240

6. Biocapteurs6.1 Principe d’un biocapteur

Biocapteur = élément de reconnaissance moléculaire + transducteur

L’élément de reconnaissance moléculaire réagit spécifiquement avec le bio-analyte d’intérêt.

Le transducteur agit en tant que détecteur, convertissant l’évènement de reconnaissance moléculaire en un signal facilement mesurable.

élément de reconnaissancemoléculaire

transducteur

analyte analyte

élément de reconnaissancemoléculaire

transducteur

signal signal

241(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

L’élément de reconnaissance moléculaire et le transducteur sont intégrés dans un seul dispositif (petit et portatif) permettant de doser directement l’analyte d’intérêt sans l’ajout d’autres réactifs ou de pré-traitement de l’échantillon.

242

L’élément de reconnaissance moléculaire:est immobilisé à/près de la surface du transducteur par physisorption, chimisorption ou par piégeage dans une membrane inerteoffre une spécificité et une sensibilité élevées pour l’analyte, ainsi qu’une réponse rapideex. enzymes, anticorps, ADN, cellules entières, micro-organismes

Le transducteur:est le composant d’un biocapteur qui détecte les changements physiques se produisant dans l’élément de reconnaissance moléculaire suite à la liaison de l’analyte et les convertit en un signal de sortie qui peut être amplifié, affiché et sauvegardépeut convertir le signal provenant d’un évènement de reconnaissance moléculaire soit directement ou par le biais d’un médiateur chimique (ex. glycomètre)

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis,Bioanalytical Chemistry, 2004)

Principe de fonctionnementd’un biocapteur

243(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

Modes de transduction:le type de reconnaissance moléculaire détermine le type de transducteur utiliséex. spectrophotométrie, électrochimie, calorimétrie et piézo-électricité

244

Combinaisons différentes

Détection de H2O2/O2, électrodes aux enzymes

ampérométrie- Enzyme- Micro-organisme- Tissue - Anticorps marqué avec enzyme

Électrodes rédox et sélectives aux ions (ex. électrode de verre, électrodes sélectives au CO2, NH3 et sulphide)

potentiométrie- Enzyme- Micro-organisme- Tissue (plante ou animale)- Anticorps marqué avec enzyme

Électrochimie

ExempleTransducteurÉlément biologique

245

BIAcore (avec surfaces d’Au ou Ag)

résonance de plasmons de

surface (SPR)

- Anticorps- Antigène- Enzyme- Acide nucléique

Électrodes de Pt ou Au pour déterminer le changement de conductivité de la solution due à la production d’ions

Photodiodes, fibre-optiques, puces à ADN

Conductimétrie

Optiquefluorescence

- Enzyme-Bicouche lipidique

- Anticorps- Acide nucléique

Électrochimie

ExempleTransducteurÉlément biologique

246

Dispositifs piezoélectriques, microbalance à cristal quartz

Thermisteur ou thermopile

Acoustique

Calorimétrie

- Anticorps- Antigène- Enzyme- Acide nucléique

- Enzyme- Micro-organisme- Cellule

ExempleTransducteurÉlément biologique

B.M. Paddle, « Biosensors for chemical and biological agents of defence interest »,Biosensors & Bioelectronics 1996, 11, 1079-1113

247

6.2 Biocapteur à base d’enzyme

Le 1er biocapteur (développé par Clark et Lyons en 1962 pour la détection du glucose) était constitué de la glucose oxydase (GO) piégée à la surface d’une électrode de Pt par une membrane à dialyse permettant la diffusion des substrats et produits à/de la couche enzymatique.

La conversion du D-glucose (S) en gluconolactone (P) et H2O2est détectée par électrochimie:

enzyme piégée dans une

membrane semi-perméableS + O2 P + H2O2

électrode de référenceélectrode

de travailélectrode auxiliaire

H2O2 2H+ + O2 + 2e

-

Eappliqué = +0.70 V vs. E.C.S.

iCapteur ampérométrique

248

L’amplitude du courant mesuré (i) dépend de quatre facteurs:

cinétique de transfert de masse qui détermine les vitesses auxquelles les substrats peuvent être fournis à et les produits enlevés de la couche enzymatique

cinétique enzymatique qui détermine la vitesse à laquelle le H2O2 est généré à l’intérieure de la couche enzymatique

cinétique de la réaction électrochimique qui détermine la vitesse à laquelle le H2O2 produit dans la réaction enzymatique est converti en O2efficacité de conversion, i.e. fraction de H2O2 oxydée

Les réactions se produisent dans une mince couche à la surface du transducteur; des concentrations stables des réactifs et des produits existent dans cette couche lorsqu’un signal constant estobtenu.

