BIOTEHNOLOGII – NOTE DE CURS

Ce sunt biotehnologiile?

“Biotehnologie” provine din doi termeni bio – deriva din grec. bios = viata tehnologia – studiul al masinilor si uneltelor (termen utilizat inca de Plutarh si

Cicero) Notiunea a aparut pentru prima data in Danemarca in 1908 Definitie

Biotehnologia este o stiinta inginereasca, pluridisciplinara ce utilizeaza materia vie pentru degradarea, sinteza si producerea de materiale noi utilizate in activitatile umane. Foloseste microorganisme, enzime, structuri celulare si subcelulare, biocatalizatori, tehnici de inginerie genetica etc.

1 BIOTEHNOLOGIILE CLASICE Încă din antichitate erau utilizate, în mod empiric, unele metode biotehnologice cum ar fi

fermentaţiile cu ajutorul microorganismelor, cunoscute cu câteva milenii înainte de era noastră. Babilonienii cunoaşteau, încă din mileniul VI î.H., modul de preparare a berii precum şi

bioconversia alcoolului etilic în acid acetic (oţet). Mai târziu, în mileniul III î.H., sumerienii cunoşteau tehnologia fabricării a peste 20 de tipuri de bere. Descoperirile au demonstrat că majoritatea popoarelor antice utilizau drojdiile pentru fabricarea unor produse alimentare (pâine, vin, bere etc) precum şi bacteriile pentru obţinerea derivatelor lactate.

Progrese însemnate sunt realizate începând din secolul XVII când olandezul ANTON VAN LEEUWENHOEK (1632- 1723) a descoperit, în anul 1680, la microscopul ce l-a inventat, existenţa unei lumi microbiene, necunoscută până atunci. La microscopul său cu putere de mărire de circa 300 de ori, a observat micile vietăţi pe care le-a numit “animalcule”, cu forme sferice, drepte sau spiralate, care trăiesc în apa de râu, decoctul de fân, salivă şi mustul de bere. Cercetările sale au făcut obiectul a 112 comunicări ştiinţifice, prezentate la Royal Society of London.

În secolul XIX, savantul francez LOUIS PASTEUR (1822- 1895) a demonstrat că în procesul de fermentaţie alcoolică are loc transformarea glucidelor în alcool etilic, cu degajare de CO2, proces care furnizează energia necesară celulelor de drojdii ce se dezvoltă chiar în absenţa O2. Concomitent extinde studiile asupra fermentaţiilor butirică şi lactică.

În timpul primului război mondial, WEIZMANN a descoperit fermentaţia acetono- butanolică iar produşii derivaţi i-a folosit la sinteza cauciucului sintetic (butadienă) şi a unui exploziv denumit cordiţă. Cercetările biologului scoţian ALEXANDER FLEMING, iniţiate în anul 1929, au deschis era microbiologiei industriale moderne, prin elaborarea bazelor de obţinere a penicilinei. A urmat descoperirea streptomicinei de către colectivul condus de WAKSMAN (1943) şi al chloramphenicolului creat de SMITH şi WORREL (1953). Până în anul 1959 s-au elaborat peste 4000 de antibiotice, perfecţionându-se tehnicile şi instrumentarul necesar în industria ffarmaceutică (bioreactoare automatizate).

Ca rezultat al acestor descoperiri, la jumătatea anilor ’60 a apărut, cu o mare forţă de dezvoltare, biologia industrială, capabilă să producă o schimbare fundamentală a tehnicilor de fabricare a unui număr mare de produse alimentare, farmaceutice şi chimice. Folosind microorganisme specifice, implicate în diferite fermentaţii anaerobe, s-au produs proteine alimentare şi furajere, aminoacizi, aromatizanţi, acizi organici, îndulcitori alimentari, solvenţi organici, enzime, medicamente precum şi noi surse energetice.

2 BIOTEHNOLOGIILE MODERNE În centrul atenţiei specialiştilor în biotehnologii stă asigurarea necesarului de alimente

pentru populaţia globului, mai ales proteine şi aminoacizi, producerea de medicamente pentru sănătatea publică, pentru profilaxia şi tratamentul celor 300 de boli ereditare şi a celor două maladii grave ale sfârşitului de secol (cancerul şi SIDA), precum şi combaterea efectelor nocive ale poluării mediului de viaţă.

Evolutia populatiei planetei •240.000 ani – 10.000 locuitori •4000 iHr. - 30 milioane •1 dHr. - 210 milioane •1900 1.650 milioane •2006 6.5 md. În fruntea ţărilor care au iniţiat dezvoltarea biotehnologiilor moderne a fost Japonia care,

ca şi alte ţări asiatice, avea o foarte veche tradiţie în domeniul producerii băuturilor şi a alimentelor fermentate, folosind ca materii prime orezul şi soia.

Pe baza unui imens volum de date experimentale de biochimie microbiană, după cel de-al doilea război mondial, microbiologia industrială japoneză a devenit rapid unul din principalele domenii ale cercetărilor ştiinţifice şi tehnologice, mai ales după anul 1953 când s-a creat Institutul de Microbilogie aplicată din Tokyo.

Creşterea preţului petrolului, după anul 1973, a stimulat industriile nipone să găsească alte materii prime, în afara celor de natură petrochimică, pentru a păstra avansul tehnologic în unele sectoare prioritare. În aceste condiţii, Japonia a trecut la industrializarea modernă a fermentaţiior microbiene, satisfăcând rapid necesarul intern şi devenind exportatorul principal cu produse de fermentaţie spre ţările asiatice. Până în anul 1980, Japonia a ajuns la o producţie anuală de 50 mil hl bere, 27 mil.hl sake, 12 mil.hl sos de soia şi 3 mil hl oţet.

Dezvoltând rapid ingineria genetică, orientată spre recombinare ADN din unele suşe de microorganisme, cercetătorii japonezi şi ulterior americanii, au devenit, încă din anul 1957, posesorii primelor licenţe de fabricare a aminoacizilor esenţiali ca: acid glutamic (1957), lizină (1957), treonină (1960), fenilalanină (1961), producând, încă din anul 1980, peste 85.000 tone anual de aminoacizi proteici, precum şi a licenţelor de fabricare a vitaminei B12 (1959), a unor antibiotice, a interferonului, a primelor medicamente de luptă împotriva cancerului şi a multor produse alimentare, farmaceutice, cosmetice şi chimice.

Miracolul japonez în lansarea biotehnologiilor se datoreşte şi investiţiilor de zeci de miliarde de yeni anual, prin cele 70 de mari companii implicate, sub coordonarea firmei Kyowa Hakko Kogyo, responsabilă şi cu păstrarea secretului ştiinţific şi tehnologic.

În prezent, microbiologia face parte din cultura cotidiană şi obligatorie a tuturor universităţilor şi întreprinderilor japoneze. Aici există peste 1.500 de specialişti cu doctorat în microbiologie.

Biotehnologiile de producere a diferitelor substanţe utile s-au extins rapid şi în alte ţări dezvoltate sub spect industrial, respectiv S.U.A., ţările vest-europene, China, fosta U.R.S.S.

În S.U.A., activitatea uzinelor biotehnologice s-a concentrat, iniţial, pe producerea siropului de fructoză prin fermentarea porumbului, realizându-se anual peste 500.000 tone High Fructose Corn Syrup, cu mari utilizări în industria alimentară şi farmaceutică. De remarcat că fructoza are o putere de îndulcire superioară zaharozei şi glucozei, fiind unicul glucid acceptat în alimentaţia diabeticilor. Alte programe naţionale americane au urmărit obţinerea, prin biotehnologii, a necesarului de medicamente, vaccinuri, acizi organici (citric, acetic, fumaric, lactic), a unor aminoacizi, a proteinelor macromoleculare şi a drojdiilor de panificaţie. Randamentele ridicate ale biotehnologiilor americane s-au datorat aplicării în producţie a rezultatelor celor 45 companii de inginerie genetică, orientate în direcţia recombinării acizilor nucleici din diferite specii vegetale şi a celor circa 700 de societăţi specializate în biotehnologii (firmele Cetus- 1970, Genentech- 1976, Eli Lilly, Genex, Genencor, Biogen, Centocor, Immunex, Genzyme, Hybritech, Syntex etc) (M.D.DIBNER- 1991).

În fosta U.R.S.S. existau în anii ’80 peste 100 de uzine biotehnologice dintre care 86 produceau proteine monocelulare pentru consum zootehnic iar celelalte produceau aminoacizi,

hormoni, vitamine, antibiotice, enzime şi lipide. Ca substrat nutritiv pentru microorganisme se foloseau, cu precădere, deşeuri cu origine forestieră, agricolă şi industrială.

În Europa de Vest programele naţionale de investiţii au stimulat apariţia unor mari uzine biotehnologice la Braunschweig (Germania), Cambridge, Mill Hill, Porton Down, Slough (Anglia), Delft (Olanda), Strasbourg, Compiégne, Toulouse, Rhône- Poulenc (Franţa), Pavia (Italia) etc.

În uzinele biotehnologice, bazate pe tehnici moderne de microbiologie industrială, se folosesc bioreactoare speciale cu factori dirijaţi, cu capacităţi între 10.000- 250.000 litri (cele mai frecvente de 20.000 litri). Prin perfecţionarea tehnicii de cultivare s-a ajuns la un flux continuu în care se menţin constante condiţiile de viaţă microbiană (temperatură, pH, oxigenare, nutriţie minerală şi organică), folosind un sistem modern de programare pe computere.

Coordonarea activităţii uzinelor biotehnologice şi elaborarea programelor naţionale de investiţii intră în atribuţiile societăţilor specializate care devin, treptat, priorităţi locale şi naţionale, asigurând legături indispensabile între bioştiinţe şi bioindustrii precum şi transferul de tehnologii ultramoderne. Dacă în anul 1983 existau, pe plan mondial, 450 societăţi de biotehnologie, în următorii 10 ani s-a ajuns la 1.700 societăţi în S.U.A., Europa şi Asia. O activitate intensă desfăşoară cele peste 60 societăţi biotehnologice din Franţa: Immunotech, Genset, Transgéne- Mérieux, Calliope, Zymogenetics, Germe, Coletica, Gist- Brocades, Bio- Europe etc (N. ESCOURROU- 1992).

Bilanţul activităţii acestor societăţi şi uzine specializate a fost prezentat la cel de al VII- lea Congres European de Biotehnologie, ţinut la Nisa în februarie 1995, la care au participat 70 de societăţi naţionale, inclusiv din România.

Evaluarea produselor tehnologice obţinute pe plan mondial la nivelul anului 1990 totaliza cifra de 250 miliarde de dolari din care: 50 miliarde din producerea de etanol, 42,8 miliarde dolari din produse agroalimentare provenite din porumb, 40,7 miliarde de dolari din antibiotice, 21,3 miliarde dolari din vaccinuri, 7,5 miliarde dolari din aminoacizi, 6,1 miliarde dolari din hormoni, 4,6 miliarde de dolari din acizi organici etc .

Extinderea biotehnologiilor în toate ţările dezvoltate şi slab dezvoltate, ar putea conduce nu numai la rezolvarea unor probleme economice locale ci şi la modificări radicale în structura industriilor alimentare, chimice şi farmaceutice, cu efecte benefice imediate, pe plan naţional şi mondial. Alegerea profilului de activitate pentru fiecare uzină biotehnologică, din diferite sau macrozone populate, merită o atenţie deosebită, urmărindu-se ca grefarea sistemelor tehnologice să corespundă cu situaţiile economice şi sociale ale populaţiilor respective. Astfel, crearea de cicluri scurte de producere a proteinelor monocelulare prin biotehnologii poate prezenta avantaje foarte mari în rezolvarea problemei alimentaţiei umane, în dezvoltarea sectorului zootehnic, protecţia solului, reducerea ritmului de despădurire şi valorificarea eficientă a forţei de muncă rămasă disponibilă.

Ca o imagine retrospectivă a evoluţiei biotehnologiilor clasice şi moderne se poate sublinia că „prima revoluţie biotehnologică” lansată prin lucrările savantului LOUIS PASTEUR, a asigurat difuzarea vaccinurilor şi a primelor antibiotice, având ca efect imediat salvarea multor vieţi omeneşti. Cea de a „doua revoluţie biotehnologică”, declanşată de şcolile microbiologice japoneze şi americane, în ultimele 3 decenii, a început să-şi facă simţită contribuţia benefică în asigurarea alimentţiei şi a dreptului la viaţă a sute de milioane de oameni, mai ales a copiilor din lumea a III- a, care piereau anual din cauza subnutriţiei cronice.

Progresele imense înregistrate în microbiologia mondială, după cel de al doilea răyboi mondial, l-au determinat pe ilustrul genetician FRANÇOIS JACOB, laureat al Premiului Nobel, să scrie: „În câţiva ani, omul a avut surpriza să constate că, fără microorganisme, această lume n-ar fi fost ceea ce este în prezent”.

