ale membranelor biologice.Aceste molecule amfifile constau dintr-o parte polar, hidrofil, i una hidrofob, avnddimensiune i sarcin variabile, precum i un lan dublu hidrocarbonat saturat sau nesaturatformat din 12-24 de atomi de carbon.n procesul de formare a lipozomilor, moleculele se autoorganizeaz prin orientarea prilorpolare ctre faza apoas, n timp ce lanurile hidrocarbonate ader unele de altele sub formaunui bistrat. Aceasta se datoreaz probabil structurii lor constituit din lanuri de acizi grainesaturai, care imprim moleculei o form tubular adecvat pentru aranjarea n folii plane,deosebindu-se de lipidele monocatenare care au tendina de a se organiza sub forma de miceleIsotropichexagonal IInverted coneMicellesLame ar(Cubic)CylinderBilayerReversemicei eshexagonal IILamellarFigura 9. Modele geometrice de organizare a lipidelor la dispersarea n apn prezent, este disponibil un numr mare de lipide amfifilice naturale, de semisintez sausintez, care poate fi inclus n formularea lipozomilor, redate n tabelul urmtor:Tabel 3AbreviereDenumire

DMPCDimiristoil-fosfatidilcolin

DPPCDipalmitoil-fosfatidilcolin

DSPCDistearil-fosfatidilcolin

DLPCDilauril-fosfatidilcolin

DOPCDioleoil-fosfatidilcolin

DGPCDiglicerilil-fosfatidilcolin

DMPEDimiristoil-fosfatidiletanolamin

DPPEDipalmitoil-fosfatidiletanolamin

DSPEDistearil-fosfatidiletanolamin

DPPGDipalmitoil-fosfatidilglicerol

DSPGDistearil-fosfatidilglicerol

DPPAAcid dipalmitoil-fosfatidic

DPPSDipalmitoil-fosfatidilserin

DSPSDistearil-fosfatidilserin

Dintre acestea, cele mai folosite sunt fosfatidilcolinele, cunoscute i sub denumirea de lecitine,obinute din surse naturale sau prin sintez.Dintre fosfolipide naturale, uzual se folosesc lecitina de ou i lecitina de soia, care sunt ieftine,lipsite de sarcin i inerte chimic.n tabelul urmtor sunt redate unele caracteristici ale unor lipide folosite la prepararealipozomilor.Tabel 4. Caracteristicile unor fosfolipide utilizate n formularea lipozomilorLipideCaracteristici principaleFosfatidilcolina din glbenu de ou (PC)- component majoritar utilizat frecventn formularea lipozomilor

Dipalmitilfosfatidilcolina (DPPC)- fosfolipid sintetic saturat

Distearilfosfatidilcolina (DSPC)- fosfolipid sintetic saturat, mai puinpremeabil pentru faza apoas dectfosfatidilcolina

Sfingomielina (SM)- crete stabilitatea lipozomilor ,,in vitro

Colesterol (CH) reduce permeabilitatea veziculelor defosfatidilcolin proporia maxim de ncorporat este de 50moli %

Stearilamina (SA) confer suprafeei lipozomului sarcinelectric pozitiv poate fi toxic pentru pereii celulari

Diacetilfosfat (DACP) confer suprafeei lipozomului sarcinelectric negativ poate fi toxic pentru pereii celulari

Acid fosfatidic (PA)- confer bistratului sarcin electricnegativ

Fosfatidilserina (PS)- confer bistratului sarcin electricnegativ

Cardiolipida (CL)- lipid antigenic care se utilizeaz naplicaii imunologice

Fosfatidildiletanolamina (PE) nu formeaz vezicule nchise se utilizeaz, cnd este necesar ca unmaterial capabil s se cupleze cu lipozomii derivaii substituii se utilizeaz n studiiimunologice

Lizofosfatidilcolina (LPC) crete permeabilitatea lipozomal poate mri fuziunea lipozomilor cucelulele

Ali aditivi n bistraturile lipidiceLipozomii alctuii doar din fosfolipide nu sunt suficient de rigizi, n principal din cauzatemperaturilor de tranziie de faz mai joase i/sau nesaturrii lanurilor acil prezente nstructur, care determin imperfeciuni n aranjarea sub forma de bistraturi lipidice.De aceea, din asemenea lipozomi are loc aproape ntotdeauna scurgerea (pierderea) substaneimedicamentoase ncapsulate n timpul conservrii.Pentru a preveni acest neajuns, n compoziia lipozomilor sunt inclui unul sau mai muli aditivi(de exemplu colesterol sau a-tocoferol) care mbuntesc rigiditatea i hidrofobicitateamembranei, reducndu-i permeabilitatea. Colesterolul, cel mai utilizat sterol, poate fi uorinserat n straturile duble lipidice, ca urmare a interaciilor cu fosfolipidele din membranelelipidice, cu modificarea conformaiei lanului acil-lipidic din membrana lipozomal.Colesterolul inserat n membrana lipozomal, datorit nucleului steroid rigid, realizeaz ompachetare strns a stratului dublu lipidic i o diminuare/evitare a scurgerii substanei activenglobate n bistrat sau n compartimentul apos.a-tocoferolul acioneaz att pentru consolidarea membranei, ct i ca antioxidant, protejndlipidele de procesul oxidativ.S-au obinut i compui conjugai ai lipidelor cu polietilenglicoli, care se utilizeaz frecvent nformulrile lipozomale.De asemenea, se folosesc i fosfolipide funcionalizate (obinute prin conjugare, cu formarea delegturi amidice, disulfidice sau tioeter) utilizate pentru ataarea covalent sau necovalent aproteinelor, peptidelor sau a altor substane active la suprafaa lipozomilor.6.2. Componentele compartimentului aposAceasta faz poate fi reprezentat de ap distilat sau purificat sau de soluia apoas a uneisubstane active.n faza hidrofil se pot dizolva sisteme sau substane tampon, n cazul lipozomilor care se obinprintr-o metod bazat pe existena unui gradient de pH ori a formulrilor care necesitajustarea pH-ului pentru asigurarea stabilitii substanei medicamentoase i a lipozomilor.6.3. Alte componentePentru formarea i stabilizarea lipozomilor este deseori necesar adugarea i a altorcomponente. Astfel, atunci cnd se prepar lipozomi cu sarcin superficial, se adaug, deexemplu, stearilamin i dicetilfosfat.Dac la preparare se folosesc lipide nesaturate, pot fi ncorporai antioxidani precumbutilhidroxitoluen, a-tocoferol i a-hidroxiacizi. Alegerea acestora se face cu atenie pentru anu interfera cu lipozomii i a nu ptrunde n interiorul lor.Agenii de chelatare (EDTA) sunt inclui pentru a reduce oxidarea catalitic a lipidelor ce poatefi indus de contaminarea cu ioni metalici.Pentru a menine izotonicitatea este esenial adugarea clorurii de sodiu sau a unor srurisimilare.Unele metode de preparare (liofilizarea sau criodesicarea) necesit aditivi speciali, precumagenii crioprotectori, destinai s asigure stabilitatea lipidelor i a substanelormedicamentoase instabile n ap n timpul preparrii (rehidratrii).Agenii antifungici i antimicrobieni pot fi adugai cu scopul de a asigura stabilitateamicrobiologic a preparatelor lipozomale.Parfumuri si colorani se pot include n lipozomi cosmetici.Aadar, lipozomii sunt sisteme farmaceutice care prezint o mare flexibilitate n design prinmodificarea structurii i a proprietilor fizico-chimice.Prin selectarea atent a componentelor incluse n formulare se pot modela unele proprieti alelipozomilor (sarcina superficial, randamentul de ncrcare cu substan activ etc.) ca icomportarea in vivo, astfel nct acesta s satisfac o aciune terapeutic specific.6.4 Substane activeLipozomii pot conine i vehicula substane active diverse, cu caracter hidrofil, lipofil sauamfifil.n tabelul urmtor sunt trecute n revist exemple de substane active investigate pentruincluderea n lipozomi.

