2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim

https://biochemianzunited.wordpress.com/

https://www2.estrellamountain.edu/faculty/

farabee/biobk/BioBookEnzym.html

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2.5.1. Factori care guvernează

activitatea catalitică

pH-ul optim

http://cbc.chem.arizona.edu/classes/bioc462/462

a/NOTES/ENZYMES/enzyme_kinetics3.html

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim vs stabilitate

Prazeres, J. N.dos, Cruz, J. A. B., & Pastore, G. M. (2006).

Characterization of alkaline lipase from Fusarium oxysporum

and the effect of different surfactants and detergents on the enzyme

activity. Brazilian Journal of Microbiology, 37(4), 505-509

pH optim – albastru

Interval pH stabilitate – roșu

Bisswanger, H. (2012) Practical Enzymology

Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

pH-ul optim vs stabilitate

Activitatea enzimatică a pepsinei vs

stabilitatea pepsinei

D W Piper and B H Fenton,

Gut, 6, 506-508, 1956

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența solventului

Ibrahim, A.S.S. et al., Enhancement of Alkaline Protease Activity and

Stability via Covalent Immobilization onto Hollow Core-Mesoporous

Shell Silica Nanospheres, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17(2), 184

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența tăriei ionice

Influența tăriei ionice asupra activității tioesterazei

Wei, J. , Kang, H. W., Cohen, D.E.

Biochemical Journal, Jul 15, 2009,

421 (2) 311-322;

Influența tăriei ionice asupra activității

ribonucleazei (wt, K41R si K7A/R10A/ K66A)

Park, C. și Raines. R.T.,

J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 11472-11479

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența soluției tampon

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența soluției tampon

Anionul fosfatul inhibă

Carboxipeptidazele

Fumarazele

Carboxilaze

Fosfoglucomutaza

Tris (Tris(hidroxi-metil)aminometan), ACES, BES, TES

Leagă ionii de Cu

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența solventului, tăriei ionice și soluțiile tampon utilizate

Influența soluției tampon

Mohan, C., A guide for the preparation and use of buffers in biological

systems, EMD, San Diego, California

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Influența temperaturii

slideplayer.com/slide/8444574/ Fox, P. F. et al., Heat-Induced Changes in Milk,

Dairy Chemistry and Biochemistry, pp 345-375

Lipaza, fosfataza alcalină termolabile

Fosfatza acidă - relativ stabilă

Lapte praspăt ↔ Lapte pasteurizat

https://drjockers.com/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

www.sharinginhealth.ca

personalpages.manchester.ac.uk

Situs activ al TBP aldolazei

Gavin J. Williams et al.

PNAS 2003;100:6:3143-3148

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Legarea Mg2+ se face la substrat

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Situs activ al endonucleazei

FEMS Microbiology Review

2001; 25:5, 583-613

Funcții

endonucleaze

replicare

recombinare

reparare ADN

Benedik, M.and Strych, U. (1998),

Serratia marcescens and its extracellular nuclease

FEMS microbiology letters, 165, 1-13

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici anorganici

Carter, E. L. et al. (2009),

Interplay of metal ions and urease

Metallomics, 1, 207-221

Hille, R. (2002),

Molybdenum and tungsten in biology

TiBS, 27(7), 360-367

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

FAD DAAO Lipoamid

dehidrogenaza

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Din punct de vedere structural coenzimele - 4 clase:

• coenzime de natură alifatică;

• coenzime de natură aromatică;

• coenzime cu structura nucleozidică;

• coenzime cu structura nucleotidică.

Coenzime de natură alifatică: GSH, acidul lipoic, acidul ascorbic

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Coenzime de natură alifatică: GSH

glutation-homocistin-transdehidrogenaza

Acidul lipoic - reacții transacilare

amit1b.wordpress.com

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Coenzime de natură alifatică: acidul ascorbic

Biosinteze dependente de vitamina C

Sinteza carnitinei

Hidroxilarea prolinei (colagen)

http://www.chemistryviews.org/details/ezine

Sinteza Tyr din Phe

Sinteza noradrenalinei din dopamina

Sinteza serotoninei din triptofan

Amidarea peptidelor

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

http://chem.libretexts.org

/

Substratul Produsul Enzima

Acetil-CoA Malonil-CoA Acetil-CoA carboxilaza

Piruvat Oxaloacetat Piruvat carboxilaza

Propionil-CoA Metilmalonil-CoA Propionil-CoA carboxilaza

Malonil-CoA Propil-CoA Malonil-CoA-carboxitransferaza

Izovaleril-CoA β-metil-crotonil-CoA β-metil-crotonil-CoA carboxilaza

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici

Piridoxal-fosfatul şi piridoxamino-fosfatul - cofactori ai enzimelor ce

catalizează transferul grupărilor aminice:

2. Transaminazele

Reactia glutamatului cu piruvatul - formarea alaninei

Reactia glutamatului cu oxaloacetatul - formarea aspartatului.

1. Decarboxilazele aminoacizilor

3. Racemazele - catalizează formarea DL-alaninei din D-sau L-alanină.

4. Dezaminazele (pentru serină şi treonină).

Piridoxal-fosfatul este transportat cu ajutorul albuminei serice

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul

TGO: forma citozolica forma mitocondriala

Aspartat-aminotransferaza (TGO)

Legarea PLP la situsul activ al transaminazelor

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – piridoxal fosfatul

https://fet-ev.eu/mediatoren-histamin/

https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0001559

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care

guvernează activitatea

catalitică

Cofactorii enzimatici

organici – THF

Metilarea uracilului

http://watcut.uwaterloo.ca/

5-fluoro-uracilul

inhibă activitatea

tiamidilat sintetazei

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – nucleozid-fosfații

Kinaze – reacții de transfosforilare

http://www.wikiwand.com/en/Nucleoside-diphosphate_kinase

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+

Rol metabolic coenzime

NAD+

NADP+

NAD+ Reactii de scindare

NADP+ Reactii de biosinteza

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.1. Factori care guvernează activitatea catalitică

Cofactorii enzimatici organici – NAD+ și NADP+

Localizare

NAD+ - intramitocondrial

NADP+ - citozol

http://www.maac10.com/science/Michan, S. and Sinclair, D.

Biochem. J. 2007;404:1-13

https://bitesizebio.com/6478/

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

1U - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / minut

1Kat - cantitatea de enzimă care transformă 1 mol de substrat / secundă

c =A

l ·

legea Lambert-Beer

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Activitatea enzimatica =modificari

timp=

c

min=

A

min · l ·

Activitatea pe litru serVolumul total din cuva

Volumul de enzima=

A

min · l · ·

Act. enzimatica din ser - U/L

Act. enzimatica - µmol min-1 L-1

X 1000

2.5. Monitorizarea activității enzimatice

2. Purificarea enzimei

2.5.2. Metode de determinare a activității enzimatice

Fluorimetric

Colorimetric