BIOTEHNOLOGIILE PENTRU ASIGURAREA SĂNĂTĂŢII Pentru sectorul de sănătate umană şi animalieră, cercetările de biotehnologie aplicativă

vizează trei câmpuri de activitate: producerea de molecule cu efecte terapeutice, producerea de vaccinuri şi elaborarea unor metode mai eficiente de diagnosticare a bolilor. Asociaţia fabricanţilor de produse farmaceutice din Franţa înregistra noi creaţii pe cale biotehnologică (exceptând antibioticile):

- hormoni de creştere 12 - interferoni 13 - interleucine 14 - anticorpi monoclonali 41 - vaccinuri 15

3. PRODUCEREA DE ANTIBIOTICE Antibioticele sunt substanţe produse de diferite microorganisme care au capacitatea

de a inhiba sau distruge alte microorganisme, unele implicate în declanşarea anumitor maladii infecţioase.

Istoricul producerii de antibiotice coboară încă în antichitate. Pe un papirus rămas din timpul celei de a 11- a dinastie egipteană (în urmă cu 4.000 de ani), se descrie utilizarea unor ciuperci şi mucegaiuri care creşteau pe suprafaţa iazurilor şi erau utilizate în tratamentul rănilor deschise şi infectate. Tot pentru vindecarea rănilor şi a furunculelor, grecii şi chinezii din antichitate foloseau sucul de soia şi lutul fierbinte. Venind din vremuri mai apropiate, găsim în ziarul medical „Lancet” că doctorul MOSSE (1852) propunea tratamentul furunculozelor epidemice cu drojdie de bere (Saccharomyces cerevisiae) (o linguriţă de 3 ori pe zi), care asigură o vindecare fără recidive.

Baza teoretică a producerii antibioticelor a fost prezentată de savantul român VICTOR BABEŞ, în anul 1885, care scria că unele microorganisme pot produce substanţe chimice capabile să inhibe dezvoltarea altora iar „o boală cauzată de unele bacterii va putea fi tratată cu ajutorul altor bacterii”. La scurt timp după formularea teoretică a lui BABEŞ apare descoperirea, din anul 1888, când CHARDIN şi GUIGNARD au demonstrat că bacteria Pseudomonas pyocyanea produce un pigment solubil care este toxic pentru bacteria Bacillus anthracis, fără a cauza hemoliza globulelor roşii din sângele organismului gazdă. Tot în acel timp, VUILLEMIN propune termenul de antibioză (contrar simbiozei) care stă la baza acţiunii antibioticelor ce vor fi descoperite ulterior.

După unele experimentări cu rezultate contradictorii (SCHAPIRO- 1908, PORTER- 1924 la actinomicete, PRAT şi BOYLE la mucegaiuri), apare marea descoperire a scoţianului ALEXANDER FLEMING (1929) care demonstra că o cultură de stafilococ auriu a fost distrusă prin suprainfectarea cu mucegaiul Penicillium rubrum (notatum).

Era antibioticelor a fost inaugurată prin comunicarea despre penicilină prezentată de FLEMING la Medical Research Club, în ziua de 13 februarie 1929. Comunicarea a fost primită de bacteriologi cu multă răceală şi zâmbete de bunăvoinţă. Ulterior, o serie de cercetători s-au ocupat de perfecţionarea peniciline (LOVELL, RAISTRICK, CLUTERBRUCK). Obiectivul acestei munci a fost finalizat abia în anul 1939 când australianul FLOREZ şi germanul CHAIN au reuşit purificarea penicilinei, în stare cristalizată, folosind procedeul liofilizării. Prin infectarea animalelor de experienţă cu stafilococi, streptococi şi Clostridium, ei au reuşit distrugerea acestora prin tratamente cu penicilină pură. Pentru această extraordinară realizare, FLEMING, FLOREY şi CHAIN au fost încununaţi cu premiul Nobel pentru medicină, în anul 1945.

Din aproape 5.500 de antibiotice cunoscute în prezent, circa 1.000 de tipuri sunt produse de 6 genuri de ciuperci filamentoase, dintre care cele mai importante sunt Penicillium, Streptomyces şi Cephalosporium. Peste 500 de forme sunt sintetizate de două tipuri de bacterii nefilamentoase, iar 3.000 de forme sunt produse de 3 genuri de actinomicete. Aceste specii de microorganisme sunt mai eficiente în cazul suşelor ameliorate prin mutaţii, recombinări de ADN şi, eventual, prin inginerie genetică.

Antibioticile au căpătat o foarte largă utilizare medicală, cu extindere rapidă în ultima jumătate de secol, cele mai mult comercializate fiind penicilinele (produse de mucegaiul Penicillium chrysogenum), cefalosporinele (produse de mucegaiul Cephalosporium acremonium), streptomicinele şi tetraciclinele (produse de bacteriile din genul Streptomyces) la care se adaugă, în cantităţi mai reduse, anthracidinele, aureomicinele, canamicinele şi neomicinele (E.J. VAN DAMME- 1984).

4. PRODUCEREA DE HORMONI a. Insulina. Este hormonul a cărui absenţă din organismul uman provoacă diabetul, boală

răspândită pe glob la peste 60 milioane de locuitori. Pentru corectarea acestei insuficienţe hormonale, insulina a fost extrasă, iniţial, din pancreasul de câine (în 1921) şi experimentată, 1922, la un băiat de 9 ani, cu rezultate spectaculoase. Din anul 1923 firma americană Eli Lilly a produs insulina pe cale industrială, prin extragerea din pancreasul de bovine şi porc, cu un randament de 100g insulină cristalizată la 100 kg pancreas (0,01 %)

Perfecţionări aduse tehnicilor de preparare au permis obţinerea unor produse cristalizate cu acţiune lentă şi ultralentă, fiind absorbite în 48 de ore. Această insulină, extrasă din bovine şi porcine, provoacă unele efecte secundare iar unii diabetici fac intoleranţă la hormonul animal: pentru aceasta a fost necesară purificarea insulinei animale până la calitatea celei umane, procedeu realizat de firma

daneză Novo Industrie (1981) prin substituirea aminoacidului alanina cu treoninâ, pe cale enzimatică şi separare cromatografică.

Ca structură chimică s-a constatat că insulina are două catene polipeptidice (A şi B), lungi de 21 şi 30 de aminoacizi. Sinteza celor două gene implicate în producerea catenelor polipeptidice a fost realizată la universitatea din California (în 1979), prin includerea genei mutante într-o plasmidă, cu rol de vector şi transferul în bacteria Escherichia coli care produce circa 100.000 molecule de insulină la o celulă bacteriană. Pe această cale microbiologică, firma Eli Lilly a dezvoltat, în anul 1977, sistemul industrial de producere a proinsulinei şi insulinei identice cu cea umană, fără a provoca eventuale efecte secundare (tulburări renale şi oculare). La Centrul de microbiologie aplicată din Porton Down (Anglia), folosind un bioreactor de 1.000 litri mediu de cultură, s-au obţinut 200 g insulină, echivalentul al cantităţii extrase din 1.600 kg pancreas de bovine sau porcine: Insulina produsă prin această tehnică de inginerie genetică poartă denumirea de humulină, înlocuind pe cea extrasă din organismele animale.

b. Somatostatina. Este un hormon produs în organismul uman de glandă hipotalamus, situată la baza creierului, având rol în eliberarea insulinei şi a unor hormoni de creştere.

Pentru suplinirea carenţei organismului în somatostatină, începând din anul 1977, a fost sintetizat hormonul respectiv cu ajutorul bacteriilor recombinate genetic. Gena somatostatinei, sintetizată artificial de ITAKURA (California), este alcătuită din 52 de nucleotide, având la bază 14 aminoacizi. Această genă a fost introdusă într-o plasmidă şi transferată în bacteria Escherichia coli care poate sintetiza circa 10.000 molecule de somatostatină la o celulă bacteriană. Este posibilă sinteza a 1 mg hormon la 1 litru de cultură bacteriană, cantitate ce s-ar extrage din 5 milioane creiere de oaie. Firma Genentech din San Francisco (S.U.A.) a obţinut un randament care poate ajunge la 3% somatostatină.

c. Somatotropina. Este hormonul uman de creştere (HCU), secretat de celulele lobului anterior al hipofazei, într-o cantitate foarte redusă (4-6 mg/ hipofiză). În absenţa sa se provoacă nanismul hipofizar (piticirea), frecvent în lume la 7-10 persoane dintr-un milion de indivizi. Administrarea de somatotropină prin injecţii intramusculare în doze de 10 mg/ kg corp/ an, fracţionate în câte 3 infecţii pe săptămână, ar asigura un ritm normal de creştere a copiilor suferinzi de piticire. Condiţia reuşitei tratamentului este începerea la vârsta de 4-5 ani, cu continuare până la sfârşitul pubertăţii şi chiar după aceasta.

Extragerea şi purufucarea somatotropinei umane (HCU) a fost realizată de ROSS şi colab. (1963) din hipofiza cadavrelor, cu un randament foarte redus (4-5 mg hormon dintr-o hipofiză umană).

Societatea de inginerie genetică Genentech (S.U.A.) a reuşit sinteza chimică a genei care determină formarea acestui hormon, respectiv o proteină complexă alcătuită dintr-o secvenţă de 191 aminoacizi. După clonare în celula bacteriană de Escherichia coli, a rezultat o suşă selecţionată (K- 12) care poate produce circa 100.000 de molecule de somatotropină la o celulă bacteriană. Acest hormon de creştere, obţinut prin inginerie genetică, este pur din punct de vedere chimic, foarte omogen, liber de viroze şi cu o metionină în plus faţă de hormonul uman.

Firma Kabi Vitrum din Suedia a preluat suşa americană K-12 şi a produs hormonul pe cale industrială astfel că 1 litru de cultură bacteriană să realizeze, în 7 ore, o cantitate de hormon egală cu cea extrasă din 60 hipofize umane şi la un preţ de cost mai redus de 3 ori. Hormonul obţinut prin biotehnologie poate fi folosit la stimularea creşterii, atât la oameni cât şi la animale domestice.

d. Interferonul. A fost descoperit de ISAACS şi LINDENMANN (1957), în Anglia, sub forma unei proteine globulară, produsă de leucocitele din celula animală sau umană, având rol de apărare antivirală şi antitumorală, atunci când un virus pătrunde în organism. Interferonul endogen, cât şi cel administrat prin injecţii, stimulează sistemul imunitar, înhibă înmulţirea celulelor anormale şi combate bolile de origine virală (gripă, hepatită, zona Zoster).

Întrucât producerea interferonului prin extracţii din celule sanguine şi fibroblaste este foarte scumpă şi laborioasă, W. GILBERT (1980) din Boston (S.U.A.) a încercat procedeul de sinteză a secvenţelor de ADN corespunzătoare unor gene modificate, pe care le-a inclus într-o plasmidă şi le-a transferat în celulele bacteriene de Escherichia coli. Ulterior, în anul 1981, cercetători de la universitatea Seattle-Washington, în colaborare cu firma Genentech din California, au reuşit să transfere genele interferonului leucocitar în celulele drojdiei de bere (Saccharomyces cerevisiae) cu genom modificat. Randamentul a devenit destul de mare în sensul că la 1 litru de mediu nutritiv de celule de levuri s-au produs 25.000 de unităţi de interferon.

În prezent, interferonul leucocitar şi fibroblastic se produce la un preţ de cost foarte redus, în urma reuşitei de transfer a genelor în celulele bacteriene de Escherichia coli şi Methylophilus methylotrophus. Purificarea şi testele chimice şi farmacologice s-au făcut în unităţi de profil din S.U.A., Japonia, Anglia, Franţa, Suedia şi Israel, urmărindu-se efectele în combaterea cancerului, prin apărarea limfocitelor capabile să distrugă celulele canceroase. De asemenea s-a testat, cu bune rezultate, eficacitatea în tratarea altor boli cum ar fi keratita herpetică, papilomul laringian, scleroza în plăci, guturaiul, gripa, hepatita şi zona Zoster.

Mai recent, firma internaţională de biotehnologie Biogen din S.U.A. a reuşit să perfecţioneze o tehnologie prin care se produce o cantitate de interferon de 1.000 de ori mai mare decât cantitatea obţinută prin prelucrarea aceluiaşi volum de sânge uman, produsul fiind utilizat, cu mare succes, şi în combaterea hepatitei (B, C)

e. Cortizonul- Este un hormon steroidic cu o eficacitate foarte ridicată în tratamentul reumatismului articular. Sinteza chimică a cortizonului se realizează în 37 de etape. Folosind calea biotehnologiilor, prin înmulţiea ciupercii Rhizopus arhizus care hidrolizează progesteronul, sinteza cortizonului s-a redus la numai 11 etape, cu un preţ de cost mai redus de 400 de ori.

f. Hormonii sexuali. Numeroase microorganisme eucariote conţin molecule de tip hormonal care joacă un mare rol în manifestările sexualităţii, unele dintre ele fiind de natură steroidă. O mare parte dintre hormonii sexuali sunt sintetizaţi prin metabolismul bacterian dar, în majoritatea cazurilor, acţiunea microbiană constă dintr-o simplă bioconversie a unui compus natural sau obţinut printr-o sinteză chimică.

Sterozii sexuali, cu aplicaţii în chimia farmaceutică, sunt transformaţi (bioconvertiţi) prin procese de oxidare, reducere, hidroliză, condensare şi izomerizare.

