BAB I

PENDAHULUAN

Latar BelakangSistem pernapasan berperan dalam keseimbangan O2, CO2 serta pertukarannya. Proses transport O2 keseluruh tubuh diperankan oleh Hemoglobin (Hb) yang terkandung dalam eritrosit.

Hemoglobin merupakan protein yang terdapat dalam sel darah merah dan berfungsi antara lain untuk mengikat dan membawa oksigen dari paru-paru ke seluruh jaringan tubuh, mengikat dan membawa CO2 dari seluruh jaringan tubuh ke paru-paru, memberi warna merah pada darah, dan mempertahankan keseimbangan asam basa dari tubuh.Hemoglobin merupakan protein tetramer kompak yang setiap monomernya terikat pada gugus hem dan keseluruhannya mempunyai berat molekul 64.450 Dalton. Darah mengandung 7,8 sampai 11,2 mMol hemoglobin monomer/L (12,6 sampai 18,4 gram/dL), tergantung pada jenis kelamin dan umur individu.

Hemoglobin memerankan peranan penting dalam pengangkutan oksigen selama ia dapat kembali mengikat oksigen. Haemoglobin cenderung mengikat oksigen apabila lingkungannya penuh dengan oksigen dan melepaskan oksigen dalam lingkungan yang relatif rendah oksigennya. Ini berarti haemoglobin mengambil oksigen dalam paru dan melepaskan ke jaringan-jaringan seperti otot aktif. Pada orang-orang yang mengandung haemoglobin normal, kapasitas darahnya membawa oksigen kira-kira 20 mL oksigen per 100 mL darah. Hampir pada semua keadaan, darah mengandung banyak sekali oksigen ketika bergerak melalui paru.

Hemoglobin berikatan dengan O2 dan selanjutnya melepaskan O2 (deoksihemoglobin). Derivat Hb dapat ditentukan dengan pengenceran. Membran sel biologis terdiri dari lipid dan protein yang dihubungkan oleh ikatan nunkovalen. Lipid sebagai sekat non permeabel sedangkan protein sebagai katalisator reaksi intrasel.

Proses oksidasi juga dapat berlangsung secara enzimatik dan nonenzim dengan melibatkan logam seperti Fe. Hasil dari oksidasi adalah radikal bebas yang dalam peroksidasi lipid berbentuk malondialdehide (MDA). Sehingga semua hal diatas dapat diketahui dengan praktikum ini.Tujuan Praktikum1. Memperlihatkan bahwa Hb dapat mengikat dan melepas O2

2. Memperlihatkan ikatan Hb dengan CO lebih larut dibanding dengan O2

3. Demonstrasi spektrum derivat Hb

4. Memperlihatkan pengaruh larutan hipotonik dan pelarut organik terhadap membran sel darah merah

5. Penetapan kadar Hb KuantitatifBAB IITINJAUAN PUSTAKA

Hemoglobin adalah pigmen pembawa oksigen pada eritrosit, dibentuk oleh eritrosit yang sedang berkembang di dalam sumsum tulang. Molekul hemoglobin ini memiliki struktur yang terdiri dari globin, yaitu protein yang terbentuk dari empat rantai polipeptida yang sangat berlipat-lipat dan empat gugus nonprotein yang mengandung besi yang biasa dikenal sebagai gugus heme, dengan masing-masing terikat ke salah satu polipeptida. Keempat atom besi yang ada pada gugus heme ini dapat berikatan secara reversibel dengan satu molekul O2. Oleh karena itu, setiap molekul hemoglobin dapat berikatan dengan empat O2 dari paru-paru. Karena O2 tidak mudah larut dalam plasma maka 98,5% O2 yang terangkut dalam darah akan terikat dengan hemoglobin.Hemoglobin yang merupakan protein tetrametrik eritrosit ini memiliki fungsi utama hemoglobin ialah mentranspor O2 dari paru ke berbagai jaringan dan membawa CO2 serta proton (H+) dari jaringan ke paru-paru. Sebuah hemoglobin mengikat satu molekul O2 untuk tiap hem, jadi satu molekul hemoglobin dapat mengikat empat molekul O2, tetapi hanya satu molekul CO2 yang terikat pada rantai polipeptida globin sebagai karbamat hemoglobin (kadarnya 15% dari CO2 darah vena). Walaupun begitu, tidak terjadi kompetisi antar kedua gas tersebut. Hemoglobin juga dapat mengembalikan karbondioksida (CO2) dan proton dari jaringan di seluruh tubuh ke paru-paru. Fungsi lainnya yaitu memberi warna merah pada darah, karena kandungan besinya maka hemoglobin tampak kemerahan jika berikatan dengan O2. Karena hemoglobin berperan kunci dalam transport O2 sekaligus memberi kontribusi signifikan pada transport CO2, maka hemoglobin pun berfungsi sebagai penyangga pH.