Tabel 5. Substane medicamentoase investigate pentru a fi incorporate n lipozomiEnzimehexozaminidaza A, amiloglucozidaza, peroxidaza, dextranaza,hexochinaza, P-galactozidaza, elastaza, ATP-sintetaza,superoxid dismutaza, catalaze

Substaneactinomicina D, bleomicina, cisplatina, daunorubicina,

antitumoraledoxorubicina, amfotericina B, fluoxuridina, 5-fluorouracil,mercaptopurina, metotrexat, vinblastina, vincristina

Vectori deinterferon, interleukine

imunomodulare

Insulinoterapiceinsulina

Substanederivai de antimoniu, grizeofulvin, amfotericina B, 5-

antiparazitarefluorouracil

Ageni chelataniEDTA

Antiinflamatoarehidrocortizon, prednison, triamcinolon, dexametazon

Polinucleotideinterferon

Adjuvani deantigeni, vaccinuri, anatoxin difteric, virus gripal, agentul HB

imunizareal hepatitei virale, antigeni din Plasmodium falciparum -antipaludic, antigeni din celule tumorale (limfocitomi)

Substane diverse: antiinfecioase interferon hormoni steroidici angiostensina II heparin substane pentru tratamentul infarctului miocardic factor VIII hemoglobin substane pentru tratamentul insuficienei respiratorii substane de contrast: acid diatrizoic (renografina),hidroxitalamat de sodiu produse radiofarmaceutice pentru diagnostic: 99Tc (nlimfoscintigrafie i studiul distribuiei lipidelor n organism) produse ca: citocrom b5; hidroxicobalamina, clorura de litiu,procaina

6.4. Obiectivele principale ale formulrii lipozomilorn ceea ce privete obiectivele principale ale formulrii lipozomilor, acestea constau n: formarea i stabilizarea structurilor veziculare bistratificate; ncorporarea i/sau ncapsularea substanelor active n lipozomi; asigurarea stabilitii fizice, chimice, microbiologice i biologice pe perioada devalabilitate a formulrii lipozomale; realizarea unor caracteristici specifice formei farmaceutice, dependent de calea deadministrare; asigurarea inocuitii, toleranei i eficacitii terapeutice.6.5.1. Formarea i stabilizarea lipozomilorFormarea i stabilizarea lipozomilor au la baz proprietile unor lipide i a altor compuiamfifili care prin dispersare n ap pot produce, aa cum s-a menionat deja, structuri coloidalediverse (vezicule, micele, nano-emulsii) n funcie de preponderena prii hidrofile sau lipofilea moleculei.Atunci cnd predomin partea hidrofil, exist tendina de formare a micelelor, iar dacpredomin partea lipofil (hidrofob), se manifest capacitatea de a forma n mod spontanstructuri bistratificate (lipozomi) atunci cnd se adaug cantiti mici de ap.

+ apVitamineA, E, F, D, K ( mai ales n produsele cosmetice)partehidrofilpartelipofilmolecul de fosfolipidFigura 10. Etapele formrii lipozomilorn formarea i stabilizarea lipozomilor intervin o serie de factori precum: proprietile structurale ale substanelor lipofile amfifilice; proprietile superficiale i electrice ale componentelor; proprietile dimensionale i optice;

- proprietile reologice.La acestea se adaug i: raportul molar fosfolipide/ap, temperatura, prezena ionilor de Ca2+ metoda depreparare a lipozomilor.Dintre factorii de mai sus, relevani sunt mrimea i distribuia dup mrime a lipozomilor isarcina superficial a acestora.Dimensiunea i distribuia dup mrime a veziculelor lipozomaleDimensiunile lipozomilor depind de metoda de preparare i de aparatura utilizat.Sunt proprieti importante care influeneaz: proprietile fizice ale lipozomilor; capacitatea de ncapsulare a substanei active; comportarea biologic.Lipozomii trebuie s fie mai mici dect porii vasculari pentru a extravasa i a ajunge ntumorile solide. Totodat, lipozomii cu dimensiuni mai mici (0,001-10pm) asigur o stabilitatemai mare, iar veziculele mai mici de 100 nm necesit strategii suplimentare pentru a preveniopsonizarea i pentru a prelungi semiviaa biologic (sau durata de circulaie n fluxul sangvin).Sarcina superficial a lipozomilorProprietile electrice ale suprafeei membranare a lipozomilor pot influena stabilitatea fizic adispersiilor lipozomale pe durata stocrii ca i comportamentul lipozomilor n mediul biologici interacia lor cu celulele.Agregarea lipozomilor, adic modificarea dimensiunilor originare, in vitro i in vivo reprezinto problem major de stabilitate. De aceea, este preferabil ca sarcina superficial a lipozomilors fie mare pentru a mpiedica fenomenul de reunire a lipozomilor.Introducerea unor molecule naturale (glicolipide, lectine, anticorpi) pe suprafaa lipozomilor leconfer stabilitate fa de autoagregare i interacii nespecifice. Un efect similar se obine iprin grefarea pe suprafaa lipozomilor a unor polimeri hidrofili (PEG-uri), care protejeazlipozomii cu o barier steric ce inhib adsorbia componentelor sangvine.n tabelul de mai jos sunt redate metodele de modelare a proprietilor fizico-chimice alelipozomilor i consecinele modificrilor rezultate asupra stabilitii i comportamentuluibiologic al lipozomilor.Tabel 6. Metode i rezultate ale modificrii proprietilor fizico-chimice ale lipidelorProprieti fizico-chimiceMetoda aplicatRezultatul modificrii

Distribuia mrimiiparticulelorsonicare, extrudere,microfluidizare controlul timpului decirculaie creterea extravazrii

Permeabilitatea membraneimodificarea compoziieilipidice (colesterol) creterea stabilitiilipozomilor sensibilitate indus de pHsau temperatur

Tendina de agregare saufuziunemodificarea compoziieilipidelor, adugarea decationic-formarea structurii carepoate transporta antigene,ADN, vaccinuri

Hidrofobicitatea suprafeeistabilizarea steric pringrefarea moleculelorhidrofile pe suprafaalipozomilor (dextranilineari, derivai lipidici depolimeri hidrofili)-creterea timpului decirculaie-modificareafarmacocineticii idistribuirii tisulare alipozomilor i substanelorncapsulate

Randament de ncrcare asubstanei activencrcare activ sau de ladistan- ncapsularea lipozomilorstabili cu substanemedicamentoase (nrapoarte mari ntresubstan medicamentoas:component lipidic)

Elasticitate, rigiditateintroducerea de detergenisau activatori marginali ilipide cutanate (ceramide)n preparate lipozomice- creterea penetraieicutanate i retenia n piele,(favorabil absorbieitransdermice a substanelormedicamentoaselipozomale)