Reacţiile de oxidare sunt de 4 tipuri: hidroxilarea, dehidroxilarea, în oxidarea grupărilor hidroxil şi degradarea oxidativă a catenelor laterale, în urma cărora se obţin corticosteron, hidroxiprogesteron, homoprogesteron, hidrocortizon etc. La aceste reacţii participă, după caz, microorganisme din genurile Aspergillus, Curvularia, Fusarium, Flavobacterium, Glomerella, Mycobacterium, Pellicularia şi Rhizopus.

Reacţiile de reducere se realizează prin hidrogenarea la nivelul grupărilor cetonice sub acţiunea microorganismelor din speciile Rhodotorula glutinis şi Kloeckera jensenii, implicate în sinteza unor prostaglandine (sulprostone).

Reacţiile hidrolitice au acţiune asupra esterilor, cu eliberarea grupării OH din steroid sau asupra eterilor, cu transformarea saponinelor, în prezenţa mucegaiului Penicillium chrysogenum, activând compuşii cu proprietăţi terapeutice.

5. BIOSINTEZA VITAMINELOR Încă din anul 1906, HOPKINS a stabilit că în alimentaţia animalelor sunt absolut necesari

“factori accesorii” care se gâsesc în drojdia de bere. Ulterior, CAZIMIR FUNK (1912) a izolat din drojdie acidul nicotinic şi a dat denumirea de vitamine pentru acest grup de substanţe.

Majoritatea microorganismelor prototrofe sunt capabile să sintetizeze toate vitaminele sau provitaminele de care au nevoie, uneori în cantităţi mult superioare faţă de necesarul propriu, pentru procesele de creştere. Astfel bacteria Ashbya gossypii, cultivată pe un mediu agitat şi îmbogăţit în lipide, sintetizează de 20.000 de ori mai multă riboflavină (vitamina B2) faţă de necesarul propriu, iar bacteria Pseudomonas denitrificans produce de 50.000 de ori mai multă cianocobalamină (vitamina B12) decât îi este necesară. De altfel, vitamina B12 are ca sursă unică biosinteza microbiană. De asemenea, beta- carotenul, precursorul vitaminei A, este sintetizat, în cantităţi foarte mari, pe cale biotehnologică (R. SCRIBAN- 1993).

În corpul microorganismelor s-a constatat prezenţa provitaminelor A, C şi D precum şi a vitaminelor B1 (tiamina), B2 (riboflavina), B5 (acidul pantotenic), B12 (cianocobalamina), C (acidul ascrbic), F (acidul folic), H (biotina), K (acidul para- aminobenzoic), PP (nicotinamida).

Vitamina B1 (tiamina, aneurina) este sintetizată de drojdii (mai ales Endomyces vernalis) şi de mucegaiuri din genul Aspergillus. Se pare că levurile au şi capacitatea de a concentra vitamina B1 dispersată în mediul de cultură. Este indicată în numeroase afecţiuni maladive, gastro- intestinale, renale, hepatice, diabetice, alcoolism, psihopatii, stări de nervozitate, hipertiroidie, pelagră, precum şi după tratamente prelungite cu sulfamide şi antiobitice. Tiamina este cunoscută şi sub denumirea de “vitamina performanţei intelectuale” deoarece are efecte pozitive asupra activităţii sistemului nervos, asigurând creşterea randamentului intelectual.

Vitamina B2 (riboflavina). Este sintetizată de numeroase microorganisme: bacterii (Aerobacter, Azobacter, Mycobacterium şi, mai ales, Clostridium la care riboflavina este un

subprodus al fermentaţiei acetono- butilice), levuri (mai ales Candida floreri şi Mycocandida riboflavina) şi mucegaiuri.

S-a constatat că cele mai bune producătoare de riboflavină sunt mucegaiurile (Ashbya gossypii şi Eremothecium ashbyii) când sunt cultivate într-un mediu agitat, suplimentat cu lipide şi la temperatura de 300C, metabolizând riboza şi un compus triciclic flavinic. După 5 zile se obţin cantităţi de riboflavină care ajung la 5.000- 6.000 unităţi / ml mediu de cultură şi se izolează prin cristalizare. Conform recomandărilor O.M.S., necesarul mediu de vitamină B2 este de 0,6 mg la 1000 kcal şi este indicată în numeroase afecţiuni maladive ca: stomatite, dermatite, conjuctivite, cataracte, keratoze, psoriazis etc. Riboflavina are rol determinant în fixarea fierului la nivelul hemoglobinei, în sinteza proteinelor precum şi în degradarea lipidelor şi glucidelor.

Îmbunătăţeşte vederea prin mărimea sensibilităţii retinei şi contribuie la dezvoltarea fizică a organismului.

Vitamina B5 (acidul pantotenic). Este produsă prin cultură de Sporobolomyces holsaticus ca urmare a condensării beta- alaninei şi a acidului pantoic, care derivă din valină. Prin cuplări fosforilate cu riboza şi adenina intră în structura coenzimei A, produsă de diferite bacterii. Acidul pantotenic are rol în catabolismul glucidelor şi lipidelor, cu eliberarea energiei necesare proceselor fiziologice şi în desfăşurarea multor reacţii enzimatice. Favorizează menţinerea structurii normale a pielii şi stimulează creşterea şi pigmentarea părului.

Vitamina B12 (cianocobolamina). Este cel mai eficient factor de prevenire şi combatere a anemiei pernicioase. Are un ciclu pseudoporfirinic, legat de un atom de cobalt.

Este produsă intracelular de microorganisme din genul Streptomyces şi din speciile Bacillus megaterium şi Propionibacterium freundenreichii, începând din anul 1949. Vitamina B12 a fost izolată prima dată din ficat de către FOLKERS şi SMITH (1948) (din o tonă de ficat au rezultat numai 28 mg vitamină B12). Cea mai importantă sursă de vitamină B12 este microflora din intestinul rumegătoarelor sau din cecul şi colonul erbivorelor nerumegătoare. Producerea pe cale fermentativă a fost realizată, pentru prima dată, de STOKSTAND (1948) prin cultivarea bacteriei Flavobacterium solare. Ulterior, cercetările au progresat rapid obţinându-se culturi de Propionibacterium shermanii, P.freundenreichii etc. care sintetizează cantităţi mari de vitamină. Mediul nutritiv este format din glucoză, extract de drojdie, hidrolizat de caseină, săruri de cobalt etc. Necesarul uman de vitamină B12 , recomandat de O.M.S., este de 2µg/ zi. Este cunoscută şi sub denumirea de “vitamina roşie” deoarece favorizează formarea şi regenerarea globulelor roşii (hematii), prevenind anemia. Intensifică procesul de creştere în greutate a copiilor, mărind pofta de mâncare. Menţine funcţionalitatea normală a sistemului nervos, scade iritabilitatea, îmbunătăţeşte capacitatea de concentrare şi memorare la copii, cu păstrarea echilibrului psihic. Vitamina exercită o acţiune de detoxifiere a ficatului, bazată pe capacitatea de activare a enzimelor tiolofore. Are şi efecte lipotrofe, prin intensificarea biosintezei colinei.

Vitamina C (acidul L- ascorbic, vitamina antiscorbutică) este gama- lactona acidului 2,3- enediol- L- gulonic. A fost descoperită de A. SZENT- GYÖRGYI, în anul 1927, la nivelul cortexului glandelor suprarenale, iar biochimiştii americani KING şi WANGH (1932) au găsit vitamina C în sucul citricelor. Acidul ascorbic este obţinut pe cale industrială prin oxidarea substratului nutritiv cu ajutorul bacteriei Acetobacter suboxidans. D- glucoza din substrat este transformată, prin reducere electrolitică, în D- sorbitol care se oxidează, pe cale microbiană, în L- sorboză. Urmează tratarea cu actonă şi formarea complexului diacetonă- L- sorboză care este oxidat în acid 2- cetogluconic şi apoi transformat, prin enolizare, în acid ascorbic.

Un alt procedeu de sinteză a vitaminei C are la bază oxidarea, pe cale bacteriană, a D- glucozei în acid 5- ceto- D- gluconic, urmată de o altă oxidare a acidului L- idonic în acid 1,2- ceto- gulonic. În aceste reacţii intervin mai multe specii din genurile Acetobacter, Aerobacter şi Pseudomonas.

Rolul fiziologic al vitaminei C este multilateral, cuprinzând majoritatea proceselor metabolice esenţiale care au loc la nivelul organismelor. Este implicată în procesele de biosinteză a ADN- ului, respectiv în biosinteza substanţelor proteice din ţesuturile de creştere. Acidul ascorbic acţionează ca transportor de hidrogen la nivel intracelular. Vitamina C stimulează sistemul imunitar şi măreşte rezistenţa organismului la bolile infecto-contagioase şi faţă de substanţele cancerigene. Accelerează vindecarea rănilor, regenerarea ţesuturilor, a cartilagiilor şi a oaselor. Facilitează absorbţia fierului şi stimulează maturarea hematiilor.

Sucul de lămâie, proaspăt recoltat, serveşte la oprirea hemoragiilor scorbutice (scorbutul), deoarece conţinutul în acid ascorbic şi bioflavonoide micşorează permiabilitatea şi măresc rezistenţa capilarelor sanguine.

Vitamina D (calciferol- vitamina antirahitică). Este constituită din substanţe care provin prin iradierea microsterolilor (ergosterol, zimosterol, escosterol etc). Cel mai cunoscut este ergosterolul care a fost izolat, prima dată, din Claviceps purpurea şi ulterior din miceliile unor mucegaiuri ca Penicillium, Fusarium şi Aspergillus. La o cultură de Aspergillus fischerii, pe un mediu nutritiv cu 10% glucoză, se obţine 1,1% ergosterol, în condiţiile unui raport optim C/N de 20/ 4.

Pe cale biotehnologică, ergosterolul se obţine prin culturi de drojdii sau micelii de Aspergillus niger şi Penicillium notatum. Urmează operaţia de transformare a ergosterolului în vitamina D prin iradiere cu lămpi de mercur sau cu sârmă incadescentă de magneziu. Are rol esenţial în fixarea calciului şi fosforului cu implicaţii directe în formarea sistemului osos şi a dentiţiei, prevenind rahitismul la copii, osteoporoza şi cariile severe. Ajută la tratarea răcelilor şi a conjuctivitelor.

Vitamina H (biotina) este sintetizată, pe cale microbiologică, în prezenţa unor microorganisme ca: Phycomyces blakesleana, Torulopsis utilis, Hansenula anomala şi Aspergillus niger. Se prezintă sub trei forme: bios I (mezoinozitol), bios II- A (acid pantotenic) şi bios II- B (biotina). Din mediu de cultură, separarea se face prin filtrare şi absorbţie pe norit. Biotina este componentă a unor enzime implicate în metabolismul proteic, lipidic şi glucidic. Ameliorează durerile musculare după oboseală excesivă şi contribuie la menţinerea integrităţii pielii. Împiedică încărunţirea părului şi previne alopecia (chelia).

Vitamina K (acidul para- aminobenzoic). Derivă din menadion, prin cultura algei Chlorella sau a anumitor specii din genul Bacillus. În organismul uman contribuie la metabolismul fierului şi la formarea hematiilor, prevenind sângerările şi emoragiile interne prin coagularea rapidă a sângelui.

Vitamina PP (nicotinamida). Nu este realizată prin culturi de microorganisme ci este sintetizată numai în plantele superioare. În schimb, niacina, o formă dezaminată a vitaminei PP, poate fi obţinută prin culturi de bacterii din genul Corynebacterium. Are rol în prevenirea pelagrei şi a dermatitelor severe, intensifică circulaţia sangvină, reduce tensiunea arterială şi atenuează tulburările gastro-intestinale, menţinând starea de sănătate a aparatului digestiv, a creierului şi a sistemului nervos. Este o vitamină esenţială în sinteza hormonilor sexuali (estrogeni, progesteron, testosteron, a cortizonului şi insulinei).

Provitamina A (carotenul). Este un pigment carotenoidic de natură terpenică, sintetizat din izo- pentil- pirofosfat. Se găseşte în anumite alge, în Mucoraceae şi în mucegaiul Choanephora. Beta- carotenul protejează mucoasa nazală, bucală, faringiană, laringiană, traheală şi pulmonară, constituind un bun remediu în tratamentul infecţiilor respiratorii şi emfizemului pulmonar. Are rol profilactic în bolile maligne (cancer gastric şi esofagian, cancer de prostată), transformând metaboliţii cancerigeni în substanţe mai solubile şi mai puţin nocive. Vitamina A contribuie la profilaxia tulburărilor de vedere, este un factor în menţinerea sănătăţii pielii, părului, danturii şi gingiilor. Totodată stimulează activitatea sistemului imunitar şi previne pigmentările cauzate de bolile ficatului sau de bătrâneţe.

Tot prin culturi microbiene pot fi produse: vitamina B6 (piridoxina), vitamina F (acidul folic) şi acidul lipoic, fără a prezenta o mare importanţă pentru producţia industrială şi farmacologică.

Biosinteza multor vitamine pe cale biotehnologică poate fi realizată prin anumite intervenţii genetice (mutaţii) sau prin reglarea proceselor metabolice din celulele diferitelor microorganisme.