249

Fe(CN)64-

Fe(CN)63-

FAD

FADH2

C6H12O6

C6H10O6

électrode

glucose oxydase

e-glucose

gluconolactone

contacteélectrique

électrode de travail/enzyme

électrode deréférence Ag/AgCl

zone réactive

Bandelette-test pour le glucose

Glycomètre - biocapteur ampérométrique

250

L’accepteur physiologique (O2) est remplacé par un médiateur synthétique (1,1’-diméthyl-ferrocène ou Fe(CN)63-/4-) pouvant transporter les électrons du centre rédox de l’enzyme à la surface de l’électrode.

Due à l’utilisation d’un médiateur artificiel, l’analyse devient insensible à la fluctuation du taux d’oxygène (i.e. N2 vs. air)

L’analyse peut aussi être effectuée à des potentiels plus bas (élimination d’espèces interférentes).

(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

Courbes d’étalonnage enregistrées pour le glucose avec le ferrocène

comme médiateur

251

sonde moléculaire

6.3 Microréseau à base d’ADN

Un microréseau à base d’ADN permet l’analyse en parallèle de plusieurs gènes sur un seul dispositif. Des dizaines de milliers de réactions peuvent être effectuées simultanément sur une seule puce à ADN.

Cette nouvelle technologie exploite l’appariement de deux oligonucléotidescomplémentaires. Avec un microréseau d’ADN, il est possible d’identifier la séquence d’un gène et de détecter des mutations génétiques.

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

252

Fabrication de macro- ou microréseaux d’ADN

Une puce à ADN contient un arrangement ordonné d’oligonucléotidesimmobilisés en forme de points sur un support solide miniaturisé(généralement du verre). Chaque point d’une puce contient jusqu’à~106 oligonucléotides identiques, mais la séquence nucléotidique varie d’un point à l’autre.

253

Dans un macroréseau, la taille des points est ≥ 300 µm. Il y a 1,000 à 10,000 différents points par puce.

Les macroréseaux sont fabriqués avec un dispositif piezoélectriqueprogrammable (cf. imprimante à jet encre)

(1) (2) (3) (4) (5)

Étapes de fabrication d’un macroréseau

254

Modes d’immobilisation des oligonucléotides:

Couplage covalent d’un oligonucléotide

1- Modification de la surface de verre avec un silane fonctionnalisé

OHSi

H3COH3CO

H3COX

SiH3CH3C

ClXOH

Si XO

O

O

O Si XH3C

H3C

+

ou

+

95% acetone/5% eau

(ou X= NH2, SH, CHO, ) O

255

2- Réaction avec oligonucléotide aminé, NH2-(CH2)6-O-(PO)2-oligo

H21,4-phénylenediisothiocynate

256

CHO

CH=

- Attaque nucléophilique (-NH2, -SH, -OH) sur des époxydes

257

Couplage non-covalent (adsorption électrostatique)groupements phosphate chargés négativement de l’ADN

– Surface modifiée avec un γ-amino propylsilane– Surface modifiée avec une couche de poly-L-lysine

258

puce à ADN d’Affymetrix

Dans un microréseau, la taille des points est de 20 à 50 µm (ex. puce à ADN d’Affymetrix).

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

259

Fabrication d’un microréseau par photolithographie

www.affymetrix.com

O OSi SiH3C CH3 H3C CH3OH OH

plaque de verre

ClSi(CH3)2

-HCl

260

Principe d’une puce à ADN

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

(marqueur fluorescent)

261

Lecteur de microréseaux-microscope confocal à fluorescence induite par laser

λexcitation: Vert (532 nm)Rouge (633 nm)

262

C

Séquençage de l’ADN avec un microréseau

Un microréseau constititué de 44 = 128 points de tetranucléotides. Pour simplicité, seulement une chaîne est illustré par point.

Un microréseau après réaction avec de l’ADNpartiellement digéré. L’hybridation avec les tetranucléotidesdu réseau est indiquée en rouge.

(D’après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)

263

Marqueurs fluorescents: rhodamine et fluoresceinou Cy3 et Cy5 λexcitation: Vert (532 nm)

Rouge (633 nm)

264

Microréseaux et les couleurs des points