Proprieti superficiale,adiia unor liganzi specifici- potenial crescut pentru

stabilitatea lipozomilor ipe suprafaa lipozomilor,intire eficace

alte proprietiasociat cu stabilizarea

steric

6.5.2. Incorporarea sau ncapsularea substanelor active n lipozomiSubstanele active pot fi incluse n lipozomi pe trei ci: prin ncorporare n structura lipozomilor; prin asociere cu lipozomii preformai; prin formarea unui sistem compatibil cu acetia.Toate aceste forme se pot obine prin procedee diferite i anume: ncapsularea substanei hidrofile n compartimentul apos al lipozomilor; interaciunea electrostatic cu lipidele ncrcate electric din compoziia stratului dubluelectric; interacia hidrofob cu lipidele constituente ale bistratului; legtura chimic cu lipidele bistratului; combinarea acestor mecanisme.Incapsularea substanelor active hidrofileEste o faz critic a preparrii, care se evalueaz prin 2 parametri: eficacitatea (randamentul) de ncapsulare, respectiv procentul de substan activncapsulat n compartimentul apos, parametru ce depinde de cantitile relative delipide i ap din formularea lipozomilor; volumul compartimentului apos, care depinde de dimensiunea i numrul de bistraturidin vezicula lipozomal.Randamentul de ncorporare a substanei active n lipozomi, esenial pentru eficacitatea clinica formulrilor lipozomale, depinde de o serie de factori: concentraia de substan hidrosolubil.Dac ncapsularea substanei este pasiv, adic nu interfereaz cu nici un alt proces, atunciconcentraia n compartimentul apos intern este identic cu cea din exterior. Cnd concentraiade substan iniial este mare, cantitatea de substan activ ncapsulat va fi crescut. Se potaplica i tehnici de ncapsulare prin transportul activ al substanei active n lipozomi, deexemplu prin crearea unui gradient de pH. tipul i mrimea veziculelor.Randamentul de ncapsulare a substanei hidrofile este mai mare n cazul lipozomilor marimultilamelari, deci coninnd mai multe compartimente apoase. sarcina electric a lipidelor.Volumul compartimentului care separ bistraturile lipozomilor multilamelari este, n general,mai mic de 0,01 pm.Adugarea de lipide ncrcate cu sarcini electrice antreneaz respingerea electrostatic ntrestraturile duble electrice adiacente, rezultnd mrirea compartimentului apos chiar i pn la50%. tria ionic a mediului apos.Dac veziculele lipozomale nu sunt ncrcate cu sarcini electrice (de exemplu cele formulate pebaz de fosfatidilcolin), compartimentul apos nu este influenat de tria ionic a mediului.n cazul n care bistratul este ncrcat electric (conine fosfatidilglicerol) compartimentul aposeste redus prin creterea triei ionice (respectiv prin neutralizarea sarcinilor electrice de ioniiprezeni n mediu). natura fosfolipidelor.Aceast parametru influeneaz rigiditatea i deci, permeabilitatea bistraturilor lipozomilor. concentraia de cholesterol.Colesterolul mrete rigiditatea i permeabilitatea stratului dublu lipidic.Coninutul de colesterol din bistrat influeneaz nivelul de ncapsulare a substanei active pnla o anumit valoare, peste care colesterolul nsui nu mai poate fi inclus n bistrat i tinde scristalizeze. condiiile de fabricare/preparare a lipozomilor.Influeneaz tipul, mrimea i distribuia dup mrime a lipozomilor.Incorporarea substanelor lipofilei ncorporarea substanelor active lipofile n bistratul lipidic este influenat de o serie defactori: natura substanei lipofile.Cu ct lipofilia unei substane este mai mare, cu att procentul de ncorporare este mai mare. concentraia substanei lipofile.ncorporarea crete cu creterea concentraiei substanei active lipofile pn la o limit i la unanumit raport substan lipofil/lipidele din bistratul lipozomal.- natura fosfolipidelor, concentraia de colesterol i condiiile de fabricare.NOVARTISConsumiT Hcaii lin general, ncapsularea unei substane lipofile este favorizat dac bistraturile lipidice prezinto oarecare fluiditate; adugarea de colesterol scade procentul de substan lipofilicncorporat.- Temperature.Este un parametru care influeneaz n mod diferit ncapsularea unei substane lipofile; pentruunele substane active asocierea este maxim la temperatura de tranziie de faz a componenteilipidice.Tehnici de ncorporare a substanelor active n lipozomiPentru ncorporarea lipozomilor cu substane medicamentoase se folosesc strategii de ncrcarepasiv sau activ.ncrcarea pasiv se efectueaz n timpul formrii lipozomilor sau n condiiile n carestructura lipozomilor nu este consolidat n procesul de obinere. Produsul rezultat poateconine proporii mari de substan medicamentoas nencorporat, a crei ndeprare dinsuspensia lipozomal este laborioas. De asemenea, dup ndeprtarea complet a substaneiactive rmas nencrcat, datorit dezechilibrului osmotic creat (gradientului de concentraie),substana medicamentoas ncorporat se scurge din lipozomi n timpul pstrrii.ncorporarea prin strategii active sau de la distan se refer la tehnici de ncrcare a substaneiactive dup formarea veziculelor, fr afectarea integritii bistratului lipozomal. Acestprocedeu se bazeaz n principiu pe crearea unei diferene ntre mediul interior i cel exterior allipozomilor, prin intermediul creia se asigur un singur sens de pasaj (de la exterior lainterior) pentru moleculele de substan medicamentoas. Datorit acestei diferene, poate fiobinut o ncrcare de aproape 100%, evitndu-se necesitatea ndeprtrii substaneinencapsulate.Metodele de ncrcare activ se bazeaz pe crearea unei gradient de pH, pe folosirea perechilorde ioni sau a complexrii cu liganzi. ncrcarea activ reprezint un avantaj pentru substanelemedicamntoase labile care se pot ncrca chiar nainte de utilizarea preparatelor lipozomale.Metoda deshidratrii lipozomilor prin liofilizare (criodesicare)Este o metod simpl de obinere a lipozomilor cu volume apoase de ncapsulare mari, care sedesfoar n condiii blnde.n aceast metod, o suspensie de vezicule unilamelare mici, mpreun cu materialul dencapsulat, este liofilizat prin mijloace convenionale. Se formeaz o structur asemntoareunei spume afinate, avnd o arie a suprafeei mare. Hidratarea eficient a acestei spume sepoate realiza cu ajutorul unui volum mic de ap distilat ori soluie tampon, rezultnd veziculemultilamelare cu o mare eficacitate de ncapsulare.Pe lng avantajul unor condiii blnde de preparare, lipozomii obinui prin aceats metod potfi pstrai o perioad de timp relativ mai lung, rehidratarea fcndu-se chiar nainte deutilizarea suspensiei lipozomale.In acest procedeu modern de preparare, intervin compoziia lipidic, asocierea de agenicrioprotectori, condiiile de congelare (viteza de congelare nu trebuie s fie prea rapid sauprea lent).Agenii crioprotectori au rolul de a preveni fuziunea, agregarea i pierderea componentelorncapsulate prin formarea unor structuri amorfe i/sau interacia cu grupele fosfolipidice.Crioprotectorii (dizaharide precum maltoza, zaharoza, lactoza sau dextran i polividon)menin integritatea fizic a lipozomilor n cursul liofilizrii, ca i n cursul rehidratriilipozomilor chiar nainte de utilizare.Aplicarea liofilizrii ca modalitate de stabilizare a lipozomilor este convenabil n cazulncapsulrii substanelor medicamentoase liposolubile (amfotericina B, doxorubicina) care,dizolvndu-se n dublul strat lipidic, rmn la acest nivel i dup rehidratarea lipozomilornainte de administrare, fr ca localizarea lor s fie influenat de rehidratare.Reconstituirea lipozomilor liofilizai este mai dificil n cazul substanelor active hidrosolubile,datorit partiiei acestora ntre faza apoas extern i compartimentul apos intern al veziculelorlipozomale.Este un procedeu de ncrcare in situ a substanei active care necesit anumite manipulritehnice, de aceea personalul farmaceutic i medical trebuie s fie bine informat i pregtitpentru a evita ncrcarea necorespunztoare a lipozomilor.6.5.3. Asigurarea stabilitii fizice, chimice i microbiologice a lipozomilorAsigurarea stabilitii fizico-chimice i microbiologice a lipozomilor, ca n cazul tuturorformelor farmaceutice, reprezint un obiectiv esenial al formulrii, cu consecine directe nasigurarea calitii acestora.Structura vezicular i compoziia complex confer lipozomilor un potenial mare deinstabilitate.n cazul lor, stabilitatea implic: meninerea structurii i dimensiunii lipozomilor; reinerea substanei active ncorporate n bistratul lipidic sau n faza apoas; meninerea stabilitii fizico-chimice; meninerea stabilitii n mediile biologice ntlnite; mpiedicarea contaminrii microbiene.Principalele tipuri de instabilitate ntlnite n cazul lipozomilor sunt rezumate n tabelulurmtor:Tabel 7. Tipuri de instabilitate a lipozomilorTipuri deinstabilitateEfecte produse

Fizic pierderea substanei medicamentoase modificarea structurii i dimensiunii veziculelor modificarea permeabilitii membranei agregarea-fuziunea lipozomilor influenarea compoziiei lipidice influenarea tehnologiei de fabricare

Chimic- oxidarea lipidelor nesaturate

hidroliza componentelor lipidice degradarea substanei medicamentoase ncapsulate

Microbiologic contaminarea microbian influenarea tehnicilor de sterilizare interaciunea cu conservanii

Stabilitatea fizicFactorii care influeneaz stabilitatea fizic a lipozomilor i consecinele asupra acestora suntrezumate n tabelul urmtor.Tabel 8FactoriEfecte produse

Lumina- pot desface sau pot sparge veziculele

Acizi(dac membrana a fost n prealabil

Bazedeteriorat prin depozitare sau de substane

Ioni metalicistrine)

Electrolii concentrai- deterioreaz veziculele lipozomale

Unele molecule organice (ncorporate nmembrana lipozomal)- modificare permeabilitii