6. PRODUCEREA DE VACCINURI SI SUBSTANTE IMUNOGENE Primul caz – L.Pasteur – a salvat un copil muscat de un caine turbat. In 3 ani, a tratat 5374

persoane (sub 1% mortalitate) Vaccinuri pentru diferite maladii: - Hepatita B, rujeola, turbarea, poliomelita, holera, lepra, malaria, pseudopesta aviara,

pseudoturbarea, pesta porcina, leucemia felina etc. 7. BIOTEHNOLOGIILE IN PERSPECTIVĂ 1992 s-a infiintat EUREKA – 20 de tari afiliate 85 md Euro – 40 md agricultura si alimentatie -24 md sanatate -15 md chimie -3 md echipamente - 2 md protectia mediului In urmatorii ani – specii de plante fixatoare de azot; - interventie - terapii genice pentru cancere si SIDA

Tendinta de crestere a populatiei modiale

country area sq.km.population (all estimates)

2006-07-01 yearly growth yesterday daily increase today

World 510,072,000 6,525,170,264 1.14% 6,542,493,250 203,800 6,542,697,050

1. China 9,596,960 1,313,973,713 0.59% 1,315,779,077 21,240 1,315,800,316

2. India 3,287,590 1,095,351,995 1.38% 1,098,872,126 41,413 1,098,913,540

3. United States of America 9,631,418 298,444,215 0.91% 299,076,671 7,441 299,084,112

4. Indonesia 1,919,440 245,452,739 1.41% 246,258,698 9,482 246,268,180

5. Brazil 8,511,965 188,078,227 1.04% 188,533,737 5,359 188,539,096

6. Pakistan 803,940 165,803,560 2.09% 166,610,546 9,494 166,620,040

7. Bangladesh 144,000 147,365,352 2.09% 148,082,597 8,438 148,091,036

8. Russia 17,075,200 142,893,540 -0.37% 142,770,417 -1,449 142,768,968

9. Nigeria 923,768 131,859,731 2.38% 132,590,559 8,598 132,599,157

10 Japan 377,835 127,463,611 0.02% 127,469,548 70 127,469,618

country area sq.km.population (all estimates)

2006-07-01 yearly growth yesterday daily increase today

World 510,072,000 6,525,170,264 1.14% 6,542,493,250 203,800 6,542,697,050

1. China 9,596,960 1,313,973,713 0.59% 1,315,779,077 21,240 1,315,800,316

2. India 3,287,590 1,095,351,995 1.38% 1,098,872,126 41,413 1,098,913,540

3. United States of America 9,631,418 298,444,215 0.91% 299,076,671 7,441 299,084,112

4. Indonesia 1,919,440 245,452,739 1.41% 246,258,698 9,482 246,268,180

5. Brazil 8,511,965 188,078,227 1.04% 188,533,737 5,359 188,539,096

6. Pakistan 803,940 165,803,560 2.09% 166,610,546 9,494 166,620,040

7. Bangladesh 144,000 147,365,352 2.09% 148,082,597 8,438 148,091,036

8. Russia 17,075,200 142,893,540 -0.37% 142,770,417 -1,449 142,768,968

9. Nigeria 923,768 131,859,731 2.38% 132,590,559 8,598 132,599,157

10 Japan 377,835 127,463,611 0.02% 127,469,548 70 127,469,618

Cresterea populaţiei pe continente până în 2020 ,

South America 8%Africa 35%

Asia 51%

Former Soviet Union 0%

Europe 0%North America 5%

Benefits of biotechnology – More food

.

8. Biotehnologiile în agricultura modernă

• Prima revolutie verde, initiata dupa cel de al doilea razboi mondial de Norman Borlaug pentru a incerca sa rezolve o parte din probleme grave ale nutriţiei omenirii .

• Cercetări dezvoltate in Mexic si Filipine la Grau, orez, porumb, sorg, mei etc. Premiul Nobel pentru agricultura A doua revoluţie verde = Biotehnologiile moderne Tendinte actuale in agricultura

Măsuri –diversificarea cultivarelor şi a speciilor cultivate –Introducerea biotehnologiilor (10% din necesarul de forţa de muncă din agricultura pentru

producerea aceleiaşi cantităţi de proteine) –Fixarea azotului atmosferic

• Valorificarea solurilor sărăturoase • Prevenirea efectelor toxice ale pesticidelor

(anual la cele 200 mii de produse chimice se adauga 1-2 mii noi, se înregistrează 1 mil intoxicatii acute soldate cu 20 mii morţi )

• Folosirea biotehnologiilor in ameliorarea plantelor • Schimbarea treptată a tuturor modelelor de producţie • Promovarea conceptului de dezvoltare durabilă • Modificarea legislaţiei privitoare la OMG (ORGANISME MODIFICATE GENETIC)

Aproape 90 de milioane de hectare cu plante modificate genetic au fost cultivate în

anul 2005, în întreaga lume. Potrivit raportului dat publicităţii de Internaţional Service of the Acquisition of Agribiotech Applications (ISAAA), suprafeţele însămânţate cu plante modificate genetic au crescut cu 11%, faţă de anul 2004. Creşterea din 2005 nu este atât de însemnată precum cea înregistrată pe parcursul anului 2004 (20%), dar se previzionează că se va menţine de-a lungul întregului deceniu.

În 2005 şase ţări au cultivat 98% din suprafaţa mondială de plante modificat genetic. Pe primul loc se situează SUA, cu 48 milioane hectare, urmate de Argentina – 17 milioane hectare, Canada – 6 milioane ha, Brazilia – 6 milioane ha, China – 4 milioane ha, Paraguay – 1,4 milioane ha. Restul de 2% din suprafaţa estimată cultivată de 15 ţări, printre care Mexic, Spania, Germania, România, Africa de Sud. Estimările ISAAA sunt puternic contestate de organizaţiile ecologiste, contestaţii cu marea carenţă de a nu avea nici o probă practică. Aflate de câţiva ani în centrul unor dezbateri contradictorii aprinse, organismele modificate genetic îşi continuă expansiunea fulminantă preconizată de oamenii de ştiinţă. În mai puţin de 10 ani ele au înregistrat un ritm mediu de dezvoltare realizat în agricultura tuturor timpurilor. Cantitativ acest ritm înregistrează o creştere anuală de peste 10 milioane hectare, iar analiştii anticipează o extindere a suprafeţelor cultivate la orizontul anului 2020 la dimensiunea totală de 350 milioane hectare, adică de aproape trei ori mai mult cât reprezintă suprafaţa cultivată a ţărilor UE – 15. Reticenţa europenilor faţă de aceste plante este una falsă din punct de vedere ştiinţific, singura explicaţie plauzibilă ţinând de imposibilitatea acestora de a valorifica eficient actuala abundenţă alimentară. Din acest punct de vedere, România este o ţară europeană atipică, dacă avem în vedere că ea este incapabilă să-şi asigure securitatea alimentară din resurse proprii.

Informaţii de ultimă oră analizează intenţia Ministerului Agriculturii de interzicere a cultivării acestor plante în România începând cu anul 2007, pe motivul absurd că UE nu ar permite acest lucru. Care este adevărul? Din Statele Unite până în Iran, inclusiv în patru state ale Uniunii Europene, agricultorii manifestă încredere în culturile modificate genetic, demonstrată de nivelul de implementare a acestor varietăţi, în 2005”, subliniază Clive James, preşedintele fondator al ISAAA. „Numărul tot mai mare de ţări unde se cultivă organisme modificate genetic, demonstrează atuurile economice, de mediu şi sociale”, adaugă domnia sa. Potrivit ISAAA, 8,5 milioane de agricultori utilizează organisme modificate genetic, pe suprafeţe de 90 de milioane de hectare, în 21 de ţări. În 1996, anul introducerii acestor plante, doar şase ţări le utilizau, iar suprafeţele erau de doar 1,7

milioane de hectare. Anul trecut, patru noi ţări – Portugalia, Franţa, Cehia şi Iranul – şi 250.000 de agricultori au adoptat culturile modificate genetic. Cea mai mare parte a suprafeţelor cultivate cu varietăţi modificate genetic este acoperită de soia (60%). Valoarea pe piaţă a culturilor transgenice a atins, în 2005, 5,25 miliarde de dolari. Raportul ISAAA remarcă faptul că agricultorii francezi şi portughezi au reintrodus, în 2005, cultura de porumb Bt, la care renunţaseră de 2 şi respectiv 5 ani. Cehia a introdus pentru prima dată cultura de porumb Bt. Până în momentul de faţă, culturile de porumb Bt au pătruns în cinci ţări din Uniunea Europeană (Cehia, Franţa, Germania, Portugalia, Spania). Spania – ţară membră a UE – cultivă, încă din anul 1998, porumb modificat genetic pe suprafeţe care în timp ar permite transformarea acestei ţări în principalul furnizor de seminţe de porumb modificat genetic al Europei.

România – in jur de 100 de mii de hectare cultivate cu organisme modificate genetic

Din cele 21 de ţări care cultivă varietăţi modificate genetic, 14 o fac pe suprafeţe care depăşesc 50.000 de hectare. Potrivit ISAAA, ţările în cauză sunt: Africa de Sud, Argentina, Australia, Brazilia, Canada, China, Filipine, India, Mexic, Paraguay, România, Spania, Statele Unite, Uruguay. În anul 2005, Brazilia este ţara care a recunoscut cea mai importantă creştere de suprafeţelor cultivate cu organisme modificate genetic: culturile de soia transgenică au progresat cu 88%, ajungând să acopere 9,4 milioane de hectare. În India, suprafeţele cultivate cu bumbac Bt (modificat genetic) au crescut de la 500.000 de hectare, în 2004, la 1,3 milioane de hectare, în 2005.

Potrivit Institutului Service of the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA), Iranul şi China sunt ţările cu potenţialul cel mai mare în comercializarea de orez modificat genetic. 250 de milioane de agricultori din întreaga lume, cultivă orezul transgenic, care se constituie în aliment de bază pentru 1,3 miliarde de persoane. International Service of the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA), asociaţie sponsorizată, într-o anumită măsură, de industria biotehnologiilor, se autocaracterizează ca fiind „un organism caritabil, fără a avea ca scop obţinerea de profit, care lucrează pentru înlăturarea sărăciei din ţările în curs de dezvoltare”. Acest scop ar putea fi atins prin facilitarea transferului de cunoştinţe şi prin „transferarea aplicaţiilor” din domeniul geneticii vegetale.

Incepand cu 2007 , in Romania este interzisa cultivarea soiei modificate genetic.

Suprafete cultivate cu plante modificate genetic in 2004

9. BAZELE MOLECULARE ALE INGINERIEI GENETICE •Ereditatea: transmiterea caracterelor codificate de materialul genetic – ADN –Celula la celulele fiice –Individ la descendenti •Genotip: totalitatea materialului genetic al unui organism •Fenotip: totalitatea trasaturilor observabile ale unui organism, determinate de materialul genetic si de mediul inconjurator

Dogma centrală a geneticii

ADN-ARN-proteine

Citoplasma

Nucleu

ADN

Citoplasma

Nucleu

ADN

CitoplasmaCitoplasma

NucleuNucleu

ADNADN

ARNARN

ProteinaProteina

ReplicatieReplicatieReplicatie

TranscriereTranscriereTranscriere

Translatie. TranslatieTranslatieTranslatie.

9.1. Structura acizilor nucleici

• Compozitia chimica a ARN – Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), uracilul (U) – Riboza (monozaharid) – Radicali fosfat • Compozitia chimica a ADN – Baze azotate: adenina (A), guanina (G), citozina (C), timina (T) – Dezoxiriboza (derivat mai stabil al ribozei) – Radicali fosfat

• Bazele purinice: A, G (dublu nucleu aromatic) • Bazele pirimidinice: C, T, U (un singur nucleu hexagonal) Structura nucleozidelor si a nucleotidelor •Nucleozide = baze azotate + monozaharid (pentoza) –Baze azotate + riboza (ribo-nucleozide) –Baze azotate + dezoxiriboza (dezoxiribo-nucleozide) •Nucleotide = nucleozide + fosfat Hibridizarea bazelor azotate • Nucleotidele formeaza intre ele legaturi de hidrogen • Aceste legaturi se realizeaza intre bazele azotate, care se asociaza 2 cate 2 (hibridizare) astfel:

– A = T (ADN) sau A = U (ARN) – C ≡ G

• Legaturile se stabilesc intotdeauna intre o baza purinica si o baza pirimidinica • Aceste legaturi formeaza baza structurii spatiale a acizilor nucleici

– Stabilizarea celor 2 lanturi de nucleotide in molecula ADN – Conformatia spatiala a lantului unic de nucleotide al ARN

• Regula lui Chargaff: [A] = [T] si [C] = [G] in orice molecula de ADN dublu catenar • Hibridizarea A = T este mai putin stabila (mai usor de disociat) decat hibridizarea C ≡ G Structura acidului dezoxiribonucleic • ADN este format din nucleotide (A, G, C, T), ale caror pentoze sunt dezoxiriboze. Legaturile dintre

nucleotide sunt de tip fosfodiester. • Molecula ADN este formata din 2 lanturi polinucleotidice ale caror nucleotide sunt unite intre ele, 2

cate 2, prin legaturi de hidrogen, pe toata lungimea – Bazele azotate sunt orientate spre interior – Ribozele si resturile fosfat formeaza un schelet exterior

• Cele 2 lanturi sunt antiparalele: extremitatea 5’ a unui lant se hibridizeaza cu extremitatea 3’ a celuilalt lant