Hemoglobin dapat mengikat 4 atom oksigen per tetramer (satu pada tiap subunit hem), atom oksigen terikat pada atom Fe2+, yang terdapat pada hem, pada ikatan koordinasi ke-5. Hemoglobin yang terikat pada oksigen disebut hemoglobin teroksigenasi atau oksihemoglobin (HbO2), sedangkan hemoglobin yang sudah melepaskan oksigen disebut deoksihemoglobin (Hb). Hemoglobin juga dapat mengikat suatu gas hasil pembakaran yang tidak sempurna yaitu karbonmonoksida (CO) dan disebut karbonmonoksidahemoglobin (HbCO). Ikatan Hb dengan CO ini 200 kali lebih kuat daripada ikatan Hb dengan oksigen, dan akibatnya Hb tidak dapat lagi mengikat, membawa dan mendistribusikan oksigen ke jaringan.

Dalam keadaan lain, muatan atom Fe yang terdapat pada pusat hem dapat berubah menjadi Fe3+. Hal ini dapat terjadi karena oksidasi dari senyawa-senyawa pengoksidasi. Hemoglobinnya disebut hemoglobin teroksidasi atau methemoglobin (MetHb) atau Hb(Fe3+). Dalam bentuk ini Hb tidak dapat mengikat oksigen atau kehilangan fungsinya yang amat penting. Beberapa derivat dari hemoglobin, misalnya oksiHb, Hb dan HbCO dapat dibedakan dengan melakukan pengenceran, dan pada pengenceran ini OksiHb terlihat berwarna merah kekuning-kuningan, Hb berwarna merah kecoklatan dan HbCO berwarna merah terang (carmine tint).

Untuk lebih jelas lagi, setiap dervat Hb dapat pula dibedakan dengan menggunakan spektroskop, yaitu suatu teknik berdasarkan perbedaan absorbsi warna-warna tertentu dari spektrum cahaya putih. Bila suatu larutan berisi suatu zat warna diletakkan antara alat tersebut dan sumber cahaya, maka akan terlihat daerah (pita) yang berwarna hitam pada bagian spektrum tepat terjadinya penyerapan warna tersebut. Dengan menentukan letak serta intensitas pita-pita absorbsi itu, maka dapat ditentukan pigmen apa yang sedang diperiksa itu. Pada spektroskop yang tidak dilengkapi dengan skala panjang gelombang cahaya, letak pita absorbsi itu ditentukan dengan membandingkan dengan garis-garis Fraunhofer dari spektrum sinar matahari. Pada gambar berikut, garis-garis Fraunhofer itu akan terletak pada perkiraan : B = 687 mu, C = 656 mu, D = 589 mu, E = 527 mu, b =517 mu, F = 468 mu dan G =431 mu.

BAB III

METODOLOGI

ALAT DAN BAHAN

A. Uji oksihemoglobin dan Deoksihemoglobin

Darah segar

Pereaksi stokes

Larutan NH4OH

B. Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)

Darah segar

Sumber gas CO

Pereaksi stokes

NH4OH

C. Uji untuk methemoglobin

Darah segar

Pereaksi K3Fe (CN)6

Pereaksi stokes

D. Penetapan kadar Hb dengan metode sianmethemoglobin

Darah yang akan diperiksa

Pipet sahli 0,2 ml

Pipet volumetric 5 ml

Pereaksi Drabkin (larutan NaHCO3, 52mg KCN beracun dan 18 mg K3Fe(CN)6 dalam 1 L air suling (simpan dalam botol)

Spektofotometer dan kuvet

Standar Hb

E. Hemolisis sel darah merah

Darah segar Larutan NaCl 2%

F. Pengaruh pelarut organic terhadap membrane sel darah merah

Darah segar Larutan NaCl 0,9% Kloroform Eter

G. Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum

Hemolisat darah Larutan asam trikloroasetat (TCA) 10% Larutan TBA 0,67%

CARA KERJA

A. Uji oksihemoglobin dan DeoksihemoglobinI. OksiHb

1. Ke dalam sebuah tabung reaksi encerkan 2 ml darah dengan 6 ml air . Campur dengan baik dan perhatikan warna merah terang dari oksihemoglobin yang terbentuk.2. Bagi 2 isi tabung tersebut sehingga masing-masing tabung berisi 4 ml. gunakan tabung 1 sebagai kontrol.

II. Pembentukan deoksiHb

1. Isi tabung ketiga dengan 2 ml pereaksi Stokes dan tambahkan NH4OH secukupnya untuk melarutkan endapan yang segera terbentuk.

Campuran ini merupakan larutan pereduksi yang kuat.Masukkan beberapa tetes larutan Stokes ke dalam tabung 2. Terlihat perubahan warna karena terbentuknya deoksiHb. Bandingkan dengan tabung 1.

III. Pembentukan kembali oksiHb dari deoksiHb

1. Kocok kuat-kuat tabung yang berisi deoksiHb, maka akan terjadi kembali oksigenasi dari udara. Perhatikan dan catat warna HbO2 yang kembali terbentuk.Oksigenasi dan deoksigenasi kembali ini dapat dilakukan berulang-ulang.