Stabilitatea chimicAsigurarea stabilitii chimice a lipozomilor vizeaz evitarea degradrii chimice att alipidelor, ct i a substanei active.Degradarea chimic a componentelor lipidiceCompoziia n acizi grai nesaturai a fosfolipidelor din formulare predispune lipozomii ladegradare prin autooxidare sau hidroliz.Lanurile acil-nesaturate din structura lipidelor sunt vulnerabile la degradare oxidativ(peroxidare lipidic). Reaciile de oxidare se produc rapid i sunt accelerate de metale, lumin,un pH crescut.Degradarea poate fi produs i prin hidroliza legturilor esterice covalente care leag aciziigrai de glicerol din molecula fosfolipidelor. Aadar, preparatele lipozomale coninndfosfolipide sunt sensibile la degradarea hidrolitic att n domeniul acid (pH 8).De asemenea, procedeele de preparare (sonicarea) sau condiiile de depozitare (expunerea ladiferite valori de pH) pot afecta viteza de descompunere a lipidelor lipozomale.Compuii de oxidare i hidroliz ai componentelor lipidice din lipozomi produc modificriimportante ale permeabilitii stratului dublu lipidic.Degradarea chimic a substanei activeProcesul de degradare chimic a substanei active crete pe msura creterii concentraieicomponentelor lipofile, deoarece stabilizarea lor se efectueaz prin cuplare la structurilemembranare (bistratul lipidic).Stabilitatea microbiologicDatorit compoziiei complexe, dispersiile lipozomale reprezint medii prielnice pentrudezvoltarea microorganismelor.n cazul lipozomilor administrai extern (cutanat/pe piele i pe mucoase), stabilitateamicrobiologic este asigurat prin adugarea n formulare a conservanilor antimicrobieni(alcool benzilic, acid sorbic, acid benzoic, sorbat de potasiu, nipaesteri). n selectarea agenilorconservani se va ine seama de interaciile acestora cu bistratul lipozomal.n cazul lipozomilor destinai administrrii parenterale sau oculare este obligatorie asigurareasterilitii, un demers dificil de realizat, innd seama de procedeele uzuale de sterilizare apreparatelor farmaceutice. Sterilizarea se efectueaz cu radiaii gamma, deoarece sterilizareaprin filtrare are inconvenientul c nu poate fi aplicat dect n cazul microveziculelor de micidimensiuni, iar alte procedee de sterilizare, ndeosebi cele termice influeneaz negativstabilitatea fizico-chimic a lipozomilor.Pentru asigurarea stabilitii lipoziomilor se recurge la diverse procedee de stabilizare: selectarea adecvat a componentelor stratului dublu lipidic, inclusive folosirea delipide saturate la formulare/preparare; adugarea de colesterol n stratul dublu lipidic (pn la 25%) n momentulpreparrii lipozomilor (care rigidizeaz membrana lipozomal); ncrcarea membranei lipozomale cu sarcini electrice (poate evita agregarealipozomilor prin respingere electrostatic); adaosul de antioxidani n formulare; adugarea de conservani antimicrobieni; prepararea prin liofilizare; ncrcarea lipozomilor chiar nainte de administrare, prin tehnici de ncrcare activ; evitarea nclzirii i lucrnd la pH = 6-7 n cursul fabricaiei (pentru diminuareaproceselor de hidroliz); - depozitare adecvat (de exemplu, la +40C, n recipiente sigilate, sub gaz inert).Lipozomii trebuie s fie stabili n suspensie sau n stare deshidratat timp de 1,5-2 ani, latemperatura ambiant.6.5.4. Realizarea caracterelor specifice, formelor farmaceutice, n funcie de calea deadministrareFormularea lipozomilor urmrete obinerea unor preparate cu caracteristici organoleptice,fizico-chimice sau farmacotehnice bine definite i corelate cu calea de administrare: caracteristici organoleptice: aspect, miros, culoare; pentru formulrile lipozomale parenterale: sterilitate i apirogenitate; pentru formulrile dermatologice sau cosmetice: aspect elegant, consisten.7. Prepararea lipozomilorAa cum s-a menionat anterior, formarea lipozomilor are loc spontan atunci cnd fosfolipidelese disperseaz n ap. Totui, prepararea lipozomilor ncrcai cu substane active cu nivelecrescute de ncapsulare i o anumit mrime i structur (lamelaritate) este un proces dificil derealizat.n literatur sunt descrise numeroase metode de preparare a lipozomilor, a cror alegerenecesit o mare atenie deoarece metoda de preparare influeneaz proprietile lipozomilor(tipul, mrimea i distribuia mrimiii ca i capacitatea de ncrcare i de reinere a substaneimedicamentoase).Tehnicile propuse sunt conceptual distincte, nici una dintre ele nu ofer avantaje absolute i nupoate fi utilizat ca o procedur universal. Unele dintre metode se pot aplica doar la scar delaborator, altele se pot transpune la scar industrial.Etapele preparrii lipozomilor includ: etapa de hidratare a componentei lipidice; ncorporarea substanei active; etapa de uniformizare a dimensiunii lipozomilor; etapa de ndeprtare a substanei active nencapsulate.1. n etapa de hidratare a filmului lipidic se pot aplica:Metode mecanice agitaremanual sau mecanic (agitatoare tip Vortex) a dispersiei de fosfolipide; microfluidizare; omogenizare prin forfecare nalt.Metode bazate pe nlocuirea solvenilor organici cu un mediu apos ndeprtarea solvenilor organici nainte de hidratare; evaporarea n faza invers; injecia cu etanol sau eter n faz hidrofil.Metode bazate pe ndeprtarea agentului tensioactiv gel-cromatografie prin excludere; dializ n timp; diluie rapid.Metode bazate pe modificarea dimensiunilor lipozomilor obinui anterior i fuziune fuziunea spontan a lipozomilor unilamelari mici n faza de gel; ngheare-dezgheare; liofilizare (criodesicare).Metode bazate pe ajustarea pH-ului2. ncrcarea substanei active n lipozomiLipozomii care conin substane hidrosolubile se prepar direct cu soluia apoas sau soluia -tampon apoas a acesteia.NOVARTISCnnsumer HealthSubstanele lipofile se pot ncorpora fie adugndu-se n solventul organic n care se dizolvcompusul lipofil, fie prin complexare cu compusul lipidic din structura bistratului lipozomal.Asocierea proteinelor n lipozomi are loc prin ncapsularea n faz hidrofil (de exempluinterferon) sau prin legare la suprafaa lipozomului (de exemplu insulina) prin legturihidrofobe sau de natur electrostatic.compusliialrofllcompusluorofobFigura 11. Modalitatea de ncorporare a substanelor active n lipozomi3. Etapa de uniformizare a dimensiunii lipozomilorn aceasta faza se aplic: extruderea la presiune ridicat sau sczut; ultrasonicarea.4. Etapa de ndeprtare a materialului nencapsulatn aceast etap se apeleaz la: dializ; ultracentrifugare; cromatografie de penetrare n gel; rini schimbtoare de ioni.n metoda de hidratare a filmului lipidic descris de Bangham, lipidele se dizolv n solveniorganici (cloroform sau amestecuri cu metanol) i solventul este apoi ndeprtat ntr-unrotaevaporator la vid, formnd un film subire pe pereii balonului cu fund rotund. Peste acestase adaug faza apoas necesar pentru rehidratatrea filmului, prenclzit la o temperatursuperioar tranziiei de faz a lipidelor folosite la preparare. Filmul subire se detaeaz de peperei prin agitare, obinndu-se vezicule multilamelare, diferite ca mrime.Simultan, poate fi ncorporat i substana activ dependent de proprietile fizico-chimice, fieprin introducerea n film mpreun cu lipidele, fie n soluia apoas de rehidratare a filmuluilipidic, dac compusul este hidrofil.

Lipide + s.liposolubilSoluie apoas a s. mhidro s o I u bile-SolventorganicFilm lipidicHidratare / AgitareVezicule Unilamelare MiciPentru omogenizarea dispersiei, respectiv pentru reducerea dimensiunii la scar nanometric alipozomilor multilamelari rezultai, dispersia se supune ultrasonicrii obinndu-se veziculeunilamelare mici.Figura 12. Fazele preparrii lipozomilor prin metoda hidratrii filmului lipidic

Alegerea metodei de preparare este important, deoarece de aceasta depind: tipul de lipozomi formai; mrimea acestora i distribuia mrimii lor; randamentul ncrcrii cu substan activ.8. Caracterele i controlul calitii lipozomilorControlul calitii lipozomilor presupune determinarea unor parametri caracteristici fizico-chimici, microbiologici i biologici. Posibilitatea caracterizrii lipozomilor i a formulrilor culipozomi a devenit mai evident o dat cu dezvoltarea unor metode analitice i echipamente decontrol performante.n tabelul urmtor sunt redate sintetic metodele folosite pentru controlul calitii formulrilorlipozomale.Tabel 9. Controlul calitii lipozomilor(caracteristici si metode)Parametri de controlProcedeu analitic

Caracterizarea fizico-chimic

aspect

pHpoteniometrie

osmolaritateaosmometru

indice de refracierefractometru

concentraia n fosfolipideconinut n fosfor lipidic/HPLC

compoziia n fosfolipideCSS i HPLC

concentraia n colesteroldeterminarea colesterol- oxidazei i HPLC

concentraia n sm (randamentulmetoda adecvat

ncorporrii)