• Secventele lor sunt complementare: pentru ca toate nucleotidele sa poata fi hibridizate, trebuie ca ordinea legarii lor pe un lant (secventa) sa fie complementara cu cea a lantului opus

• Lanturile polinucleotidice sunt spiralate unul in jurul celuilat dubla spirala (modelul J.D. Watson si F.H.C. Crick, 1953)

• Cele 2 lanturi unite prin legaturi de hidrogen pot fi disociate la cald: denaturarea ADN; refacerea legaturilor: renaturarea

• Replicarea: sinteza ADN identic cu materialul genetic al celulei, inainte de diviziunea mitotica

dublarea cantitatii de ADN • Replicarea este semiconservativa: fiecare lant este matrita pentru sinteza lantului complementar: 1

molecula ADN 2 molecule, fiecare avand un lant vechi si unul nou sintetizat Comparaţie dintre ADN şi ARN

9.2. Codul genetic

Codul genetic este – universal

• degenerat • ambiguu • fară virgule

9.3. Expresia genica

Transcriptia si translatia genereaza expresia genica Informatia genetica codificata in ADN unui embrion include toate genele necesare pentru a mentine si dezvolta organismul. Diferite tipuri de celule exprima diferite tipuri de gene Expresia genica diferita in timpul dezvoltarii stabileste rolul celulei in corp Initierea transcriptiei Transcriptia Prin intermediul ARN polimerazei se sintetizeaza o molecula de ARN m complementara Procesul citirii ARM mesager si transformare informatiei in prioteine se numeste translatie

99..44..SSttrruuccttuurraa ggeenneelloorr llaa eeuuccaarriioottee •Gena: secventa de nucleotide care contine informatia necesara sintezei unei proteine sau a unei molecule de ARN •Alcatuirea unei gene –Elemente reglatoare •P: promotorul: secventa situata inaintea genei, leaga ARN polimeraza si determina locul de unde incepe transcrierea –O succesiune de exoni (secvente transcrise, pastrate in mARN si traduse à exprimate in proteine) si introni (secvente eliminate, absente din mARN) –O secventa semnal (AAUAAA) pentru terminarea transcrierii la sfarsitul ultimului exon

10. INGINERIA GENETICĂ, ETAPELE TRANSGENEZEI

Ingineria genetica poate fi definita ca un ansamblu de metode si tehnici care permit fie introducerea in patrimoniul genetic al unei celule a uneia sau mai multor gene noi, “de interes”, fie modificarea expresiei unei/unor gene prezente, deja, in celula. Genele transferate sunt denumite “transgene”. Ingineria genetica mai este numita, uneori, si “modificare genetica”, “transformare genetica” sau “transgeneza”, iar produsele obtinute poarta numele de “organisme modificate genetic” (OMG) sau “organisme transgenice” (Badea, 2000). In Germania, definitia data organismelor modificate genetic este urmatoarea: OMG sunt organisme al caror material genetic a fost modificat intr-un mod care nu exista in natura in conditii naturale sau de recombinare naturala. Organismul modificat genetic trebuie sa fie o unitate capabila de autoreplicare sau transmitere a materialului genetic. In Statele Unite, termenul de organism modificat genetic se refera la plante si la animale care contin gene transferate de la alte specii, pentru a obtine anumite caractere, precum rezistenta la anumite pesticide si erbicide. In Romania (conform OG nr. 49/2000), organismul modificat generic este un organism care contine o combinatie noua de material genetic, obtinut prin tehnicile biotehnologiilor moderne care ii confera noi caracteristici. ROMANIA este singura tara din Balcani care a stabilit legea organismelor modificate genetic. Ordonanta Guvernului nr. 49/2000 a stabilit infiintarea Comisiei Nationale pentru Securitate Biologica (CNSB), care a fost abilitata sa puna in aplicare dispozitiile legislatiei nationale si internationale referitoare la regimul activitatilor care implica utilizarea organismelor modificate genetic prin tehnicile biotehnologiei moderne, numai dupa avizarea scrisa, emisa de Punctul Focal National. Pentru modificarea genetica a plantelor este nevoie de:

- “gene de interes”; - metode care sa permita patrunderea si integrarea transgenelor in nucleul celulei care va

fi la originea unei noi plante; - - selectia plantelor in care transgena se exprima la un nivel adecvat scopului urmarit

(toleranta la erbicid, rezistenta la atacul unui daunator etc.).

Transgeneza presupune parcurgerea a trei etape: - identificarea, izolarea si clonarea “genelor de interes”; - - transferul “genelor de interes” la plantele de cultura ; - - selectia plantelor care exprima, la un nivel optim, caracterul transferat si testarea

acestora in camp pentru evaluarea stabilitatii expresiei transgenei in timp, in conditii naturale.

Comparativ cu metodele clasice de ameliorare, transformarea prin ingineria genetica prezinta, cel putin,doua avantaje:

- ofera posibilitatea introducerii unui singur caracter la o varietate, deja evaluata ca performanta;

- gena transferata poate proveni din orice sursa, ceea ce extinde, practic, in mod nelimitat, posibilitatile de ameliorare.

11. IDENTIFICAREA, IZOLAREA SI CLONAREA “GENELOR DE INTERES” Exemple de enzime de restricţie şi secvenţele recunoscute de acestea

Identificarea şi izolarea genelor se face cu ajutorul enzimelor de restricţie

Clonarea genelor de interes

1. Vectorul de clonare (de obicei un plasmid) este secţionat cu ajutorul enzimelor de restricţie

2. Frgmantul de ADN de interes este detaşat de din cromozom cu ajutorul aceleiaşi enzime

de restricţie 3. Fragmentele rezultate sunt ataşate vectorului de clonare cu ajutorul ligazelor rezultând

un vector recombinant

4. Vectorul recombinant este introdus (de exemplu prin metoda biolistică) în celula gazdă (de regulă o bacterie)

5. Bacteria împreună cu vectorul recombinant se înmulţeşte (clonează) producând multe

copii de ADN recombinant 6. ADN recombinant se extrage si se purifică

Secventa codificatoareINTRON poly A signalPROMOTOR Secventa codificatoareINTRON poly A signalPROMOTOR

Constructia unei transgene

Gena de interes

Gene bacteriene•antibiotic marker•replication origin

Gene bacteriene•antibiotic marker•replication origin

Gena marker pentruselectia plantei

Plasmid ADNConstruct

Gena marker pentruselectia plantei

Plasmid ADNConstruct

“intrerupator” Sinteza proteinei Semnal stop

12. PRINCIPALELE METODE UTILIZATE PENTRU TRANSFERUL GENELOR DE INTERES METODE INDIRECTE – TRANSFORMAREA MEDIATA 1. Transformarea mediată de bacterii: Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes 2. Transformarea mediată de virusuri METODE DIRECTE 1. Metoda “biolistics” – împuşcarea directă a ADN în celule 2.Transformarea protoplastelor a.Microinjectarea b.Electroporarea c.Sonicarea3. Electroforeza4. Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu

12.1 TRANSFORMAREA MEDIATĂ DE AGROBACTERIUM

Bacteriile din sol, Agrobacterium tumefaciens şi Agrobacterium rhizogenes realizeză ceea ce adeseori s-a numit “inginerie genetică naturală”. Aceaste bacterii sunt capabile să transfere în ţesutul vegetal lezat, un fragment de ADN propriu, ADN-T, de pe plasmida Ti (“tumor inducing”) – în cazul speciei A. tumefaciens – sau Ri (“root inducing”) – în cazul speciei A. rhizogenes, care se integrează în genomul plantei. Ca urmare bacteria A. tumefaciens induce formarea de tumori la nivelul coletului (“crown gall disease”) iar A. rhizogenes formarea de rădăcini firoase (“hairy roots”). In decursul coevoluţiei plantă – microorganism aceste bacterii au devenit capabile să transforme plantele pentru a

le exploata mai bine ca şi surse de energie. ADN –T se transmite după legile Mendeliene, ca genă dominantă. Există date care confirmă faptul că o astfel de transformare genetică are loc în natură fără intervenţia omului.

Astfel, s-a demonstrat că plasmida Ri poate purta una sau două copii de ADN-T, iar o parte din una dintre aceste secvenţe a fost regăsită în genomul unor plante nemodificate genetic. Celulele vegetale care poartă ADN-T devin celule tumorale, deoarece acest fragment de ADN conţine gene cu efect oncogen. Deleţia acestor gene din ADN-T nu interferă, din fericire, cu transferul şi integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale receptoare. Doar capetele ADN-T, aşa numitele latură dreaptă şi stângă constănd din o secvenţă alcătuită din 24 de nucleotide care se repetă, reprezintă situri de recunoaştere pentru sistemul de transfer. Prin înlocuirea oncogenelor din ADN-T cu gene de interes este posibil transferul acestora în celule vegetale ţintă, celule care nu mai dobândesc caracter tumoral şi deci pot regenera plante transformate genetic. Genele de interes – fie ele gene marker sau raportoare sau gene cu importanţă economică – pot fi introduse în plante fie prin linkage cu regiunea ADN-T dezarmată prin recombinare, obţinându-se un aşa numit vector de integrare, fie prin clonarea lor între secvenţele repetate laterale într-un replicon independent, ceea ce se numeşte vector binar. Existenţa mai multor regiuni T în celula de Agrobacterium conduce la cotransferul acestora în celula vegetală ţintă cu eficienţă crescută. Pe de altă parte pentru integrarea ADN-T în celula vegetală se pot utiliza secvenţe omoloage ADN vegetal ţintă care induc, cu frecvenţă relativ scăzută, recombinarea omologă între ADN-T şi ADN vegetal.

Agrobacterium tumefaciens poate transfera ADN-T diferitelor specii de plante chiar dacă unele dintre acestea nu formează tumori. Deşi spectrul de gazde pentru această bacteriei este limitat la plantele dicotiledonate s-au obţinut tulpini supervirulente, capabile să infecteze eficient şi celulele plantelor monocotiledonate. S-a deschis, astfel, calea transformării cerealelor şi prin intermediul acestui vector bacterian. Eficienţa transformării celulei vegetale de către A. tumefaciens, variază destul de mult în funcţie de specie, genotip sau chiar de ţesutul ţintă. Este foarte important, totodată, ca ţesutul supus transformării să fie totipotent şi deci să regenereze plante transformate genetic. De cele mai multe ori, însă, dintr-un ţesut doar un număr limitat de celule sunt totipotente şi nu întodeauna acestea sunt şi cele transformate de agrobacterium. Pentru diferite specii de plante s-au identificat metode potrivite pentru transformarea eficientă mediată de A. tumefaciens. Ca ţesuturi ţintă pot fi utilizate: discuri sau fragmente foliare, fragmente de rădăcini, hipocotile, peţiol, cotiledoane sau seminţe întregi. Primele plante transformate prin intermediul lui A. tumefaciens au fost regenerate în 1983, succesele iniţiale limitându-se la solanacee, în particular la sistemul model tutunul (Nicotiana tabacum L.). Ulterior au fost transformate: soia, bumbacul, orezul, ovăzul, sorgul, trestia de zahăr, grâul şi multe altele. Eficienţa transformării variază foarte mult de la o specie la alta în funcţie de: identificarea metodei optime de cultură a ţesutului ţintă, condiţiile de cultură a materialului sursă, sau suşa bacteriană utilizată. Aceşti factori afectează şi numărul de copii de ADN-T care se integrează în genomul vegetal receptor. Predominant s-a constatat, la diferite specii de plante, integrarea unei singure copii de ADN-T. Mai recent, cercetările au vizat descifrarea mecanismelor implicate în colonizarea ţesuturilor vegetale de către bacterii, relevându-se noi detalii privind controlul genetic al virulenţei bacteriene .