B. Uji karbonmonoksidahemoglobin (HbCO)

1. Encerkan 2 mL darah dengan 8 mL air suling. Bagi 2 darah encer itu (masing-masing 5 mL) dalam dua tabung reaksi.2. Pada tabung 1 alirkan gas CO (dalam lemari asam). Oksihemoglobin akan berubah menjadi karbonmonoksihemoglobin. Bandingkan warna kedua tabung tadi. 3. Pindahkan masing-masing 1 mL dari tabung 1 (yang berisi HbCO) ke dalam tabung 3 dan 4, dan masing-masing 1 mL dari tabung 2 (yang berisi HbO2) ke dalam tabung 5 dan 6. 4. Tambahkan pereaksi stokes pada tabung ke 3 dan 5. Jelaskan hasil yang didapat!5. Encerkan isi tabung 4 dan 6 dengan 4 mL air suling. Bandingkan warna kedua cairan itu. OksiHb berwarna kekuning-kuningkan, sedangkan HbCO bersemu kemerahan (carmine tint).

C. Uji untuk methemoglobin

1. Encerkan 1 mL darah dengan 4 mL air suling dalam tabung reaksi.2. Ke dalam tabung itu tambahkan beberapa tetes K3Fe(CN)6 33%. Perhatikan dan catat perubahan warna yang terjadi. Kemudian tambahkan pereaksi Stokes ke dalam tabung itu dan kocok kuat-kuat. Perubahan apakah yang terlihat ?3. Encerkan 3 mL darah dengan 3 mL air suling dan panaskan sebentar, lalu tambahkan 6 mL K3Fe(CN)6. Campur dengan membalik-balikkannya. Perhatikan gelembung- gelembung oksigen yang terbentuk.

D. Penetapan kadar Hb dengan metode sianmethemoglobin

1. Pipetkan dengan pipet volumetric 5 mL perekasi drabkin ke dalam sebuah tabung reaksi2. Tambahkan 0,02 mL darah yang akan diperiksa pada tabung yang berisi pereaksi Drabkin, bilas pipet tersebut 3 kali dengan pereaksi Drabkin dalam tabung tersebut3. Diamkan selama 10 menit4. Pindahkan campuran tersebut ke dalam kuvet spektofometer dan tentukan serapannya pada 540nm. Sebagai blanko digunakan pereaksi Drabkin5. Tentukan kadar Hb dalam 9% dari standar Hb yang disediakan dengan rumus sebagai berikut :

6. Kadar Hb =Ru/Rs x 10 g%= g%

E. Hemolisis sel darah merah

Kedalam 10 tabung reaksi, isiskan campuran berikut:

TabungAir suling (mL)NaCl 2% (mL)%NaCl

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1. Campurkan dengan baik

2. Tambahkan 2 tetes suspense ke dalam setiap tabung dan kocok dengan

membalik-balikkan tabung perlahan. Diamkan 1 jam

3. Perhatikan dan catatlah derajat hemolisis pada tiap tabung

F. Pengaruh pelarut organic terhadap membrane sel darah merah

1. Ke dalam 6 tabung reaksi, masukkan setiap 10 mL larutan NaCl 0,9%.2. Tabung pertama digunakan sebagai kontrol dan pada ke 5 tabung lainnya tambahkan setiap 2 tetes kloroform, eter, aseton, toluen, dan alkohol secara berurutan.3. Tambahkan ke dalam tiap tabung 2 tetes suspensi darah, biarkan selama setengah jam. Perhatikan warna yang terbentuk dan bandingkan dengan kontrol.

G. Pengukuran kadar peroksida lipid dalam serum

BahanUji (mL)Blanko

Hemolisat darah0,25-

Akuades -0,25

Larutan TCA 10% dingin0,500,50

Kosong, pusing, ambil supernatan

Larutan TBA 0,067%0,750,75

Masukkan penangas mendidih 10 menit, didinginkan/ baca serapan pada panjang gelomang 532 nm

Hasil A 532 kadar MDA

DAFTAR PUSTAKA1. Dorland, W. A. N., 2012. Kamus Saku Kedokteran Dorland. 28 ed. Jakarta: EGC.2. Kadri, Husnil. 2012. Hemoprotein dalam Tubuh Manusia. Jurnal Kesehatan Andalas 2012.3. Kennelly PJ, Rodwell VW. Protein: Myoglobin &hemoglobin. In: Murray RK, Granner DK, Rodwell VW, editors. Harpers Illustrated Biochemistry. 27th ed. United States: The McGraw-Hill Companies, 2006: 41-8.4. Murray, R. K., Granner, D. K. & Rodwell, V. W., 2009. Biokimia Harper. 27th ed. Jakarta: EGC.5. Rubenstein, David, David Wayne, dan John Bradley. 2007. Lecture Notes : Kedokteran Klinis, Edisi 6. Jakarta : Erlangga.6. Sherwood, L., 2011. Fisiologi Manusia : Dari Sel ke Sistem. 6th ed. Jakarta: EGC.