Stabilitatea chimic

pHpotentiometrie

hidroliza fosfolipidelorHPLC, CSS

autooxidarea colesteroluluiHPLC, CSS

degradarea antioxidantuluiHPLC, CSS

Stabilitatea fizic

mrimea i distribuia mrimiidifracia dinamic a luminii

lamelaritateamiroscopie electronic

potenialul electric zetazeta-sizer

Caracterizarea biologic

sterilitateaculturi aerobe sau anaerobe

pirogenitateatestul pe iepure ori testul LAL(Limulus)

toxicitatea animalmonitorizarea letalitii, histologiei i patologiei

Evaluarea eficienei terapeuticeteste in vitro utiliznd membrane artificialeteste in vivo

Pentru lipozomii cu aplicaie cutanat se efectueaz teste suplimentare cum ar fi:- determinarea capacitii de umectare a pielii, determinarea efectuluiemolient9. Dificulti privind dezvoltarea lipozomilorRealizarea lipozomilor ntmpin o serie de dificulti generate de calitatea materiilor prime,caracteristicile lipozomilor, tehnologiile de fabricaie, metodele de control, stabilitate etc.Calitatea materiilor primeCompoziia variabila a fosfolipidelor provenind din surse naturale diverse poate afectareproductibilitatea, de la o serie la alta, a calitii lor i implicit a lipozomilor. Utilizareaproduselor de sintez minimizeaz acest neajuns.Proprietile fizico-chimice ale lipozomilorEficacitatea in vivo a lipozomilor este n mare msur dependent de proprietile structurale ide suprafa.La dezvoltarea unei formulri lipozomale este necesar s se ia n consideraie unelecaracteristici importante ale lipozomilor (mrimea i distribuia dup mrime, potenialul zeta irandamentul de ncrcare a substanei medicamentoase) care determina comportamentullipozomilor in vitro ^i in vivo.Se impune deci o caracterizare complet fizico-chimic a lipozomilor farmaceutici n stadiilepreliminare ale dezvoltrii farmaceutice, fapt ce reclam utilizarea unor metode analiticecomplicate.Randamentul ncrcrii cu substan medicamentoasn mod obinuit, n lipozomi nu se nglobeaz toat cantitatea de substan medicamentoasintrodusa n formulare. Uzual, procentele incluse sunt mai reduse, iar cantitatea rmasnencrcat trebuie s fie ndeprtat (dac este mai mare de 10%), aciune laborioas icronofag.Dezvoltarea unor strategii de ncrcare activ sau de la distan crete eficacitateancapsulrii.Perioada de valabilitateDup cum s-a descris anterior, valabilitatea lipozomilor poate fi limitat de fenomenele deinstabilitate fizic i chimic.Ambele tipuri de instabiliti modific disponibilitatea in vivo, iar procesul degradrii chimicepoate influena i sigurana lipozomilor.Transpunerea preparrii la scar industrial a lipozomilorPrepararea lipozomilor necesit existena unui echipament de fabricaie adecvat. n plus,preparatele lipozomale parenterale reclama aplicarea unor tehnici de fabricatie capabile sasigure sterilitatea i apirogenitatea preparatelor parenterale sau oftalmice.10. Alte tipuri de sisteme vezicularePentru a evita unele limite ale lipozomilor (instabilitate chimic, costul i puritateafosfolipidelor, degradarea oxidativ a fosfolipidelor) s-au dezvoltat i alte tipuri de sistemeveziculare, care s constituie alternative la sistemele lipozomale.Denumirile acestor vezicule fac referire la natura componentelor ce formeaz nveliulvesicular i sunt limitate doar de imaginaia productorilor.Niozomii sunt vezicule obinute cu surfactani (ageni tensioactivi) bicatenari de sintezneionogeni.Sfingozomii sunt lipozomi care conin sfingolipide (sfingomielina, gangliozide) sau lipide acror compoziie este asemntoare pielii (ceramide, colesterol, acizi grai, sulfat de clesterol).Imunozomii sunt sisteme veziculare la care sunt ataai anticorpi specifici sau fragmente deanticorpi.Hemozomii sunt vezicule asemntoare lipozomilor care conin hemoglobine.Catezomii sunt lipozomi cationici care conin sruri ale acizilor grai cu amine cuaternare.Virozomii conin vaccinuri.Imunoenzimozomii sunt vezicule coloidale ce conin enzime (utili n maladii autoimune).Ufazomii sunt sisteme veziculare ce conin acizi grai nesaturai cu caten lung.Etozomii sunt vezicule lipidice cu un coninut ridicat (pn la 45%) de etanol. Etanolulfluidizeaz att lipidele etozomale, ct i din straturile lipidice ale celulelor stratului cornos.Aciunea de dezorganizare a stratului lipidic cornos permite penetraia veziculelor n piele.Sunt capabili s ncapsuleze i s elibereze n piele molecule lipofile, precum testosteron,minoxidil, ca i substane medicamentoase cationice, precum propranololul sau chiar plasmidei insulin.Rovizomii sunt transportori veziculari multifuncionali care au un coninut mare de acizi graieseniali (de exemplu, acid linoleic) utilizai pentru transferul a numeroase ingrediente activecosmetice.Dragozomii sunt sisteme veziculare obinute din lecitin hidrogenat i colesterol, cu aplicaiin cosmetologie.Transferozomii sunt un tip special de lipozomi n care sunt ncorporai aa numii activatorimarginali (molecule, precum colat de sodiu).Sunt vezicule ultradeformabile cu o capacitate de deformare mai mare de pn la 105 ncomparaie cu lipozomii. Datorit elasticitii i capacitii de deformare, ei se pot strecura prinporii stratului cornos (care sunt cu 1/10 mai mici dect diametrul lor). Astfel, ei pot penetra prinpielea intact acionnd pe baza existenei gradientului de hidratare cutanat (diferenei dehidratare din stratul cornos i esuturile viabile ale epidermului mai hidratate n comparaie custratul cornos deshidratat).11. Mecanisme de aciune in vitro a lipozomilorNatura fosfolipidic a lipozomilor le confer o mare asemnare cu membranele biologice, ncare cele mai importante componente sunt fosfolipidele (considerate elemente ale vieii).n principal, pe aceast similitudine se bazeaz mecanismul de aciune a lipozomilor, respectivinteraciile dintre acetia i celulele vii.n absena oricarei specificiti, interaciile dintre lipozomi i celulele vii, investigate in vitro,pot fi descrise de urmtoarele procese:Adsorbia la suprafaa celulelor - facilitat de ncrctura electric a veziculelor lipozomale.Adsorbia se poate produce prin fore hidrofobe nespecifice sau electrostatice sau prininteraciuni specifice cu componentele suprafeei celulare.Transferul lipidic- mediat de proteinele de suprafa (exist o analogie ntre lipide, lipozomi imembrane lipidice). Colesterolul trece foarte uor ntre membranele lipozomal i celular,fr distrugerea lipozomuluiTransferul lipidic poate determina modificarea permeabilitii lipozomilor nsoit de eliberareaunei pri din faza apoas a veziculelor. n anumite condiii, substanele active ncapsulatetraverseaz apoi membrana celular.Endocitoza, un fenomen influenat de sarcina electric a particulelor, permite digestialipozomilor de lizozomi n interiorul celulei i facilitarea cedrii ingredientului active.Endocitoza reprezint mecanismul predominant de ptrundere a lipozomilor n celule; n acestcaz exist riscul degradrii principiului activ n lizozomii intracelulari.Fuziunea cu plasma membranei celulare este un proces care rezult prin inserareaconstituenilor membranei lipozomale n membrana celular, nsoit de eliberarea simultan aconinutului lipozomal n citoplasma celular.Figura 13. Reprezentarea schematic a interaciilor lipozomilor cu celuleleAdesea este greu de stabilit mecanismul de interaciune dintre lipozomi i celule, existndposibilitatea ca simultan s intervin mai multe mecanisme.Afinitatea lipozomilor pentru diverse esuturi poate fi modificat prin utilizare n formulare adiferite fosfolipide, cu configuraii diverse ale lanului de acid gras.De asemenea, modificarea sarcinii (ncrcturii) veziculelor lipozomale poate influena n maremsur distribuia lor n organism.Veziculele ncrcate negativ, de exemplu, intr n celule prin fuziune, n timp ce veziculeleneutre sunt ncorporate prin endocitoz, substana medicamentoas fiind expus sistemulhidrolitic liozomal al celulelor.Veziculele pozitive sau neutre sunt ndeprtate mai lent dect acelea ncrcate negativ.12. Ci de administrare a lipozomilorIn vivo, obstacolele ntmpinate la transportul i eliberarea la int a substanelormedicamentoase ncorporate n lipozomi sunt substaniale i dificil de depit.n acest sens, se pot cita ca fiind bariere de depit: clearance-ul nespecific i rapid al lipozomilor prin intermediul celulelor SRE; dificultatea traversrii endoteliului capilar i a membranei bazale; capacitatea endocitar foarte mic a numeroase tipuri de celule, inclusiv a celulelor tumorale.Aceste bariere limiteaz n mare msur aplicarea cu succes a lipozomilor.Efectul lipozomilor ca sisteme farmaceutice de eliberare a agenilor terapeutici este intrinseclegat de capacitatea de a controla cu exactitate concentraia de substan activ eliberat careatinge locul de aciune ntr-o perioad de timp dat.Atingerea locului int din organism presupune ca lipozomii s rmn intaci ca transportori aisubstanei active (s-i menin integritatea structural) i s conin cantitatea