Agrobacterium rhizogenes a fost utilizat pentru prima oară pentru transformarea plantelor de tutun în anul 1977. Această bacterie transferând ADN-T de pe plamida Ri determină formarea rădăcinilor firoase pe diferite organe ale plantelor, rădăcini care pot purta gene de interes, dacă acestea au fost integrate în ADN-T, respectiv pot regenera plante transformate genetic. O etapă intermediară, în procesul de transformare mediată de A. rhizogenes, este cultura rădăcinilor firoase care au capacitatea de a se alungi şi ramifica. Astfel, prin cultura rădăcinilor firoase se pot obţine metaboliţi secundari sau pot fi realizate studii fundamentale privind creşterea şi dezvoltarea rădăcinilor. Acest sistem experimental este foarte potrivit şi pentru analize biochimice, rădăcinile prezentând căi biochimice mai simple şi, deci, mai uşor de analizat. Rădăcinile firoase pot fi cultivate uşor, folosind un echipament simplu şi ieftin iar, comparativ cu suspensiile celulare, celulele radiculare sunt stabile din punct de vedere genetic. Asemănător sistemului A. tumefaciens, bacteria A. rhizogenes poate co-tranfera ADN-T de pe plasmida Ri şi un vector “binar”, de obicei o plasmidă mai mică. Aceasta din urmă poate purta în ADN-T o genă marker, de exemplu o genă care conferă rezistenţă la un antibiotic, o genă raportoare - sau marker pentru vizualizare fenotipică şi o genă cu importanţă economică. Avantajul acestui sistem este acela că cele două tipuri de ADN-T, cel care determină dezvoltarea

rădăcinilor firoase, şi ADN-T de pe vectorul binar, se integrează de obicei pe cromozomi diferiţi în plantele transformate şi deci, vor segrega independent în descendenţă. Un avantaj aparte al sistemului de transformare Ri este faptul că toate celulele vegetale care integrează ADN-T de pe plasmida Ri pot fi uşor identificate şi selectate prin prezenţa fenotipului de rădăcină firoasă. Sistemul de transformare mediată de A. rhizogenes a fost aplicat unui mare număr de specii de plante (în jur de 200 încă în 1989), dar asemănător sistemului A. tumefaciens răspunsul optim variază în funcţie de specie, genotip sau suşa bacteriană. Organele vegetale potrivite pentru transformarea cu A. rhizogenes sunt: fragmente de tulpină de la plante tinere, fragmente de peţiol, fragmente foliare, segmente de hipocotile sau cotiledoane, sau fragmente ale unor organe de rezervă cum ar fi rădăcinile de morcov sau tuberculii de cartof. Uneori astfel de explante prezintă un răspuns polar, formând rădăcini firoase numai la una din

extremele explantului, rădăcini capabile să ignore forţa gravitaţională. Mai mult, există date experimentale care sugerează efectul de piticire a plantelor indus de una dintre genele de virulenţă, rolA, de la A. rhizogenes, efect cu importanţă practică mai ales pentru unele plante horticole

12.3 TRANSFORMAREA MEDIATĂ DE VIRUSURI

Utilizarea vectorilor virali pentru transformarea plantelor, în ciuda numeroaselor eforturi experimentale, nu a adus rezultate spectaculoase. Deşi, în 1984 a fost posibil transferul unei gene de rezistenţa la antibiotic cu ajutorul unui virus ADN cercetările ulterioare au demonstrat că genomul viral nu poate accepta şi transfera fragmente mai lungi de ADN străin. Descoperirea faptului că virusurile ARN pot genera ADN prin transcripţie inversă a generat speranţa că, mult mai numeroasele virusuri ARN ar putea fi utilizate ca vectori de gene pentru celula vegetală. Din păcate, însă, s-au întâmpinat alte dificultăţi. ADN viral nu se integrează în genomul vegetal iar meristemele, principala

sursă de celule totipotente, nu sunt infectate de virusuri. De aceea, vectorii virali sunt mai rar utilizaţi în experimentele de transformare genetică a plantelor.

METODE DIRECTE

12.4 METODA “BIOLISTICS” – împuşcarea directă a ADN în celule Metoda biolistică (“biolistics”) sau “particle gun”, de împuşcare directă a ADN în ţesuturi

ţintă este cea mai spectaculoasă metodă de transformare genetică a plantelor. In dezvoltarea acestei tehnici s-au investit foarte mult efort şi bani iar rezultatele obţinute au fost pe măsura aşteptărilor. Metoda constă în accelerarea unor particule foarte mici (1µm diametru) din tungsten sau aur coloidal, pe care a fost precipitat ADN, în ţesuturi vegetale ţintă. Această tehnică are numeroase avantaje care o recomandă pentru aplicabilitate generală: este o metodă uşor de aplicat, printr-o împuşcătură pot fi ţintite mai multe celule, celulele supravieţuiesc după împuşcare, genele purtate de particule îşi păstrează activitatea biologică, particulele pot fi împuşcate în straturile superficiale sau în profunzimea unui organ vegetal. Celulele ţintă pot fi foarte diferite: polen, celule în suspensie, embrioni imaturi, celule din ţesuturi diferenţiate sau chiar meristeme. Datorită avantajelor sale biolistica a devenit metoda favorită în numeroase laboratoare, permiţând transformarea cu succes a unor plante pentru care alte metode nu au dat rezultate cum ar fi: soia, porumbul, ovăzul, orezul, sorgul, trestia de zahăr, grâul, plante forestiere etc. O aplicaţie aparte a fost utilizarea împuşcării de microproiectile pentru rănirea apexurilor la floarea soarelui, eficientizând astfel transformarea mediată de Agrobacterium tumefaciens. Mai mult, s-a reuşit împuşcarea directă în ţesuturi vegetale a celulelor bacteriene întregi

12.5. UTILIZAREA PROTOPLASTELOR PENTRU TRANSFERUL DIRECT DE ADN Protoplastele, celulele vegetale lipsite de perete celular, reprezintă limita de expresie a

totipotenţialităţii. De la primele plante de tutun regenerate din protoplaste izolate până astăzi numărul plantelor pentru care regenerarea din protoplaste a devenit posibilă a crescut permanent, ajungând actualmente la aproximativ 400 de specii de plante.

Protoplastele sunt sistemele celulare ideale pentru transferul de ADN şi selecţia transformanţilor. Indepărtarea peretelui celular elimină principala barieră în calea pătrunderii ADN străin în celula vegetală. Izolarea enzimatică a protoplastelor acţionează ca un factor de stress care induce reacţii de răspuns la rănire – reacţii presupuse a declanşa starea de competenţă atât de importantă pentru transformarea eficientă. Mai mult, suspensia de protoplaste se aseamănă cu o suspensie bacteriană avand avantaje similare prin posibilitatea de a cultiva populaţii mari de celule individuale în medii de cultură bine definite. Tesuturile derivate din protoplaste au în general origine clonală provenind din celule individuale. Eficienţa selecţiei transformanţilor este deci maximă în cazul protoplastelor deoarece se evită formarea de himere, destul de frecvente la nivelul sistemelor multicelulare. Pentru transferul ADN, de obicei plasmidial, în protoplastele izolate se pot utiliza diferite metode, şi anume: a. Microinjectarea – constă în introducerea cu ajutorul unei micropipete a ADN direct în protoplaste, acestea fiind fixate cu o altă micropipetă. Microinjectarea celulei vegetale

întregi sau a ţesuturilor este, de asemenea posibilă, dar se realizează mai greu din punct de vedere tehnic. Un sistem eficient a fost utilizat mai recent şi constă în imobilizarea protoplastelor recipiente de tutun într-un strat foarte subţire de mediu solidificat cu agaroză sau alginat. Protoplastele au fost imobilizate deasupra unei grile care a permis localizarea şi monitorizarea prin fotografiere a protoplastelor microinjectate, respectiv a celulelor sau calusurilor derivate din acestea. b. Electroporarea – implică permeabilizarea reversibilă a membranei plasmatice în prezenţa unor pulsuri de curent continuu având amplitudine crescută şi durată foarte scurtă, porii formaţi în membrană permiţând intrarea ADN străin în citoplasmă . Electroporarea a devenit o metodă de rutină pentru transformarea protoplastelor vegetale, dar şi pentru celulele de mamifere sau bacteriene. La plante electroporarea protoplastelor se foloseşte eficient pentru transformarea permanentă la numeroase specii de plante incluzând cerealele. Mai mult, prin electroporarea protoplastelor se elimină necesitatea utilizării unor gene marker, ceea ce reprezintă un avantaj deosebit în condiţiile oponenţei acerbe a opiniei publice fată de eliberarea în câmp a unor plante purtând gene marker. Avantajele electroporării constau în eficienţa crescută a incorporării ADN străin, reproductibilitatea şi simplitatea acestei metode. Singura limitare a aplicării electroporării o reprezintă capacitatea de regenerare a protoplastelor, dar şi acest dezavantaj a fost depăşit prin extinderea aplicării electroporării celulelor sau chiar ţesuturilor întregi c. Sonicarea – permeabilizarea membranei protoplastelor în prezenţa ultrasunetelor s-a dovedit, de asemenea o metodă eficientă pentru transferul ADN în protoplaste vegetale. Ulterior metoda a fost aplicată şi celulelor sau ţesuturilor întregi, dar este utilizată pe scară mai redusă comparativ cu electroporarea

12.6 ALTE METODE DE TRANSFER DIRECT AL ADN ÎN CELULELE VEGETALE Electroforeza Migrarea ADN printr-un ţesut vegetal ţintă a fost o altă idee interesantă pentru transferul de gene şi a fost aplicată pentru prima oară embrionilor intacţi de orz.

Utilizarea fibrelor de carbură de siliciu („silicon carbide technology“) Fibrele de carbură de siliciu se utilizează în industrie. Transformarea genetică prin această tehnologie este relativ simplă, constând în vortexarea (agitarea) ţesuturilor împreună cu ADN şi fibre de carbură de siliciu. Astfel, fibrele penetrează pereţii celulari permiţând ADN să pătrundă în citoplasmă. Metoda a fost aplicată iniţial transformării embrionilor de insecte, iar ulterior s-a dovedit eficientă şi în transformarea celulelor vegetale. Cercetările de microscopie electronică au relevat penetrarea peretelui celular de către astfel de fibre, sugerând că ADN aderă de suprafaţa fibrelor şi este introdus odată cu acestea în celulă. Având proprietăţi fizice asemănătoare azbestului fibrele de carbură de siliciu sunt probabil carcinogene. Transformarea genetică a fost raportată folosind această tehnologie pentru suspensii celulare de porumb, ovăz, tutun şi Agrostis alba. Transformarea stabilă a fost, de asemenea posibilă folosind suspensii celulare de porumb şi tutun. Datele obţinute au indicat transformarea preponderentă a aglomeratelor celulare neembriogene la porumb, de aceea se impun cercetări ulterioare pentru optimizarea acestei metode. Metoda prezintă avantajul de a fi foarte simplă şi ieftină, dar datorită riscurilor potenţiale pentru sănătatea umană se caută materiale alternative, eventual biodegradabile .

Alte metode cu aplicabilitate restrânsă de transformare a celulei vegetale sunt: îmbibarea ADN în ţesuturi utilizând seminţe uscate sau embrioni, transformarea polenului sau a tubului polinic, macroinjectarea ADN în ţesuturi sau utilizarea microlaserului pentru a perfora peretele celular şi plasmalema. Astfel de metode se află, actualmente, în diferite faze de experimentare. De un interes deosebit, se vor bucura metodele alternative care nu necesită faze de cultură in vitro. O astfel de metodă, cu potenţial deosebit este transformarea grăuncioarelor de polen, dar deocamdată rezultatele în acest domeniu sunt relativ modeste

12.7 SELECŢIA TRANSFORMANŢILOR Selecţia este o parte importanţă a proceselor de transformare. În general, genele de interes sunt co-integrate cu markeri selectabili pentru identificarea cu uşurinţă a celulelor recipiente transformate. Markerii de selecţie cei mai utilizaţi conferă rezistenţă la agenţi chimici, cum ar fi antibiotice şi erbicide. Manozo-6 fosfat izomeraza (MPI) este unul dintre cei mai recenţi markeri de selecţie. Enzima este codificată de gena manA de la E.coli, care converteşte monoza-6P în frucozo-6P. Astfel, transformanţii ce conţin manA pot creşte pe manoză ca sursă de carbon. Această selecţie este un mod pozitiv al acţiunii de creştere a ţesuturilor transformante cu o rată care să-i permită acest lucru. Markerul MPI este extrem de eficace pentru selecţia transformanţilor de sfeclă (0,94%), porumb (50%) şi grâu (25%) . Genele de selecţie pot fi utilizaţe într-o primă generaţie şi eliminaţe mai târziu prin încrucişare convenţională. O posibilitate este de a obţine două ADN-T separate; una cu gene de interes şi alta cu markeri de selecţie, în aceeaşi sau două celule diferite de Agrobacterium. Cele două ADN-T sunt inserate în situsuri nelincate în genomul plantei gazdă, permiţând mai târziu segregarea genetică . Transformarea optimă se caracterizează printr-o singură copie a transgenei care va segrega mendelian cu o expresie uniformă de la o generaţie la alta. Transformanţii ideali pot fi identificaţi cu dificultate, depinzând de materialul vegetal care va fi transformat şi de cantitatea şi complexitatea transgenelor. O genă inserată este esenţial randomizată în genom, se observă o variabilitate de la o plantă transgenică la alta, fenomen cunoscut sub numele de „variaţie cu efect de poziţie. Dintre genele marker cel mai mult a fost utilizată gena nptII, sau neo, genă izolată din transpozonul Tn5 de la Escherichia coli K12. Această genă codifică neomicinfosfotransferaza – enzima implicată în detoxificarea unor antibiotice aminoglucozidice cum ar fi:neomicina, kanamicina, paramomicina sau geneticina. Numeroase specii de plante au fost transformate cu gena nptII, cum ar fi tutunul, cartoful, Arabidopsis, porumbul, orezul, soia, bumbacul – ca să le amintim pe cele mai importante. Pentru această genă ca agenţi de selecţie se utilizează cel mai mult kanamicina (50 – 100 mg/l) sau geneticina. Unele specii de plante, mai ales monocotiledonate s-au dovedit insensibile la kanamicină, în acest caz geneticina dând rezultate mai bune. De asemenea, s-a observat că la unele specii kanamicina poate interfera cu procesele de organogeneză, afectând eficienţa regenerării plantelor transformate. O altă genă marker mult utilizată este gena hpt sau hph, genă izolată tot de la bacteria E. coli codificând enzima HPT (higromicinfosfotransferaza). Această enzimă detoxifică antibioticul higromicină B, antibiotic faţă de care majoritatea ţesuturilor vegetale sunt foarte sensibile. De aceea, această genă marker a fost utilizată pentru transformarea multor specii de plante, cum ar fi: tutunul, Arabidopsis, porumbul, orezul sau gramineele perene. Higromicina este îndeosebi foarte potrivită ca agent de selecţie pentru cereale, folosindu-se în concentraţii de 25-200 mg/l. Secvenţa codantă a genei a fost, de asemenea, modificată pentru o expresie mai bună în celula vegtală.Dintre genele care conferă rezistenţă la erbicide cel mai mult a fost utilizată gena bar, izolată de la bacteria Streptomyces hygroscopicus şi gena pat de la S. viridochromogenes, ambele codificând enzima fosfinotricinacetiltransferaza. Fosfinotricina este compusul activ cel mai mult utilizat ca erbicid de selecţie a plantelor transformate genetic, genele amintite fiind transferate cu succes la plante ca: tutunul, rapiţa, porumbul, orezul, grâul şi altele. O altă genă marker este gena dhfr pentru enzima dihidrofolatreductază (DHFR), izolată tot de la E. coli de pe plasmida R67. Enzima DHFR conferă rezistenţa la un analog al acidului folic, metotrexat, celulele vegetale fiind extrem de sensibile la

