2.3. Enzim Restriksi - staff.unand.ac.id file2.2. Enzim Restriksi Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi,

Dr. Jamsari, Prog. Studi Pemuliaan Tanaman Jurusan BDP-FPUA

2.3. Enzim Restriksi

Bioteknologi Tanaman

Copyright Statement:

Dengan ini dinyatakan, bahwa seluruh material (teks, gambar, grafik dan seluruh alat bantu penjelas lainnya)

bahan kuliah dalam format .ppt sebagaimana tercantum disini memiliki hak eksklusif intelektual bagi penyusun.

Penggunaan diluar untuk keperluan pembelajaran sebagaimana disepakati dalam pemberian material harus mendapatkan izin tertulis dari penyusun dan pelanggaran dalam hal ini akan dikenakan sanksi hukum sebagaimana

berlaku di Negara Kesatuan Republik Indonesia.


2.2. Enzim Restriksi

Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi,

internal = endonuklease


Aktifitas:Memutuskan ikatan rantai phospodiester pada ujung 5‘ rantai DNA


3 Macam golongan, restriksi endonuklease type I, II dan III

Type I dan III melakukan proses metilasi dan restriksi pada DNA yang sama

Type II proses metilasi dan restriksi pada DNA yang berbeda

Dalam keperluan rekayasa genetika enzym restriksi type II banyak digunakan

Memotong DNA menurut urutan sisi pengenalan (recognition site), bedakan dengan cutting site (titik pemotongan)

Jenisnya bermacam-macam: dari mulai 4-8 (tetra nukleotide-oktanukleotide)

Contoh:

4: AfaI ; GT AC ; 37°C ; Rhodopseudomonas sphaeroides; 65°C-15 menit

6: Eco RI; G AATTC; 37°C; Escherichia coli H709C; 60°C-15 menit

8; Not I; GC GGCCGC; 37°C; Nocardia otitidis-caviarum; ekstraksi phenol


Enzim Sisi Pengenalan Suhu inkubasi Organisme asal Suhu inaktifasi

Aat II GACGT C 37°C Acetobacter aceti IFO3281 65°C; 20’Afa I GT AC 37°C Rhodopseudomonas sphaeroides 65°C; 15’Alu I AG CT 37°C Arthrobacter luteus 60°C; 15’Apa I GGGCC C 37°C Acetobacter pasteurianus sub.

pasteurianus60°C; 15’

BamHI G GATCC 30°C Bacillus amyloliquifaciens H. 60°C; 15’Bgl I GCCNNNN NGGC 37°C Bacillus globigi 65°C; 15’Bgl II A GATCT 37°C Bacillus globigi 70°C; 15’Eco RI G AATTC 37°C Escherichia coli H709C 60°C; 15’Eco RV GAT ATC 37°C Escherichia coli 70°C; 15’Hae III GG CC 37°C Haemophilus aegyptus 70°C; 15’Hind III A AGCTT 37°C Haemophilus influenzae Rd 70°C; 15’Hpa I GTT AAC 37°C Haemophilus parainfluenzae 60°C; 15’Mbo I GATC 37°C Moraxella bovis 70°C; 15’Nco I C CATGG 37°C Nocardia corallina 70°C; 15’Not I GC GGCCGC 37°C Nocardia otitidis-caviarum Ekst. phenolPst I CTGCA G 37°C Escherichia coli ED8654 yang

membawa gene Pst I60°C; 15’

Sau3A I GATC 37°C Staphylococcus aureus 3A 70°C; 15’Taq I T CGA 65°C Thermus aquaticus Tidak adaXba I T CTAGA 37°C Xanthomonas badrii 60°C; 15’Xho I C TCGAG 37°C Xanthomonas holcicola Presipitasi

ethanol

Tabel beberapa contoh enzim, sisi pengenalan, suhu inkubasi dan suhu inaktivasi


C T G A T G A A T T C C G T

G A C T A C T T A A G G C AEcoRI

C T G A T G

G A C T A C T T A AA A T T C C G T

G G C A

A

MseIG A T G A T G A A T T C C G T

C T A C T A C T T A A G G C A

G A T GA T G A A

C T A C T A C T T

T T C C G T

A A G G C AB

Contoh titik potong enzim restriksi endonuklease

Ujung kohesif

Cohesive end

Ujung tumpul

Blunt end


Analogi Pemotongan Enzim Restriksi

Enzim A Enzim B

A B AB

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

2,5

3,0

11,511,0

7,0

1,0

20,0

2,5

3,0

10,0

7,0

1,0

4,5


M V 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M

1,6 kb

2 kb

3 kb

6 kb

12 kb

Contoh dalam praktek hasil restriksi DNA

DNA BAC dipotong dengan EcoRI dan HindIII, sumber Jamsari



Frekuensi pemotongan = 4n

4 = jumlah total macam basa nitrogen (CGAT)

N = jumlah sisi pengenal spesifik

Contoh :

EcoRI, hexanukleotid , maka enzim tersebut memotong DNA setiap: 46

basa = 4096

Maka apabila panjang DNA = 10 kb = 10.000 bp,

akan terpotong menjadi sekitar 2 atau 3 fragmen jika dipotong dengan EcoRI,

Jika dipotong dengan MseI akan menghasilkan 38-40 fragment




Transfer Asam Nukleat

Southern Transfer (DNA)

Northern Transfer (RNA)

Western Transfer (Protein)



Pemberat

Tumpukan kertas penghisap

Bak berisi larutan alkali

Gel tempat DNA

Bahan penghisap larutan alkaliMembran selulosa

Transfer Asam Nukleat

Southern Transfer (DNA) diperkenalkan oleh Edward Southern (1977)



Hibridisasi Asam Nukleat

Hibridisasi : Penyatuan molekul DNA asing dengan sekuens DNA (probe)

yang sudah diketahui identitasnya

Syarat : ada homologi antara molekul DNA asing dengan probe yang kita

miliki (70-100%)

Sumber Probe:

1. Pustaka DNA genomik anonym yang dipilih.

2. Pustaka cDNA

3. DNA yang dihasilkan dari luar inti sel (sitoplasma)



Agarose gel Nylon membran Röntgen Film

Hibridisasi

dengan Probe

Langkah-langkah Proses Hibridisasi


Restriksi




Gambar hasil autoradiogram jumlah kopi ujung Klon BAC yang dihibridisasi dengan DNA genomik tanaman asparagus,

Sumber, Jamsari

Selesai

Documents

2.3. Enzim Restriksi - staff.unand.ac.id file2.2. Enzim Restriksi Pengamatan terhadap bakteri yang mampu menghalangi pertumbuhan bakteriophage, disebut nuklease , memotong = restriksi,