iniial desubstan activ ncorporat ce urmeaz a fi eliberat la inta vizat.Succesul unui tratament cu lipozomi nu depinde doar de caracteristicile de formulare, ci i decalea de administrare.Iniial, lipozomii au fost dezvoltai pentru administrare pe cale parenteral, ca vectorimedicamentoi n terapia cancerului. Ulterior, s-a studiat i posibilitatea administrrii lor i pealte ci (oral, transmucozal sau cutanat).Mediile biologice variate ntlnite dup administrare (snge, fluide digestive, lichidele:interstiial, peritoneal, sinovial) influeneaz evoluia in vivo a acestora.Calea intravenoasLipozomii convenionali administrai intravenos sunt pui n faa unor bariere precum endoteliulvascular i bariera hemato-encefalic.Ca atare, aa cum s-a mai subliniat, extravazarea lipozomilor, ndeosebi a celor multilamelari ia celor unilamelari mari, apare doar n organe, precum ficat, splin i mduva spinrii (datoritfenestrelor i jonciunilor lejere dintre celule endoteliale), i n anumite stri patologice(prezena tumorilor, inflamaie, infecie).Lipozomii unilamleari mici pot avea o distribuie mai mare n esuturi, dar i ei pot fisechestrai de ficat i splin.n afar de asta, lipozomii prencrcai cu sarcin electric superficial i cu dimensiuni maimici de 100 nm prezint un clearance sangvin lent n comparaie cu ali lipozomi cudimensiune mai mare i/sau transportori ncrcai pozitv sau negativ.Schimbul lipidic dintre transportorii lipozomali i lipoproteinele plasmatice contribuie laruperea membranei i ulterior la pierderea substanei active. De aceea, lipozomii convenionalise folosesc n principal n tratarea SRE sau pentru a masca efectele adverse ale substanelormedicamentoase antitumorale.n cazul lipozomilor de lung-circulaie, profilul biodistribuiei se schimb semnificativdeoarece suprafaa veziculelor este acoperit cu polimeri, uzual cu PEG-uri. Studiiexperimentale au evideniat o circulaie sangvin mai lung, o preluare mai mic de ficat i oacumulare mai mare n tumori.Acoperirea cu PEG a lipozomilor i face potrivii pentru administrarea intravenoas. Moleculelede PEG furnizeaz o repulsie electrostatic i steric ntre lipozomii i neutralizeaz sarcinaelectric, previnind opsonizarea lor.De asemenea, opsonizarea lipozomului este redus din cauza inabilitii opsoninelor de a selega de suprafee hidrofile. Mai mult, grosimea stratului de PEG, care depinde de masamolecular a PEG i de procentul ncorporat n compoziia lipozomilor, influeneaz interacialipozomilor cu macrofage.De altfel, acest tip de lipozomi au fost concepui pentru a fi administrai pe cale parenteral ide a mri timpul de remanen i circulaia sistemic.n design-ul unor lipozomi eficieni pe cale parenteral trebuie luate n consideraie parametriiimportani, precum mrimea, compoziia, sarcina electric a lipozomilor, densitatea substaneiactive n membrana lipozomal i metoda de preparare, parametrii care influeneaz soarta ibiodistribuia lor dup administrare.Calea intramuscularn acest caz, transferul de molecule are loc de la locul de administrare n snge prin difuziepasiv, injecia respectiv realiznd un depozit local de substan activ i implicit o eliberareprelungit a sa.Calea subcutanatLipozomii administrai subcutanat au scopul de a inti sistemul limfatic n scop imagistic,precum i n distribuirea unor ageni terapeutici sau n vaccinare.Lipozomii injectai subcutanat care nu intr n fluxul sangvin, fie intr n capilarele limfatice,fie staioneaz la locul de injectare.Veziculele neutre mai mici de 100 nm traverseaz prin interstiiu i apoi spre limfatice cu multmai uor dect veziculele mari.Transportorii medicamentoi rmai la locul de injectare vor ceda moleculele activencorporate.Calea intraperitonealAdministrarea intraperitoneal are avantajul de a asigura o expunere direct a tumorii, infecieisau inflamaiei la agentul terapeutic inclus n lipozomi.Aceast metod de eliberare a substanei medicamentoase crete efectul dozei n cavitateaperitoneal.Pentru substanele antitumorale, acest mod de administrare este preferat celui intravenosdatorit acumulrii mai mari a substanei medicamentoase i a minimizrii toxicitii.Calea oralPrin administrarea pe cale oral a lipozomilor se urmrete evitarea degradrii substanei activei facilitarea absorbiei substanelor active coninute.Eficacitatea lipozomilor administrai oral impune meninerea integritii structurale n cursultrecerii prin tractul gastrointestinal i necesitatea absorbiei intestinale cu un randamentsuficient.Pentru meninerea structurii, lipozomii trebuie s reziste la valorile de pH variate din tractuldigestiv i la aciunea srurilor biliare i a lipazei pancreatice (aciune fosfolipazic).Administrarea oral a lipozomilor ce conin fosfolipide saturate are efecte benefice asupramucoasei gastrice, inhibnd aciditatea sau aciunea duntoare a unor substane asupramucoasei gastrice.Calea dermic (cutanat)Administrarea dermic a veziculelor bazate pe fosfolipide apare pentru prima dat n literaturla nceputul anilor 80.Dup aplicarea pe piele, lipozomii joac un dublu rol i anume acela de a reine/protejacompusul activ de-a lungul stratului cornos i de a aciona ca un promotor pentru penetraie.Viteza de transport a substanei medicamentoase coninute n formulrile lipozomale prin pielepoate fi influenat de compoziia, mrimea i sarcina de suprafa a lipozomilor.n cazul lipozomilor destinai aplicrii cutanate este necesar un design atent pentru a definicompoziia optim, dependent de obiectivul specific, respectiv: eliberarea dermic, cnd se dorete retenia crescut a substanei medicamentoase npiele sau eliberarea transdermic, cnd se impune penetrarea mai profund a transportoruluilipozomal n piele.Lipozomii cu sarcin pozitiv pot interaciona cu pielea ncrcat negativ.Deoarece mrimea porilor cutanai este de aproximativ 0,3 nm, mrimea lipozomilor pentrueliberare transdermic este un parametru crucial pentru performana global a formulrii.n general, se consider c principalele ci de penetraie transdermic a compuilor activi suntcile intercelular sau pe la nivelul anexelor cutanate (calea transfolicular).Tratamentul local al bolilor de piele prin intermediul lipozomilor vizeaz tratamentul acneii, aarsurilor solare i a plgilor sau pentru combaterea mbtrnirii.Lipozomii pentru uz dermatologic sunt potrivii pentru ncrcarea cu antiinflamatoare,antimicotice, antibiotice, retinoide.Recent, pentru eliberarea transdermic a substanelor medicamentoase, atenia a fost centrat pedezvoltarea unor vezicule transformabile sau elastice, precum transferozomii i etozomii,menionai anterior.n pofida unor rezultate promitoare raportate n unele cercetri, mecanismul eliberriitransdermice rmne nc un subiect controversat, n special n legtur cu profunzimeapenetraiei n piele a lipozomilor intaci.Calea ocular (oftalmic)Corneeareprezintobariereficacefadeabsorbiasubstanelormedicamentoasehidro/lipofile la nivelul segmentului posterior al ochiului.Lipozomii au caracteristici promitoare pentru eliberarea ocular a substanelormedicamentoase deoarece pot fi administrai sub form de picturi sau geluri oftalmice, carevor localiza i menine activitatea farmacologic a acestora la locul de aciune.Niozomii prezint o biodisponibilitate ocular crescut pentru substane medicamentoasehidrofile, deoarece agenii tensioactivi din formulare acioneaz ca promotori de absorbie indeprtreaz stratul mucos de pe suprafaa ocular.O versiune modificat a niozomilor, denumii discozomi, variaz n mrime i form.Dimensiunea mai mare a acestora (12-60 ^.m) previne drenajul n sistemul de drenajnasolacrimal. Mai mult, forma lor asemntoare unor discuri furnizeaz o fixare mai bun lanivel ocular.Studii pe niozomi i discozomi cu timolol maleat au demonstrat o biodisponibilitate mai mare atimololului.Calea vaginalAdministrai vaginal, lipozomii au avantajul c pot controla i susine eliberarea substaneimedicamentoase la locul de aciune. Substanele investigate sunt contraceptive, antimicrobiene,antibiotice, antifungice, antivirale. Au fost dezvoltate formulri lipozomale n geluri decarbopol care s mreasc timpul de retenie n vagin.Alte ci investigate pentru administrarea lipozomilor sunt calea nazal (pentru eliberareavaccinurilor) i cea pulmonar (pentru eliberarea peptidelor i proteinelor).13. Produse farmaceutice lipozomaleFa de numrul mare de cercetri raportate de literatura de specialitate, se constat c numrulproduselor lipozomale care au obinut autorizaia de punere pe pia este restrns, faptexplicabil avnd n vedere consideraiile de mai sus.NOVARTISCnnsunuT HealthTotui, agenii terapeutici investigai sunt mult mai numeroi, ca i numrul produselor aflate ndiverse stadii ale studiilor clinice.Cteva exemple dintre cele mai folosite preparate medicamentoase care conin lipozomi suntredate n continuare.Tabel 10. Preparate parenteraleProdusSubstanmedicamentoasTipul particulelorIndicaiiProductor