concentraţii mici ale acestui compus (Schrott, 1995). Gena dhfr a fost transferată la specii cum ar fi: tutunul, petunia şi grâul. Genele raportoare, spre deosebire de markerii de selecţie nu conferă celulelor rezistenţă faţă de un anumit compus. Ele codifică proteine care pot fi detectate direct sau catalizează reacţii specifice ai căror produşi pot fi detectaţi prin metode relativ simple. Genele raportoare permit studiul factorilor de transcripţie cis sau trans, în condiţiile transformării tranziente sau permanente, precum şi monitorizarea şi optimizarea tehnologiei de transformare. Cele mai importante gene raportoare sunt:¨ gena gus (uidA) – codifică β-glucuronidaza (GUS) şi a fost izolată de la E. coli K12 (Jefferson şi colab., 1986); este gena raportoare cel mai mult utilizată la plante. Există pentru această hidrolază compuşi substat pentru evidenţierea prin metode spectrofotometrice, fluorimetrice sau histochimice – la nivelul ţesuturilor rezultând un compus de culoare albastră uşor de evidenţiat. La pH-ul utilizat pentru determinarea GUS nu există activitate β-glucuronidazică detectabilă în nici un ţesut vegetal. Toate metodele de determinare se aplică însă, numai celulelor fixate, nonviabile.¨ gena raportoare luc pentru enzima luciferază foloseşte un sistem substrat-enzimă care produce bioluminescenţă. Gena luc a fost izolată de la o specie de licurici din America de Nord, Photinus pyralis, fiind exprimată în plante (Ow şi colab. 1986). Produsul genei, luciferaza poate fi extrasă din ţesuturi iar activitatea ei poate fi determinată în prezenţa luciferinei. Dar, există şi o metodă de determinare non-letală şi neinvazivă direct în ţesuturile şi organele plantelor transformate, pentru măsurarea bioluminescenţei fiind necesar un luminometru. gena gfp pentru proteina cu fluorescenţă verde (GFP) – reprezintă cea mei nouă genă raportoare şi totodată cea mai spectaculoasă şi avantajoasă. Gena a fost izolată de la o meduză, Aequarea victoria, fiind transferată la câteva specii de plante (Chalfie şi colab., 1994). GFP prezintă o serie de avantaje şi anume: nu necesită un substrat, proteina se evidenţiază în ţesuturi intacte in vitro şi in vivo, prin excitarea în UV, proteina poate fi fuzionată cu alte proteine permiţând monitorizarea traficului proteic şi a metabolismului (vezi Rakosy-Tican şi colab., 1999; 2000).¨ gena cat izolată de la E. coli, codifică enzima cloramfenicolacetiltransferaza (CAT), fiind, de asemenea, mult utilizată ca genă raportoare la plante. Determinarea sa este mai pretenţioasă bazându-se pe monitorizarea acetilării cloramfenicolului prin marcarea cu 14C fie a acetil-CoA, fie a cloramfenicolului, produşii fiind separaţi prin cromatografie în strat subţire (TLC) şi măsuraţi prin densitometrie sau prin scintilaţie. Uneori poate exista activitate CAT şi în unele ţesuturi vegetale, mai ales la Brassicaceae, ceea ce afectează eficienţa acestui sistem.¨ antocianii sunt pigmenţi roşii sau purpurii care se acumulează în vacuole în unele ţesuturi ale plantelor. Sinteza de antociani este controlată de gene structurale şi reglatoare, unele dintre ultimele gene fiind izolate şi clonate. Astfel de gene pot fi utilizate ca gene raportoare în ţesuturile şi organele unor genotipuri care conţin gene structurale dar nu sintetizează antociani. Utilizarea antocianilor ca markeri prezintă o serie de avantaje: nu necesită un substrat, se exprimă doar în celulele viabile şi metabolic active, sunt uşor de vizualizat. Cel mai mult s-au utilizat genele pentru factorii de transcripţie R şi C1 de la porumb (Schrott, 1995).genele care conferă rezistenţă la streptomicină şi/sau spectinomicină – au fost, de asemenea, utilizate ca gene raportoare prin efectul de etiolare pe care îl au, prin inactivarea cloroplastelor

13. PRIMA GENERAŢIE DE PLANTE TRANSGENICE

Prima generaţie de plante transgenice este constituita din cultivare care au fost modificate prin

6315

1413

Productia realizataBoliInsecteBuruieni

introducerea unuia sau cel mai două caractere noi, cum sunt toleranţa la unul sau mai multe erbicide, toleranţă la insecte sau la dăunători sau toleranţa combinată (caractere input).Ponderea pierderilor produse de diferiţi factori din producţia potenţială

Ponderea diferitelor caractere obtinute prin transgeneza in cadrul suprafetelor total cultivate cu OMG

75

178

Toleranta laerbicide(TE)Rezistenta la insecte(RI)

TE/RI

13.1 PLANTE TRANSGENICE TOLERANTE LA ERBICIDE

Erbicidele – molecule chimice care actioneaza selectiv, afectand buruienile -Specifice -Totale Avantajele erbicidelor totale: -toxicitate redusa -efecte minore asupra mediului -costuri reduse Strategii : -modificarea tintei erbicidului (cantitativ si calitativ) -introducerea in plantele cultivate a unui sistem de degradare a erbicidului

Erbicidele sikimice (glifosat) sunt sistemice totale si actioneaza avand ca tinta o enzima din

calea metabolica ce duce la sinteza aminoacizilor aromatici (prezenta la plante si microorganisme nu si la om sau animale). O gena mutanta care sa determine sinteza unei enzime insensibile la actiunea erbicidului poate fi izolata de la bacterii sau chiar de la plante.

Soia Roundup Ready (RR) poseda o gena transferata de la E. coli Porumbul RR poseda o gena transferata de la …. Porumb Roundup – aprobat in Romania de 20 de ani A doua strategie – aplicata in cazul erbicidului glufosinat de amoniu (fosfinotricin) – care

inhiba o enzima cheie in procesul de asimilare a azotului, rezultand concentratii letale de amoniac la numai cateva ore.

Gena cu care au fost obtinute plante tolerante de rapita codifica o enzima ce detoxifica fosfinotricinul, inactivandu-l.

Gena – izolata de la o actinomiceta din genul Streptomyces a fost transferata cu Agrobacterium

13.2 PLANTE REZISTENTE LA ATACUL INSECTELOR

Pierderile globale cauzate de insecte s-ar putea ridica anual la 4000 de md. dolari (daca nu s-ar aplica nici o masura de combatere) actualmente fiind de numai 100 md. Avantaje- reducerea poluarii chimice - protejarea entomofaunei utile - eliminarea reziduurilor din apa si alimente Strategia – introducerea in plante a unor gene ce determina sinteza unor proteine insecticide (origine vegetala, animala sau microorganisme) Cel mai frecvent se utilizeaza la gene din bacteria de sol Bacillus thuringiensis

In conditii de stress bacteria formeaza un endospor. Pentru constructia endosporului celula bacteriana sintetizeaza proteine specifice. Surplusul este depozitat sub forma unui corp proteic paracristalin. Celula bacteriana se degradeaza eliberandu-se sporul si cristalul. Insectele care ingereaza cristalele proteice, proteina este taiata in doua. Un fragment (delta endotoxina) formeaza un complex cu receptori specifici cu mebrana epiteliului intestinal. S-au studiat 40000 de tulpini de B. thuringiensis- 1000 toxine diferite fiecare cu spectru specific Genele Bt au fost transferate la peste 26 de specii Compania Monsanto – porumb Yieldgard ce sintetizeaza Cry I A (b)– construind o gene sintetica in proportie de 65%

Combaterea sfredelitorului porumbului (Ostrinia nubilalis)

A) Bacillus thuringiensisA) Bacillus thuringiensis

Bt-Gen

Wirkstoff Bt-Eiweiß

Zellkern mit DNA

Bt-Mais

B) Bt - Porumb

Bt-Gen

Wirkstoff Bt-Eiweiß

Zellkern mit DNA

Bt-Mais

B) Bt - Porumb

Bt-Gen

Wirkstoff Bt-Eiweiß

Zellkern mit DNA

Bt-Mais

Wirkstoff Bt-Eiweiß

Zellkern mit DNA

Bt-Mais

B) Bt - Porumb

14. A doua generatie de plante transgenice

A doua generatie de plante transgenice se refera la noi cultivare care au modificate caractere legate de calitatea produselor obtinute (caractere output). Exemple: -modificarea continutului de amidon, proteine, zaharuri -modificarea insusirilor de panificatie -cresterea duratei de pastrare a fructelor -sporirea continutului de beta-caroten -imbunatatirea digestibilitatii furajelor

Tomatele la care a fost modificat procesul de coacere a fructelor

Tomatele comercializate in stare proasp\t\ sub numele FLAVRSAVRR sunt primul produs alimentar recoltat de pe plante transgenice care a fost aprobat pentru consum.~n general, tomatele sunt culese când sunt `nc\ necoapte [i tari - stadiu pe care cultivatorii `l numesc “matur-verde”. Coacerea este indus\ dup\ ajungerea la destina]ie, printr-un tratament cu etilen\ (hormon natural implicat `n coacerea fructelor). Din p\cate, din cauza recolt\rii timpurii, aceste tomate nu au arome [i gustul maturate pe plant\. Evident, o recoltare ceva mai târzie ar ameliora considerabil calitatea tomatelor proaspete. ~n consecin]\, s-a procedat la modificarea genetic\ `n sensul p\str\rii consisten]ei dup\ cules, fapt ce face posibil\ nu numai recoltarea `ntr-un stadiu de dezvoltare mai avansat, când s-au acumulat [i aromele specifice, ci [i reducera pierderilor determinate de zdrobirea `n timpul transportului.Pentru modificarea procesului de coacere al tomatelor, au fost aplicate dou\ strategii. Prima a fost conceput\ pornind de la faptul c\ `nmuierea fructelor, `n general, se produce atunci când pere]ii celulelor sunt degrada]i de enzime specifice; dou\ dintre aceste enzime au fost identificate [i la tomate. Cum s-a procedat? Simplu: cercet\torii de la Calgene, din Davis (California), au blocat sinteza uneia dintre ele - poligalacturonaza (PG)- [i ca urmare, procesul de degradare a pere]ilor celulari a fost `ntârziat, iar fructele [i-au conservat fermitatea mai mult timp. A doua strategie se bazeaz\ pe faptul c\, `ntr-o anumit\ faz\ a dezvolt\rii lor, fructele produc etilen\ - hormonul men]ionat mai sus, care declan[eaz\ [i accelereaz\ procesul de coacere. Evident, dac\ se suprim\ sinteza acestui hormon- sinteza `n care sunt implicate tot dou\ enzime - `ntregul proces de coacere este `ntârziat. Mai precis, se folosesc genele care codific\ una sau alta dintre cele dou\ enzime implicate `n sinteza etilenei, dar orientate `n sens invers. Transferate la tomate, aceste transgene antisens determin\ reducerea cu 95% (!) a cantit\]ii de etilen\ sintetizate [i prelungirea duratei coacerii de la una la patru s\pt\mâni. ~n Fran]a, a fost ob]inut\ o linie de pepene cantalup care exprim\ o gen\ antisens ACC oxidaz\. Fructele acestei linii se `nmoaie mult mai târziu decât fructele variet\]ilor conven]ionale. Prin urmare, ele pot r\mâne mai mult timp pe plant\, acumulând zaharuri solubile [i componente ale aromei `n cantit\]i superioare.Tomatele constituie, de asemenea, materia prim\ pentru o industrie de multe miliarde de dolari, care produce Ketchup, supe, paste, sosuri, conserve etc. Toate acestea se ob]in din variet\]i special create pentru industrializare. Totu[i, 95% din fruct este ap\, care trebuie par]ial eliminat\ `n procesul prelucr\rii. Ca urmare a acestui fapt, o parte din pre]ul produselor pe baz\ de tomate este reprezentat\ decostul elimin\rii apei. Cre[terea ponderii substan]elor solide solubile (`n principal, zaharuri, acizi organici [i compu[i aromatici) `n fruct cu numai un procent- de la 5% la 6%- ar permite economisirea `n industria tomatelor din SUA a nu mai pu]in de 75 de milioane de dolari anual. Evident, [i acest obiectiv poate fi atins tot prin modificare genetic\, adoptându-se diferite strategii.Noi amidonuri la orizont De[i amidonul este prezent `n `ntreaga lume vegetal\, sunt exploatate industrial doar câteva surse: porumbul, cartoful, grâul, maniocul [i orezul. Produc]ia european\ se ridic\ la 10 milioane de tone, iar cea mondial\ - la 35 milioane de tone. 60% din amidonul produs provine din porumb, 25% - din grâu [i 15% - din cartof. O treime dintre produse sunt naturale, iar dou\ treimi sunt derivate, dintre care 20% - amidonuri modificate [i 55% - zaharuri. Exist\ deja numeroase brevete referitoare la aplica]ii ale amidonului modificat prin transgenez\.~n SUA, cartofii se consum\ sub form\ de “chips” sau cartofi pr\ji]i. Pentru a putea fi folosi]i `n acest scop, ei trebuie s\ con]in\ amidon `n propor]ie de 25%. Un con]inut mai mic - de exemplu, 21- 22% - impune evaporarea unei cantit\]i mari de ap\, fapt ce duce la absorb]ia gr\similor `n timpul prepar\rii. Recurgând la o gen\ bacterian\, cercet\torii de la Monsanto au reu[it s\ sporeasc\ con]inutul de amidon al tuberculilor de cartof de la 22 la 25%.Amidonul - glucid puternic polimerizat- are doi constituien]i esen]iali: amiloza [i amilopectina. Diferen]ele de structur\ molecular\ le confer\ acestora [i propriet\]i reologice foarte diferite, care sunt exploatate `n industria agroalimentar\: amiloza formeaz\ u[or geluri, `n timp ce amilopectina este un agent de `ngro[are foarte eficace. ~n amidonurile cerealelor predomin\ amilopectina, raportul amiloz\/amilopectin\ variind `ntre 20/ 80 [i 30/70. Având `n vedere faptul c\ amiloza prezint\ avantaje, `n prezent se `ncearc\ “r\sturnarea” acestui raport prin inginerie genetic\.Sinteza unor glucide noi, de interes industrial Metabolismul plantelor poate fi deturnat `n sensul sintetiz\rii unor molecule de interes pentru industrie prin introducerea unor noi echipamente enzimatice. O strategie de acest tip a fost aplicat\ pentru sinteza unor oligozaharide - ciclodextrinele. Acestea au o structur\ ce le confer\ capacit\]i de adsorb]ie utilizate `n industriile cosmetic\ [i farmaceutic\, `n agrochimie sau `n industria agroalimentar\, pentru stabilizarea parfumurilor [i aromelor, pentru complexarea produ[ilor cu eliberare treptat\, ca [i pentru extragerea unor substan]e speciale (cofein\, colesterol) din amestecuri. De exemplu, o gen\ izolat\ de la o bacterie a fost introdus\ `n genomul cartofului [i a determinat sinteza enzimei ce condi]ioneaz\ formarea ciclodextrinelor `n tuberculi. Evident, aceast\ tentativ\ reu[it\ atest\ viabilitatea conceptului