AmBisomeAmfotericina BLipozomi (decirculaiendelungat)Infecii fungicegraveNeXstarPharmaceuticals

AbelcetAmfotericina BComplex lipidicInfecii fungicegraveThe LiposomeCompany

AmphocilAmfotericina BComplex lipidicInfecii fungicegraveSequusPharmaceuticals

DoxilDoxorubicinaLlipozomi decirculaie lung(PEGY-lai)Sarcom KaposiSequusPharmaceuticals

DaunoXomeDaunorubicinaLipozomi decirculaielung(PEGY-lai)Sarcom KaposiNeXstarPharmaceuticals

Tabel 11. Preparate cutanateProdusSubstanmedicamentoasTipul particulelorIndicaiiProductor

Pevaryl -LipogelEconazol bazLipozomi (gel)Eczeme/micozecutanateCilag Corp.

Heparin PurHeparinLipozomi (gel)AnticoagulantRatiopharmCorp.

Heparin PurForteHeparinLipozomi (gel)AnticoagulantRatiopharmCorp.

HepaPlus 30EmgelHeparinEmulgelAnticoagulantRatiopharmCorp.Corp.

Alte preparate lipozomale aflate n uz clinic conin:Amfotericin B, vaccinuri pentru hepatita A, hepatita B, difterie, tetanos vaccin oral E. coli sauShigella flexneri, amikacin vincristin nistatin, kanamicin i tretionin.14. Lipozomii - vectori cosmeticiCercetrile privind utilizarea lipozomilor n domeniul cosmetic sunt mai recente dect celeiniiate pentru aplicaiile farmaceutice.Primul produs lipozomal cosmetic, Capture, a fost obinut de DIOR n 1987.Totui, n prezent pe piaa produselor cosmetice lipozomii sunt larg comercializai, nregistrndadevrate succese comerciale, spre deosebire de lipozomii medicamentoi care au o aplicareclinic mult mai restrns.Se pot desprinde dou motive eseniale care justific puterea de atracie a acestor preparate ncosmetologie: pielea ndeplinete funcii fiziologice foarte importante pentru organism i, depunndde-a lungul timpului o munc extraordinar, merit o atenie special, mai ales atunci cndvreuna dintre aceste funcii este perturbat; similaritatea unor componente ale epidermului cu cele ale lipozomilor, fac din acetiaprincipalii transportori (vectori) ai compuilor dermatologici, respectiv ai ingredientelorcosmetice.Preparatele lipozomale au deschis calea unor noi formulri i chiar a unor categorii de produsecare ofer consumatorului ansa unei ngrijiri eficace i intense.Lipozomii utilizai n cosmetic prezint o serie de avantaje: au o bun compatibilitate cu lipidele cutanate; formeaz o barier natural la suprafaa pielii, favoriznd hidratarea acesteia; asigur o eliberare prelungit a ingredientului activ; prezint afinitate pentru cheratin, favoriznd fixarea ingredientului cosmetic n stratulcornos i o absorbie prelungit;Multe din produsele comerciale reprezint variante ale lipozomilor, niozomi, rovizomi,dragozomi etc., a cror denumire au legtur cu compoziia lor sau sunt rodul imaginaieiproductorilor.Produsele cosmetice coninnd lipozomi sunt formulate: pentru aplicare n timpul zilei, cu aciune protectoare; pentru aplicare n timpul nopii, cu aciune de regenerare; pentru pielea uscat i sensibil; ca produse anti-age, antirid, ecrane solare, bronzare, autobronzare etc.n tabelul urmtor sunt prezentate unele ingredientele active cosmetice ncorporate n lipozomi,aciunile i formele de prezentare a produselor lipozomale cosmetice.Tabel 12Ingredient cosmeticAciuneForme cosmetice

Vitamine (A, B3, C, E, F)RevitalizantCreme

Ulei de AvocadoUlei de JojobaEmolient, nutritiv protectoare restructurante

Aloe- antirid

alfa hidroxi -acizi- antiage

Pirolidon-carboxilat de sodiuHidratant

NMF (Factor natural de umectare)Geluri

Hialuronat de sodiu

Filtre UVProtecie solarLoiuni

Ginkgo BilobaAntioxidantContur de ochi

Factor uman de cretereAntiaging

Hidrolizat de colagenElastinRefacerea arhitecturi:Baze de machiaj

Precursori de glicozaminoglicaniCeramidedermiceSprayuriProduse pentru baieampoane