[i deschide calea spre alte `ncerc\ri de a produce, cu ajutorul plantelor, moleculare cu mare valoare ad\ugat\, derivate din amidon.Una dintre cele mai spectaculoase realiz\ri apar]ine Institutului Federal de Tehnologie din Zurich. Este vorba de un soi de orez cu bobul galben care, ca urmare a modific\rii genetice, con]ine, `n semin]e, vitamina A [i fier. Desigur, aceast\ realizare este extrem de interesant\ mai ales pentru popula]ia s\rac\, malnutrit\.Se [tie c\ b- carotenul este un pigment necesar pentru fotosintez\, sintetizat `n ]esuturile verzi ale tuturor plantelor, deci [i ale orezului, dar nu [i `n ]esuturile nefotosintetizatoare, cum sunt cele ale semin]elor. Pe de alt\ parte, se estimeaz\ c\, `n `ntreaga lume, peste 124 de milioane de copii sunt deficien]i `n vitamina A. Ce s-ar realiza printr-un aport de vitamina A `n diet\? S-ar preveni, anual, moartea a 1,3- 2,5 milioane de copii mici [i de vârst\ prescolar\. Orezul galben auriu sintetizeaz\ b- caroten [i `n semin]e, deoarece `n genomul s\u sunt incluse patru gene care codific\ enzimele cheie ale biosintezei acestui pigment, izolate de la Narcissus [i Erwinia. O alt\ problem\ acut\ de nutri]ie este deficitul de fier `n organism, care afecteaz\ 30% din popula]ia globului. Solu]ia: `n acela[i orez, a fost introdus\ [i o gen\, izolat\ de la soia, care codific\ feritina - o protein\ ce stocheaz\ fierul. Func]ionarea acestei gene, pus\ sub controlul unui promotor cu “expresie s\mân]\ specific\”, a f\cut s\ creasc\ de trei ori nivelul fierului `n bobul de orez.~n cadrul unui alt proiect, a fost ob]inut\ sfecla de zah\r transgenic\ ce produce fructan, un “`ndulcitor necaloric”: O alt\ cale de a spori dulcea]a fructelor const\ `n a face plantele s\ sintetizeze proteine naturale dulci, cum sunt monelina [i taumatina-proteine prezente `n fructele unor specii de plante tropicale. Gena pentru monelin\ a fost transferat\ la tomate [i salat\, iar gena care codific\ precursorul taumatinei - la cartof [i castravete. Evident, pe aceast\ cale devine posibil\ [i reducerea cantit\]ilor de zaharuri ad\ugate `n unele preparate alimentare. Un alt `ndulcitor proteic este brazeina. Unul deosebit de performant. De 500 pân\ la 2000 de ori mai dulce decât zah\rul. Societ\]ile ProdiGene [i NeKtar Worldwide preconizeaz\ s\ transfere gena care `l codific\ la porumb.~n anul 2001, `n SUA se afl\ `n câmpuri de testare o nou\ genera]ie de produse cu `nsu[iri de ordin calitativ [i tehnologic modificate.Alte proiecte interesante pentru industrie:- plante transgenice de plop, eucalipt [.a. produc\toare de biomas\ pentru ob]inerea etanolului;- plante transgenice cu lignina modificat\ pentru fabricarea hârtiei;- plante de rapi]\ modificate pentru a produce un… material plastic biodegradabil (polimerul respectiv a fost “exprimat” [i `n lumenul fibrelor de bumbac). Dintre plantele care nu se cultiv\ pentru hran\, bumbacul r\mâne cazul cel mai interesant `n privin]a aplica]iilor ingineriei genetice. ~n afara soiurilor rezistente la insecte [i erbicide (obiectiv impus de faptul c\ aproximativ 40% din cantitatea total\ de pesticide consumate se aplic\ la aceast\ specie), cultivate deja pe suprafe]e mari `n Statele Unite ale Americi, dar [i `n China, Africa de Sud [i India, sunt `n curs de ob]inere:- linii care sintetizeaz\ melanin\, pentru culoarea neagr\, `n lumenul fibrei, prin expresia unor transgene sub controlul unor promotori fibr\ specifici [i- linii care sintetizeaz\, tot `n lumenul fibrei, un miez de material plastic.Scopurile finale ale acestor transform\ri sunt evidente: renun]area la opera]iunea de colorare a fibrelor, costisitoare [i poluant\, [i ameliorarea propriet\]ilor termice.Tot pentru ameliorarea calit\]ii `mbr\c\min]ii, `n plantele furajere se introduc gene care codific\ proteine cu sulf. Proteine menite s\ amelioreze calitatea lânii oilor.Plantele ornamentale modificate genetic pe pia]\ `nc\ din 1996: o garoaf\ mov- MoondustTM- ob]inut\ prin introducerea genelor ce codific\ pigmen]ii corespunz\tori `ntr-un soi cu flori albe, precum [i o garoaf\ care poate fi p\strat\ t\iat\, `n vaz\, timp relativ `ndelungat. De altfel, `n curând, pia]a va fi inundat\ de plante ornamentale cu culoarea florilor modificat\.Un interes aparte prezint\ plantele modificate genetic pentru a fi folosite ca “instrumente de bioremediere”, adic\ de decontaminare a terenurilor poluate natural sau contaminate ca urmare a unor activit\]i ale omului. Iat\ numai câteva exemple de asemenea plante: plopul galben, care posed\ dou\ gene bacteriene ce-i permit s\ converteasc\ mercurul ionic [i metilmercurul `n mercur volatil; mu[tarul cu toleran]\ sporit\ la cadmiu; tutunul care posed\ enzime ce degradeaz\ hidrocarburile poluante; arborii care supraexprim\ nitratreductoza, eliminând oxizii de azot ce se acumuleaz\ `n marile aglomer\ri urbane.

15. A TREIA GENERATIE DE PLANTE TRANSGENICE

Cea de a treia generatie include plante modificate genetic in vederea producerii unor molecule utile pentru industrie, medicină sau stiinţă Produse primare –Anticorpi (imunoglobuline) - Enzime (cosmetică, terapeutică, industrie,diagnostic) - Proteine structurale (peptide, hormoni) - Vaccinuri - Medicamente

Produse secundare –Bioplastic -Vitamine - Metaboliti secundari (fenoli, taninuri, amidonuri, arome, alcaloizi) - Fibre Realizari Primul vaccin comestibil pentru on a aparut in 1995 – cartoful crud care contine o enterotoxina termolabila codificata de o gena de la E. coli Salata care vaccinează contra hepatitei B Cartoful care imunizează impotriva holerei Rapita care produce de doua ori mai multa vitamina E Cartof care nu se mai brunifica la prajire

16. RISCURILE PENTRU MEDIU

Ingineria genetica si produsele sale au aparut numai in ultimii 20 de ani. De aceea, este aproape imposibil de evaluat impactul potential al speciilor trangenice asupra mediului. Totusi, pornind de la observatiile efectuate in situatii similare cu specii naturale, oamenii de stiinta au sugerat urmatoarele efecte: 1. Crearea de noi daunatori: a planta de cultura care a fost modificata prin inginerie genetica pentru a fi toleranta fata de saruri ar putea scapa (evada) din lanul de cultura, ar putea invada estuarele, sufocand vegetatia naturala a acestui habitat. 2. Amplificarea problemelor cu daunatorii deja existenti: plantele de cultura sunt capabile de a transfera gene la distante de kilometrii la specii inrudite, prin polenizarea mediata de vant sau insecte, unele dintre aceste specii putand fi buruieni cunoscute. Astfel, genele straine de la plantele de cultura cu caractere inginerizate, cum ar fi toleranta la erbicide sau uscaciune, ar putea fi transferate la buruieni, facandu-le si mai greu de controlat. 3. Afectarea speciilor nevizate, non-tinta: virusurile, microorganismele sau plantele modificate genetic pentru a omora insectele daunatoare ar putea afecta si insectele utile. In experimentele de laborator, bacteriile modificate pentru a converti reziduurile vegetale cum ar fi frunzele in alcool, cu scopul utilizarii acestuia ca si combustibil, au determinat reducerea populatiilor de ciuperci (fungi) benefice. In unele cazuri, au fost omorate si ierburile din zone invecinate prin otravire cu alcool. 4. Reducerea biodiversitatii prin inlocuirea speciilor native: plantele de cultura GE care au un avantaj de supravietuire ar putea evada din campurile de cultura, ar putea invada alte ecosisteme si ar putea inlocui alte specii. Aceasta pierdere a biodiversitatii ar putea diminua sever abilitatea ecosistemelor sau speciilor de a raspunde cu succes la stessuri neasteptate, cum ar fi uscaciunea sau bolile.

RISCURILE ASUPRA SANATATII Principalele griji referitoare la siguranta alimentelor care contin derivate OMG se concentreaza asupra urmatoarelor aspecte: 1. Testele analitice existente si bazele de date continand substantele toxice naturale sau nutrientii prezenti in alimentele conventionale nu sunt adecvate pentru a testa modificarile neintentionate ale derivatelor OMG; 2. Ingineria genetica poate afecta in mare masura toxinele, alergenii sau nutrientii din alimente; 3. Alergiile asociate alimentelor pot fi exacerbate prin inginerie genetica; 4. Folosirea genelor marker care confera rezistenta la antibiotice in unele alimente OMG ridica probleme de sanatate.

Bibliografie:

1. Badea Elena Marcela, 2003 – Plantele transgenice în cultură, Bucureşti. 2. Banu C. şi colab., 2000 – Biotehnologii în industria alimentară. Ed. Tehnică, Bucureşti. 3. Beceanu B., 1994 – Tehnologia produselor horticole, vol I. Centrul de multiplicare U:S.A.M.V., Iaşi. 4. Bourgeois C.M., Larpent J.P., 1989 – Microbiologie alimentaire, vol. I-II. Edit. Lavoisier, Paris. 5. Danson M. J., Hough D. W., 1998 – Les enzymes de l` extreme. Biofutur. 6. Fellet P., 1998 – Aliments et industries allimentaires. Versailles, INRA Editions.