CofeinStimularea lipolizei imicrocirculaiei

De asemenea, exist lipozomi n care sunt ncorporate i alte ingrediente: depigmentani; compui nutritivi; alte substane pro-barier (acizi grai linoleic i gamalinoleic); extracte vegetale; cheratin; peptide capilare; triclosan (antiacneic); salicilat de sodiu (antiacneic); aminoacizi; coenzima Q (regenerarea i netezirea pielii); lactat de sodiu (hidratant); dihidroxiaceton (autobronzant) etc.Bibliografie1. Baillie A.J., Florence A.T., Muirhead L.H., J. Pharm. Pharmacol., 37, 863, (1985).2. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins J.C./1965, Diffusion of univalent ions acrossthe lamellae of swallen phospholipids, J.Mol.Biol., 13, 238-252.3. Betageri Guru V., Shirish B. Kulkarni, Preparation of Liposomes in Preparation &Chemical Applications, vol. I, ed. Reza Arshady, Citus Books, 489-521, (1999).4. Billah M.M., Finean J.B., Coleman R., Biochim. Biophys. Acta, 433, 54, (1976);5. Boddy A., Aarons L., Adv. Drug Deliv. Rev., 3, 155, (1989).6. Burkhanov S.A. et al., Int. J. Pharm., 46, 31, (1988).7. Cafiso D.P., Petty F.R., Biochim. Biophys. Acta, 649, 129-132, (1981).8. Caque J.P. and Bernoud T., Les cristaux liquides dans les cosmetiques, Parf. Cosmet.Aromes, (1990).9. Cerezo Galan, Liposomas, in Tratado de Farmacia Galenica, ed. Faulii Trillo, Luzan 5,S.A. De Ediciones, Madrid, 173-186, (1993).10. Chakravarty P.K. & colab., J. Med. Chem., 26, 638, (1983).11. Chew C.H. and Gan L.M., Monohexylether of ethylene glycol and diethylene glycol asmicroemulsions cosurfactants, J. Dispersion Sci. Tchnol., 1990.12. Cioca G. and Calvo L., Liquid crystals and cosmetics applications, Cosmet. Toiletries(1990).13. Davis S.S., J. Pharm. Pharmacool., 44 (suppl. 1), 186, (1992).14. Deamer D., Bangham A.D., Biochim. Biophys. Acta, 443, 629-634, (1976).15. Dlattre J., Couvreur P., Puisieux F. et al., Les liposomes: Aspects technologiques,biologiques et pharmacotechniques, Lavoisier Tec et Doc, Paris 1993.16. Dressman J.B., Bas P., Ritschel W.A., J. Pharm. Sci., 82, 857, (1983).17. DSilva J.B., Notary R.E., J. Pharm. Sci., 71, 1394-1398, (1982).18. De Luca M., Grossiord J.L., Medard J.M., A stable W/O/W multiple emulsion, Cosmet.Toiletries, 1990.19. Ghiescu L., Fixman A., Simionescu M., Simionescu N., J. Cell. Biol., 102, 1304,(1986).20. Gonzales-Rothi, R.J. SchreiperH, Pulmonary delivery of liposomes, J. ControlledRelease, 1993,5, 149-161.21. Grossiord J.L., Seiller M. and Puisieux F., Apport des analyses rheologiques dansletude des emulsions multiples H/L/H, Rheologica Acta, 1993.22. Gruner S.M., Novel Multilayered Lipid Vesicles, Biochem., 24, 2833-2842, (1985).23. Haran G., Cohen R., Bar L., Barenholz Y., Transmembrane ammonium sulphategradients in liposomes produce efficient and stable entrapment of amphipathis weakbases, Biochim. Biophys. Acta, 1993, 1151, 201-215.24. Hellstrom K.E. & colab., Antibodies for Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery:Fundamental and Applications, ed. J. R. Robinson and V. H. Lee, Marcel Dekker, N.Y., 623, (1987).25. Harrington K.J., Syrigos K.N., Vile R.G., Liposomally targeted cytotoxic drugs for thetreatment of cancer, J. Pharm. Pharmacol., 2002, 54, 1573-1600.26. Hrju V., Lupuliasa D., Dumitrescu A.M., Dermocosmetologie, ed. Polirom, 30-35,(1998).27. Hrju Victoria, Lupuliasa D., Hrju M., Sisteme cu eliberare la int a substanelormedicamentoase n Tehnologie Farmaceutic, (Iuliana Popovici, D. Lupuliasa), EdituraPolirom, vol. 3, 2009, 682-686.28. Hofland H.E., Bouwstra J.A., Spies F., Interactions between nonioniques surfactantvesicles and human stratum corneum in vitro, J. Liposome, 1995.29. Hope M.J., Bally M.B., Biochim. Biophys. Acta, 816, 294, (1985).30. Hopkins C.R., Site-specific Drug Delivery Cell Biology Medical and PharmaceuticalAspects, ed. Tomlinson E. i Davis S.S., John Wiley & Sons, Chichester, 27, (1986).31. Hsu M.J., Juliano R.L., Biochim Biophys. Acta, 720, 411, (1982).32. Hussain A., Truelove J.E., J. Pharm. Sci., 65, 1510, (1976).33. Illum L., Farraj F., Davis S.S., Int. J. Pharm., 46, 261 (1988).34. Ishida O., Maruyama K., Sasaki K., Iwatsuru M., Size-dependent extravasation andinterstitial localization of polyethylenglycolliposomes in solid tumor bearing mice, Int.J. Pharm., 1999, 190, 49-56.35. Johnson M.M., Biochim. Biophys. Acta, 307, 27-41, (1973).36. Kenneth A. Walters, Drug Delivery: Topical and Transdermal Routes, Encyclopediaof Pharmaceutical Technology, Informa Healthcare USA, 2007, 1318-1319.37. Kirby C., Clarke J. and Gregoriadis G. (1980), Cholesterol content of smallunilamellar liposomes controls phospholipid loss to high density lipoproteins in thepresence of serum, FEBS, Lett, 111, 324-328.38. Kim C.K., Lee M.K., Int. J. Pharm., 108, 21, (1994).39. Kulkarni S.B., Betageri G.V., Singh M., J. Microencap., 12, 229-246, (1995).40. Kumar V., Banker G.S., Target - Oriented Drug Delivery Systems, in ModernPharmaceutics, third ed., ed. Banker S. G. i Rhodes T. C., Marcel Dekker Inc., 611-679, (oct. 1995).41. Lasic D.D., Liposomes: From Physics to Applications, Elsevier, Amsterdam, 63-107,(1993).42. Lassic D.D., The Mechanism of Vesicle Formation, Biochem. J., 29, 335-348, (1988).43. Leucua S., Medicamente vectorizate, Ed. Medical, 163-165, (1993).44. Machida K.J., Hu R., Int. J. Pharm., 61, 109, (1990).45. Magenheim B. and Benita S., Nanoparticles characterisation. A Comprehensivephysicochemical approach, STP Pharma., (1991).46. Martn F.J., Morano J.K., Liposome Extrusion Method, U.S. Patents, 4737 323, 1988.47. Marsh D., Handbook of Lipid Bilayers, CRC Press, Boca Raton, FL, 1990.48. Mayer L.D., Hope M., Cullis P.R., Biochem. Biophys. Acta, 817, 193-196, (1985).49. Meric E., Tehnologia produselor cosmetice, ed. Corson Iai, 274-278, (2000).50. Mezei M., Nugent F.J., Method of Encapsulating Biologically Active Materials inMultilamellar Lipid Vesicles, U. S. Patent, 4 485 054, CA 101, 12 227 w., 1984.51. Muller R.H., Hildebrand G.E., Pharmazeutiche Technologie: Moderne Arzneiformen,Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart (1998).52. Muranishi S.S. et al., Delivery Systems for Peptide Drugs, ed. S. S. Davis, L. Illum, E.Tomlinson, Plenum Press, N. Y., 177, (1986).53. New R.R.C., Liposomes, A Practical Approach, IRL press, Oxford and New York, 33-103, (1989).54. Notari R.E., Optimization of Drug Delivery, ed. H. Bundgaard, A. B. Hansen, H.Koford, Munksgaarg Copenhagan, 117, (1982).55. Oku N., MacDonald R.C., Biochem, 22, 855-863, (1983).56. Oussoren C., Storm G., Liposomes to target the lymphates by subcutaneousadministratio, Adv. Drug Delivery rev. 2001, 50, 143-156.57. Popovici Adriana, Antofie I., Lipozomii ca vectori medicamentoi, Cluj-Napoca2004, 123-128.58. Popovici Iuliana, D. Lupuliasa, Tehnologia farmaceutic, volumul 2, ed. Polirom,2008, 311-386.59. Prybilski C., de Luca M., Grossiord J.L., et al., W/O/W multiple emulsionsmanufacturing and formulation considerations, Cosmet. Toiletries, 1990.60. Seiller M., Orecchioni A.M., and Vautions C., Vesicular Systems in cosmetologye, inCosmetic Dermatologye (R. Baran and H. I. Maibach), London, Martin Dunitz, 1994.61. Seymour L. W., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 19, 135 (1992).62. Sone S., Matsura S., J. Immunol., 132, 2105, (1984).63. Sophia G. Antimisiaris, Paraskevi Kallinteri, Dimitrios G. Fatouros, Liposomes andDrug Delivery, in Pharmaceutical Manufacturing Handbook: Production andProcesses, edited by Shayne Cox Cad, John Willey&Sons, Inc., 2008, 443-50664. Stella V. I. & colab., J. Med. Chem., 23, 1275, (1980).65. Storm G., Crommelia D.J.A: Liposomes: Quo vadis?, Pharma Science & TehnologyToday, 1998,vol.1,nr.1, 19-31.66. Suzuki T., Nakamura M., Sumida H. and Shigeta I., Liquid crystal make-upremover:condition of formation and its cleansing mechanisms, J. Soc. Cosmet. Chem.1992.67. Talsma H., Crommelin D.J., Liposomes As Drug Delivery Systems, PharmaceuticalTechnology International, 24-36, (Nov. 1992).68. Talsma H., Crommelin D.J., Liposomes As Drug Delivery Systems, PharmaceuticalTechnology International, 34-38, (Dec. 1992).69. Talsma H., Crommelin D.J., Liposomes As Drug Delivery Systems, PharmaceuticalTechnology International, 48-59, (Jan. 1993).70. Taylor K.M., Taylor G., Stevens J., Int. J. Pharm., 58, 57-61, (1998).71. Tomlinson E., Int. J. Pharm. Technol., 4, 49, (1983).72. Vasant V. Ranade, Manfred A. Hollinger, Site-specific Drug delivery usingLiposomes as carriers, Drug delivery Systems, CRC Press, Boca Roton, Florida 1995,3-25.73. Vauthier C., Holzcherer, S. Benabbou, G. Spenlehauer, et al., Methodology for thepreparation of ultradispersed polyner systems, STP Pharma Sci., 1991.74. Wu P.C., Liao Y.H. C.C., Chang J.S., Hiang, Y.B., The characterization andbiodistribution of cefocitin-loaded liposomes, Int. J. Pharm., 2004, 271, 31-39.